Visualisatie van

Het algemene doel van het volgende experiment is om een reproduceerbaar protocol te demonstreren voor de vorming van ESMO-cardiale micro-laesies in het hart van geïnfecteerde muizen. Dit wordt bereikt door muizen te infecteren met ESMO en de ontwikkeling van bacteriëmie toe te staan, waardoor bacteriën toegang krijgen tot de cardiale vasculatuur waar zij het myocard kunnen invallen en microscopische laesies kunnen vormen. Vervolgens worden de harten ofwel in paraffine ingebed en conventioneel gekleurd, of gefixeerd in OCT-compound voor immunofluorescente kleuring.

Evaluatie van de gekleurde coupes kan cardiale microlesies tonen die willekeurig over het myocard zijn verdeeld, collageendeposities en herstellende myocardsecties en pneumokokkenkapsels binnen de cardiale microlesie, wat de procedure demonstreert. Is Armand Brown een promovendus in mijn laboratorium? Deze methode kan echter inzicht bieden in de cardiale beschadigende effecten van S. pneumoniae tijdens invasieve pneumokokkenziekte bij muizen.

Het kan ook worden toegepast op hartstalen van andere systemen, zoals niet-menselijke primaten of mensen. Begin met het kweken van de ESMO Serotype four stam Tiger four in Todd Hewitt-bouillon tot een optische dichtheid van 0,5 bij 620 nanometer. Wanneer de juiste dichtheid is bereikt, wordt de cultuur gecentrifugeerd bij 3.500 G gedurende 10 minuten om een pellet te vormen.

Verwijder vervolgens het supernatant met een vacuümlijn en resuspendeer de bacteriën in steriele PBS op 10.000 colony forming units per milliliter. Anestheseer nu valve C-muizen van 10 tot 12 weken oud en bevestig de anesthesietoestand met een zachte kneep in de teen met een stompe pincet, vul een spuit met de bacteriesuspensie en bevestig een naald van 27 tot 30 gauge. Pak vervolgens een geanestheseerde muis met één hand in de nek vast, terwijl u met de andere hand 100 microliters van de suspensie intraperitoneaal injecteert, en plaats elke muis terug in de kooi.

De muizen worden doorgaans 30 tot 40 seconden na de injectie wakker. Het nauwkeurig bepalen van de dosis S. pneumonia is cruciaal, anders kunnen de muizen herstellen van de infectie of kan er te snel een invasieve pneumokokkenziekte ontstaan voordat er laesies kunnen ontwikkelen. Omdat elke bacteriële stam verschillende virulentieniveaus heeft, kan het via vallen en opstaan gaan om de juiste dosis te bepalen.

Laat de infectie gedurende ten minste 24 uur voortschrijden voor een vroeg stadium, of tot 30 uur voor een gevorderd stadium van de infectie. Euthanaseer vervolgens elke geïnfecteerde muis. Neem eerst een bloedmonster door de staart te desinfecteren met een alcoholswab en een sectie van twee tot drie millimeter af te knippen.

Neem twee microliters bloed af van de knipplaats. Verdun het bloed serieel tienvoudig in PBS met natriumheparine met een concentratie van one unit per milliliter. Plaats vijf verdunningsniveaus op triptisch soja-bloedagarplaten en incubeer deze gedurende één nacht.

Voer de volgende dag kolonietellingen uit. Ga over tot het oogsten van het hart zoals beschreven in de volgende sectie. Alternatief kan dit 30 uur na infectie gebeuren.

Probeer de muis te redden door ampicilline intraperitoneaal toe te dienen in 100 µL zoutoplossing. Ga door met het toedienen van ampicilline elke 12 uur gedurende 36 uur en neem de harten af op de gewenste tijdstippen. Oogst eerst het hart.

Immobiliseer de geëuthanaseerde muis in rugligging op een chirurgisch platform, bespuit de borstkas met 70% ethanol en dep deze droog. Open de borstholte met een chirurgische schaar en een pincet. Verwijder de borstkas en doorsnij het diafragma om het hart en de longen bloot te leggen.

