Name: Neurale activiteit Voortplanting in een Uitgeklapt hippocampus Voorbereiding met een doordringende micro elektrode-array (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Leer hoe je een muizenhippocampus uitvouwt en plaatst op een doordringende micro-elektrode-array voor gelijktijdige neurale opnames. Deze methode behoudt de CA1-CA3-neuronen en maakt uitgebreide elektrofysiologische studies mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een National Institutes of Health (National Institute of Neurological Disorders and Stroke) Grant 1R01NS060757-01 en door de E.L. Lindseth leerstoel aan Dominique M. Durand. We danken Dr. Andrew M. Rollins’ laboratorium voor de hulp bij de OCT-beeldvorming.

OPMERKING: Animal experimentele protocollen werden beoordeeld en door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de universiteit goedgekeurd. CD1-muizen van beide geslachten op de leeftijd van P10 tot P20 worden in deze studie. 1. Oplossingen voor chirurgie en experimentele Opname <ol><li> Bereid normale kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) buffer bevattende (mM): NaCl 124, KCl 3,75 KH 2 PO4 1,25 MgSO4 2, NaHCO3 26 Dextrose 10 en CaCl2 2. Met deze normaal aCSF voor weefselherstel na sectie en voor wassysteem aan het begin van het experiment. </li><li> Bereid sucrose aCSF die wordt gebruikt tijdens de hippocampus dissectie en bevat (mM): Sucrose 220, KCl 2,95, NaH 2 PO4 1.3, MgSO4 2, NaHCO3 26 Dextrose 10 en CaCl2 2. Om epileptische activiteit in de intacte hippocampus weefselpreparaat induceren wordt 4-aminopyridine (4-AP) naar normaal aCSF opde concentratie van 100 uM. </li></ol> 2. Chirurgische Procedure voor de Intact Hippocampus Voorbereiding <ol><li> Drop isofluraan (1 ml) in de kamer op de bodem van een exsiccator glazen pot (No.1 in bepaalde materialen en apparatuur) en gebruik een gewone papieren handdoek om het oppervlak van de onderste fase te dekken, zodat het dier niet in contact met krijgt de vloeistof. Vervolgens plaatst u de CD1 muis in de pot en sluit het deksel. Houd het dier in de gesloten pot gedurende ongeveer 1 min tot 2 min. Wanneer adem frequentie is ongeveer één per seconde, verwijdert u de muis uit de pot. </li><li> Plaats de muis op de operatie podium en onthoofden met een geschikte schaar. Onmiddellijk na onthoofding, plaats het hoofd in het ijs-koude (3-4 ° C), geoxygeneerde sucrose aCSF gedurende 30 sec. </li><li> Gebruik fijne schaar (No.5 in bepaalde materialen en apparatuur) om de huid op de top van de schedel te verwijderen en de schedel langs de middelste lijn van het hoofd, evenals snijden aan twee einden in de buurt van het temporal kwab. Gebruik een tang (nr 6 in bepaalde materialen en apparatuur) om de cut schedel naar elke kant van het hoofd schil om de hersenen bloot te leggen. </li><li> Plaats een micro lab spatel (nr 8 in bepaalde materialen en apparatuur) in de spleet tussen de pariëtale kwabben van de hersenen en de schedel zorgvuldig schil de hersenen van de onderkant van de schedel en vervolgens laten vallen op een voorbereide ijskoude (3 -4 ° C) chirurgische podium bedekt met natte papieren filter (No.2 in bepaalde materialen en apparatuur). Verwijder het cerebellum met een ijs-gekoelde blad en scheiden de twee hersenhelften hierdoor de middellijn van de hersenen. Plaats vervolgens de twee gescheiden helften in een beker gevuld met ijskoude sucrose aCSF geborreld met 95% O2 / 5% CO2. </li><li> Neem de helft van de halve bol en op de ijskoude filtreerpapier fase. Plaats gewone papieren handdoeken of filtreerpapier rond de hersenen om de extra oplossing zuigen. Gebruik twee-brand gepolijst glas pipet gereedschappen (nr 10 in Materialen enEquipment) de cortex scheiden van de rest van het centrale deel van de hersenen. </li><li> Na de hippocampus wordt blootgesteld van de binnenkant van de cortex en op de ijskoude podium, plaatst u twee of drie druppels ijskoude sucrose aCSF op het weefsel en verwijder extra oplossing rond de hippocampus. Snijd de verbindingen met de cortex aan beide uiteinden van de hippocampus. Vervolgens ontleden de hippocampus van de hersenen met vuur gepolijst glas gereedschappen en verwijder het resterende deel van de hersenen. </li><li> Scheid de hele hippocampus met zijn alveus kant naar boven en de hippocampus sulcus naar beneden. Snel dalen twee of drie druppels ijskoude sucrose aCSF op het weefsel opnieuw en verwijder de extra oplossing rond het weefsel met behulp van een stuk keukenpapier. Gebruik een brand gepolijst glas hulpmiddel om te draaien de hele hippocampus naar de sulcus (Figuur 1B, C) ​​bloot. </li><li> Onder een normale optische microscoop, plaatst u een op maat gemaakte glazen naald (No. 11 in Specifieke MateriALS activa) in een uiteinde van de sulcus en snijd de vezelverbindingen van dentate gyrus (DG) naar subiculum of het veld CA1, in de richting van sulcus (figuur 1C). Breng een ijskoude blad om de septale en temporele uiteinden van de hippocampus trimmen indien nodig. Plaats een op maat gemaakte metalen draad lus (No. 12 in bepaalde materialen en apparatuur) in de uitsparing sulcus en trek dan de DG weg van het weefsel terwijl de subiculum / CA1 einde van de hippocampus door een brand gepolijst glas gereedschap (figuur 1D) . </li><li> Naar aanleiding van de zich ontvouwende bovenstaande procedure, voeg nog twee of drie druppels van de ijskoude sucrose aCSF op het weefsel en verwijder de