Verbeterde Genetische analyse van Single Human Bioparticles Hersteld door vereenvoudigd Micromanipulatie uit Forensisch 'Touch-DNA' Evidence
9 maart 2015
Hier beschrijven we een optimale en efficiënte verwijdering strategie voor het verzamelen van onderhavige bio-deeltjes "raken DNA" monsters, tezamen met een verbeterde amplificatieprotocol waarbij in één stap 5 gl micro-volume lysis / STR amplificatie, het herstel van mogelijk short tandem repeat (STR) profielen van de bio-deeltje donor (en).
Het algemene doel van deze procedure is om individuele of agglomerate cellen, aangeduid als vermeende bio-deeltjes, te herstellen van forensisch DNA-bewijs van een aanraking en een DNA-profiel van de donor te verkrijgen. Tijdens het plegen van een gewelddadig misdrijf wordt een klein aantal cellen overgedragen van een persoon naar een andere persoon, zoals wanneer een agressor de pols van een slachtoffer grijpt. Om het kleine aantal cellen eerst te herstellen, gebruikt u een laag hechtend gelfilm dat op een microscoopglasplaat is bevestigd om het contactgebied te bemonsteren.
De tweede stap is om de overgedragen bio-deeltjes te kleuren voor gemakkelijker bekijken onder de microscoop. Vervolgens worden de bio-deeltjes geïsoleerd van de gelfilm met behulp van micro-manipulatie. Verzamel de wateroplosbare kleefstof aan de punt van een wolfraamnaald en gebruik deze om de gewenste bio-deeltjes van het gelfilmoppervlak te verwijderen.
De laatste stap is om de afzonderlijk verzamelde bio-deeltjes voorzichtig over te brengen naar een PCR-amplificatiemix aan de onderkant van een PCR-collectie om uiteindelijk verbeterde DNA-typeringsmethoden te gebruiken om een DNA-profiel van de donor van spoor-DNA-bewijs te verkrijgen. Oké, in mijn lab richten we ons op de genetische analyse van het kleine aantal cellen dat wordt overgedragen tijdens het plegen van een gewelddadig misdrijf tegen een persoon tussen één individu en een ander individu, of tussen een individu en een object. Traditionele methoden falen vaak bij het herstellen van het DNA-profiel uit zo'n klein aantal cellen.
Hier hebben we een vereenvoudigde methode ontwikkeld voor de fysieke herstelling en genetische analyse van dergelijke kleine aantallen cellen, ofwel individuele cellen of agglomeraten van cellen die in elk forensisch laboratorium kunnen worden geïntegreerd. Katie Fairish, een afstudeerstudent in mijn lab, zal de procedure demonstreren. Om deze procedure te beginnen, bereidt u de gelfilm voor die zal worden gebruikt voor het verzamelen van bio-deeltjes.
Knip de gelfilm op de gewenste maat die geschikt is voor de glazen microscoopglasplaat die als vaste ondergrond wordt gebruikt. Gebruik bijvoorbeeld voor een glasplaat van drie inch bij een inch, een gelfilmmaat van twee inch bij 0,75 inch. Verwijder de witte achterkant van de gelfilm en bevestig de gelfilm aan de microscoopglasplaat door stevig aan te drukken om een volledige bevestiging te garanderen.
Let op dat er een heldere bovenste beschermende laag is die niet mag worden verwijderd om druk op het stuk gelfilm aan te brengen zonder het gelfilmoppervlak te besmetten. Gelfilms met de beschermlaag kunnen bij kamertemperatuur worden bewaard tot ze nodig zijn. Wanneer u de gelfilm klaar bent om te gebruiken, gebruik dan steriele pincetten om de heldere bovenste beschermlaag te verwijderen. Plaats het gelfilmoppervlak in direct contact met een gewenst aangeraakt object of oppervlak.
Bijvoorbeeld, menselijke huid van de pols. Oefen een kleine hoeveelheid druk uit om een efficiënte overdracht van bio-deeltjes naar de gelfilm te garanderen. Oefen niet te veel druk uit, omdat de glasplaat kapot kan gaan. Meerdere bemonsteringen van hetzelfde object of oppervlak kunnen worden verzameld op hetzelfde stuk gelfilm. Op dezelfde manier kunnen bio-deeltjes worden verzameld van objecten en kledingstukken zoals een shirtkraag.
