Name: Systemische bacteriële infectie en afweer Phenotypes in Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Leer hoe je systemische bacteriële infecties induceert bij Drosophila melanogaster en de immuunrespons kwantificeert. Deze methode meet infectieernst en genexpressie van antimicrobiële peptiden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen het hele Lazzaro-lab bedanken, en vooral Susan Rottschaefer, voor hun hulp bij zowel het herzienen als testen van deze protocollen. Dit is een product van hun cumulatieve expertise. Het werk in het Lazzaro-lab wordt ondersteund door subsidies R01 AI083932 en R01 AI064950 van de US National Institutes of Health.

<ol><li>Lemaitre, B., Hoffmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+defense+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">The host defense of Drosophila melanogaster.</a> Annual review of immunology. 25, 697-743 (2007).</li>
<li>Dionne, M. S., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+infectious+diseases+in+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+models+%26+mechanisms%22%5BJournal%5D)">Models of infectious diseases in the fruit fly Drosophila melanogaster.</a> Disease models & mechanisms. 1 (1), 43-9 (2008).</li>
<li>Rutschmann, S., Jung, A. C., Hetru, C., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A., Ferrandon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rel+protein+DIF+mediates+the+antifungal+but+not+the+antibacterial+host+defense+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The Rel protein DIF mediates the antifungal but not the antibacterial host defense in Drosophila.</a> Immunity. 12 (5), 569-580 (2000).</li>
<li>Ayres, J. S., Freitag, N., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Drosophila+mutants+altering+defense+of+and+endurance+to+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of Drosophila mutants altering defense of and endurance to Listeria monocytogenes infection.</a> Genetics. 178 (3), 1807-1815 (2008).</li>
<li>Cronin, S. J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+identifies+genes+involved+in+intestinal+pathogenic+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen identifies genes involved in intestinal pathogenic bacterial infection.</a> Science. 325 (5938), 340-343 (2009).</li>
<li>Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+study+Drosophila+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods to study Drosophila immunity.</a> Methods. , (2014).</li>
<li>Dionne, M. S., Pham, L. N., Shirasu-Hiza, M., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+and+FOXO+dysregulation+contribute+to+infection-induced+wasting+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+CB%22%5BJournal%5D)">Akt and FOXO dysregulation contribute to infection-induced wasting in Drosophila.</a> Current biology CB. 16 (20), 1977-1985 (2006).</li>
<li>McKean, K. a, Yourth, C. P., Lazzaro, B. P., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolutionary+costs+of+immunological+maintenance+and+deployment%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+evolutionary+biology%22%5BJournal%5D)">The evolutionary costs of immunological maintenance and deployment.</a> BMC evolutionary biology. 8 (1), 76(2008).</li>
<li>Kuo, T. -H., Pike, D. H., Beizaeipour, Z., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+triggered+by+an+immune+response+in+Drosophila+is+regulated+by+the+circadian+clock+and+requires+the+NFkappaB+Relish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sleep triggered by an immune response in Drosophila is regulated by the circadian clock and requires the NFkappaB Relish.</a> BMC neuroscience. 11, 17(2010).</li>
<li>Panayidou, S., Ioannidou, E., Apidianakis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pathogenic+bacteria%2C+fungi%2C+and+viruses+in+Drosophila%3A+disease+modeling%2C+lessons%2C+and+shortcomings%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Human pathogenic bacteria, fungi, and viruses in Drosophila: disease modeling, lessons, and shortcomings.</a> Virulence. 5 (2), 253-269 (2014).</li>
<li>Keebaugh, E. S., Schlenke, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+natural+host%E2%80%93parasite+interactions%3A+The+Drosophila+model%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+%26+Comparative+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insights from natural host–parasite interactions: The Drosophila model.</a> Developmental & Comparative Immunology. 42 (1), 111-123 (2014).</li>
<li>Howick, V. M., Lazzaro, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotype+and+diet+shape+resistance+and+tolerance+across+distinct+phases+of+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+evolutionary+biology%22%5BJournal%5D)">Genotype and diet shape resistance and tolerance across distinct phases of bacterial infection.</a> BMC evolutionary biology. 14 (1), 56(2014).</li>
