Name: Probe-gebaseerde real-time PCR Benaderingen voor kwantitatieve meting van microRNAs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Leer drie probe-gebaseerde real-time PCR-methoden voor kwantitatieve meting van microRNAs in plasma en serum. Deze technieken ondersteunen biomarkeronderzoek voor ziekten zoals kanker en diabetes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Alle auteurs erkennen de ondersteunende infrastructuur van de NHMRC CTC, Universiteit van Sydney, de Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF), Australië en de Rebecca Cooper Foundation, Australië. Dit onderzoek werd gefinancierd door subsidies van de Australian Research Council (FT110100254) en de JDRF, Australië (CRN201314) naar WW, RJF AAH en MvJ uitgevoerd helemaal nat lab experimenten, ASJ uitgevoerd data-analyse. WW schreef het eerste ontwerp. AAH gepland de studie en de gegevens geanalyseerd. Alle auteurs gelezen en akkoord over de definitieve versie van het manuscript, cijfers en werkbladen voor publicatie voorgelegd.

<ol><li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functions+of+animal+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The functions of animal microRNAs.</a> Nature. 431, 350-355 (2004).</li>
<li>Alvarez-Garcia, I., Miska, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+functions+in+animal+development+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MicroRNA functions in animal development and human disease.</a> Development. 132, 4653-4662 (2005).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-297 (2004).</li>
<li>Joglekar, M. V., Wei, C., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+estimation+of+multiple+miRNAs+and+mRNAs+from+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitative estimation of multiple miRNAs and mRNAs from a single cell.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010, pdb prot5478(2010).</li>
<li>Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet-specific+microRNAs+in+pancreas+development%2C+regeneration+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Islet-specific microRNAs in pancreas development, regeneration and diabetes.</a> Indian J Exp Biol. 49, 401-408 (2011).</li>
<li>Farr, R. J., Joglekar, M. V., Taylor, C. J., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+non-coding+RNAs+as+biomarkers+of+beta+cell+death+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Endocrinol+Rev%22%5BJournal%5D)">Circulating non-coding RNAs as biomarkers of beta cell death in diabetes.</a> Pediatr Endocrinol Rev. 11, 14-20 (2013).</li>
<li>Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+islet-specific+microRNAs+during+human+pancreatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr+Patterns%22%5BJournal%5D)">Expression of islet-specific microRNAs during human pancreatic development.</a> Gene Expr Patterns. 9, 109-113 (2009).</li>
<li>Iorio, M. V., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling in ovarian cancer.</a> Methods Mol Biol. 1049, 187-197 (2013).</li>
<li>Mitchell, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> P Natl Acad Sci USA. 105, 10513-10518 (2008).</li>
<li>Mattie, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+high-throughput+microRNA+expression+profiling+provides+novel+biomarker+assessment+of+clinical+prostate+and+breast+cancer+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Optimized high-throughput microRNA expression profiling provides novel biomarker assessment of clinical prostate and breast cancer biopsies.</a> Mol Cancer. 5, 24(2006).</li>
<li>Zhu, W., Qin, W., Atasoy, U., Sauter, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+in+breast+cancer+and+healthy+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs in breast cancer and healthy subjects.</a> BMC Res Notes. 2, 89(2009).</li>
<li>Zhu, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+suitable+reference+genes+for+qRT-PCR+analysis+of+circulating+microRNAs+in+hepatitis+B+virus-infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification of suitable reference genes for qRT-PCR analysis of circulating microRNAs in hepatitis B virus-infected patients.</a> Mol Biotechnol. 50, 49-56 (2012).</li>
<li>Yamada, H., Itoh, M., Hiratsuka, I., Hashimoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+in+autoimmune+thyroid+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Endocrinol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs in autoimmune thyroid diseases.</a> Clin Endocrinol (Oxf). , (2014).</li>
<li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+MicroRNA+Expression+Profile+as+a+Biomarker+in+the+Diagnosis+and+Prognosis+of+Pancreatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Serum MicroRNA Expression Profile as a Biomarker in the Diagnosis and Prognosis of Pancreatic Cancer.</a> Clinical Chemistry. 58, 610-618 (2012).</li>
<li>Gilad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+microRNAs+are+promising+novel+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Serum microRNAs are promising novel biomarkers.</a> PLoS One. 3, e3148(2008).</li>
<li>Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Mehta, S., Bhonde, R. R., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+of+developing+and+regenerating+pancreas+reveal+post-transcriptional+regulation+of+neurogenin3%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling of developing and regenerating pancreas reveal post-transcriptional regulation of neurogenin3.</a> Dev Biol. 311, 603-612 (2007).</li>
<li>Hardikar, A. A., Farr, R. J., Joglekar, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+understanding+the+limits+for+quantitative+measurement+by+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: understanding the limits for quantitative measurement by real-time PCR.</a> J Am Heart Assoc. 3, e000792(2014).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+Prognostic+Implications+of+a+Serum+miRNA+Panel+in+Oesophageal+Squamous+Cell+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and Prognostic Implications of a Serum miRNA Panel in Oesophageal Squamous Cell Carcinoma.</a> PLoS One. 9, e92292(2014).</li>
<li>McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+microRNA+profiling+of+exosomes+derived+from+blood+and+culture+media%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification and microRNA profiling of exosomes derived from blood and culture media.</a> J Vis Exp. , e50294(2013).</li>
<li>Joglekar, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miR-30+family+microRNAs+confer+epithelial+phenotype+to+human+pancreatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells.</a> Islets. 1, 137-147 (2009).</li>
<li>Genda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA+changes+in+the+dorsal+horn+of+the+spinal+cord+of+rats+with+chronic+constriction+injury%3A+A+TaqMan%28R%29+Low+Density+Array+study%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">microRNA changes in the dorsal horn of the spinal cord of rats with chronic constriction injury: A TaqMan(R) Low Density Array study.</a> Int J Mol Med. 31, 129-137 (2013).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+three+microRNA+profiling+platforms%3A+microarray%2C+beads+array%2C+and+quantitative+real-time+PCR+array%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of three microRNA profiling platforms: microarray, beads array, and quantitative real-time PCR array.</a> PLoS One. 6, e17167(2011).</li>
<li>Cuk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+in+plasma+as+early+detection+markers+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs in plasma as early detection markers for breast cancer.</a> Int J Cancer. 132, 1602-1612 (2013).</li>
<li>Morrison, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter+high+throughput+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nanoliter high throughput quantitative PCR.</a> Nucleic Acids Res. 34, e123(2006).</li>
<li>Git, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+microarray+profiling%2C+real-time+PCR%2C+and+next-generation+sequencing+technologies+for+measuring+differential+microRNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression.</a> RNA. 16, 991-1006 (2010).</li>
<li>Benes, V., Castoldi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling+of+microRNA+using+real-time+quantitative+PCR%2C+how+to+use+it+and+what+is+available%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available.</a> Methods. 50, 244-249 (2010).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33, e179(2005).</li>
<li>Schmittgen, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+quantification+of+precursor+and+mature+microRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA.</a> Methods. 44, 31-38 (2008).</li>
<li>Kodani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+TaqMan+low-density+arrays+for+simultaneous+detection+of+multiple+respiratory+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Application of TaqMan low-density arrays for simultaneous detection of multiple respiratory pathogens.</a> J Clin Microbiol. 49, 2175-2182 (2011).</li>
<li>Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereirae Cotta,, V, M., Joglekar, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+measurement+of+noncoding+RNA+in+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum.</a> Exp Diabetes Res. 2012, 168368(2012).</li>
<li>TPF & SPF File Download Options [Internet]. , Available from: 
	 <a target="_blank" href="http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/products/tpf-spf-download.html">http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/products/tpf-spf-download.html</a> (2014).</li>
<li>Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+extracellular+circulating+microRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of extracellular circulating microRNA.</a> Nucleic Acids Res. 39, 7223-7233 (2011).</li>
<li>Li, Y., Kowdley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+microRNA+isolation+from+clinical+serum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Method for microRNA isolation from clinical serum samples.</a> Anal Biochem. 431, 69-75 (2012).</li>
</ol>