extra oplossing rond het weefsel. Vervolgens trimmen uitgeklapte hippocampus met ijskoude mes aan de randen (figuur 1E) en plaats de opstelling met een spatel in de herstellende kamer vullen met aCSF en geborreld met 95% O2 / 5% CO2 bij kamertemperatuur (ongeveer 25 ° C). Vertrekkenongevouwen hippocampus weefsel tot ongeveer 1 uur te herstellen voordat u ze in de opname kamer. </li><li> Neem de andere hersenhelft en gebruik deze om te gaan door stappen 2,5-2,9. Gewoonlijk ongeveer 1-2 min de gehele procedure te beëindigen om een ​​hippocampus ontvouwen en drop ijskoude sucrose aCSF continu aan het weefsel zuurstof en gehydrateerd. </li></ol> 3. Experimentele System Setup <ol><li> Lijm een maat gefabriceerd PMEA op een pin grid array (PGA) pakket en gebruik micro wire bonding aan elke pad verbinden van een enkele micro-elektrode aan de pad van een speld op de verpakking (Figuur 3B). Steek dan het pakket in de aansluiting op een op maat gemaakte printplaat 13. </li><li> Individueel elk micro-elektrode aan te sluiten op de filters met band pass cut-off frequentie van 1 Hz tot 4 kHz en versterkers met een winst van 100 op de op maat gemaakte printplaat 13. Digitaliseren van de analoge uitgang van de printplaat door een A / D converting systeem, en het verwerven en opslaan van de gegevens op een computer. </li><li> Lijm een op maat gemaakte plastic opname kamer rond de array met inlaat en uitlaat slangen voor de oplossing stroom (Figuur 4A). Gebruik ten minste twee flessen om verschillende oplossingen in het systeem te houden en aan te sluiten en de controle van de uitvoer slang van de flessen door een tri-klep. Verbind de uitgang van de tri-klep een buissysteem met een IV druppelkamer die bepalend is de oplossing in de opname kamer. </li><li> Tussen de tri-ventiel en de inlaat van de opname kamer, voeg een elektrische verhitter om de oplossing op een gecontroleerde temperatuur (35 ° C) voordat de oplossing wordt geleid naar de opname kamer te verwarmen. Bevestig de uitlaat van de opname kamer een vacuümbuis de oplossing in een vacuümbuis aangesloten kolf verzamelen. Gebruik geen oplossing in een experiment in deze studie niet te recyclen. </li></ol> 4. Het plaatsen van de Uitgeklapt Hippocampus op de PMEA om de neurale activiteit opnemen </p&gt; <ol><li> Om de experimentele opstelling voor te bereiden, vul een fles met normale aCSF en een andere fles met 4-AP aCSF. In beide flessen, bel 95% O 2/5% CO 2 vanaf het begin van elk experiment. Gebruik een tri-klep connector om te bepalen welke oplossing tijdens een experiment zal worden geselecteerd. Sluit een vacuümbuis bij de uitlaat van de kamer naar de oplossing in een stofreservoir pomp. Verwarm de pijpleiding voor het leveren van het in de opname kamer en houdt de oplossing bij een gecontroleerde temperatuurniveau (35 ° C). </li><li> Wanneer de inlaat en uitlaat van opname kamer gesloten, een aangepaste gemaakte glazen pipet dropper overdragen en plaatsen ongevouwen hippocampus in de opname kamer. Onder de microscoop, plaats ongevouwen hippocampus met een gewone kleine kwast terwijl het weefsel drijft in de oplossing. Leg de opengevouwen hippocampus met zijn alveus zijde naar beneden, CA3 gebied weg te wijzen, en CA1 gebied richting van de onderzoeker. </li&gt; <li> Zorgvuldig zuigen oplossing weg in de kamer met een stofzuiger pipet uit de rand van de opname kamer om de oplossing te verlagen tot de kamer wordt gedroogd en het weefsel wordt neergelaten op de array. Daarna voorzichtig plaats een maat Weefselanker (figuur 4) (nr 14 in specifieke materialen en apparatuur) bovenop het weefsel ongevouwen hippocampus vasthouden van de array. Een paar druppels van de oplossing in de opname kamer te vullen en geleidelijk open de inlaat en uitlaat stroomsnelheid ongeveer twee druppels per seconde in de IV druppelkamer passen. </li><li> Incubeer het weefsel in de opname kamer met normale aCSF voor ongeveer 1 minuut om te herstellen, schakel dan de oplossing levering aan 4-AP opgelost aCSF en correct af te stellen het debiet. Incubeer het weefsel in 4-AP opgelost aCSF gedurende 5 tot 10 min en vervolgens kan de onderzoeker de software te starten om het signaal opnemen wanneer spontane activiteit weergegeven. </li></ol> 5. Het verwijderen van deWeefsel van de PMEA Na een experiment <ol><li> Beheersen het weefsel anker door een micromanipulator en geleidelijk opheffen van het weefsel van de opname kamer. Stilgelegd zowel inlaat en uitlaat van de stroming in de opname kamer te stoppen. De opname kamer moet vol met oplossing of voeg een paar druppels van de oplossing om de kamer te vullen als de opname kamer niet vol is. </li><li> Gebruik een kleine kwast op elke hoek van het weefsel te heffen. Als het weefsel niet drijft in de oplossing daarvoor beroep vacuümbuis de kamer voorzichtig droog met het weefsel zitten nog op de array. Vervolgens opent voorzichtig de inlaat om geleidelijk vullen de kamer en het afsluiten van de inlaat van de stroom te stoppen wanneer de opname kamer is vol. Breng de kleine kwast op elke hoek van het weefsel opnieuw tillen. </li><li> Herhaal stap 5.2 totdat het weefsel wordt losgemaakt van de array en drijvend in de oplossing. Wanneer het weefsel drijft in de oplossing, vervolgens de vacuümbuis weg te zuigen weefsel. Open thij stroomt in de inlaat en open het vacuüm in de uitlaat. Was het systeem met gedestilleerd water en droog het uit. </li></ol>

