Name: Visualisatie van Streptococcus pneumoniae Binnen Cardiac microverwondingen en Latere Cardiac Remodeling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Ontdek een protocol voor visualisatie van Streptococcus pneumoniae in cardiale microverwondingen bij muizen. Deze methode toont bacteriële invasie en myocardiale schade via immunofluorescentie en histologische kleuring.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidie 13IRG14560023 van de American Heart Association en NIH-subsidies AI078972 en HL108054 aan CJO. Ondersteuning voor AOB kwam van het NIH National Center for Advancing Translational Sciences NIH ULTR001120 en F31 A110417701.

OPMERKING: Alle muis experimenten werden beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Commissies goedgekeurd aan de Universiteit van Texas Health Science Center in San Antonio (protocol # 13032-34-01C). Dierenverzorging en experimentele protocollen gehandeld op grond van Public Law 89-544 (Animal Welfare Act) en de bijbehorende amendementen, GGD richtlijnen, en de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren (US Department of Health &amp; Human Services). 1. Infectie <ol><li> Verkrijgen BALB / c muizen van beide geslachten tussen de leeftijd van 10-12 weken. OPMERKING: S. pneumoniae stam TIGR4 serotype 4 is een virulent klinisch isolaat dat gesequenced 16. </li><li> Groei TIGR4 in Todd-Hewitt bouillon bij 37 ° C in 5% CO2 tot aan een optische dichtheid (OD) 620 0,5 (overeenkomend met 1,0 x 10 8 kolonievormende eenheden [CFU] / ml). Pellet de pneumococcen kweek door centrifugatie gedurende 10 min bij 3, 500 xg en verwijder het supernatant met behulp van een vacuüm lijn. Suspendeer en verdun bacteriën met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tot een eindconcentratie van 1,0 x 10 4 CFU / ml. </li><li> Met behulp van een inductie kamer, verdoven muizen met 2,5% verdampt isofluraan in zuurstof. Bevestig verdoofde toestand door zachte teen knijpen met stompe pincet. <ol><li> Houd de verdoofde muis door het nekvel en rechtop met enerzijds injecteren elke muis intraperitoneaal (ip) met 100 ul van het S. pneumoniae suspensie op met een spuit met een 27-30 gauge naald (overeenkomend met een provocatiedosis van 1,0 x 10 3 CFU). Plaats de muis terug in zijn kooi. Muizen meestal ontwaken 30-40 sec na de injectie. </li></ol></li><li> Laat de infectie verlopen gedurende ten minste 24 (vroeg) of 30 (advanced) hr. <ol><li> Euthanaseren de muizen door CO 2 stikken. Voeren cervicale dislocatie aan de muis te garanderen is overleden. Euthanasie wordt verder bevestigd door het verwijderenvan het hart in stap 1.6. </li></ol></li><li> Ontsmet de staart met een alcoholdoekje en knip een paragraaf 2-3 mm. Verzamel 2 pl bloed en serieel verdund bloed 10-voudig in PBS bevattende natriumheparine 1 U / ml vijfmaal. Plaat seriële verdunningen op tryptische soja-agar plaat en incubeer overnacht bij 37 ° C in 5% CO 2. De volgende dag extrapoleren kolonie telt het niveau van bacteremia. </li><li> Immobiliseren van de muis in een liggende positie op een chirurgische platform. Spray de borst met 70% ethanol en dep ze droog. Met behulp van chirurgische schaar en pincet open de borstholte, verwijder de ribbenkast, en doorsnijden het membraan naar het hart en de longen bloot. Met behulp van een schaar knippen de bloedvaten verbonden met het hart en zachtjes accijnzen het hart met zorg om te voorkomen blauwe plekken met een pincet. </li><li> Spoel het hart met PBS en vervolgens te plaatsen in weefselmonster collectie cassettes zodanig dat coronale secties zouden worden verkregen tijdens het weefsel snijden. Voor inbedden in paraffine, place cassettes in 10% gebufferde formaline-oplossing en de volgende dag te sturen voor paraffine inbedding. <ol><li> Als alternatief flash freeze behulp oktober Compound binnen een cryomold die op droog ijs geplaatst. </li></ol></li></ol> 2. Visualisatie van hartlesies en Pneumokokken binnen Letsels <ol><li> Verminder paraffine ingebedde secties hart zodat de 4 hartkamers zichtbaar in elke sectie weefsel. Snij slides bij een dikte van 5 urn. </li><li> Deparaffinize en vlek dia&#39;s met hematoxyline en eosine (H &amp; E) met behulp van standaard methoden 17. </li><li> Bekijk H &amp; E gekleurde cardiale secties met behulp van een