Artikel verwerkingskosten / publicatie werden gedekt door Life Technologies, na de aanvaarding van dit manuscript voor publicatie.

De kritische stappen in de probes gebaseerde qPCR protocollen om nauwkeurige en reproduceerbare resultaten te verkrijgen om er zeker 1) dezelfde hoeveelheid en concentratie van RT-product wordt in elke qPCR reactie geladen, 2) de juiste verhoudingen en hoeveelheden van de componenten die nodig zijn voor qPCR reactie worden voorbereid en goed gemengd, 3) de correcte en consistente volumes worden toegevoegd aan elke qPCR reactie, en 4) de voorbereiding en het laden van elk monster en het reactiemengsel wordt voltooid in de kortst mogelijke tijd, terwijl nog steeds bewust van de bovenstaande kritische stappen eerder vermeld. De microfluidics reeks kaarten nodig geschikte centrifuge en specifieke emmers. Elke emmer kan maximaal 3 kaarten (geladen / leeg). Zorg er altijd voor dat alle 3 slots van een emmer bezet zijn en de emmer wordt in evenwicht gehouden door het plaatsen van vergelijkbare emmer (deze bak moet ook 3 kaarten, leeg of vol bevatten) in de tegenovergestelde sleuf van de centrifuge. Terwijl het plaatsen van de kaart in de bucket houder, zorg ervoor dat de 8 reservoirs projecteren naar boven en reactieputjes geconfronteerd met de buitenwand van centrifuge. Spin kaarten bij 331 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur. Na de eerste spin, opent u de centrifuge en visueel zorgen de reactie mix is ​​afgegeven door de 384 putten. Herhaal de spin in dezelfde instellingen voor nog 1 keer. Neem de kaart uit emmer en zorgen dat het niveau van reactiemengsel in elk van de reservoirs 8 is uniform. Inconsistenties in de vloeistofvolumes links in de reservoirs maakt de kaart ongeschikt verdere gebruik. Om dezelfde concentratie van het RT-product, wordt dezelfde ingang concentratie van RNA toegevoegd in elke RT-reactie. Het totale RNA-concentratie wordt gemeten met een micro-volumespectrophotometer. De waargenomen 260/280 verhouding kan zo laag als 1.3 voor de RNA geïsoleerd uit plasma / serum zijn; dit lijkt geen effect te hebben op downstream-qPCR gerelateerde verwerking of gegenereerd 30. Ook de verhouding 260/280de RNA monsters hierin geteste tussen 1,3-1,7 geen abnormale effecten in het qPCR waargenomen. Bij gebruik van laag gehalte RNA monsters, zoals die van biovloeistoffen, kan het moeilijk zijn om RNA voorafgaand aan de verwerking kwantificeren. Wij raden het gebruik van synthetische spike-in in het RNA-isolatie, evenals het omgekeerde fasen transcriptie. In onze ervaring, Arabidopsis thaliana miRNA kandidaten (ATH-miR-159a en ath-miR-172a) de voorkeur boven Caenorhabditis elegans miRNAs (zoals CEL-miR-39 of CEL-miR-54), die in onze ervaring hoger kunnen hebben homologie dan die van A. thaliana. Het gebruik van dergelijke fasespecifieke spike-in kan verklaren de normalisatie van miRNA data over meerdere monsters geanalyseerd op verschillende tijdstippen. Met behulp van een vaste ingang volume van RNA voor cDNA-synthese reactie wordt ook aanbevolen 32,33. De drie probes gebaseerde protocollen voor miRNA kwantificering hier beschreven vereisen verschillende hoeveelhedentotaal RNA-ingang, verschillende workflows en kosten. Elk van de workflows zijn ontworpen om te voorzien in verschillende doorvoersnelheden op basis van het aantal miRNA targets en het aantal te analyseren monsters. Met toenemende doorvoer (96 rxn 384 rxn 3072 rxn), de kosten per reactie afneemt met een toename in de hoeveelheid gegevens verkregen over een tijdseenheid. Omdat al deze platforms gebruiken TaqMan chemie kan worden verwacht de kwaliteit van de gegevens verkregen vergelijkbaar. TaqMan qPCR is een bekende methode voor het identificeren van de overvloed van miRNAs in serum / plasma monsters 9,11,27. Hoewel de drie platforms besproken dezelfde chemie, een afname van het reactievolume leidt tot een afname van het dynamisch bereik van transcript detectie (Farr RJ et al., Ongepubliceerde gegevens). De 96-well qPCR platform is een lagere doorvoersnelheid, maar hoge gevoeligheid platform en in onze ogen, de &quot;gouden standaard&quot; voor alle probes gebaseerde (of kleurstoffen gebaseerde) PCR-platforms. Dit kan echterde meest economische of efficiënt platform niet zijn als enkele honderden of duizenden monsters worden geanalyseerd en voor meerdere microRNAs. Microfluidics (TLDA) en nanofluidics (OA) platforms zijn high-throughput / content platforms ontworpen om acquisitie van grotere gegevens mogelijk te maken in een kortere tijd. Hoewel batch verschillen waargenomen in de TLDA kaarten, kan deze worden geminimaliseerd door het vragen TLDA kaarten van dezelfde partij. We merken op dat TLDA platform (figuur 3) toonde significante verschillen in 17% van mid - lage abundantie miRNAs bij testen met dezelfde monster op verschillende partijen TLDA kaarten. Daarom adviseren wij het gebruik van de dezelfde partij nummers voor analyse met behulp van TLDA kaarten. Deze variatie kan ook worden veroorzaakt door de technische variabiliteit inclusief mogelijke laad- en pipetteringsfouten. Echter, raden wij bestellen / aanvragen van dezelfde partij TLDA kaarten. Geen significante batch variatie werd waargenomen op de OA platform. Ondanks dit, TaqMan gebaseerd ExperimenTal qPCR benadert aanbod gemak naar de overvloed van miRNAs in plasma / serum monsters te meten. De lage, middelhoge en hoge throughput benaderingen hier besproken bieden de flexibiliteit om een ​​reeks van samples en miRNAs met behulp van een zeer efficiënte, reproduceerbare en schone (lage ruis) chemie analyseren.

