Visualisatie van Streptococcus pneumoniae Binnen Cardiac microverwondingen en Latere Cardiac Remodeling
7 april 2015
Streptococcus pneumoniae vormt discrete niet-purulente microscopische laesies in het hart. Beschreven wordt het protocol voor een muismodel van hartmicrolaesievorming. Er wordt instructie gegeven over microlaesievisualisatie met behulp van microscopie, onderscheid tussen vroege en late microlaesies en methoden om cardiale remodellering in harten van herstellende dieren te detecteren.
Het algemene doel van het volgende experiment is om een reproduceerbaar protocol voor ESMO-hartmicro-laesievorming binnen het hart van geïnfecteerde muizen aan te tonen. Dit wordt bereikt door muizen te infecteren met ESMO en de ontwikkeling van bacteriëmie toe te staan, waardoor bacteriën toegang krijgen tot de hartvaten waar ze het myocardium kunnen binnendringen en microscopische laesies kunnen vormen. Vervolgens worden de harten ofwel in paraffine ingebed en conventioneel gekleurd of vastgelegd in OCT-compound voor immunofluorescente kleuring.
Evaluatie van de gekleurde secties kan hartmicrolaesies willekeurig verdeeld over de myocardium collageenafzetting en herstellende hartsecties en pneumokokkencapsules binnen de hartmicrolaesie tonen. Demonstratie van de procedure. Is Armand Brown een afgestudeerde student in mijn lab? Hoewel deze methode inzicht kan geven in de hartschadelijke effecten van S pneumonia tijdens invasieve pneumokokkenziekte bij muizen.
Het kan ook worden toegepast op hartmonsters uit andere systemen zoals niet-menselijke primaten of mensen. Begin met het laten groeien van de ESMO Serotype vier stam Tiger vier in Todd Hewitt bouillon tot een optische dichtheid van 0,5 bij 620 nanometer. Wanneer op de juiste dichtheid, pellet de cultuur bij 3.500 G gedurende 10 minuten.
Verwijder vervolgens het supernatant met behulp van een vacuümlijn en schud de bacteriën opnieuw op met steriel PBS bij 10.000 kolonievormende eenheden per milliliter. Vervolgens worden 10 tot 12 weken oude klep C muizen geanesthetiseerd en bevestig hun geanesthetiseerde toestand met een zachte teenprik van een paar stompe pincetten, lotus spuit met de bacteriesuspensie en bevestig een 27 tot 30 gauge naald. Pak vervolgens een geanesthetiseerde muis met één hand bij zijn nek terwijl je met de andere hand 100 microliters suspensie intraperitoneaal injecteert, plaats elke muis terug in zijn kooi.
De muizen worden meestal 30 tot 40 seconden na de injectie wakker. Het correct doseren van S pneumonia is cruciaal, anders kunnen de muizen herstellen van de infectie of te snel een invasieve pneumokokkenziekte krijgen voordat laesies zich kunnen ontwikkelen. Aangezien elke bacteriestam verschillende niveaus van oorlenzen heeft, kan het enige proef en fout vereisen om de juiste dosis te identificeren.
Laat de infectie gedurende minimaal 24 uur naar een vroeg stadium of tot 30 uur voor een gevorderd stadium van infectie voortgaan. Euthanasie later elke geïnfecteerde muis. Neem eerst een bloedmonster, desinfecteer de staart met een alcoholdoek en snij een twee tot drie millimeter sectie af.
Verzamel twee microliter bloed vanaf de snijplek. Verdun het bloed seriëel tienvoudig in PBS met natriumheparine bij één eenheid per milliliter. Plateer vijf niveaus van verdunning op triptych soja bloed agar platen en incubeer ze overnacht.
Neem de volgende dag de kolonietellingen. Ga door met het oogsten van het hart zoals beschreven in de volgende sectie. Of, 30 uur na infectie.
Probeer de muis te redden door ampicilline intraperitoneal toe te dienen in 100 microliters zoutoplossing. Blijf ampicilline elke 12 uur gedurende 36 uur toedienen en verzamel harten op de gewenste tijdstippen. Verzamel eerst het hart.
Immobiliseer de geëuthanasieerde muis in een rugligging op een chirurgisch platform, en besproei de borstkas met 70%ethanol en dep droog. Gebruik chirurgische schaar en pincetten om de borstholte te openen. Verwijder de ribbenkast en doorsnijd het diafragma om het hart en de longen bloot te leggen.
Snijd vervolgens de bloedvaten die op het hart zijn aangesloten door en gebruik pincetten om het hart voorzichtig zonder blauwe plekken te verwijderen. Spoel het hart met PBS en plaats het in een weefselspecimenverzamelcassette voor coronaal doorsnijden. Breng vervolgens de cassettes over in 10% gebufferde formalineoplossing en stuur op de volgende dag voor paraffine-inbedding.
In vroege stadia kunnen hartlaesies worden geïdentificeerd door hun verandering in kleuruiterlijk en in sommige gevallen de aanwezigheid van immuuncellen. In gevorderde laesies zullen immuuncellen afwezig en groot zijn. VA-achtige laesies worden op hun plaats gevonden.
Gebruik een vijf micron hartsectie op positief geladen glazen platen, bevries de secties eerst, bevriest ze dan en laat ze aan de lucht drogen. Fixeer de slides in 10% neutraal gebufferde formaline gedurende 10 minuten bij 25 graden Celsius. Verwijder vervolgens het fixeermiddel met drie wasbeurten en PBS gedurende vijf minuten per wasbeurt.
Volg door het weefsel doorlaatbaar te maken met 0,2% tritton X 100 in PBS gedurende 15 minuten. Verwijder het detergent met drie meer wasbeurten in zuiver PBS. Blokkeer vervolgens het weefsel met 10% coating serum in PBS gedurende een uur na een spoeling in PBS, bedek de sectie met antiserum gedurende twee uur bij 37 graden Celsius.