lichtmicroscoop bij lage (100X, 200X) en hoge (olie-immersie: 400X, 1000x) vergrotingen. Karakteriseren harten voor de aanwezigheid van microverwondingen in het myocardium. Hier verwerven H &amp; E beelden met behulp van een Zeiss Axioskop 2 microscoop uitgerust met een 100X 1,3 numerieke opening Plan-Neofluar doelstelling. OPMERKING: in een vroeg stadium cardiale lesions gediscrimineerd door hun differentiële gekleurde uiterlijk en in sommige gevallen de aanwezigheid van immuuncellen (monocyten en granulocyten) schijnbaar monocyten zijn. In geavanceerde laesies, met name gezien bij 30 uur, immuuncellen afwezig zijn en grote vacuole-achtige laesies worden waargenomen in hun plaats. Het is belangrijk op te merken dat terwijl immuuncel instroom gedurende de vroege stadia van cardiale laesie ontwikkeling optreden blijkt niet een eis. </li></ol> 3. Immunofluorescente Microscopie voor Pneumokokken binnen microverwondingen <ol><li> Sectie hart in cryomolds met microtoom tot een dikte van 5 pm en plaats delen op positief geladen glasplaatjes. Laat bevroren cardiale secties te ontdooien en aan de lucht drogen. Fix secties gedurende 10 minuten in 10% neutraal gebufferd formaline (pH 6,8-7,2 bij 25 ° C). </li><li> Was slides (3x) in PBS gedurende 5 min, doorlaatbaar voor 15 min in 0,2% Triton X-100 in PBS, opnieuw wassen in PBS. </li><li> Blok weefsel secti<html> on op objectglaasjes met 10% geit serum in PBS gedurende 1 uur. </li><li> Spoel dia met PBS, deksel en incubeer cardiale secties met konijn anti-serotype 4 pneumococcus antiserum bij 1: 1000 in PBS met 10% geit serum gedurende 2 uur bij 37 ° C. LET OP: Voor de negatieve controles onderzoekers moeten naïef konijnenantiserum gebruiken </li><li> Na wassen met PBS, deksel en incubeer secties met 10% geit serum-PBS met geit anti-konijn-FITC geconjugeerd antilichaam bij 1: 2000 gedurende 30 minuten bij 37 ° C. </li><li> Na instructies van de fabrikant gebruikt DAPI (4 &#39;, 6- diamidino-2-fenylindool) en 5 mg / ml voor visualisatie van eukaryote kernen. Wassen en monteer weefsel secties met FluorSave. </li><li> Verwerven fluorescerende beelden met behulp van een confocale microscoop systeem bij zowel lage als hoge vergroting. Stel de numerieke apertuur dienovereenkomstig voor optimale resultaten. Hier verkrijgen fluorescerende beelden met behulp van een confocale systeem met een numerieke apertuur 1,42 60X objectief. </li></ol>&quot;&gt; 4. Antibiotica Redding van Septic Muizen <ol><li> Beginnen met muizen geïnfecteerd ip met 1,0 x 10 3 CFU van TIGR4 zoals eerder in stap 1 is aangegeven. </li><li> Beginnend op 30 uur na infectie, toedienen van farmaceutische kwaliteit ip ampicilline (80 mg / kg lichaamsgewicht) in 100 pl zoutoplossing elke 12 uur gedurende 36 uur. Verzamel hart op het gewenste tijdstip en zoals beschreven in stap 1.6 voor paraffine inbedding en weefsel snijden. </li></ol> 5. Collageen Deposition Detection <ol><li> Met xyleen en ingedeeld alcohol wast met gedeïoniseerd water, deparaffinize en hydraat weefselsecties middels standaardwerkwijzen 17. Behandel secties met waterige 0,2% fosfomolybdeenzuur gedurende 5 minuten en spoel met gedeïoniseerd water gedurende 5 min. </li><li> Stain secties met 0,1% Sirius Red in pikrinezuur 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Was secties 0,01 N zoutzuur gedurende 3 min en spoelen met 70% ethanol gedurende 1 minuut. </li><li> DehydraTé de secties met behulp van de identieke, maar in omgekeerde volgorde van wasbeurten met die beschreven in 5.1, uitdrogen cardiale secties in het verhogen en gegradeerde concentraties van ethanol dan xyleen. </li><li> Mount weefsel secties met een montage oplossing voor microscopische evaluatie. </li><li> De regio&#39;s van collageen te identificeren, te onderzoeken in lood weefsel secties voor gebieden van diepe read vlekken onder lage en hoge vergroting met een lichtmicroscoop. Elk gebied binnen de ventrikels van het hart, dat is rood is een gebied waar collageen is gedeponeerd. Gebieden zonder deze rode vlek zijn sites van gezond weefsel ontbreekt collageen depositie. Hierin verkrijgen Picro Sirius rood gekleurde beelden met behulp van een microscoop uitgerust met een 20X 0,5 numerieke apertuur doelstelling. OPMERKING: Het atrium vlekken rood in gezonde weefsels. </li></ol>