<ol><li>Richardson, K. A., Schiff, S. J., Gluckman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+traveling+waves+in+the+Mammalian+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Control of traveling waves in the Mammalian cortex.</a> Phys Rev Lett. 94 (2), 028103-028112 (2005).</li>
<li>Luhmann, H. J., Dzhala, V. I., Ben-Ari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+propagation+of+4-AP-induced+epileptiform+activity+in+neonatal+intact+limbic+structures+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Generation and propagation of 4-AP-induced epileptiform activity in neonatal intact limbic structures in vitro.</a> Eur J Neurosci. 12 (8), 2757-2768 (2000).</li>
<li>Grinvald, A., Manker, A., Segal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+spread+of+electrical+activity+in+rat+hippocampal+slices+by+voltage-sensitive+optical+probes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Visualization of the spread of electrical activity in rat hippocampal slices by voltage-sensitive optical probes.</a> J Physiol. 333, 269-291 (1982).</li>
<li>Gloveli, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+arrangement+of+rhythm-generating+microcircuits+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 102 (37), 13295-13300 (2005).</li>
<li>Amaral, D. G., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three-dimensional+organization+of+the+hippocampal+formation%3A+a+review+of+anatomical+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data.</a> Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).</li>
<li>Albani, S. H., McHail, D. G., Dumas, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+studies+of+the+hippocampus+and+hippocampal-dependent+behaviors%3A+insights+from+interdisciplinary+studies+and+tips+for+new+investigators%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Biobehav+Rev%22%5BJournal%5D)">Developmental studies of the hippocampus and hippocampal-dependent behaviors: insights from interdisciplinary studies and tips for new investigators.</a> Neurosci Biobehav Rev. 43, 183-190 (2014).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+Epileptiform+Activity+Can+Be+Independent+of+Synaptic+Transmission%2C+Gap+Junctions%2C+or+Diffusion+and+Is+Consistent+with+Electrical+Field+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Propagation of Epileptiform Activity Can Be Independent of Synaptic Transmission, Gap Junctions, or Diffusion and Is Consistent with Electrical Field Transmission.</a> J Neurosci. 34 (4), 1409-1419 (2014).</li>
<li>Kibler, A. B., Durand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+wave+propagation+of+epileptiform+activity+in+the+planar+mouse+hippocampus+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Orthogonal wave propagation of epileptiform activity in the planar mouse hippocampus in vitro.</a> Epilepsia. 52 (9), 1590-1600 (2011).</li>
<li>Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+voltage+sensor+imaging+of+electrical+activity+from+neurons+in+hippocampal+slices+from+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice.</a> J Neurophysiol. 108 (11), 3147-3160 (2012).</li>
<li>Wingenfeld, K., Wolf, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+%2C+memory%2C+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stress , memory, the hippocampus.</a> Front Neurol Neurosci. 34, 109-121 (2014).</li>
<li>Liu, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+dynamics+of+high-K%2B-induced+epileptiform+discharges+in+hippocampal+slice+and+the+effects+of+valproate%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Bull%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal dynamics of high-K+-induced epileptiform discharges in hippocampal slice and the effects of valproate.</a> Neurosci Bull. 29 (1), 28-36 (2013).</li>
<li>Oka, H., Shimono, K., Ogawa, R., Sugihara, H., Taketani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+planar+multielectrode+array+for+extracellular+recording%3A+application+to+hippocampal+acute+slice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A new planar multielectrode array for extracellular recording: application to hippocampal acute slice.</a> J Neurosci Methods. 93, 61-68 (1999).</li>
<li>Kibler, A. B., Jamieson, B. G., Durand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+aspect+ratio+microelectrode+array+for+mapping+neural+activity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A high aspect ratio microelectrode array for mapping neural activity in vitro.</a> J Neurosci Methods. 204 (2), 296-305 (2012).</li>
<li>Schechter, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potassium+channel+blockers+4-aminopyridine+and+tetraethylammonium+increase+the+spontaneous+basal+release+of+%5B3H%5D5-hydroxytryptamine+in+rat+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">The potassium channel blockers 4-aminopyridine and tetraethylammonium increase the spontaneous basal release of [3H]5-hydroxytryptamine in rat hippocampal slices.</a> J Pharmacol Exp Ther. 282 (1), 262-270 (1997).</li>
<li>Perreault, P., Avoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-aminopyridine-induced+epileptiform+activity+and+a+GABA-mediated+long-lasting+depolarization+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">4-aminopyridine-induced epileptiform activity and a GABA-mediated long-lasting depolarization in the rat hippocampus.</a> J Neurosci. 12 (1), 104-115 (1992).</li>
<li>Chesnut, T. J., Swann, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epileptiform+activity+induced+by+4-aminopyridine+in+immature+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+Res%22%5BJournal%5D)">Epileptiform activity induced by 4-aminopyridine in immature hippocampus.</a> Epilepsy Res. 2 (3), 187-195 (1988).</li>
<li>Nam, Y., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Microelectrode+Array+Technology+and+Neural+Recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">In Vitro Microelectrode Array Technology and Neural Recordings.</a> Crit Rev Biomed Eng. 39 (1), 45-62 (2011).</li>
<li>Gonzalez-Sulser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+neuron+firing+and+local+field+potentials+in+the+in+vitro+4-aminopyridine+epilepsy+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Hippocampal neuron firing and local field potentials in the in vitro 4-aminopyridine epilepsy model.</a> J Neurophysiol. 108 (9), 2568-2580 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De ontwikkeling van het ongevouwen hippocampus preparaat, waarbij de longitudinale en transversale assen van de hippocampus worden bewaard in combinatie met een penetrerende micro-elektrode array, een krachtig hulpmiddel om de anatomie aansluitingen of neurale propagatie in de hippocampus 7 onderzoeken. Dit ontvouwen procedure ook voor het bestuderen van de hippocampus bij volwassen muizen. Recente studies met dit preparaat bleek dat de 4-AP-geïnduceerde epileptische activiteit kan voortplanten met een diagon...