MicroRNAs (miRNAs) zijn ~ 22 nucleotide niet-coderende (nc) RNA&#39;s, functioneren als regulatoren van genexpressie 1-3. De meeste miRNAs bij dieren verricht door sequentiespecifieke baseparing met een mRNA, gericht op de 3&#39;-UTR, hetgeen leidt tot negatieve regulatie van genexpressie 2-4. Dit gebeurt meestal via remming van mRNA translatie of door ribosomale drop-off. miRNAs in omloop is aangetoond om nieuwe biomarkers in onderzoek en klinische velden voor diverse ziekten zoals diabetes 5-7, ovariale 8, 9, prostaat- en borstkanker 10,11, hepatitis B-12 en andere auto-immuunziekten 13. Onderzoek is uitgevoerd overvloedige miRNAs identificeren in verschillende cellen of weefsels, en in omloop uit menselijk plasma en serum, die gemakkelijker en met minder invasieve 9,11-15. Verschillende methoden van miRNA kwantificering hebben e geweestIngesteld met behulp van meerdere platforms, zoals de standaard 96-well plaat platform 4,12,16-18, de microfluidics kaart platform 12,18-23 en de nanofluidics testplatform 17,24. Kwantitatieve real time PCR (qPCR) biedt de mogelijkheid om relatieve of absolute aantal transcripten te meten met behulp van meerdere (dye of probes gebaseerde) chemie. Probe-based real-time PCR chemie biedt het voordeel van lage achtergrond fluorescentie en hoge gevoeligheid voor een enkel transcript kopie detecteert. Het is relatief kosteneffectief, eenvoudig te gebruiken en zeer reproduceerbaar, waardoor het een favoriete methode voor het kwantificeren en het bepalen van miRNA expressie 25. Probe-based qPCR methode houdt in het algemeen in twee stappen: reverse transcriptie (RT) en qPCR 4,26,27. RT is waar de stamlus RT-primer wordt gehybridiseerd met een rijpe of primaire miRNA molecuul en omgezet in complementaire (c) DNA. Kwantificering van het cDNA wordt vervolgens uitgevoerd met miRNA-specifieke PCR primers26-28. Het principe van probe-gebaseerde qPCR is gebaseerd op de detectie van complementaire streng verlenging in real time, waarbij hydrolyse van de fluorescent gemerkte probe omvat. Deze probes zijn ontworpen om een ​​fluorescente reporter en een quencher die net elkaar om FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) kunnen worden onderzocht. Detectie van de emissie van de fluorescentie rapporteur (zender) wordt gemaskeerd door de nabijheid van de quencher molecule. Wanneer Taq polymerase (pol) zich vanaf de stroomopwaartse primer en een vork (einde van de sonde de 5 &#39;) bereikt, het Taq pol exonuclease activiteit hydrolyseert de sonde, waardoor de fysische dissociatie / scheiding van de fluorescente emitter van de quencher. Deze release van een enkel molecuul van fluorescentie zender wordt opgenomen door de detector en gepresenteerd als een incrementele toename van de fluorescentie signaal van die goed / reactie. De toename in fluorescentie is evenredig met de hoeveelheid PCR product gegenereerd, waardoor een nauwkeurige quantification van de geamplificeerde doel 26,28. Met de toenemende vraag in miRNA kwantificering zijn gemiddelde tot hoge doorvoer technologieën ontwikkeld om een ​​groter aantal monsters in een korte tijd te verwerken. TaqMan Low Density Array (TLDA) is een middelgrote doorvoer innovatief microfluïdische ontwerp op probes gebaseerde qPCR chemie met een toename van het aantal miRNAs op een plaat geanalyseerd. TLDA omvatten het gebruik van een vooraf bepaalde pool van RT-primers die worden gebruikt voor het synthetiseren van het cDNA. Deze cDNA&#39;s worden vervolgens gesponnen tot een aangepaste 384 goed micro-fluïde kaart om de expressie van meerdere miRNAs gebruik qPCR 22,26,29 bepalen. Elk putje van de kaart bevat gedroogde primers en probes specifieke miRNA (s) versterken, dus tot 384 reacties kunnen in één TLDA kaart 26 verwerkt. De nanofluidics array is een high-throughput platform dat wordt gebruikt voor detectie van gen transcripten <sup&gt; 24 gebruikmaking van dezelfde probes gebaseerde chemie. Het maakt gebruik van een eigen matrix met hydrofobe-hydrofiele interacties eenvoudig laden van de 33 nanoliter reactiemengsel in een array van 3072 doorgaande gaten op een roestvrij stalen glijbaan 24 te vergemakkelijken. Dit artikel richt zich op het aantonen hoe deze werkwijzen voor het kwantificeren van miRNAs in serum / plasma wordt uitgevoerd en de kritische factoren die moeten worden overwogen bij het uitvoeren en interpretatie van dergelijke gegevens. Genomen om rekening te houden, zullen hun individuele voordelen en beperkingen in dit artikel worden besproken.