<ol><li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+complications+in+patients+with+community-acquired+pneumonia%3A+incidence%2C+timing%2C+risk+factors%2C+and+association+with+short-term+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: incidence, timing, risk factors, and association with short-term mortality.</a> Circulation. 125, 773-781 (2012).</li>
<li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+bacterial+pneumonia+is+associated+with+the+occurrence+of+acute+coronary+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Acute bacterial pneumonia is associated with the occurrence of acute coronary syndromes.</a> Medicine (Baltimore). 88, 154-159 (2009).</li>
<li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+complications+in+patients+with+community-acquired+pneumonia%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+observational+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: a systematic review and meta-analysis of observational studies.</a> PLoS Med. 8, e1001048(2011).</li>
<li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+stratification+for+cardiac+complications+in+patients+hospitalized+for+community-acquired+pneumonia.+Mayo+Clin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc%22%5BJournal%5D)">Risk stratification for cardiac complications in patients hospitalized for community-acquired pneumonia. Mayo Clin.</a> Proc. 89, 60-68 (2014).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+11+common+viral+and+bacterial+pathogens+causing+community-acquired+pneumonia+or+sepsis+in+asymptomatic+patients+by+using+a+multiplex+reverse+transcription-PCR+assay+with+manual+%28enzyme+hybridization%29+or+automated+%28electronic+microarray%29+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detection of 11 common viral and bacterial pathogens causing community-acquired pneumonia or sepsis in asymptomatic patients by using a multiplex reverse transcription-PCR assay with manual (enzyme hybridization) or automated (electronic microarray) detection.</a> Journal Of Clinical Microbiology. 46, 3063-3072 (2008).</li>
<li>Musher, D. M., Rueda, A. M., Kaka, A. S., Mapara, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+between+pneumococcal+pneumonia+and+acute+cardiac+events%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The association between pneumococcal pneumonia and acute cardiac events.</a> Clin Infect Dis. 45, 158-165 (2007).</li>
<li>Brown, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae+translocates+into+the+myocardium+and+forms+unique+microlesions+that+disrupt+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae translocates into the myocardium and forms unique microlesions that disrupt cardiac function.</a> PLoS Pathogens. In press, (2014).</li>
<li>Orihuela, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+receptor+initiates+bacterial+contact+with+the+blood+brain+barrier+in+experimental+meningitis+models%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Laminin receptor initiates bacterial contact with the blood brain barrier in experimental meningitis models.</a> The Journal of Clinical Investigation. 119, 1638-1646 (2009).</li>
<li>Flick, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+elimination+of+the+binding+motif+on+fibrinogen+for+the+S.+aureus+virulence+factor+ClfA+improves+host+survival+in+septicemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Genetic elimination of the binding motif on fibrinogen for the S. aureus virulence factor ClfA improves host survival in septicemia.</a> Blood. 121, 1783-1794 (2013).</li>
<li>Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+play+in+four+acts%3A+Staphylococcus+aureus+abscess+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation.</a> Trends Microbiol. 19, 225-232 (2011).</li>
<li>Arenal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+the+spatial+characteristics+of+myocardial+scar+tissue+determine+the+risk+of+ventricular+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Do the spatial characteristics of myocardial scar tissue determine the risk of ventricular arrhythmias.</a> Cardiovasc Res. 94, 324-332 (2012).</li>
<li>Deneke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+histopathology+of+electroanatomic+mapping+after+cooled-tip+radiofrequency+ablation+to+treat+ventricular+tachycardia+in+remote+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Human histopathology of electroanatomic mapping after cooled-tip radiofrequency ablation to treat ventricular tachycardia in remote myocardial infarction.</a> J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 1246-1251 (2005).</li>
<li>Bakker, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reentry+as+a+cause+of+ventricular+tachycardia+in+patients+with+chronic+ischemic+heart+disease%3A+electrophysiologic+and+anatomic+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Reentry as a cause of ventricular tachycardia in patients with chronic ischemic heart disease: electrophysiologic and anatomic correlation.</a> Circulation. 77, 589-606 (1988).</li>
<li>Verma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+successful+ablation+sites+and+the+scar+border+zone+defined+by+substrate+mapping+for+ventricular+tachycardia+post-myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Relationship between successful ablation sites and the scar border zone defined by substrate mapping for ventricular tachycardia post-myocardial infarction.</a> J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 465-471 (2005).</li>
<li>Wu, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+risk+for+ventricular+tachyarrhythmias+and+sudden+cardiac+death%3A+is+there+a+role+for+cardiac+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Cardiovasc+Imaging%22%5BJournal%5D)">Assessing risk for ventricular tachyarrhythmias and sudden cardiac death: is there a role for cardiac MRI.</a> Circ Cardiovasc Imaging. 5, 2-5 (2012).</li>
<li>Tettelin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+a+virulent+isolate+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae.</a> Science. 293, 498-506 (2001).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflict in dit onderzoek.