Inzicht in de neurale geleiding of voortplanting van neurale signalen is cruciaal voor het bepalen van het mechanisme van neuronale communicatie in zowel de normale functie en pathologie hersenen 1-3. De hippocampus is een van de meest uitgebreid bestudeerde structuren in de hersenen omdat speelt fundamentele rol in diverse hersenfuncties zoals geheugen en ruimtelijk volgen en is betrokken bij verscheidene pathologische veranderingen dramatisch effect functie en 1,6. Hoewel, de hippocampus vertoont een complexe organisatie, kunnen de verschillende elementen van de structuur gemakkelijk worden geïdentificeerd en toegankelijk in de slice voorbereiding 4-6. In de dwarsrichting van de hippocampus, is neurale activiteit bekend voortplanten door de tri-synaptische traject dat de gyrus dentatus (DG), CA3, CA1 andsubiculum 4,5 omvatten. Er wordt aangenomen dat de synaptische transmissie en axonale geleiding spelen een belangrijke rol voor de plaatselijke communicatiein deze dwarse circuit 4,6. Echter, vermeerdering van neurale signaal vindt plaats in zowel dwars- als lengterichting 4,6. Dit betekent dat de hippocampus niet volledig kan worden onderzocht door gebruik slice preparaten die de waarneming van een bepaalde voortplantingsrichting 4 beperken. De longitudinale plak werd ontwikkeld om de axonale paden langs de langsas 5 onderzoeken. Onderzoekers hebben het gedrag van specifieke gamma en theta-oscillaties waargenomen voornamelijk langs de transversale en longitudinale assen respectievelijk 6. Deze gedragingen zijn afzonderlijk onderzocht, maar toch gelijktijdige toegang tot beide richtingen is cruciaal om dit gedrag te begrijpen. Zelfs met de ontwikkeling van de intacte hippocampus preparaat, is het moeilijk om de propagatie in het gehele weefsel toezicht door de gevouwen structuur van de hippocampus 4. Ongevouwen hippocampus geeft toegang tot de verpakte neuronenin de vorm van een platte tweedimensionale cellaag 7,8. Door het uitvouwen van de dentate gyrus (DG) (figuur 1), de hippocampus neemt een afgeplatte vorm met een rechthoekige configuratie waarin zowel transversale als longitudinale verbindingen intact met de piramidale cellaag gerangschikt in een tweedimensionale plaat die zowel CA3 en CA1 blijven, waardoor een plat stuk neuraal weefsel dat kan worden gebruikt om neurale vermeerdering onderzoeken (figuur 2) 8. Neurale activiteit kan vervolgens worden gevolgd met afzonderlijke glazen pipetten, micro-elektrode arrays, prikkelelektroden, evenals spanningsgevoelige kleurstoffen (VSD) 3,7,8. Bovendien kunnen genetisch gecodeerde voltageindicator uit transgene muizen worden gebruikt voor de vermeerdering patroon 9 te volgen. De vlakke configuratie van het ongevouwen hippocampus netwerk geschikt voor optische registratie werkwijze, maar ook in een micro-elektrode array. Most van de commercieel beschikbare arrays worden gefabriceerd met een vlakke of low profile elektroden en kan neurale activiteit opnemen in zowel weefsel plakjes en gekweekte neuronen 10-12. De signaal-ruisverhouding (SNR) afneemt wanneer de signalen worden verkregen van een intact weefsel, aangezien de soma van de neuronen worden dieper in het weefsel bevindt. Micro-elektrode elektrode arrays met een hoge aspect ratio&#39;s zijn nodig om de SNR te verbeteren. Daartoe heeft een indringende micro-elektrode array (PMEA) ontwikkeld in ons laboratorium, en biedt de mogelijkheid om direct sonde in het weefsel door het invoegen van 64 spikes met een diameter van 20 urn en hoogte van 200 urn in de ongevouwen hippocampus 7,13 . Deze micro-elektrode array hogere SNR vergeleken met de spanningsgevoelige kleurstof beeldvorming en de SNR blijft gedurende een experiment 7,13. De combinatie van het ongevouwen hippocampus opstellen en PMEA verschaft een nieuwe manier om te investereniGate de neurale propagatie over een tweedimensionaal vlak. Experimenten met deze techniek hebben al belangrijke resultaten over de mechanismen van neurale signaalvoortplanting in de hippocampus, waarbij neurale activiteit onafhankelijk van synaptische of elektrische synapsen 7 kunnen voortplanten opgeleverd.