<table><tbody><tr><td>96 well-platform</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Voor Reverse transcriptie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays INV SM </td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4427975</td><td>https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 De assays worden geleverd als een pakket met RT-primers en PCR-primer.</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4366597 of 4366596</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 of http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 De TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is dezelfde kit die wordt gebruikt voor reverse transcriptie in alle drie deTaqMan platform- 96-well platform, TLDA en OpenArray.</td></tr><tr><td>Voor qPCR uitgevoerd op een 96-well platform</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, geen AmpErase UNG </td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4367846</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 De 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix wordt gebruikt voor qPCR op&nbsp; de twee TaqMan platforms-96-well platform en TLDA.</td></tr><tr><td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td><td>Applied Biosystems</td><td>4311971</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product</td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0,1 ml </td><td>Applied Biosystems</td><td>4346907</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product</td></tr><tr><td>Microfluidics platform (TLDA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Voor Reverse transcriptie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zie 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 of 4366596) (zoals hierboven getoond).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4399966</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 De Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 wordt gebruikt voor RT op&nbsp; de twee TaqMan platforms- TLDA en OpenArray.</td></tr><tr><td>Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4444281</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 De Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 wordt gebruikt voor RT op&nbsp; de twee TaqMan platforms- TLDA en OpenArray.</td></tr><tr><td>OF</td><td></td><td></td><td>OF</td></tr><tr><td>Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4444750</td><td>http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 De Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 wordt gebruikt voor RT op&nbsp; de twee TaqMan platforms- TLDA en OpenArray.</td></tr><tr><td>Voor Pre-amplificatie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan PreAmp Master Mix</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4391128 of 4488593</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 of http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 De TaqMan PreAmp Master Mix wordt gebruikt voor pre-amplificatie van qPCR op&nbsp; de twee TaqMan platforms- TLDA en OpenArray.</td></tr><tr><td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 </td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4444303</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 De Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 wordt gebruikt voor pre-amplificatie van qPCR op&nbsp; de twee TaqMan platforms- TLDA en OpenArray.</td></tr><tr><td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4399233</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 De Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 wordt gebruikt voor pre-amplificatie van qPCR op&nbsp; de twee TaqMan platforms- TLDA en OpenArray.</td></tr><tr><td>1x TE Buffer (100 ml)</td><td>Invitrogen</td><td>12090-015</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product De 1x TE Buffer wordt gebruikt voor pre-amplificatie van qPCR op&nbsp; de twee TaqMan platforms- TLDA en OpenArray.</td></tr><tr><td>Om de 384 well microfluidics (TLDA) kaart te laden en uit te voeren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 </td><td>Applied Biosystems</td><td>4444913</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913</td></tr><tr><td>Nanofluidics platform (OpenArray)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Voor Reverse transcriptie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zie 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 of 4366596) (zoals hierboven getoond).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Voor Pre-amplificatie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zie TLDA pre-amplificatie reagentia (zoals hierboven getoond)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Om de slides te laden en uit te voeren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 paneel)</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4470187</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessoires Kit </td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4469576</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/446

probe-gebaseerde real-time pcr benaderingen voor kwantitatieve meting van micrornas

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-gebaseerde kwantitatieve PCR (qPCR) een voorkeur werkwijze voor het meten transcript overvloed, omdat het een van de meest gevoelige detectiemethoden een nauwkeurige en reproduceerbare analyse levert. Probe-gebaseerde chemie biedt de minst achtergrond fluorescentie in vergelijking met andere (dye-based) chemie. Momenteel zijn er verschillende platforms die gebruik probe gebaseerde chemie transcript overvloed kwantificeren. qPCR in een plaat met 96 putjes is de meest gewoonlijk gebruikte methode is echter slechts maximaal 96 monsters of miRNAs kunnen worden getest in een enkele run. Dit is tijdrovend en vervelend als een groot aantal monsters / miRNAs worden geanalyseerd. High-throughput-probe gebaseerde platforms zoals microfluidics (bijv TaqMan Array Card) en nanofluidics arrays (bijv OpenArray) bieden hun gemak reproduceerbaar en efficiënt op te sporen de overvloed van meerdere microRNAs in een groot aantal monsters in een korte tijd. Hier tonen we de experimentele opstelling eennd protocol voor miRNA kwantificering van serum of plasma-EDTA monsters met probes gebaseerde chemie en drie verschillende platforms (96 putjes, microfluïdische en nanofluidics arrays) met toenemende doorvoer.