In dit verslag zeer reproduceerbare methode S. induceren pneumoniae gemedieerde cardiale microverwondingen bij muizen tijdens IPD en de technieken voor de visualisatie wordt aangetoond. Muizen geïnfecteerd met een dosis bacteriën die drempelwaarde van het immuunsysteem voor klaring overtreft, waardoor hoogwaardige bacteremie, vergelijkbaar met die welke optreedt tijdens menselijke sepsis, en leidt tot uiteindelijke bacteriële translocatie in het myocardium. Voor nog onbekende redenen, S. pneumoniae...

Hospitalisatie van volwassenen voor community-acquired pneumonie (CAP) draagt ​​een gedocumenteerde risico op cardiale complicaties die bijdraagt ​​aan de sterfte 1-4. In een recente studie van Corrales-Medina et al., Cardiale complicaties bleken geassocieerd te worden met en / of verantwoordelijk voor 27% van de longontsteking gepaard sterfgevallen 3. Streptococcus pneumoniae (de pneumokokken), de meest voorkomende oorzaak van het GLB en sepsis 5, is direct geassocieerd met negatieve cardiale gebeurtenissen in maar liefst 19% van de opgenomen volwassen patiënten 6. Cardiale complicaties geassocieerd met een longontsteking zijn onder andere een nieuwe of verergerde congestief hartfalen, hartritmestoornissen, en myocardinfarct in volgorde van afnemende frequentie 6. In een recent PLoS Pathogens artikel van Brown et al., S. pneumoniae werd gevonden kunnen translocatie via cardiaal vasculair endotheel, binnenkomst in de myocardium en vorming van discrete niet-purulent microscopische lesies (microverwondingen) gevuld met bacteriën in de ventrikels gedurende invasieve pneumokokkeninfecties (IPD) 7. Bewijs van cardiale microlesion vorming werd waargenomen in cardiale monsters van niet-menselijke primaten en mensen die bezweken aan pneumokokken infectie. Ook experimenteel geïnfecteerde muizen reproduceerbaar ontwikkeld cardiale microverwondingen. In muizen, werd microlesion grootte en aantal positief gecorreleerd met de duur en ernst van bacteremie niveaus van troponine in sera en afwijkende cardiale elektrofysiologie. Bacteriële translocatie naar het hart te treden via dezelfde mechanismen die translocatie van de pneumococcus over de bloed-hersenbarrière en ontwikkeling van pneumococcen meningitis, dwz Choline-bindende eiwit A gemedieerde invasie van vasculaire endotheelcellen in een laminine receptor en bloedplaatjes -activating factor receptor afhankelijke manier 8. Microlesionenvorming vereist ook de pneumokokken porievormende toxine pneumolysine dat bleek te hartspiercellen 7 doden. Pneumokokken cardiale microverwondingen verschillen van de purulente zachte weefsel en cardiale abcessen die worden veroorzaakt door andere Gram-positieve bacteriën zoals Staphylococcus aureus. Deze worden gekenmerkt door een enkele foci bacteriën omgeven door neutrofielen en fibrine depositie 9,10. Microverwondingen gevormd door S. pneumoniae zijn kleiner in omvang, verspreid over een getroffen hart, en missen immuun celinfiltraten. Tijdens de vroege stadia van de infectie microverwondingen veroorzaakt door S. pneumoniae verschijnen als gebieden van beschadigde of ontstoken weefsel doet denken aan de pathologische tekenen van cardiomyopathie. Sommige monocyten kunnen worden waargenomen tijdens deze periode, maar hun aanwezigheid is kortstondig en snel lesies necrotisch in verschijning en gevuld met bacteriën tegelijkertijd blijft grow in grootte tot de dood van het dier of antimicrobiële interventie. Belangrijk binnen 3 dagen na antibioticum interventie wordt overvloedig immune cel infiltratie waargenomen bij de vroegere laesie en dit gaat gepaard met sterke collageen afzetting. Soortgelijke remodellering is gemeld optreden na infarct met blijvende gevolgen op de hartfunctie 11-15. Zo microverwondingen zijn een potentiële verklaring voor de ongunstige cardiale gebeurtenissen die zich voordoen tijdens de IPD en eventueel de verhoogde incidentie van cardiale-gerelateerde sterfte in herstellingsoord personen die de ziekte episode hebben overleefd. Hierin wordt instructie die op de experimenteel muismodel van IPD en cardiale laesievorming en visualisatie van cardiale microverwondingen op vroege en late stadia van de infectie. Het protocol voor detectie van collageen in dieren die zijn opgeslagen door antimicrobiële maatregelen blijkt. Het doel van dit artikel is om facilitate het onderzoek van andere onderzoekers over dit belangrijke en nieuwe pneumokokken pathologie.