<li>Babin, A., Kolly, S., Kawecki, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulent+bacterial+infection+improves+aversive+learning+performance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+behavior%2C+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Virulent bacterial infection improves aversive learning performance in Drosophila.</a> Brain, behavior, and immunity. , (2014).</li>
<li>Chambers, M. C., Song, K. H., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+infection+causes+metabolic+shifts+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes infection causes metabolic shifts in Drosophila melanogaster.</a> PLoS ONE. 7 (12), e50679(2012).</li>
<li>Fellous, S., Lazzaro, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+food+quality+affects+adult+%28but+not+larval%29+immune+gene+expression+independent+of+effects+on+general+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+ecology%22%5BJournal%5D)">Larval food quality affects adult (but not larval) immune gene expression independent of effects on general condition.</a> Molecular ecology. 19 (7), 1462-1468 (2010).</li>
<li>Stone, E. F., Fulton, B. O., Ayres, J. S., Pham, L. N., Ziauddin, J., Shirasu-Hiza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circadian+clock+protein+timeless+regulates+phagocytosis+of+bacteria+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">The circadian clock protein timeless regulates phagocytosis of bacteria in Drosophila.</a> PLoS pathogens. 8 (1), e1002445(2012).</li>
<li>Chambers, M. C., Jacobson, E., Khalil, S., Lazzaro, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thorax+injury+lowers+resistance+to+infection+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Thorax injury lowers resistance to infection in Drosophila melanogaster.</a> Infection and immunity. , (2014).</li>
<li>Rich, J. T., Neely, J. G., Paniello, R. C., Voelker, C. C. J., Nussenbaum, B., Wang, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+understanding+Kaplan-Meier+curves%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngology--head+and+neck+surgery+official+journal+of+American+Academy+of+Otolaryngology-Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">A practical guide to understanding Kaplan-Meier curves.</a> Otolaryngology--head and neck surgery official journal of American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 143 (3), 331-336 (2010).</li>
<li>Freeman, W. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSokal%2C+RR+%22Biometry%22">Biometry</a>. , (1995).</li>
<li>Frydman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+bacterial+infection+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Wolbachia bacterial infection in Drosophila.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (2), 158(2007).</li>
<li>Kuo, T. -H., Handa, A., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+of+the+immune+response+and+sleep+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement of the immune response and sleep in Drosophila.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (70), e4355(2012).</li>
<li>Vodovar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+host+defense+after+oral+infection+by+an+entomopathogenic+Pseudomonas+species%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Drosophila host defense after oral infection by an entomopathogenic Pseudomonas species.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (32), 11414-11419 (2005).</li>
<li>Nehme, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+bacterial+intestinal+infections+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">A model of bacterial intestinal infections in Drosophila melanogaster.</a> PLoS pathogens. 3 (11), e173(2007).</li>
<li>Jaenike, J., Polak, M., Fiskin, A., Helou, M., Minhas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecific+transmission+of+endosymbiotic+Spiroplasma+by+mites%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Interspecific transmission of endosymbiotic Spiroplasma by mites.</a> Biology. 3 (1), 23-25 (2007).</li>
<li>Kanbar, G., Engels, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+and+bacterial+infection+of+wounds+in+honey+bee+%28+Apis+mellifera%29+pupae+punctured+by+Varroa+mites%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+research%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure and bacterial infection of wounds in honey bee ( Apis mellifera) pupae punctured by Varroa mites.</a> Parasitology research. 90 (5), 349-354 (2003).</li>
</ol>

Geen van de auteurs heeft concurrerende belangen of tegenstrijdige belangen.