De aanbevolen volume voor een miRNA probe gebaseerde assay qPCR reactie 20 pl. OPMERKING: Wij hebben bevestigd dat een reactievolume van 5 ul kan zelfde resultaat bereikt met 20 gl volume 4,7,30 produceren. Het reactievolume op 5 ul verlagen zorgt voor een afname van 75% in reagens kosten zonder noemenswaardig verlies van gevoeligheid. Zoals weergegeven in figuur 2, reactievolume van 20 pl en 5 pl een sterke co-verhouding tot 39 cycli (met r2 van 0,92, p = 0.0002). Microfluidics matrix verschaft een middel om gegevens over 754 miRNAs uitgedrukt in een monster in ongeveer 5 uur (voor kaart A en kaart B), wat een efficiëntere manier van analyseren van meervoudige monsters in vergelijking met conventionele 96 putjes PCRs. We vergeleken miRNA microfluidica scala kaart voor hetzelfde monster (Monster A en Monster A repeat) Figuur 3A -. B toont een Bland-Altman plot (&lt;strong&gt; 3A) en Correlatie perceel (3B) voor alle 754 miRNAs getest voor deze monsters. Er zijn 3 verschillende miRNAs controle (U6, RNU44 en RNU48) willekeurig op zowel de kaarten (Kaart A en B) op meerdere locaties. Wanneer U6 cyclus drempelwaarde (Ct) waarden worden vergeleken tussen de 2 runs, we significante verschillen tussen de waarden (tabel 4) niet waarnemen. Het is ook belangrijk op te merken dat U6 wordt uitgedrukt op grotere overvloed (lagere Ct-waarde) in de beoordeelde monster. We vervolgens vergeleken alle miRNAs die Ct-waarden hebben tussen 0-19,99 in zowel de runs (n ​​= 150), die vergelijkbaar zijn met de expressie van miRNAs had overall met een co-efficiënte van de bepaling van de 98% (Figuur 3C-D). Van alle 277 miRNAs die Ct-waarden hebben tussen 20 en 29.99 in zowel de pistes, 16 miRs verschilde significant tussen de originele en herhaal runs (figuur 3E - F) Het aantal miRNAs met significant verschil betwee.n de runs toegenomen (89 van 327) als de Ct-waarden werden geselecteerd 30-40 voor beide runs (figuur 3G - H). De nanofluidics matrix platform levert gegevens 754 miRNAs van elk serum / plasma monster getest, zoals weergegeven in figuur 4A Het is belangrijk om deze versterking te bestuderen -. Zoals bij alle qPCR - zodat het resultaat indicatief waar amplificatie. Elk van de 48 subarrays (figuur 1) bevat ook een bepaling voor de drie meest populaire &quot;housekeeping&quot; ncRNAs. U6, RNU44 en RNU48 Figuur 4B illustreert een typische clustering van U6 replica van een enkel monster. Deze replica&#39;s te tonen lage standaarddeviatie (SD &lt;0,5) en zo zijn een indicator van de betrouwbaarheid. Alternatief Figuur 4C toont de verhoogde variabiliteit van U6 duplo (SD&gt; 0.5) in een tweede monster. Dit doet de geldigheid o niet ontkennenf de resterende assays, hoewel het noodzakelijk een grondiger kritiek. U6, zoals met de meeste &quot;housekeeping&quot; miRNAs in biologische vloeistoffen, kan een variabele expressie hebben. Opgemerkt moet worden dat één van de monsters, die in figuur 4C, wordt 4-voudig minder U6 inhoud dan die weergegeven in figuur 4B. Daar de U6 monster gepresenteerd 4C is 75% minder beginnen dan degene die in paneel 4B, is een verdergaande variabiliteit verwacht vanwege de Poisson verdeling van transcripten, die wordt verergerd door de kleine reactievolume 17. Een ander handig hulpmiddel is de Kwaliteitscontrole (QC) beelden, beschikbaar voor de export een keer de run is voltooid. Een selectie van deze toepassingen de fluorescentie van ROX, de passieve kleurstof in de qPCR reagens mengsel, te bevestigen dat elk doorgaand gat correct is geladen (figuur 5). Een through-hole, of zelfs een eigen<html> band subarray, kan niet laden vanwege onvoldoende monstervolume, verdamping, aanwezig in de putjes van de 384-wells monster plaat, het niet het monster plaat zegel, of gebreken volledig te verwijderen binnen de Accufill systeem of de tips bubbels. Elke gelost doorgaande gaten moeten worden geïdentificeerd aan de etikettering miRNAs te vermijden als &quot;niet op te sporen&quot;, terwijl in werkelijkheid de test werd nooit geladen. Als dit probleem wordt aangetroffen, bevestigt dat ten minste 5 ul van het monster / mastermix in elk putje van de 384-wells monster plaat is geplaatst, wordt het monster plaat behoorlijk voorafgaand gecentrifugeerd om het laden, de folie afdichting is volledig verwijderd, en de geladen OpenArray dia wordt afgesloten en lopen binnen de toegestane tijd voor alle opeenvolgende series. Als het laden problemen blijven bestaan, kunnen deze meer kans te worden met betrekking tot specifieke partij of het lot van de arrays of aanverwante verbruiksartikelen en verdere hulp gezocht moet worden door de fabrikant. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 52586 / 52586fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1: Lay-out van de monsters voor de Nanofluidics Array workflow: (A) Elke 384-wells monster plaat kan steekproeven houden voor maximaal 8 nanofluidics arrays. (B) Verwaterde, wordt voorversterkt cDNA geplaatst in 8 putten (2 kolommen met 4 rijen), met zwembad A en Poule B in aangrenzende 8-goed groepen. Elke cirkel staat voor een goed. (C) elk putje van de monsterplaat wordt in een submatrix van de nanofluidics matrix geladen. Elk klein vierkant vertegenwoordigt één subarray. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig2.jpg" /> Figuur 2: Co-verhouding analyse conventionele 96-wells PCR platforms: Co-verhouding van 20 pl en 5 pl reactievolume op TaqMan real-time qPCR met een standaard 96-putjesplaat platform CT waarden (39 cycli). We vergeleken 4 verschillende microRNAs (miR-375, miR-30c, miR-30d en miR-7) in 4 verschillende humaan serum en plasma monsters. Slechts 11 punten uitgezet omdat de anderen waren niet op te sporen. R 2 = 0,92, p = 0.0002. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig3.jpg" /> . Figuur 3: De doorgeven miRNA profilering behulp microfluidics serie kaarten met behulp van 2 microfluidics kaarten (kaart-A en kaart-B), wordt een profiel van 754 miRNAs gegenereerd (A - B). Zoals hier getoond, gebruikten we hetzelfde monster voor 2 microfluidics scala loopt naar de reproduceerbaarheid van de microfluidics kaart resultaten te controleren. We zagen een soortgelijke uitdrukking van miRNAs in het algemeen, met Ct-waarden tussen 0-19,99 (C - D). Er zijn weinig miRNAs (16 van 277) met Ct-waarden tussen 20-29,99 en significante verschillen tussen repeat runs (E - F). Negenentachtig van 327microRNA met hogere Ct-waarden (30-40) vertoonden significante verschillen tussen beide punten (G - H). &#160; De gegevens worden geanalyseerd met behulp van gepaarde T-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig4.jpg" /> Figuur 4: Vertegenwoordiger Profiel van PCR-product amplificatiecurven: Is een representatieve waarde van de gecombineerde (A) amplificatiecurven van alle miRNA doelen voor een menselijk plasma monster. Een assay voor U6 (a common control ncRNA) wordt in elke submatrix. Het monster in (B) vertoont een lage variabiliteit (SD &lt;0,5), terwijl (C) toont een hoge standaarddeviatie (SD&gt; 0,5) binnen U6 repliceert. Beide monsters zijn total RNA geïsoleerd uit menselijk plasma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig5.jpg" /> Figuur 5: QC Analyse van Nanofluidics Arrays: Kwaliteitscontrole (QC) beelden van een correct geplaatste nanofluidics array (links) en een verkeerd geladen nanofluidics array (rechts). De passieve kleurstof, ROX (aanwezig in de qPCR reagens mix), fluoresceert om een ​​correct geplaatste through-hole aan te geven. De array op de rechter heeft verschillende subarrays / doorgaande gaten die niet worden geladen met de qPCR reagens mix en deze moeten worden geïdentificeerd als vals-negatieve PCR-reacties. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Onderdelen </td><td> Volume per 5 ul reactie (pl) </td></tr&gt; <tr><td> RT buffer (10x) </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> dNTPs (100 mM) </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> RNase inhibitor </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> Nuclease-vrij water </td><td> 1.39 </td></tr><tr><td> Reverse transcriptase </td><td> 0,33 </td></tr><tr><td> Totale volume </td><td> 2.33 </td></tr></tbody></table> Tabel 1A: RT reagens mengsel componenten in een 5 pl RT-reactie voorbereiding TaqMan real-time qPCR met een standaard 96-putjesplaat platform. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Onderdelen </td><td> Volume per 5 ul reactie (pl) </td><td> Volume per 20 ul reactie (pl) </td></tr><tr><td> Snelle PCR mastermix (2x) </td><td> 2.5 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> TaqMan qPCR assay (20x) * </td><td> 0.25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Nuclease-vrijwater </td><td> 1.45 </td><td> 5.8 </td></tr><tr><td> Totaal Volume: </td><td> 4.2 </td><td> 16.8 </td></tr></tbody></table> * Testcomponent op basis van de geselecteerde miRNA getest. Tabel 1B: qPCR reagens mengsel componenten in een 5 of 20 ul qPCR reactie voorbereiding TaqMan real-time qPCR met een standaard 96-putjesplaat platform. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Onderdelen </td><td> Volume per reactie (pl) </td></tr><tr><td> Megaplex RT Primers (10x) </td><td> 0.8 </td></tr><tr><td> dNTP met dTTP (100 mM) </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> Multiscribe Reverse Transcriptase (50 U / ul) </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 10X RT Buffer </td><td> 0.8 </td></tr><tr><td> MgCl2 (25 mM) </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> RNase Inhibitor &amp; #<html> 160; (20 U / ul) </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> Nuclease-vrij Water </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> Totaal </td><td> 4.5 </td></tr></tbody></table> Tabel 2A: RT reagens mix componenten in een 5 pl RT-reactie voorbereiding op TLDA miRNA paneel. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Onderdelen </td><td> Volume per reactie (pl) </td></tr><tr><td> TaqMan PreAmp Mastermix (2x) </td><td> 12.5 </td></tr><tr><td> Megaplex PreAmp Primers (10x) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Nuclease-vrij water </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Totaal </td><td> 22.5 </td></tr></tbody></table> Tabel 2B: Voorversterking reagens mix componenten in een 25 ul pre-amplificatie reactie voorbereiding op TLDA miRNA paneel. &quot;Cellspacing =&quot; 0 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Onderdelen </td><td> Volume per reactie (pl) </td></tr><tr><td> Megaplex RT Primers (10x) </td><td> 0.75 </td></tr><tr><td> dNTP met dTTP (100 mM) </td><td> 0.15 </td></tr><tr><td> Multiscribe Reverse Transcriptase (50 U / ul) </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 10X RT Buffer </td><td> 0.75 </td></tr><tr><td> MgCl2 (25 mM) </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> RNase Inhibitor (20 U / ul) </td><td> 0.09 </td></tr><tr><td> Nuclease-vrij Water </td><td> 0.35 </td></tr><tr><td> Totaal </td><td> 4.5 </td></tr></tbody></table> Tabel 3A: RT reagens mengsel componenten in een 5 pl RT-reactie voorbereiding op probes gebaseerde nanofluidics miRNA panel. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Bestanddeels </td><td> Volume per reactie (pl) </td></tr><tr><td> TaqMan PreAmp Mastermix (2x) </td><td> 12.5 </td></tr><tr><td> Megaplex PreAmp Primers (10x) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Nuclease-vrij water </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Totaal </td><td> 22.5 </td></tr></tbody></table> Tabel 3B:. Voorversterking reagens mix componenten in een 25 ul pre-amplificatie reactie voorbereiding op-sonde gebaseerd nanofluidics miRNA panel OPMERKING: De interactieve aanvullende Excel-spreadsheets voorzien voor de drie platforms, al goed voor de 5% bijtelling te compenseren voor het pipetteren fout. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Monster A </td><td> Monster A repeat </td></tr><tr><td> 15,535 </td><td> 16,156 </td></tr><tr><td> 15,471 </td><td> 15,652 </td></tr><tr><td> 15.623 </td><td> 16,063 </td></tr><tr><td> 15,963 </td><td> 15,889 </td></tr><tr><td> 14,006 </td><td> 13,993 </td></tr><tr><td> 14,502 </td><td> 14,623 </td></tr><tr><td> 14,907 </td><td> 14,384 </td></tr><tr><td> 13,732 </td><td> 14,946 </td></tr></tbody></table> Tabel 4: De doorgeven miRNA U6 profileren met behulp van microfluidics scala kaart. Met behulp van twee microfluidics serie kaarten (A en B). Ct-waarden van U6 controle miRNA uit Monster A (totaal = 8). Consistente U6 controle miRNA overvloed waargenomen tussen de runs.