<table><tbody><tr><td>Todd-Hewitt bouillon&nbsp;</td><td>Neogen</td><td>7161A</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T Compound&nbsp;</td><td>Tissue-Tek (Sakura Finetek)&nbsp;</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Fisher Scientific (Acros)</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Normaal geitenserum</td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td></td></tr><tr><td>anti-serotype 4 pneumokokken antiserum&nbsp;</td><td>Statens Serum Institut</td><td>16747</td><td></td></tr><tr><td>geit anti-konijn FITC-geconjugeerd antilichaam&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-096-144</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Fluorsave</td><td>Millipore</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>S70104</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A9393</td><td></td></tr><tr><td>fosfomolybdinezuur 0,2%&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>26357-01</td><td></td></tr><tr><td>0,1% Sirius Red in picrinezuur&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>26357-02</td><td></td></tr><tr><td>0,01 N zoutzuur&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>26357-03</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tack Microscoopglazen</td><td>Polysciences, Inc</td><td>24216</td><td></td></tr><tr><td>Paralube Vet Ointment</td><td>Dechra</td><td>12920060</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxyline en Eosine Kleuring Kit</td><td>ongespecificeerd&nbsp;</td><td></td><td>Standaard</td></tr></tbody></table>

visualisatie van<em&gt; streptococcus pneumoniae</em&gt; binnen cardiac microverwondingen en latere cardiac remodeling

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Tijdens bacteremia Streptococcus pneumoniae kan verplaatsen door het vasculair endotheel in het myocardium en vormen discrete bacteriën gevulde microscopische lesies (microverwondingen) die opmerkelijk zijn vanwege de afwezigheid van infiltrerende immuuncellen. Door hun vrijgave van cardiotoxische producten, S. pneumoniae binnen microverwondingen worden verondersteld bij te dragen tot het hartfalen die vaak waargenomen tijdens fulminaat invasieve pneumococcen ziekte bij volwassenen. Hierin wordt aangetoond een protocol voor experimentele muis-infectie die leidt tot cardiale microlesion vorming reproduceerbaar binnen 30 uur. Instructie wordt voorzien op microlesion identificatie in hematoxyline &amp; eosine gekleurde hart secties en de morfologische verschillen tussen vroege en late microverwondingen worden gemarkeerd. Instructie wordt verstrekt over een protocol voor de controle van S. pneumoniae binnen microverwondingen behulp van antilichamen tegen pneumokokken capsulaire polysaccharideimmunofluorescentie microscopie. Eindelijk is een protocol voor antibiotische interventie die geïnfecteerde muizen en voor de detectie en beoordeling van littekenvorming in de harten van de herstellende muizen redt verstrekt. Samen zullen deze protocollen het onderzoek naar de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen pneumokokken cardiale invasie, cardiomyocyte dood, cardiale remodeling als gevolg van blootstelling aan S. vergemakkelijken pneumoniae en de immuunrespons op het pneumokokken in het hart.