De hier beschreven procedure levert strenge en hoge kwaliteit infectie van Drosophila melanogaster. De weergegeven voorbeelden vooral gericht op infectie met Providencia rettgeri en E. coli, maar het protocol is zeer flexibel en kan worden toegepast voor besmetting met diverse bacteriën over een traject van gastheer wordt toegepast en onderhoudsvoorwaarden. De data van een optimale experimentele benadering zal afhangen van de bacterie die voor infectie, het genotype van de gastheer, en de algemene experimentele omstandigheden. Het wordt sterk aanbevolen om pilot eventuele nieuwe experimentele omstandigheden voor het starten van meer ambitieuze projecten. Een goed uitgangspunt is om drie infectie doses te testen over een 100-voudig bereik. Zeer virulente pathogenen worden vaak best geïntroduceerd bij zeer lage doses besmettelijk, in de orde van 10-100 bacteriële cellen per vliegen. Gematigdere ziektekiemen worden geïnjecteerd bij hogere doses van ongeveer 1000 bacteriën per fly en niet-pathogenen worden geïnjecteerd in doses zo hoog als 10.000 bacteriën per vlieg. Vaak is het leerzaam om de kinetiek van nieuwe infecties te bepalen door het volgen pathogenen talrijke mortaliteit en activiteit van het immuunsysteem in een longitudinale tijdreeks. Door meting van pathogenen en gastheer genexpressie destructieve metingen, moet worden onderscheiden vliegen infecteren bij het begin van het experiment voor elk tijdstip dat moet worden gemeten. Bij de beslissing om speldenprik of-microcapillaire gebaseerde injectie gebruiken, is het belangrijk om op te merken zijn er voordelen en beperkingen van elke benadering. Capillaire injectie wordt een hoeveelheid vloeistof in de vlieg, die zowel geringe verhoging turgor en introduceert zouten of andere moleculen die zijn gesuspendeerd of opgelost in de drager. Capillaire injectie vereist ook toegang tot een injectie faciliteit of de aankoop van de benodigde apparatuur. Septic speldenprik vereist geen speciale apparatuur en introduceertverwaarloosbare media in de vlieg en is meestal efficiënter te infecteren grote aantallen vliegen. Echter, pinprick infecties niet de nauwkeurige controle over infectiedosis die kan worden bereikt met capillaire injectie toe. Het onderhavige protocol gericht op een injectie-inrichting die mechanisch regelt injectievolume, maar er zijn ook injectiesystemen gebaseerd op discrete pulsen van perslucht. 20,21 Deze zijn meestal duurder dan de inrichting gekenmerkt worden gekalibreerd naar en van de luchtpuls elke naald teneinde consistente injectie volumes garanderen. Er is veel discussie, maar zeer weinig gegevens over hoe vliegen worden systemisch besmet met bacteriën in het wild. Sommige onderzoekers stellen dat de meeste natuurlijke infecties optreden bij Drosophila inslikken pathogene bacteriën en de bacteriën vervolgens kunnen de darm ontsnappen naar een systemische infectie te vestigen. Er zijn echter zeer few bacteriën die in staat zijn om de darm van D. steken melanogaster, en degenen die hebben dit vermogen zijn zeer dodelijk voor vliegen 22,23. Een andere theorie is dat regelmatig vliegt houden cuticulair verwondingen door de ontsnapping van mislukte pogingen predatie of aanval door ectoparasitaire mijten. Deze hypothese wordt ondersteund door de frequente verzameling van wilde D. melanogaster dragende melanisatie plekken die indicatief genezen wonden (ongepubliceerde observaties) zijn. Mijten is aangetoond dat bacteriële infecties uitzenden in Drosophila 24 en wonden door mijten kan secundair geïnfecteerd met bacteriën in honingbijen 25. De frequentie aard mijt gedreven of anderszins opportunistische infectie van D. melanogaster door de cuticula inbreuken is niet bekend. De hier beschreven protocol maakt introductie van bacteriën direct in de hemolymfe door middel van kwantitatieve injectie die alle epitheliale barrières of gedragsproblemen IMMU omzeiltschap. Werkwijzen voor het toevoeren van pathogene bacteriën D. melanogaster zijn beschreven in Vodovar et al. 22 en Nehme et al. 23. Veel entomopathogene bacteriën vormen weinig of geen gevaar voor de menselijke gezondheid, waardoor onderzoekers om comfortabel te werken met hen. Verder weinig bacteriën het vermogen om Drosophila infecteren contact zonder experimentele interventie, waardoor de kans op &quot;epidemische&quot; verspreiding van bacteriële infecties door een laboratorium via besmette oppervlakken of ontsnapt vliegt het algemeen zeer laag. Toch is het raadzaam om ervoor te zorgen dat er voldoende containment maatregelen zijn getroffen om te voorkomen dat besmette vliegen ontsnappen en heroveren elke ontsnapte vliegen. Het laboratorium dient te worden uitgerust met een biologische veiligheid niveau dat overeenstemt met dat van de ziekteverwekkers wordt gebruikt en standaard best practices in de microbiologie moeten worden gebruikt. De experimentele infectiop de hier beschreven methode maakt infecties van Drosophila melanogaster met een dosis willekeurige bacterie. Nadat infectie is vastgesteld, is het eenvoudig om de kinetiek van bacteriële proliferatie of klaring meten gastheer sterfte te volgen en inductie van het gastheerimmuunsysteem testen. Geïnfecteerde vliegen kunnen gemakkelijk worden onderworpen aan andere fenotypische testen, waaronder testen van fysiologische functies die kunnen vormen of worden gevormd door de infectie. De beschreven procedures zijn goedkoop, vereisen relatief weinig gespecialiseerde apparatuur, en zijn gemakkelijk te leren, waardoor ze vatbaar zijn voor gebruik in uiteenlopende projecten over een breedte van onderzoek en onderwijs labs.