Circulerende microRNAs zijn onlangs naar voren gekomen als veelbelovend en nieuwe biomarkers voor verschillende vormen van kanker en andere ziekten. Het doel van dit artikel is om drie verschillende probes gebaseerde real-time PCR-platforms en methoden die beschikbaar zijn om te kwantificeren en te bepalen de overvloed aan circulerende microRNAs zijn te bespreken.

Probe-gebaseerde real-time PCR Benaderingen voor kwantitatieve meting van microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om drie verschillende sonde-gebaseerde real-time PCR-methoden te demonstreren die worden gebruikt voor het kwantificeren van micro RNA in plasma- en serummonsters. Sonde-gebaseerde real-time PCR wordt bereikt door hydrolyse en detectie van de fluorescerend gemerkte sonde, die een fluorescerende reporter en een quencher bevat. Wanneer de tack-polymerase zich vanuit de upstream-primer uitstrekt en het vijf-prime-uiteinde van de sonde bereikt, leidt dit tot een fysieke dissociatie van de fluorescerende emitter van de quencher.Vervolgens wordt een enkele molecuul van fluoro vier vrijgegeven, die wordt geregistreerd door de detector en gepresenteerd als een incrementele toename van het fluorescente signaal van die reactie. Uiteindelijk kan de hoeveelheid gegenereerd PCR-product worden gemeten op basis van de toename in fluorescentie, waardoor een nauwkeurige kwantificering van het versterkte doelwit wordt mogelijk. Deze methode ontwikkelt zich tot een veelbelovende methode voor het ontdekken van nieuwe biomarkers voor verschillende kankers en andere ziekten zoals diabetes.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de overvloed van micro RNA's in serum en plasma, kan deze ook worden toegepast op andere monsters zoals perifere cellen en weefsels. Een visuele demonstratie van dit protocol is van cruciaal belang, aangezien sommige van de stappen die betrokken zijn bij het afdichten van de nano fluidics array-slide moeilijk te leren zijn door simpelweg het protocol te lezen Voor sonde-gebaseerde real-time kwantitatieve PCR rijpe micro RNA-detectie bij 4,2 microliter van de individuele QPCR-reagensmengsels in elk putje van een optische 96-putjesplaat, gevolgd door 0,8 microliter van de juiste vers bereide CDNA-reactieoplossing. Verzegeld de plaat met de juiste optische deksel en start vervolgens de QPCR op het real-time PCR-systeem.Om een microfluïdische arraykaart voor te bereiden met een startinput van één tot 1000 nanogram totaal RNA, ontdooi eerst de pool A en B primers buffer, deoxy nucleotide fosfaten, magnesiumchloride en RNA's-remmer op ijs. Om vervolgens reverse transcriptie uit te voeren, verdeel 100 nanogram van elk RNA-monster in een pool A of pool B buis, gevolgd door de toevoeging van het juiste volume nuclease-vrij water om het totaalvolume in elke buis op drie microliter te brengen. Verdeel vervolgens 4,5 microliter van het juiste reverse transcriptiereagensmengsel in de bijbehorende buizen.Plaats vervolgens de monsters in de thermocycler en start de reverse transcriptie. Terwijl de reverse transcriptie vordert. Voor totale RNA-monsterinputs tussen één en 350 nanogram ontdooi het voorgedefinieerde pool van pre-amplificatieprimers op ijs wanneer de monsters klaar zijn, verdeel 22,5 microliter van het juiste preamp-reagens.Meng in de pool A en pool B buizen en voeg 2,5 microliter van het omgekeerde getranscripeerde CDNA-monster toe aan elk. Laad vervolgens de monsters in de thermocycler en start de preamp-cyclus. Aan het einde van de cyclus voegt u 75 microliter van 0,1 x tris EDTA-buffer toe aan de voorversterkte CDNA om de microfluïdische kaart te laden.Voeg vervolgens 450 microliter van QPCR-reagensmengsel toe aan negen microliter van de verdunde PREPL-versterkte CDNA voor kaart A, gebruik het PREPL-versterkte product dat is bereid met behulp van de primer pool A en voeg 441 microliter nuclease-vrij water toe aan een eindvolume van 900 microliter. Vervolgens, wanneer het de kamertemperatuur bereikt, verwijder de tack man lage dichtheidsarraykaart uit de verpakking en plaats deze met de foliezijde naar beneden op een schone plek. Voeg 100 microliter PCR-reactie toe.Meng in elk van de acht vulpoorten op de kaart. Draai de kaart een minuut lang op 331 GS en kamertemperatuur. Duw vervolgens in een langzame, gelijkmatige en enkele uniforme streek de koets door de kaart tot deze het eindpunt van de verzegelaar bereikt.Verwijder de verzegelde arraykaart en knip de reservoirs af. Bevestig vervolgens dat de juiste verwarmde blokdeksel en monsterdrager zijn geïnstalleerd in het microfluïdische array realtime PCR-systeem. Om de nano fluidic arrays te laden, ontdooi de verdunde prepl, versterkte CDNA en tack man realtime QPCR-reagens.Meng en meng de QPCR-reagensfles door te schudden. Voeg vervolgens 22,5 microliter van QPCR-reagensmengsel toe aan 22,5 microliter verdunde prepl, versterkte CDNA. Voeg vervolgens vijf microliter van elk monster toe in acht putjes van de nano fluidics array workflow 384-putjes monsterplaat, zorg ervoor dat de pool A en pool B van elk monster wordt geplaatst.In aangrenzende acht putjes wanneer alle monsters zijn overgebracht, bedek elk deel van de plaat met stukjes open array monsterplaatverzegeling. Ontdooi vervolgens de eerste nano fluidics array-slide tot kamertemperatuur na ongeveer 15 minuten. Bevestig dat de juiste blokbewerkingsdeksel en monsterdrager zijn geïnstalleerd in het nano fluidics array-systeem en ontgrendel vervolgens de plunjer van de onderdompeling vloeistof spuit met zachtjes trekken.Verwijder de dop, plaats de punt op zijn plaats en spoel de lucht uit de punt. Plaats vervolgens de laadsysteemtips binnen het laadsysteem. Open het deksel en plaats de monsterplaat in het laadsysteem.Trek nu een paar goed passende handschoenen aan. Open voorzichtig de pakking van de slide en giet de slide langzaam uit de verpakking zonder de bovenkant aan te raken. Plaats de slide in het laadsysteem met de streepjescode aan de linkerkant.Verwijder vervolgens de verzegelaar van het gedeelte van de monsterplaat dat bedoeld is voor het laden en gebruik de laadsysteemsoftware om de slide streepjescode, slidepositie, monsterpositie en tipconfiguratie in te voeren. Terwijl de slide wordt geladen, verwijdert u het heldere en rode plastic van de onderkant van het slidedeksel. Verwijder vervolgens voorzichtig en verzegel de slide binnen 90 seconden na het einde van het laadproces.Plaats de slide binnen de platenklem en het slidedeksel op de slide gedurende 30 seconden om te bevestigen dat het deksel zo is gepositioneerd dat de streepjescode correct wordt weergegeven. Plaats vervolgens de onderdompeling vloeistof spuit binnen