Om de overdracht van bio-deeltjes op de gelfilm te bevestigen, onderzoekt u de schuif onder een stereomicroscoop met behulp van trans- of epi-verlichting. Een vergroting van ongeveer 20 x is het beste voor het bekijken van grotere gebieden van de gelfilm, terwijl een vergroting van ongeveer 200 x het beste is voor het bekijken van individuele bio-deeltjes. Bewaar de gelfilm-steekproefschuif bij kamertemperatuur in een afgedekte schuivendoos.
Totdat ze klaar zijn voor kleuring en/of het verzamelen van bio-deeltjes, kunnen bio-deeltjes worden gekleurd om de visualisatie te vergemakkelijken. Om dit te bereiken, plaatst u eerst de gelfilm-steekproefschuif die eerder is voorbereid, op een schuifkleurrak boven een gootsteen. Gebruik een wegwerp-overdrachtspijp om het volledige oppervlak van de gelfilm te bedekken met trianblauwe kleurstof. Bewaar deze bij kamertemperatuur gedurende één tot twee minuten.
Verwijder overtollige kleurstof door de schuif te kantelen zodat de kleurstof in de gootsteen kan weglopen indien nodig. De schuif kan worden gespoeld door voorzichtig te overspoelen met steriel water met behulp van een wegwerp-overdrachtspijp. Nadat de schuif is gedroogd, bekijkt u de schuif met behulp van een stereomicroscoop om een correcte kleuring te garanderen.
De gekleurde schuif kan bij kamertemperatuur worden bewaard in een afgedekte schuivendoos. Begin deze procedure door het juiste aantal PCR-buisjes van 0,2 milliliter in een rek te plaatsen en de buisjes op de juiste manier te labelen. Bereid een geschikt volume STR-amplificatiemix voor voor het gewenste aantal monsters.
Vortex en mastermix goed en centrifugeer kort in een minicentrifuge PI-pad. 3,5 microliters van de versterking. Meng in elke 0,2 milliliter buis elk buisje losjes.
Plaats een stuk dubbelzijdig plakband direct op een glazen blok. Dit wordt gebruikt om de 0,2 milliliter buis op zijn plaats te houden tijdens het verzamelen van monsters. Plaats nog een stuk dubbelzijdig plakband op een schone glazen microscoopglasplaat.
Plaats vervolgens een stuk wateroplosbaar golfschoudertape bovenop het dubbelzijdig plakband. Zet het plakband vast door druk uit te oefenen over de lengte van het plakband. De beschermende bovenste witte laag kan vervolgens worden verwijderd.
Plaats vervolgens de eerste 0,2 milliliter buis op het dubbelzijdige plakband Op het glazen blok. Zet deze buis opzij totdat het monster is verzameld. Plaats de wateroplosbare golfsoldaatslide onder de microscoop terwijl u met een lage vergroting kijkt.
Gebruik de punt van een tongstandnaald om voorzichtig het opper
Overzicht
Dit artikel presenteert een gestroomlijnde methode voor het terugwinnen van bio-partikels uit forensische touch-DNA-monsters, waardoor het vermogen om DNA-profielen te verkrijgen uit minimale cellulaire bewijslast wordt vergroot. De procedure omvat een eenstaps micro-volumelyse en STR-amplificatie, wat de collectie en analyse van sporen-DNA optimaliseert.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk vakgebied
- Forensische biologie
- DNA-analyse
- Technieken voor celterugwinning
Achtergrond
- Touch-DNA-bewijs bevat vaak zeer weinig cellen.
- Traditionele methoden kunnen erin falen om DNA-profielen uit dergelijke beperkte monsters te herstellen.
- Efficiënte hersteltechnieken zijn essentieel voor forensisch onderzoek.
- Biopartikels kunnen tijdens gewelddadige misdrijven worden overgedragen, wat effectieve verzamelmethoden noodzakelijk maakt.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een vereenvoudigde methode voor het terugwinnen en analyseren van biodeeltjes.
- Het verbeteren van DNA-typeringsmethoden voor sporen van DNA-bewijsmateriaal.
- Het faciliteren van de integratie van deze technieken in forensische laboratoria.
Gebruikte methoden
- Bereiding van een gelfilm met lage adhesie voor de collectie van biodeeltjes.
- Kleuring van biodeeltjes voor verbeterde visualisatie onder een microscoop.
- Micromanipulatietechnieken voor het isoleren van biodeeltjes.
- Eénstaps microvolume-lyse en STR-amplificatie voor DNA-profilering.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle recovery van individuele en geagglomereerde cellen uit touch-DNA-monsters.
