Probe-gebaseerde real-time PCR Benaderingen voor kwantitatieve meting van microRNAs

Het algemene doel van het volgende experiment is om drie verschillende sonde-gebaseerde real-time PCR-methoden te demonstreren die worden gebruikt voor het kwantificeren van micro RNA in plasma- en serummonsters. Sonde-gebaseerde real-time PCR wordt bereikt door hydrolyse en detectie van de fluorescerend gemerkte sonde, die een fluorescerende reporter en een quencher bevat. Wanneer de tack-polymerase zich vanuit de upstream-primer uitstrekt en het vijf-prime-uiteinde van de sonde bereikt, leidt dit tot een fysieke dissociatie van de fluorescerende emitter van de quencher.

Vervolgens wordt een enkele molecuul van fluoro vier vrijgegeven, die wordt geregistreerd door de detector en gepresenteerd als een incrementele toename van het fluorescente signaal van die reactie. Uiteindelijk kan de hoeveelheid gegenereerd PCR-product worden gemeten op basis van de toename in fluorescentie, waardoor een nauwkeurige kwantificering van het versterkte doelwit wordt mogelijk. Deze methode ontwikkelt zich tot een veelbelovende methode voor het ontdekken van nieuwe biomarkers voor verschillende kankers en andere ziekten zoals diabetes.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in de overvloed van micro RNA's in serum en plasma, kan deze ook worden toegepast op andere monsters zoals perifere cellen en weefsels. Een visuele demonstratie van dit protocol is van cruciaal belang, aangezien sommige van de stappen die betrokken zijn bij het afdichten van de nano fluidics array-slide moeilijk te leren zijn door simpelweg het protocol te lezen Voor sonde-gebaseerde real-time kwantitatieve PCR rijpe micro RNA-detectie bij 4,2 microliter van de individuele QPCR-reagensmengsels in elk putje van een optische 96-putjesplaat, gevolgd door 0,8 microliter van de juiste vers bereide CDNA-reactieoplossing. Verzegeld de plaat met de juiste optische deksel en start vervolgens de QPCR op het real-time PCR-systeem.

Om een microfluïdische arraykaart voor te bereiden met een startinput van één tot 1000 nanogram totaal RNA, ontdooi eerst de pool A en B primers buffer, deoxy nucleotide fosfaten, magnesiumchloride en RNA's-remmer op ijs. Om vervolgens reverse transcriptie uit te voeren, verdeel 100 nanogram van elk RNA-monster in een pool A of pool B buis, gevolgd door de toevoeging van het juiste volume nuclease-vrij water om het totaalvolume in elke buis op drie microliter te brengen. Verdeel vervolgens 4,5 microliter van het juiste reverse transcriptiereagensmengsel in de bijbehorende buizen.

Plaats vervolgens de monsters in de thermocycler en start de reverse transcriptie. Terwijl de reverse transcriptie vordert. Voor totale RNA-monsterinputs tussen één en 350 nanogram ontdooi het voorgedefinieerde pool van pre-amplificatieprimers op ijs wanneer de monsters klaar zijn, verdeel 22,5 microliter van het juiste preamp-reagens.

Meng in de pool A en pool B buizen en voeg 2,5 microliter van het omgekeerde getranscripeerde CDNA-monster toe aan elk. Laad vervolgens de monsters in de thermocycler en start de preamp-cyclus. Aan het einde van de cyclus voegt u 75 microliter van 0,1 x tris EDTA-buffer toe aan de voorversterkte CDNA om de microfluïdische kaart te laden.

Voeg vervolgens 450 microliter van QPCR-reagensmengsel toe aan negen microliter van de verdunde PREPL-versterkte CDNA voor kaart A, gebruik het PREPL-versterkte product dat is bereid met behulp van de primer pool A en voeg 441 microliter nuclease-vrij water toe aan een eindvolume van 900 microliter. Vervolgens, wanneer het de kamertemperatuur bereikt, verwijder de tack man lage dichtheidsarraykaart uit de verpakking en plaats deze met de foliezijde naar beneden op een schone plek. Voeg 100 microliter PCR-reactie toe.

Meng in elk van de acht vulpoorten op de kaart. Draai de kaart een minuut lang op 331 GS en kamertemperatuur. Duw vervolgens in een langzame, gelijkmatige en enkele uniforme streek de koets door de kaart tot deze het eindpunt van de verzegelaar bereikt.

Verwijder de verzegelde arraykaart en knip de reservoirs af. Bevestig vervolgens dat de juiste verwarmde blokdeksel en monsterdrager zijn geïnstalleerd in het microfluïdische array realtime PCR-systeem. Om de nano fluidic arrays te laden, ontdooi de verdunde prepl, versterkte CDNA en tack man realtime QPCR-reagens.

Meng en meng de QPCR-reagensfles door te schudden. Voeg vervolgens 22,5 microliter van QPCR-reagensmengsel toe aan 22,5 microliter verdunde prepl, versterkte CDNA. Voeg vervolgens vijf microliter van elk monster toe in acht putjes van de nano fluidics array workflow 384-putjes monsterplaat, zorg ervoor dat de pool A en pool B van elk monster wordt geplaatst.

In aangrenzende acht putjes wanneer alle monsters zijn overgebracht, bedek elk deel van de plaat met stukjes open array monsterplaatverzegeling. Ontdooi vervolgens de eerste nano fluidics array-slide tot kamertemperatuur na ongeveer 15 minuten. Bevestig dat de juiste blokbewerkingsdeksel en monsterdrager zijn geïnstalleerd in het nano fluidics array-systeem en ontgrendel vervolgens de plunjer van de onderdompeling vloeistof spuit met zachtjes trekken.

Verwijder de dop, plaats de punt op zijn plaats en spoel de lucht uit de punt. Plaats vervolgens de laadsysteemtips binnen het laadsysteem. Open het deksel en plaats de monsterplaat in het laadsysteem.

Trek nu een paar goed passende handschoenen aan. Open voorzichtig de pakking van de slide en giet de slide langzaam uit de verpakking zonder de bovenkant aan te raken. Plaats de slide in het laadsysteem met de streepjescode aan de linkerkant.

Verwijder vervolgens de verzegelaar van het gedeelte van de monsterplaat dat bedoeld is voor het laden en gebruik de laadsysteemsoftware om de slide streepjescode, slidepositie, monsterpositie en tipconfiguratie in te voeren. Terwijl de slide wordt geladen, verwijdert u het heldere en rode plastic van de onderkant van het slidedeksel. Verwijder vervolgens voorzichtig en verzegel de slide binnen 90 seconden na het einde van het laadproces.

Plaats de slide binnen de platenklem en het slidedeksel op de slide gedurende 30 seconden om te bevestigen dat het deksel zo is gepositioneerd dat de streepjescode correct wordt weergegeven. Plaats vervolgens de onderdompeling vloeistof spuit binnen