Roman Atomic Force Microscopy Based Biopanning voor isolatie van morfologie specifieke reagentia tegen TDP-43 Varianten in Amyotrofische Lateraal Sclerose

Het algemene doel van deze procedure is om morfologie-specifieke reagentia te isoleren tegen tar DNA-bindend eiwit. 43 varianten die aanwezig zijn in een LS, gebruikmakend van een tweefasen A FM-gebaseerde radio-panningtechnologie. Dit wordt bereikt door eerst een diverse faagbibliotheek te onderwerpen aan meerdere rondes van negatieve panning tegen niet-doelwitten met behulp van immunobuizen.

Negatieve panning wordt sequentieel uitgevoerd tegen bovien serumalbumine, geaggregeerd alfa-synucleïne en gezond menselijk hersenweefsel. De tweede stap is het voltooien van een FM-verificatie na elke reeks negatieve panning om te zorgen voor een succesvolle verwijdering van alle ongewenste fagen. In dit voorbeeld van negatieve panning zijn fagen die zichtbaar zijn na een ronde met geaggregeerd alfa-synucleïne, maar afwezig zijn na de 10e ronde.

Vervolgens worden de resterende negatieve panning rondes uitgevoerd op MICA vanwege beperkte beschikbaarheid van monsters. Fagen die reageren op immunogeprecipiteerd TDP 43 uit gezond en uit frontotemporale dementie of FTD-weefsel worden sequentieel verwijderd. De laatste stap is het isoleren van de fagen die zich binden aan de immunogeprecipiteerde LS.

TDP 43 met behulp van mica-gebonden fagen wordt aangegeven met behulp van trypsine, triethyl, amine en TG een cellen. Uiteindelijk wordt de specificiteit van deze potentiële LS-klonen geverifieerd met behulp van indirecte fa eliza's en dot blots, waarbij gehomogeniseerde A-L-S-F-T-D en gezond menselijk hersenweefsel in beide assays worden geïmmobiliseerd. Grotere reactiviteit met LS-weefsel wordt meestal gedetecteerd in vergelijking met de andere geteste groepen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van conventionele faag bio-panning is het gebruik van uitputtende negatieve panning protocollen zoals geverifieerd door een FM om te zorgen voor de isolatie van reagentia die selectief ziekte-specifieke eiwitvarianten herkennen direct uit complexe biologische monsters, zelfs wanneer ze in lage concentraties aanwezig zijn. Hoewel een FM inzicht kan geven in het onderzoek naar biomoleculaire kenmerken en de interacties, kan het ook worden toegepast op andere systemen, zoals het monitoren van de voortgang van bio-panning en het bevestigen van de specificiteit van enkele CLOs. Begin deze procedure met faagproductie zoals beschreven in het tekstprotocol om negatieve panning uit te voeren tegen BSA, voeg eerst vier milliliter van één milligram per milliliter toe.

BSA-oplossing in fosfaatgebufferd zout of PBS naar 12 immunobuizen en incubeer een nacht bij vier graden Celsius. Combineer vervolgens faagdeeltjes van elk van de drie bibliotheken en zet een kleine hoeveelheid van deze faagmixture voor toekomstige verificatie van het negatieve panning-proces opzij. Gooi vervolgens de BSA-oplossing uit de eerste buis weg en was de buis twee tot drie keer met PBS om eventueel ongebonden BSA te verwijderen, voeg de gecombineerde faagbibliotheken toe aan deze eerste buis, incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op de rotator voordat u de ongebonden fagen verzamelt.

Houd er rekening mee dat het belangrijk is om een kleine hoeveelheid faag te bewaren na het voltooien van de vele rondes van negatieve panning tegen elk doelwit om het succes van het panning-proces te verifiëren en in geval van besmetting, herhaal het negatieve panning-proces met de resterende buizen met BSA-oplossing telkens wanneer. Gebruik de ongebonden faag die is verzameld na de incubatie van de vorige buis. Verifieer vervolgens de verwijdering van alle BSA-fagbinders met behulp van de A FM-procedure die in het volgende deel van de video is beschreven.

Voer het a FM-beeldvormingsproces uit met behulp van een FM-tappingmodus met een nano scope drie, een controller in de lucht bij kamertemperatuur. De silicium a FM-sondes hebben een resonantiefrequentie van 300 kilohertz en een veerconstante van 40 newton per meter. Plaats de a FM-tip in de tiplader.

Bevestig de tiplader aan de A FM-microscoop. Plaats het monster onder de A FM-microscoop. Gebruik de knoppen om de laser op de A FM-tip uit te lijnen.

Stel de scanfrequentie in op 3,05 hertz en de scanresolutie op 512 steekproeven per lijn. Auto-Tune de machine om de silicium trilling te optimaliseren. Frequentie van de tip, start het scannen van het monster.

De tip scant het oppervlak van de MICA en meet de hoogte van de gebonden fagen. De fagen zijn de lange witte lijnen die na het acquisitieproces de beelden door basisvereffening van de achtergrond vlakmaken om ervoor te zorgen dat alle deeltjesgrootten vergelijkbaar zijn binnen elk beeld. De breedte van de faag kan van beeld tot beeld variëren vanwege andere deeltjesgrootten en het scangebied, maar het zal de nauwkeurigheid van of de faag bindt aan het antigeen nooit compromitteren.

Het beeld wordt afgeplat naar een 2D-beeld en slecht afgebeelde gebieden veroorzaakt door PEG-besmetting worden gemarkeerd voor verwijdering uit toekomstige gegevensanalyse. Immunoprecipiteer gezond TDP 43-eiwit uit gezond menselijk hersenweefsel zoals beschreven in het tekstprotocol vanwege de kleinere hoeveelheid immunogeprecipiteerd eiwit. Voer deze rondes van negatieve panning uit met behulp van MICA, eerst splijt u acht MICA-oppervlakken tot de eerste MICA bij ongeveer 100 microliters van het immunogeprecipiteerde eiwit en incubeer gedurende vijf tot tien minuten bij kamertemperatuur na incubatie.

Was de MICA vijf keer met 0,1% fosfaatgebufferd zout met tween 20, afgekort PBST. Voeg vervolgens ongeveer 100 microliters faag toe na de negatieve panning tegen gezond menselijk hersenweefsel en incubeer gedurende vijf tot tien minuten bij kamertemperatuur. Halverwege de incubatie, voegt u het immunogeprecipiteerde eiwit toe aan de tweede mica.

Verzamel de faag uit de eerste MICA voordat u de MICA vijf keer met 0,1% PBST wast. Na het wassen van de tweede mica, voegt u de eerder