Imaging Ca

Het algemene doel van deze procedure is het registreren van door lichtstimulatie opgewekte calciumsignalen van kegelfotoreceptoren in het netvlies van de muis met behulp van een fluorescerende biosensor. Dit wordt bereikt door het netvlies te isoleren van een transgene muizenlijn die een genetisch gecodeerde calciumsensor uitsluitend in de kegelfotoreceptoren tot expressie brengt. De tweede stap is het maken van verticale coupes van het netvliesweefsel.

Vervolgens worden de retinale coupes op dekglasplaatjes gemonteerd en onder een tweefotonmicroscoop geplaatst. De laatste stap is het registreren van calciumsignalen van de individuele synaptische terminalen van kegelcellen als reactie op lichtstimulatie. Uiteindelijk worden de geregistreerde calciumsignalen offline geanalyseerd.

Met deze methode kunnen we de activiteit van veel fotoreceptoren in maïs gelijktijdig registreren met subcellulaire resolutie. Dit is het belangrijkste voordeel ten opzichte van bestaande technieken, zoals elektrische registraties van individuele cellen, die moeilijker zijn en meer tijd in beslag nemen. De vraag die we daarom willen beantwoorden is of en hoe calcium betrokken is bij de degeneratie van fotoreceptoren.

Met deze methode kunnen we bepalen of de instroom van calcium de degeneratie van fotoreceptoren veroorzaakt of dat dit een gevolg is van het afsterven van de cel. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode vooral moeite hebben omdat de lichtgevoeligheid van het netvlies behouden moet blijven; daarom moeten alle delicate stappen, inclusief de dissectie van het netvlies en het snijden in plakjes, onder groen of rood licht worden uitgevoerd. Om met deze procedure te beginnen, brengt u een muisog over naar een Petrischaal met vers carbogengeoxygeneerde extracellulaire oplossing.

Doorboor de oogbol op een willekeurig punt langs de grens tussen het hoornvlies en de sclera met een scherpe injectienaald. Houd vervolgens het oog bij de sclera vast met een pincet en voer voorzichtig één schaarblad in het gat in. Knip langs de ora serrata om het voorste gedeelte van het oog te scheiden van de oogbeker.

Snijd vervolgens de oogbeker radiaal door op de positie van de penmarkering om de dorsale positie op het netvlies aan te geven. Positioneer de oogbeker vervolgens zodanig dat de dorsale snede naar buiten wijst. Pak de sclera aan de linker- en rechterzijde van de oogbeker vast door de pincetpunten tussen het netvlies en de sclera te plaatsen.

Los vervolgens het netvlies los door het sclera-gedeelte van de iica voorzichtig om te keren. Snijd tot slot de oogzenuw door om het netvlies van de sclera te bevrijden. Houd de rand van het netvlies vast met een pincet en verwijder voorzichtig debris en het glasachtig lichaam van het netvliesoppervlak met een tweede pincet.

Wanneer het netvliesoppervlak schoon is, worden er drie extra kortere radiale sneden gemaakt. Dompel nu langzaam een glazen objectglas in de extracellulaire oplossing vlakbij het weefsel. Trek het netvlies voorzichtig met de ganglioncellzijde naar boven op het objectglas door de rand vast te pakken, om mechanische schade en vouwing van het weefsel te verminderen.

Snijd vervolgens met een gebogen scalpellames een rechthoek van ongeveer één bij twee millimeter uit het geselecteerde retina-gebied en veeg overtollige oplossing rond het weefsel weg. Plaats daarna het vooraf geprepareerde nitrocellulose-vezelmembraan bovenop het retinastukje, zodanig dat de zijde van de ganglioncellen aan het membraan hecht. Voeg onmiddellijk een druppel extracellulair medium toe aan het membraan om het weefsel er stevig aan te bevestigen.

Breng het op het membraan gemonteerde retinaweefsel over naar de snijkamer die verse extracellulaire oplossing bevat. Snijd de retina vervolgens in verticale coupes van 200 micrometer dikte. Gebruik een weefselhakker om een enkele op het membraan gemonteerde coupe vast te lijmen op een glazen dekglas dat vooraf is behandeld met hoogvacuümvet.