probe-based-real-time-pcr-approaches-for-quantitative-measurement

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We zullen aantonen de opzet en analyse van pre-microRNA 96-wells-arrays voor QPCR het gebruik van een robot als door de hand met een Thermo Scientific Matrix multichannel pipet.

Profilering van de Pre-micro-RNA&#39;s en microRNA&#39;s met behulp van kwantitatieve real-time PCR (qPCR) arrays

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde multiplex reverse transcriptase kwantitatieve PCR (qRT-PCR)-protocol in combinatie met een microfluïdisch platform als een kost en tijd efficiënte high-throughput screening tool voor microRNA (miRNA) expressie niveaus, in het bijzonder bij het werken met beperkte hoeveelheden van het monster.

High Throughput MicroRNA Profiling: Geoptimaliseerd Multiplex qRT-PCR op nanoliter Schaalverdeling op de Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCS

Kwantitatieve Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is een snelle en gevoelige methode om de expressie niveaus van verschillende microRNA (miRNA) moleculen te onderzoeken in tumor monsters. Met deze methode uitdrukking van honderden verschillende miRNA-moleculen kunnen worden versterkt, gekwantificeerd en geanalyseerd uit dezelfde cDNA sjabloon.

MicroRNA Detectie in prostaattumoren op Kwantitatieve Real-time PCR (qPCR)

We beschrijven een protocol van real time PCR om microRNA profileren in de cerebrospinale vloeistof (CSF). Met uitzondering van RNA-extractie protocollen kan de procedure worden uitgebreid tot RNA geëxtraheerd uit andere lichaamsvloeistoffen, gekweekte cellen of weefselmonsters.

Cerebrospinale vloeistof MicroRNA Profiling Met behulp van kwantitatieve real time PCR

Moleculaire signalering via zowel oestrogeen en microRNA's zijn cruciaal in de ontwikkeling en de groei van borstkanker. Oestrogeen activeert de oestrogeenreceptoren die transcriptiefactoren. Veel transcriptiefactoren kan de expressie van microRNA's te reguleren, en oestrogeen-gereguleerde microRNA kunnen worden geprofileerd met behulp van verschillende grootschalige technieken.

Profilering van oestrogeen-gereguleerde MicroRNA in borstkankercellen

Er wordt een gevoelige en nauwkeurige methode beschreven voor de kwantificering van celvrije microRNA's met behulp van een kleurstof-gebaseerde chemie en druppel digitale PCR-technologie.

Circulerende MicroRNA Kwantificering Met behulp van DNA-bindende Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Dit verslag beschrijft een protocol voor het meten van de absolute niveaus van plasma miRNA, kwantitatieve real-time omgekeerde transcriptie PCR gebruiken met of zonder voorafgaande versterking. Dit protocol biedt een beter begrip van de hoeveelheid plasma miRNAs en laat de kwalitatieve beoordeling van de bijbehorende gegevens uit verschillende studies of laboratoria.

Absolute kwantificering van Plasma MicroRNA niveaus bij Cynomolgus apen, met behulp van kwantitatieve Real-time omgekeerde transcriptie PCR

Hier, wordt een kwantitatief real-time op de kettingreactie-gebaseerd protocol van de polymerase voorgesteld voor de bepaling van de inheemse micro-RNA inhoud (absoluut/verwant) van lipoprotein deeltjes. Bovendien is een methode voor het verhogen van het micro-RNA-niveau, evenals een methode voor het bepalen van de cellulaire opnamesnelheid van lipoprotein deeltjes, aangetoond.

Verrijking van native lipoprotein deeltjes met microRNA en daaropvolgende bepaling van hun absolute/relatieve microRNA inhoud en hun cellulaire overdrachtssnelheid

Dit protocol maakt gebruik van een sonde-gebaseerde real-time polymerase kettingreactie (PCR), een sulforhodamine B (SRB) Assay, 3 ' onvertaalde gebieden (3 ' UTR) klonen, en een plaats assay om de doel genen van een Mirna van belang te controleren en om de functies van miRNAs te begrijpen.

Een in vitro protocol voor het evalueren van MicroRNA-niveaus, functies en geassocieerde doel genen in tumor cellen

Hier beschrijven we een stapsgewijze strategie voor het isoleren van kleine Rna's, verrijkend voor Microrna's en het voorbereiden van samples voor sequentiëren met hoge doorvoer. Vervolgens beschrijven we hoe u de volgorde leest en lijnt u deze uit op microRNAs met behulp van open source tools.

Een complete pijplijn voor het isoleren en Sequentiëren van Microrna's en het analyseren ervan met open source tools

Het protocol beschrijft een tandem-immunofluorescentiehybridisatietest met in formaline gefixeerd in paraffine ingebed weefsel om microRNA en gemultiplexte eiwitten tegelijkertijd te detecteren en te kwantificeren.

MicroRNA-amplificatie en -herkenning door middel van locked-nucleic-acid in situ hybridisatie als een nieuwe detectie- en kwantificeringsmethode

Leer drie probe-gebaseerde real-time PCR-methoden voor kwantitatieve meting van microRNAs in plasma en serum. Deze technieken ondersteunen biomarkeronderzoek voor ziekten zoals kanker en diabetes.

Probe-gebaseerde real-time PCR Benaderingen voor kwantitatieve meting van microRNAs

Meer video's verkennen