Visualisatie van microverwondingen door H &amp; E Cardiale microverwondingen werden waargenomen in de ventrikels van H &amp; E gekleurde hart- coupes van muizen met IPD na hun ip uitdaging TIGR4. Figuur 1 toont de toename in grootte van deze laesies tussen 24 en 30 uur na infectie (HPI), met groter aantal hematoxyline -stained (dwz, paars-blauw) pneumokokken zichtbaar binnen de laesie. Microverwondingen werden gekenmerkt door een vacuole-achtige morfologie,...

Streptococcus pneumoniae vormt discrete niet-purulente microscopische laesies in het hart. Beschreven wordt het protocol voor een muismodel van hartmicrolaesievorming. Er wordt instructie gegeven over microlaesievisualisatie met behulp van microscopie, onderscheid tussen vroege en late microlaesies en methoden om cardiale remodellering in harten van herstellende dieren te detecteren.

Visualisatie van<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Binnen Cardiac microverwondingen en Latere Cardiac Remodeling

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om een reproduceerbaar protocol te demonstreren voor de vorming van ESMO-cardiale micro-laesies in het hart van geïnfecteerde muizen. Dit wordt bereikt door muizen te infecteren met ESMO en de ontwikkeling van bacteriëmie toe te staan, waardoor bacteriën toegang krijgen tot de cardiale vasculatuur waar zij het myocard kunnen invallen en microscopische laesies kunnen vormen. Vervolgens worden de harten ofwel in paraffine ingebed en conventioneel gekleurd, of gefixeerd in OCT-compound voor immunofluorescente kleuring.Evaluatie van de gekleurde coupes kan cardiale microlesies tonen die willekeurig over het myocard zijn verdeeld, collageendeposities en herstellende myocardsecties en pneumokokkenkapsels binnen de cardiale microlesie, wat de procedure demonstreert. Is Armand Brown een promovendus in mijn laboratorium? Deze methode kan echter inzicht bieden in de cardiale beschadigende effecten van S. pneumoniae tijdens invasieve pneumokokkenziekte bij muizen.Het kan ook worden toegepast op hartstalen van andere systemen, zoals niet-menselijke primaten of mensen. Begin met het kweken van de ESMO Serotype four stam Tiger four in Todd Hewitt-bouillon tot een optische dichtheid van 0,5 bij 620 nanometer. Wanneer de juiste dichtheid is bereikt, wordt de cultuur gecentrifugeerd bij 3.500 G gedurende 10 minuten om een pellet te vormen.Verwijder vervolgens het supernatant met een vacuümlijn en resuspendeer de bacteriën in steriele PBS op 10.000 colony forming units per milliliter. Anestheseer nu valve C-muizen van 10 tot 12 weken oud en bevestig de anesthesietoestand met een zachte kneep in de teen met een stompe pincet, vul een spuit met de bacteriesuspensie en bevestig een naald van 27 tot 30 gauge. Pak vervolgens een geanestheseerde muis met één hand in de nek vast, terwijl u met de andere hand 100 microliters van de suspensie intraperitoneaal injecteert, en plaats elke muis terug in de kooi.De muizen worden doorgaans 30 tot 40 seconden na de injectie wakker. Het nauwkeurig bepalen van de dosis S. pneumonia is cruciaal, anders kunnen de muizen herstellen van de infectie of kan er te snel een invasieve pneumokokkenziekte ontstaan voordat er laesies kunnen ontwikkelen. Omdat elke bacteriële stam verschillende virulentieniveaus heeft, kan het via vallen en opstaan gaan om de juiste dosis te bepalen.Laat de infectie gedurende ten minste 24 uur voortschrijden voor een vroeg stadium, of tot 30 uur voor een gevorderd stadium van de infectie. Euthanaseer vervolgens elke geïnfecteerde muis. Neem eerst een bloedmonster door de staart te desinfecteren met een alcoholswab en een sectie van twee tot drie millimeter af te knippen.Neem twee microliters bloed af van de knipplaats. Verdun het bloed serieel tienvoudig in PBS met natriumheparine met een concentratie van one unit per milliliter. Plaats vijf verdunningsniveaus op triptisch soja-bloedagarplaten en incubeer deze gedurende één nacht.Voer de volgende dag kolonietellingen uit. Ga over tot het oogsten van het hart zoals beschreven in de volgende sectie. Alternatief kan dit 30 uur na infectie gebeuren.Probeer de muis te redden door ampicilline intraperitoneaal toe te dienen in 100 µL zoutoplossing. Ga door met het toedienen van ampicilline elke 12 uur gedurende 36 uur en neem de harten af op de gewenste tijdstippen. Oogst eerst het hart.Immobiliseer de geëuthanaseerde muis in rugligging op een chirurgisch