Houd het glazen oppervlak onder het netvlies en vrij van vet. Voeg daarna een druppel extracellulaire oplossing toe aan elke op een dekglas gemonteerde slice in de holdingkamer bij kamertemperatuur. Introduceer carbogeen in de kamer door een klein waterreservoir te beluchten om de atmosfeer in de holdingkamer bevochtigd te houden.

Laat de coupes 10 tot 15 minuten rusten in de bewaarkamer voordat u ze één voor één overbrengt naar de registratiekamer. Breng een coupe over van de bewaarkamer naar de registratiekamer en start onmiddellijk met het perfunderen ervan met een gecarboniseerde extracellulaire oplossing. Handhaaf een perfusiesnelheid van 2 mL per minuut en een temperatuur van 37 °C.

In de registratiekamer. Gebruik een 20 x 0,95 NA waterimmersie-objectief en een CCD-camera in combinatie met een infrarood-led onder de registratiekamer. Om het retina-coupe te lokaliseren, start u het tweefoton-beeldvormingssysteem volgens de instructies van de fabrikant.

Zet vervolgens de laser aan en stel deze in op 860 nanometer. Schakel de twee detectiekanalen in voor fluorescentie-imaging van ECFP en citrine. Bedien daarna de tweefotonmicroscoop via de software voor beeldacquisitie om een rij kegeltreminals te scannen en te selecteren voor registratie; stel de beeldacquisitie in op afbeeldingen van 128 bij 16 pixels of een soortgelijke configuratie, en beperk het gescande gebied tot de kegeltreminals om bleken van fotopigmenten in de buitensegmenten te voorkomen.

Zet de laser aan. Laat de kegeltjes 20 tot 30 seconden wennen aan de scanlaser en het achtergrondlicht van de stimulus voordat er lichtstimuli worden gepresenteerd of farmacologische middelen worden toegediend. Start nu de presentatie van de willekeurige stimuli.

De stimuli worden gegenereerd door de intensiteit van de twee LED's in de tijd te moduleren, met behulp van een microprocessorbord dat wordt aangestuurd door op maat gemaakte software. Start vervolgens de gelijktijdige opname van de twee fluorescentiekanalen met de respectievelijke software voor beeldacquisitie. De opnames waren gericht op de synaptische terminals van kegelfotoreceptoren in de retinale coupes.

Dit is een voorbeeld van een geregistreerde regio met zeven individuele terminals. Fluorescentie werd geregistreerd met behulp van twee kanalen, één voor de fre scepter citrine en één voor de fret donor.ECFP. Hier worden de door licht opgewekte veranderingen in citrine- en ECFP-fluorescentie getoond die zijn geregistreerd in een enkele regio van interesse.

En hier zijn de calciumresponsen van een kegeltreminaal op een reeks heldere lichtflitsen van één seconde met intervallen van vijf seconden. Deze figuur toont de voorbeeldmatige kwantitatieve analyse van licht-evokeerde calciumresponsen van kegeltjes. En hier zijn de licht-evokeerde calciumresponsen van een enkele kegeltreminaal.

Deze figuur toont de bepaling van de gemiddelde calciumrespons. Het rustniveau van calcium vertegenwoordigt de baseline voorafgaand aan de lichtstimulatie en de grootte van de respons is ra, wat het oppervlak is tussen het rustniveau van calcium en de piekamplitude, en tussen de kinetiek van het begin en het einde van de respons. Deze procedure kan verder worden uitgebreid.

Fotoreceptor-calciumsignalen kunnen bijvoorbeeld significant zijn onder diverse farmacologische omstandigheden en bij sterke stimulatie, wat nuttig is voor het onderzoeken van adaptatie of het gedetailleerd bestuderen van verschillende stappen van fototransductie. Deze techniek maakt het mogelijk om calciumedynamiek in kegelfotoreceptoren onder normale fysiologische omstandigheden te onderzoeken. Dit is bijzonder relevant voor het begrijpen van primaire en secundaire degeneratie van kegelfotoreceptoren bij menselijke blindmakende ziekten zoals achromatopsie of retinitis pigmentosa.