Snij vervolgens de bloedvaten door die met het hart verbonden zijn en gebruik een pincet om het hart voorzichtig uit te snijden zonder beschadigingen te veroorzaken. Spoel het hart met PBS en plaats het in een cassette voor weefselmonsters voor coronale doorsneden. Breng de cassettes vervolgens over naar een 10% gebufferde formalinesolutie en stuur deze de volgende dag door voor paraffine-inbedding.

In vroege stadia kunnen hartlaesies worden geïdentificeerd aan hun kleurverandering en, in sommige gevallen, aan de aanwezigheid van immuuncellen. In gevorderde laesies zijn immuuncellen afwezig en groot. In hun plaats worden VA-achtige laesies aangetroffen.

Bevries eerst hartcoupes van vijf micron op positief geladen glasplaatjes, ontdooi deze vervolgens en laat ze aan de lucht drogen. Fixeer de plaatjes 10 minuten in 10% neutraal gebufferde formaline bij 25 graden Celsius. Verwijder daarna het fixatief door drie keer vijf minuten te wassen met PBS.

Maak het weefsel vervolgens permeabel met 0,2% Triton X-100 in PBS gedurende 15 minuten. Verwijder het detergent door drie keer extra te wassen met pure PBS. Blok daarna het weefsel met 10% coat-serum in PBS gedurende een uur; na een spoeling met PBS wordt de sectie gedurende twee uur bij 37 graden Celsius behandeld met antiserum.

Behandel negatieve controles met naïef konijnenantiserum. Omdat hartweefsel de XI-immunofluorescentiekleurstof gemakkelijk absorbeert, wat leidt tot hoge achtergrondwaarden, moet de concentratie en incubatietijd voor verschillende typen antilichamen waarschijnlijk worden geoptimaliseerd. Was het antiserum twee uur later weg met PBS. Vervang vervolgens de oplossing door een secundair antilichaam en laat de coupes 30 minuten incuberen bij 37 °C. Breng nu DPI aan in een concentratie van 5 mg/mL en was de coupes met PBS.

Monteer ten slotte de preparaten in een medium, bewaar deze en beeld ze af met confocale microscopie. Begin met het verwijderen van de paraffine en het hydrateren van de weefselcoupes. Gebruik xyleenwassingen gevolgd door een reeks alcoholwassingen met een afnemende concentratie.

Bad de coupes vervolgens vijf minuten in 0,2% fosfomolybdeenzuur, gevolgd door een spoeling met water van vijf minuten; kleur daarna twee uur met 0,1% Sirius Red en picrinezuur. Was de coupes vervolgens drie minuten in 0,01 N zoutzuur en spoel ze een minuut in 70% ethanol. Dehydrateer de coupes nu door de reeks alcoholbaden in omgekeerde volgorde te doorlopen, gevolgd door wassingen met xyleen; monteer de coupes en evalueer de preparaten met lichtmicroscopie.

Muizen ontwikkelden een invasieve pneumokokkenziekte na een challenge met de tiger-vier-stam. In de ventrikels werden cardiale micro-laesies waargenomen en er werd een toename van de grootte en het aantal laesies genoteerd tussen 24 en 30 uur na infectie. Om te controleren of S. pneumoniae zich inderdaad in de laesies bevonden, werden coupes gekleurd voor het capsulair polysaccharide van serotype vier geproduceerd door Tiger vier.

Dit bevestigde de aanwezigheid van dicht opeengepakte en compacte aggregaten binnen de microlesieplaatsen. Piro serious red-kleuring werd uitgevoerd op hartsecties van muizen die met ampicilline waren gered en onbeïnvloede controles. Bij de geredde dieren.

Er was een dramatische toename in de aanwezigheid en intensiteit van de kleuring, met banden die uitvloeiden vanuit wat leken te zijn op voormalige laesieplaatsen in de ventrikels. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken de muizen te infecteren met voldoende S pneumonia zodat de infectie gedurende ten minste 28 tot 30 uur kan voortschrijden, zodat bacteriëmie en cardiale micro-laesies voldoende tijd hebben om zich te vormen.