<table><tbody><tr><td>desiccator jar</td><td>LABRECYCLERS Inc.</td><td>5410</td><td>Plaats regelmatige papieren handdoeken op de bodem van de pot voor gebruik bij anesthesie van dieren.&nbsp;</td></tr><tr><td>A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Een petrischaal wordt ondersteboven (in het midden) in het ijs geplaatst met een vochtig filterpapier erop.&nbsp;</td></tr><tr><td>Custom made tissue recovery chamber</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Kunststof buizen werden met plastic gaas op de bodem gelijmd en belucht met 95% O2/ 5% CO2 in de aCSF.</td></tr><tr><td>Straight Operating&nbsp;Scissors</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17336B&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; Medco Instruments No.:81995&nbsp;</td><td>Deze schaar wordt gebruikt om&nbsp;&nbsp; de muizen te onthoofden.</td></tr><tr><td>Integra Miltex Goldman-Fox&nbsp;Scissors</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-460-517&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; MILTEX INC&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; No.:5-SC-320</td><td>Deze schaar wordt gebruikt om de schedel van de muizen te snijden.&nbsp;</td></tr><tr><td>Miltex Hysterectomy Forceps</td><td>Claflin Medical equipment</td><td>CESS-722033-00001</td><td>Deze pincetten worden gebruikt om de afgesneden schedel te schillen om de hersenen bloot te leggen</td></tr><tr><td>Micro Spatula</td><td>Cardinal Health</td><td></td><td>Deze micro spatel wordt gebruikt om de hele hersenen van een halfrond in de opvangkamer over te brengen.&nbsp;</td></tr><tr><td>Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula</td><td>Cardinal Health</td><td></td><td>Deze semi-micro spatel wordt gebruikt om de ongevouwen hippocampus over te brengen naar de glucose aCSF in de hersteelkamer.</td></tr><tr><td>small paint brush</td><td>Lowe's</td><td>tem #:&nbsp;105657&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; Model #:&nbsp;90219</td><td>De kleinste in een normale verfkwastverpakking</td></tr><tr><td>Fire polished glass help tool</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Dit gereedschap is vuurgepolijst en gemaakt van de gebruikelijke Pasteur-glaspipetten.</td></tr><tr><td>Custom made glass needle</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Dit gereedschap is vuurgepolijst en gemaakt van de gebruikelijke Pasteur-glaspipetten.</td></tr><tr><td>Custom made glass tool with a metal wire loop</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Dit gereedschap is vuurgepolijst en gemaakt van de gebruikelijke Pasteur-glaspipetten met een gereconstrueerde metalen draadlus.</td></tr><tr><td>Custom made glass solution dropper</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Dit gereedschap is&nbsp; gemaakt van de gebruikelijke Pasteur-glaspipetten met gesneden punten en een rubberen kop aan het gesneden uiteinde.</td></tr><tr><td>Custom made tissue anchor</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Nylonvezelgaas werd op een geïsoleerde koperdraadring gelijmd. De weefselanker werd vastgehouden door een micromanipulator.&nbsp;</td></tr><tr><td>Custom fabricated microelectrode array</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Meer informatie over de array vindt u bij&nbsp; Kibler, et al, 2011.&nbsp;</td></tr><tr><td>Custom made filter and amplifiers circuits for the array</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Meer informatie over de array vindt u bij&nbsp; Kibler, et al, 2011.&nbsp;</td></tr><tr><td>Data acquisition processor 3400a</td><td>Microstar Laboratories</td><td>N/A</td><td>Dit is een compleet data-acquisitiesysteem met A/D-converter.</td></tr></tbody></table>

neurale activiteit voortplanting in een uitgeklapt hippocampus voorbereiding met een doordringende micro elektrode-array

Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het bereiden van een nieuw in vitro flat hippocampus preparaat in combinatie met een micro-bewerkte array neurale activiteit in kaart in de hippocampus. De dwarse hippocampus slice voorbereiding is de meest voorkomende voorbereiding weefsel om hippocampus elektrofysiologie studeren. Een longitudinale hippocampus plak werd ontwikkeld om longitudinale verbindingen in de hippocampus onderzoeken. De intacte muis hippocampus kan ook worden gehandhaafd in vitro vanwege zijn dikte maakt voldoende zuurstof diffusie. Echter, deze drie bereidingen geen directe toegang tot neurale voortplanting omdat sommige van het weefsel ontbreekt of gevouwen. Ongevouwen intacte hippocampus levert zowel transversale als longitudinale verbindingen in een vlakke configuratie voor directe toegang tot het weefsel analyseren de volle omvang van signaalvoortplanting in de hippocampus in vitro. Om effectief toezicht op de neurale activiteit van tHij cellaag, een maat penetrerende micro-elektrode array (PMEA) werd vervaardigd en toegepast op de ongevouwen hippocampus. De PMEA met 64 elektroden van 200 micrometer in de hoogte kon neurale activiteit diep binnenin de muis hippocampus opnemen. De unieke combinatie van een ongevouwen hippocampus opstellen en PMEA verschaft een nieuwe in vitro hulpmiddel om de snelheid en de voortplantingsrichting van de neurale activiteit in de tweedimensionale CA1-CA3 gebieden van de hippocampus studie met een hoge signaal-ruisverhouding.

De in de figuren hier gegevens werden geregistreerd in ongevouwen hippocampus bereiding 4-AP (100 uM) aCSF toegevoegd tijdens de incubatie van het weefsel in de opname kamer bij kamertemperatuur (25 ° C). Gewoonlijk activiteit begint binnen 5 minuten, maar in sommige hippocampale weefsels van de oudere dieren het langer duren. De 4-AP-geïnduceerde neuronale waargenomen met de PMEA is hetzelfde als eerder beschreven 14,15. Aangezien de elektroden een hoogte van 200 urn, worden de elektrodetoppen net onder de c...

We hebben een in vitro ongevouwen hippocampus die CA1-CA3 reeks van neuronen behoudt ontwikkeld. Gecombineerd met de penetrerende micro elektrode-array, kunnen neurale activiteit worden gevolgd in zowel de longitudinale als transversale richtingen. Deze werkwijze verschaft voordelen boven hippocampus slice preparaat als voortplanting in de gehele hippocampus gelijktijdig kunnen worden opgenomen.

Neurale activiteit Voortplanting in een Uitgeklapt hippocampus Voorbereiding met een doordringende micro elektrode-array

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in ...