platform, bespuit de borstkas met 70% ethanol en dep deze droog. Open de borstholte met een chirurgische schaar en een pincet. Verwijder de borstkas en doorsnij het diafragma om het hart en de longen bloot te leggen.Snij vervolgens de bloedvaten door die met het hart verbonden zijn en gebruik een pincet om het hart voorzichtig uit te snijden zonder beschadigingen te veroorzaken. Spoel het hart met PBS en plaats het in een cassette voor weefselmonsters voor coronale doorsneden. Breng de cassettes vervolgens over naar een 10% gebufferde formalinesolutie en stuur deze de volgende dag door voor paraffine-inbedding.In vroege stadia kunnen hartlaesies worden geïdentificeerd aan hun kleurverandering en, in sommige gevallen, aan de aanwezigheid van immuuncellen. In gevorderde laesies zijn immuuncellen afwezig en groot. In hun plaats worden VA-achtige laesies aangetroffen.Bevries eerst hartcoupes van vijf micron op positief geladen glasplaatjes, ontdooi deze vervolgens en laat ze aan de lucht drogen. Fixeer de plaatjes 10 minuten in 10% neutraal gebufferde formaline bij 25 graden Celsius. Verwijder daarna het fixatief door drie keer vijf minuten te wassen met PBS.Maak het weefsel vervolgens permeabel met 0,2% Triton X-100 in PBS gedurende 15 minuten. Verwijder het detergent door drie keer extra te wassen met pure PBS. Blok daarna het weefsel met 10% coat-serum in PBS gedurende een uur; na een spoeling met PBS wordt de sectie gedurende twee uur bij 37 graden Celsius behandeld met antiserum.Behandel negatieve controles met naïef konijnenantiserum. Omdat hartweefsel de XI-immunofluorescentiekleurstof gemakkelijk absorbeert, wat leidt tot hoge achtergrondwaarden, moet de concentratie en incubatietijd voor verschillende typen antilichamen waarschijnlijk worden geoptimaliseerd. Was het antiserum twee uur later weg met PBS. Vervang vervolgens de oplossing door een secundair antilichaam en laat de coupes 30 minuten incuberen bij 37 °C. Breng nu DPI aan in een concentratie van 5 mg/mL en was de coupes met PBS.Monteer ten slotte de preparaten in een medium, bewaar deze en beeld ze af met confocale microscopie. Begin met het verwijderen van de paraffine en het hydrateren van de weefselcoupes. Gebruik xyleenwassingen gevolgd door een reeks alcoholwassingen met een afnemende concentratie.Bad de coupes vervolgens vijf minuten in 0,2% fosfomolybdeenzuur, gevolgd door een spoeling met water van vijf minuten; kleur daarna twee uur met 0,1% Sirius Red en picrinezuur. Was de coupes vervolgens drie minuten in 0,01 N zoutzuur en spoel ze een minuut in 70% ethanol. Dehydrateer de coupes nu door de reeks alcoholbaden in omgekeerde volgorde te doorlopen, gevolgd door wassingen met xyleen; monteer de coupes en evalueer de preparaten met lichtmicroscopie.Muizen ontwikkelden een invasieve pneumokokkenziekte na een challenge met de tiger-vier-stam. In de ventrikels werden cardiale micro-laesies waargenomen en er werd een toename van de grootte en het aantal laesies genoteerd tussen 24 en 30 uur na infectie. Om te controleren of S. pneumoniae zich inderdaad in de laesies bevonden, werden coupes gekleurd voor het capsulair polysaccharide van serotype vier geproduceerd door Tiger vier.Dit bevestigde de aanwezigheid van dicht opeengepakte en compacte aggregaten binnen de microlesieplaatsen. Piro serious red-kleuring werd uitgevoerd op hartsecties van muizen die met ampicilline waren gered en onbeïnvloede controles. Bij de geredde dieren.Er was een dramatische toename in de aanwezigheid en intensiteit van de kleuring, met banden die uitvloeiden vanuit wat leken te zijn op voormalige laesieplaatsen in de ventrikels. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken de muizen te infecteren met voldoende S pneumonia zodat de infectie gedurende ten minste 28 tot 30 uur kan voortschrijden, zodat bacteriëmie en cardiale micro-laesies voldoende tijd hebben om zich te vormen.

visualization-streptococcus-pneumoniae-within-cardiac-microlesions

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Source: Brown, A. O., et al. Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the microscopic visualization of bacterial microlesions in mouse heart tissue. The heart of a mouse infected with Streptococcus pneumoniae is harvested, washed, and fixed before being processed to obtain coronal sections. These sections are stained with hematoxylin and eosin and examined under a microscope to visualize...