- Verbeterde visualisatie van biodeeltjes door middel van kleuring.
- Verbeterde DNA-profileringsresultaten door gebruik van het geoptimaliseerde amplificatieprotocol.
- Aantoonbare toepasbaarheid van de methode in forensische contexten.
Conclusies
- De ontwikkelde methode verbetert het herstel van DNA uit sporenbewijs aanzienlijk.
- Het biedt een betrouwbare benadering voor de forensische analyse van touch DNA.
- Toekomstige toepassingen kunnen de effectiviteit van forensische onderzoeken vergroten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Forensische touch-DNA-analyse staat voor uitdagingen bij het herstellen van profielen van een enkele bron uit gemengde monsters of monsters met een lage opbrengst, wat de identificatie van daders in zedenzaken beperkt. Deze methode maakt het gericht herstellen van individuele biodeeltjes mogelijk, waardoor kunstmatige DNA-mengsels worden verminderd en het herstel van allelen uit sporenbewijs wordt verbeterd. Door single-cell genetische analyse te ondersteunen, vergroot het de voorspellende betrouwbaarheid in forensische workflows en bij daaropvolgendestappen in de besluitvorming tijdens het onderzoek.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door DNA-profielen van individuele cellen te isoleren uit complexe mengsels.
- Operationele waarde: Vermindert biologische ruis in sporenmonsters, waardoor het vertrouwen in de validatie van targets wordt verbeterd.
- Strategische waarde: Ondersteunt het verminderen van risico's bij studies naar target-engagement door schonere genetische input.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert gezuiverd DNA afgeleid van biodeeltjes voor betrouwbare STR-amplificatie en genotyping.
- Operationele waarde: Standaardiseert de monsterinvoer via micromanipulatie, wat de reproduceerbaarheid van de assay verbetert.
- Strategische waarde: Maakt schaalbare screeningsworkflows mogelijk voor biologische doelen met een lage abundantie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Handhaaft de genetische traceerbaarheid van ontdekkingsmonsters tot aan resolutie op enkelvoudig-deeltjesniveau.
- Operationele waarde: Faciliteert de uitlijning van biomarkers door het genotype te koppelen aan de fenotypische oorsprong in sporenmateriaal.
- Strategische waarde: Verbetert de translationele continuïteit door monster-afgeleide artefacten in longitudinale studies te verminderen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in discovery biology-workflows door de nauwkeurige isolatie van sporen van cellulair materiaal vóór genetische analyse mogelijk te maken, wat hypothese-gestuurde target-validatie ondersteunt.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door het terugwinnen van donor-specifiek DNA uit overgedragen biodeeltjes.
- Screening: Verbetert de gereedheid voor assays door het leveren van gezuiverde DNA-templates uit enkele of een klein aantal cellen.
- Analytica: Genereert kwantitatieve STR-profielen die allelische vergelijking en deconvolutie van mengsels mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt sporenbewijs aan de identiteit van de donor, wat de continuïteit in onderzoeksvalidatie ondersteunt.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Vestigt een herbruikbaar micromanipulatieplatform voor genetische analyse met een lage input over verschillende monstertypes.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door het mogelijk maken van DNA-herstel van een enkele bron uit aanraaksporen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde biopartikelcollectie en lysis/amplificatie.
- Strategische waarde: Vermindert biologische risico's in een laat stadium door interferentie van mengprofielen in forensische zaken te minimaliseren.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde prioritering van monsters op basis van het potentieel voor herstel van een enkele bron.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in microscopie en micromanipulatie voor de isolatie van biodeeltjes.
- Is afhankelijk van steriele gelfilm, wolfraamnaalden en thermocyclers voor PCR met lage volumes.
- Vereist gestandaardiseerde kleurings- en visualisatieprotocollen voor alle operators.
- Overwegingen bij aanpassing omvatten variërende biodeeltjesdichtheid en adhesie over verschillende monstermatrices.
- Praktische beperkingen omvatten een lage doorvoer vanwege handmatige collectie van deeltjes en afhankelijkheid van de vaardigheid van de operator.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
Chapters in this video
0:05
Title
2:13
Collection of Bioparticles from Touched Objects and Surfaces
4:31
Optional Staining of Bioparticles to Aid in Visualization
5:33
Isolation of Bioparticles of Interest for Analysis
9:05
Combined Microvolume Nucleic Acid Isolation and Autosomal STR Profiling
9:51
Results: Enhanced Genetic Analysis of Touch DNA Evidence
11:14
Conclusion