Het algemene doel van deze procedure is om het proces van het ontvouwen van de hippocampus van knaagdieren te introduceren en de platte weefselvoorbereiding op het penetrerende micro-elektrodenarray te plaatsen. Voor opname. Dit wordt bereikt door eerst een muis-hippocampus van de helft van zijn hersenen te isoleren.De tweede stap is om de gebogen structuur van de hippocampus met op maat gemaakte hulpmiddelen uit te vouwen. Vervolgens wordt de uitgevouwen hippocampus overgebracht naar de opnamekamer en op het opnamearray geplaatst. De laatste stap is om de uitgevouwen hippocampus na het experiment uit het array te verwijderen.Uiteindelijk wordt de individuele normalisatie-mappingmethode gebruikt bij gegevensanalyse om de door de penetrerende micro-elektrodenarray geregistreerde neurale activiteitspropagatie te tonen. Nou, het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het ons toestaat om neurale activiteit in twee richtingen, dwars en longitudinaal, te registreren. Om de werkelijke propagatie van neurale activiteit te zien, heb je een intacte hippocampus nodig, de dent jars uitrollen en plat in een opnamekamer leggen, en de propagatie zal dan in zowel dwars als longitudinale richtingen plaatsvinden.En we waren in staat om vervolgens de snelheid van propagatie van het weefsel te bepalen. We waren van de activiteit in de twee richtingen, en we waren in staat om de propagatiemechanismen te bestuderen, in het bijzonder de niet-s synaptische mechanismen. We waren in staat om activiteit te zien die propageerde met die synaptische transmissie met die gap junctions, en vanwege de snelheid weten we dat het geen diffusie is.Dus nu proberen we de werkelijke mechanismen van deze propagatie uit te werken. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze techniek worstelen vanwege de uitdagende procedures van het uitvouwen van de hippocampus en de platte weefselvoorbereiding op dit penetrerende micro-elektrodenarray te plaatsen zonder het weefsel of het array te beschadigen. Om deze procedure te beginnen, plaats de kop van de muis in ijskoud geoxygeneerd sucrose.Een CSF gebruik een paar fijne schaar om de huid van de schedel te verwijderen. Snijd vervolgens de schedel langs de middellijn en de twee uiteinden nabij de temporale kwab. Schil vervolgens de gesneden schedel naar de zijkanten van het hoofd.Om de hersenen bloot te leggen, verwijder voorzichtig de hersenen uit de schedel met de spatel. Plaats de hersenen daarna op een ijskoud chirurgisch platform bedekt met nat filterpapier. Verwijder de cerebellum met een ijsgekoeld mes.Gescheiden vervolgens de twee hemisferen door de middellijn van de hersenen te snijden. Plaats vervolgens de twee gescheiden hemisferen in een beker gevuld met ijskoud sucrose. Een CSF gebubbeld met 95% zuurstof, 5% koolstofdioxide.Breng een hemisfeer over naar het ijskoude platform bedekt met filterpapier. Plaats gewone papieren handdoeken of filterpapieren rond de hersenen om de extra oplossing te absorberen. Gebruik vervolgens twee met vuur gepolijste glazen pipetten om de cortex van het centrale deel van de hersenen te scheiden om de hippocampus bloot te leggen.Breng vervolgens twee tot drie druppels ijskoud suse A CSF op het weefsel aan en verwijder de extra oplossing. Snijd de verbindingen met de cortex aan de twee uiteinden van de hippocampus. Ontleed vervolgens de hippocampus uit de hersenen met de met vuur gepolijste glazen gereedschappen.Gescheiden vervolgens de hele hippocampus met zijn ous zijde omhoog en de hippocampale sulcus naar beneden. Breng snel twee tot drie druppels ijskoud sase CSF op het weefsel aan en verwijder de extra oplossing eromheen. Gebruik vervolgens het met vuur gepolijste glazen gereedschap om de hele hippocampus om te draaien. Om de sulcus bloot te leggen, gebruik een ijskoud mes om de septale en temporale uiteinden van de hippocampus te trimmen.Indien nodig, steek een op maat gemaakte glazen naald in de sulcus en snijd het vezelpad van DG naar ca drie. Gebruik vervolgens een metalen draadlus om de DG omhoog te trekken en de hippocampus uit te vouwen. Het hele chirurgische proces duurt meestal ongeveer twee minuten.Breng nogmaals twee tot drie druppels ijskoud sucrose A CSF op het weefsel aan en verwijder de extra oplossing eromheen. Trim vervolgens de randen van de uitgevouwen hippocampus met een ijskoud mes. Breng de voorbereiding over naar de herstelkamer gevuld met normale A CSF en gebubbeld met 95% zuurstof, 5% koolstofdioxide bij kamertemperatuur gedurende een uur voordat u het naar de opnamekamer overbrengt.Vul in deze procedure één fles met normale A CSF en een andere fles met vier AP A CSF-bubbels. De oplossingen met 95% zuurstof, 5% koolstofdioxide vanaf het begin van de experimenten. Gebruik een trivalve connector om te controleren welke oplossing tijdens een experiment zal worden geselecteerd.Verbind vervolgens een vacuümbuis met de uitlaat van de kamer. Om de oplossing in een stofdop te verwijderen, verwarm de pijplijn voordat u de oplossing in de opnamekamer aflevert en houd deze op een gecontroleerde temperatuur van 35 graden Celsius. Gebruik na het sluiten van de inlaat en uitlaat van de opnamekamer een op maat gemaakte glazen pipet om de uitgevouwen hippocampus naar de opnamekamer over te brengen.Positioneer onder de microscoop de uitgevouwen hippocampus met zijn alvia zijde naar beneden ca een drie gebied wijzend weg en ca een veld wijzend naar de onderzoeker, verwijder voorzichtig de oplossing in de kamer met behulp van een vacuümpipet vanaf de rand van de opnamekamer totdat de kamer is gedroogd en het weefsel op het array ligt. Plaats vervolgens voorzichtig een op maat gemaakt weefselanker op het weefsel om de uitgevouwen hippocampus op het array vast te houden. Vul de opnamekamer opnieuw met een paar druppels oplossing.Open geleidelijk de inlaat en uitlaat om de stroomsnelheid aan te passen tot ongeveer twee druppels per seconde in de IV-tripkamer. Incubeer het weefsel in de opnamekamer met normale A CSF gedurende ongeveer een minuut. Schakel vervolgens de oplossingen om.Breng toe vier AP opgelost A CSF en pas de stroomsnel

neural-activity-propagation-an-unfolded-hippocampal-preparation-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De bereiding van acute hersenplakjes van hippocampi geïsoleerd, evenals de gelijktijdige elektrofysiologische opnames van astrocyten en neuronen...