Microscopic Visualization of Bacterial Microlesions in Mouse Heart Tissue

Source: Brown, A. O., and Orihuela, C. J. Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the immunostaining of chemically fixed mouse cardiac tissue sections to visualize pathogenic bacteria localized within infection-induced microlesions. The process includes tissue washing, membrane permeabilization, blocking of nonspecific sites, antibody labeling, nuclear counterstaining, and confocal...

Immunostaining of Bacteria-Filled Microlesions in a Mouse Cardiac Tissue Section for Imaging

Deze studie toont de succesvolle implementatie van magnetische resonantiemicroscopiebeeldvorming aan als een niet-invasieve tool om de hartafwijkingen te beoordelen bij muizen die zijn getroffen door auto-immuun myocarditis. De gegevens geven aan dat de techniek kan worden gebruikt om de ziekteprogressie bij levende dieren te volgen.

Niet-invasieve evaluatie van cardiale afwijkingen in experimentele autoimmuun Myocarditis door Magnetic Resonance Imaging Microscopy in de muis

Hier wordt een methode getoond voor het visualiseren van de ultrastructuur van de extracellulaire matrix in gedecellulariseerde hartweefsels.

Scanning Electron Microscopy van Gemacereerde Tissue te visualiseren de extracellulaire matrix

Betrouwbare en nauwkeurige uitkomst evaluatie is de sleutel voor de vertaling van preklinische therapieën in de klinische behandeling. De huidige paper beschrijft hoe drie klinisch relevante primaire uitkomstmaten van cardiale prestaties en de schade op te nemen in een varken acuut hartinfarct model.

Primaire Outcome Assessment in een Varken Model acuut myocardinfarct

Hier beschrijven we een microscopie-aanpak van lichte lakens om het cardiale CD45 + leukocyten infiltraat te visualiseren in een muizenmodel van aseptische fulminante myocarditis, die wordt geïnduceerd door de intratracheale difterie toxine behandeling van CD11c.DTR muizen.

Kwantitatieve visualisatie van leukocytinfectiet in een muizenmodel van Fulminant-myocarditis door middel van lichte microscopie

Hier presenteren we een protocol voor de inductie van links ventriculaire cryoinjury gevolgd door de inplanting van een patch van de hartspier, afgeleid van menselijke iPS-cel cardiomyocytes in een cavia-model.

Implantatie van hiPSC afkomstige hartspier Patches na myocardiale letsel in een cavia-Model

Dit protocol schetst de stappen voor het induceren van een hartinfarct bij muizen met behoud van het hartzakje en de inhoud ervan.

Een intact pericardium ischemisch knaagdiermodel

Hier presenteren we een protocol om hoge resolutie microcomputertomografiebeelden te verkrijgen van gezonde en pathologische grote zoogdierharten met collageenselectieve contrastverbetering.

Weefselvoorbereidingstechnieken voor contrastverbeterde microcomputertomografie beeldvorming van grote hartmodellen bij zoogdieren met chronische ziekte

Driedimensionale (3D) reconstructie van hartschade bij gerefused acuut myocardinfarct (repAMI) maakt getrouwe kwantificering en co-lokalisatie van geassocieerde ziekte-beïnvloedende patronen mogelijk. Hier wordt een automatiseerbare lichtbladgeleide beeldvormingsbenadering geboden voor gelijktijdige meting van hartschade, risicogebied en immuuncelrespons.

Gelijktijdige 3D-analyse van hartbeschadiging en immuunrespons bij recidorsus acuut myocardinfarct met behulp van fluorescentiemicroscopie

Ontdek een protocol voor visualisatie van Streptococcus pneumoniae in cardiale microverwondingen bij muizen. Deze methode toont bacteriële invasie en myocardiale schade via immunofluorescentie en histologische kleuring.

Visualisatie van

Meer video's verkennen