Behandel negatieve controles met naïef konijnen antiserum Omdat hartweefsel de XI Immunofluorescent kleuring gemakkelijk absorbeert, wat leidt tot hoge achtergrondniveaus, zal de concentratie en incubatietijd voor verschillende soorten antilichamen waarschijnlijk geoptimaliseerd moeten worden. Twee uur later, spoel het antiserum weg met PBS. Vervang vervolgens de oplossing met een secundair antilichaam en laat de slides gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius incuberen. Pas nu DPI toe bij vijf milligram per milliliter en was de slides met PBS.
Monteer tenslotte de slides in vloer, sla op en beeld ze af met confocale microscopie. Begin met het verwijderen van de paraffine en het hydrateren van de weefselsecties. Gebruik xyleen wasbeurten gevolgd door een gegradeerde serie alcohol wasbeurten.
Baad vervolgens de secties in 0,2% fosforimetisch zuur gedurende vijf minuten, gevolgd door een vijf minuten water spoeling en volgende kleuring met 0,1% ernstig rood en ric zuur gedurende twee uur. Was vervolgens de secties in 0,01 normale zoutzuur gedurende drie minuten en spoel ze af in 70% ethanol gedurende een minuut. Dehydrateer nu de secties door de gegradeerde alcohol bad serie om te
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel schetst een protocol voor het bestuderen van de vorming van hartmicrolesies bij muizen geïnfecteerd met Streptococcus pneumoniae. De methodologie omvat visualisatietechnieken en differentiatie tussen vroege en late microlesies, evenals methoden voor het beoordelen van hartremodellering.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Cardiologie
- Besmettelijke ziekten
Achtergrond
- Streptococcus pneumoniae kan aanzienlijke hartschade veroorzaken.
- Begrip van microlesievorming is cruciaal voor inzichten in hartziekten.
- Deze studie gebruikt een muismodel om deze effecten te onderzoeken.
- Microscopische laesies kunnen de ernst van de infectie en het harteffect aangeven.
Doel van de studie
- Om een reproduceerbaar protocol voor de vorming van hartmicrolesies vast te stellen.
- Om verschillende stadia van microlesies te visualiseren en te differentiëren.
- Om hartremodellering bij herstellende muizen te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Besmetting van muizen met ESMO om bacteriëmie te induceren.
- Microscopische evaluatie van gekleurde hartsecties.
- Gebruik van paraffine-inbedding en conventionele kleuringstechnieken.
- Immunfl uorescente kleuring voor gedetailleerde visualisatie.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van hartmicrolesies in het myocardium.
- Observatie van collageenafzettingen in herstellende hartsecties.
- Detectie van pneumokokkencapsules binnen microlesies.
- Inzichten in de hartbeschadigende effecten van S. pneumoniae.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van hartlaesies.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de pathofysiologie van pneumokokkenziekte.
- Dit model kan worden gebruikt voor verder onderzoek naar hartinfecties.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Visualization and quantification of Streptococcus pneumoniae within cardiac microlesions provide a reproducible preclinical model for interrogating host-pathogen interactions and cardiac tissue remodeling. This workflow enables mechanistic de-risking of infection-driven cardiac injury, supporting predictive confidence in translational research and target validation for anti-infective or cardioprotective strategies. The protocol's reproducibility and adaptability across model systems position it as a foundational tool for portfolio triage and early discovery decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of bacterial localization and tissue response for mechanistic hypothesis testing.
- Supports functional target validation by linking pathogen presence to cardiac lesion formation and remodeling.
- Facilitates biological de-risking by distinguishing early versus late lesion characteristics and immune cell involvement.
- Provides a platform for evaluating candidate interventions targeting bacterial invasion or cardiac protection.
Screening & Assay Development
- Establishes a validated, reproducible model for downstream screening of anti-infective or cardioprotective compounds.
- Standardizes quantitative assessment of lesion number, size, and collagen deposition for assay development.
- Enables robust immunofluorescent and histological readouts for comparative compound evaluation.
- Supports scalability and platform reuse across different bacterial strains or host models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant endpoints by modeling cardiac remodeling post-infection.
- Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of therapeutic hypotheses.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing quantitative, histopathological biomarkers.
- Facilitates adaptation to non-human primate or human cardiac samples for translational relevance.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates from early discovery through preclinical research, enabling hypothesis testing, target validation, and translational biomarker development for infection-driven cardiac injury.
- Discovery Biology: Supports mechanistic interrogation of bacterial invasion, immune evasion, and tissue remodeling.
- Screening: Provides standardized, quantitative lesion and collagen readouts for compound evaluation.
- Analytics: Enables statistical comparison of lesion metrics and intervention outcomes across experimental groups.
- Translational Research: Bridges murine findings to higher-order models and human tissue for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable workflow for diverse infection and cardiac injury studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in infection-induced cardiac injury models.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible protocols for cross-study and cross-team comparability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by providing robust preclinical data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of anti-infective and cardioprotective candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine infection models, histology, and immunofluorescence microscopy.
- Demands access to animal facilities, confocal imaging, and quantitative histopathology infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of infection dose, timing, and staining protocols.
- Adaptable to other model systems but may require optimization of antibody concentrations and imaging parameters.
- Lesion formation and detection are sensitive to infection kinetics and bacterial strain variability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:23
Infection
3:38
Visualization of Cardiac Lesions and Pneumoccocci within Lesions
4:38
Immunofluorescent Microscopy for S. pneumoniae within Microlesions
6:13
Collagen Depostion Detection
7:03
Results: Cardiac Pathology of S. pneumoniae-challenged and Rescued Mice
7:56
Conclusion