Dubbele Elektrofysiologische Opnames van synaptisch-opgeroepen astrogliale en Neuronale responsen bij acute hippocampus Slices

This video demonstrates the procedure to set up a recording chamber with a penetrating microelectrode array (PMEA) to capture neural signals from an unfolded hippocampus. This method allows us to study the speed and direction of propagation of neural activity within the unfolded hippocampus in vitro.

Recording Neural Activity of Unfolded Hippocampal Tissue Using Penetrating Microelectrode Array

This protocol involves using a microelectrode array (MEA) to record electrical activity in a brain slice exposed to a seizure-inducing drug. The procedure includes positioning the brain slice in an MEA recording chamber, applying electrical stimulation to induce artificial seizures, and analyzing the resulting signals.

Monitoring Seizure-Induced Neural Electrical Activity in Brain Slices Using Microelectrode Arrays

This video demonstrates the procedure for setting up a brain slice in a submersion chamber to record synaptic activity. The process involves securing the slice on lens paper, maintaining a continuous flow of artificial cerebrospinal fluid (aCSF) to ensure neuronal viability, and accurately positioning the stimulation and recording electrodes relative to a specific brain region of interest. This setup allows for precise monitoring of baseline synaptic activity and the effects of electrical...

Recording Neuronal Field Excitatory Postsynaptic Potentials in Acute Hippocampal Slices

This video demonstrates the stereotactic implantation of a wire electrode array and an optic fiber in the hippocampus of a mouse model.

Implanting an Electrode Array and Optic Fiber into the Mouse Hippocampus

Implanteren georganiseerde arrays van microwires voor gebruik in een enkele eenheid elektrofysiologische opnames presenteert een aantal technische uitdagingen. Methoden voor het uitvoeren van deze techniek en de apparatuur die nodig zijn beschreven. Ook is het nuttig gebruik van de georganiseerde Microwire arrays op te nemen van verschillende neurale subregio's met een hoge ruimtelijke selectiviteit besproken.

Een procedure voor het implanteren van georganiseerde Arrays van microwires voor Single-unit Opnamen in Awake, Gedragen Dieren

Deze video-artikel beschrijft experimentele procedures om langetermijnplasticiteit en de daarmee geassocieerde processen zoals synaptische tagging, capture en cross-tagging in de CA1-piramideneuronen te bestuderen met behulp van acute hippocampus-sneden van knaagdieren.

Onderzoek van Synaptic Tagging / Capture en Cross-capture met Acute hippocampus Plakjes van Knaagdieren

We illustreren hoe u opnemen en elektrische modulatie van 4-aminopyridine-geïnduceerde epileptiform activiteit in knaagdier hersenen segmenten met behulp van micro-elektrode arrays. Een aangepaste opname-kamer onderhoudt weefsel levensvatbaarheid in langdurige experimentele sessies. Leven van de elektrode toewijzing en selectie van stimulerende paren worden uitgevoerd door een aangepaste grafische gebruikersinterface.

Opname en moduleren van Epileptiform activiteit in knaagdier hersenen plakjes gekoppeld aan micro-elektrode Arrays

Dit protocol beschrijft de opname van het lokale veld potentieel met multi schacht lineaire silicon sondes. Conversie van de signalen met behulp van de huidige Bronanalyse dichtheid kan de wederopbouw van lokale elektrische activiteit in de hippocampus muis. Met deze techniek, kunnen ruimtelijk beperkte hersenen oscillaties in vrij bewegende muizen bestudeerd worden.

Opname ruimtelijk beperkte schommelingen in de Hippocampus gedragen muizen

Dit protocol heeft tot doel om aan te tonen hoe te in vitro micro-elektrode-arrays combineren met microfluidic apparaten voor het bestuderen van de actiepotentiaal transmissie in neuronale culturen. Data-analyse, namelijk de opsporing en karakterisering van teeltmateriaal van de actie potentieel, is uitgevoerd met behulp van een nieuwe geavanceerde, nog gebruikersvriendelijk en vrij beschikbaar zijn, computationele gereedschap.

Interfacing Microfluidics met micro-elektrode Arrays voor het bestuderen van de neuronale communicatie- en axonale signaal vermeerdering

Dit protocol beschrijft de voorbereiding van horizontale hippocampal-entorhinal cortex (HEC) plakjes van muizen die spontane scherpe golf rimpelactiviteit vertonen. Plakjes worden geïncubeerd in een vereenvoudigde interface-holdingkamer en opnames worden uitgevoerd onder ondergedompelde omstandigheden met snelstromende kunstmatige cerebrospinale vloeistof om weefsel oxygenatie en de spontane opkomst van activiteit op netwerkniveau te bevorderen.

Acute muis hersenen snijden om spontane Hippocampal Netwerk activiteit te onderzoeken

Leer hoe je een muizenhippocampus uitvouwt en plaatst op een doordringende micro-elektrode-array voor gelijktijdige neurale opnames. Deze methode behoudt de CA1-CA3-neuronen en maakt uitgebreide elektrofysiologische studies mogelijk.

Neurale activiteit Voortplanting in een Uitgeklapt hippocampus Voorbereiding met een doordringende micro elektrode-array

Meer video's verkennen