De fruitvlieg Drosophila melanogaster is een van de belangrijkste modelorganismen voor het bestuderen van de functie en de ontwikkeling van immune afweer. Drosophila zijn goedkoop en gemakkelijk kweken, zijn zeer vatbaar voor experimentele manipulatie en worden ondersteund door een uitgebreide wetenschappelijke gemeenschap dat een breed ontwikkeld reeks van research tools. Veel aspecten van aangeboren immuniteit worden geconserveerd tussen insecten en zoogdieren, waaronder signaaltransductie gemedieerd door Toll-like receptoren en NF-kB familie transcriptiefactoren, JAK / STAT signalering en JNK pathway reacties. 1,2 De functie van deze genen en paden kan worden opgevraagd in D. melanogaster middels mutaties of RNAi knockdowns deze verhoging of verlaging pathway activiteiten 3 -. 6 Daarnaast Drosophila kan worden gebruikt om de fysiologische gevolgen van infectie en ziekte te bestuderen, zoals in de context van de evolutionaire levensloop theorie 7.- 9 Al deze studies echter afhangen van het vermogen om op betrouwbare infecteren experimentele vliegen onder gedefinieerde behandelingsomstandigheden. De hier beschreven procedure geeft een methodologisch raamwerk voor het leveren robuuste en herhaalbare bacteriële infecties Drosophila melanogaster en vervolgens meten infectie ernst en kwantificeren van de immuunrespons van de gastheer. Drosophila kan natuurlijk en experimenteel geïnfecteerd met diverse parasieten en pathogenen, waaronder bacteriën, schimmels, virussen, nematoden en sluipwespen. Het huidige protocol is gericht op het leveren van systemische bacteriële infectie. Veel verschillende bacteriën kunnen worden gebruikt om vliegen te infecteren, en de keuze van de experimentator moet worden gebaseerd op de precieze wetenschappelijke vragen worden gesteld. Bijvoorbeeld kunnen menselijke klinische isolaten worden toegepast om bacteriële virulentie mechanismen 10 studeren of ecologisch relevante isolaten kunnen worden preferred voor evolutionair onderzoek. 11 Sommige bacteriën zijn bevoegde ziekteverwekkers van D. melanogaster, uitdijende na infectie en het veroorzaken van gastheer ziekte of dood. Andere bacteriën effectief worden beheerd door het gastheerimmuunsysteem en opgeruimd binnen enkele dagen. In deze demonstratie wordt Providencia rettgeri gebruikt als een proliferatieve ziekteverwekker die gastheer sterfte kunnen veroorzaken en blijft in overlevende gastheren. Escherichia coli wordt gebruikt als een niet-pathogeen die wordt gewist door het gastheerimmuunsysteem. Infectie wordt vastgesteld door het inbrengen van bacteriën direct in de lichaamsholte van de vlieg. Deze aanpak omzeilt epitheliale barrières en beschermende gedrag, waardoor onderzoek naar systemische infectie, ongeacht de natuurlijke wijze van overdracht. Er zijn twee primaire werkwijzen voor experimenteel vaststelling van systemische infectie. In de eerste, een nanoinjector en getrokken glazen capillaire naalden worden gebruikt om een ​​exact aantal spuitenbacteriën in de vlieg. Deze methode heeft het voordeel van het toestaan ​​van een groot dynamisch bereik van infectie doses en kwantitatief hoge herhaalbaarheid. De tweede benadering is om infectie te leveren met een septische speldenprik. Deze aanpak heeft het voordeel dat het snel en vereist geen speciale apparatuur. Zodra de infecties zijn vastgesteld, wordt het mogelijk om systemische pathogenen talrijke mortaliteit en induceerbare immuunsysteem te meten. Natuurlijk kan elk aantal bijkomende fenotypen denkbaar gemeten in geïnfecteerde D. melanogaster, met inbegrip van post-infectie vruchtbaarheid 12, leervermogen 13, metabole status van 14, of vrijwel elke andere eigenschap die kan worden gedacht.

<table><tbody><tr><td>Incubator</td><td>Powers Scientific, Inc</td><td>DROS52SD</td><td></td></tr><tr><td>Paintbrush</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 Flypads</td><td>FlyStuff</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Airgas</td><td>CD FG50</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila rearing mix&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td></td></tr><tr><td>Nosterile Extra Large Cotton Balls</td><td>Fisher brand</td><td>22-456-882</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Vials polystyrene</td><td>VWR international</td><td>89092-720</td><td></td></tr><tr><td>Nosterile Large Cotton Balls</td><td>Fisher brand</td><td>22-456-883</td><td></td></tr><tr><td>2 L flask</td><td>VWR international</td><td>89000-370</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 x 15 mm;</td><td>VWR international</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar, Miller</td><td>Difco</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Innoculing Loop</td><td>VWR international</td><td>80094-488</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Clasic Pipettes in various sizes 0.1 &micro;l to 2 &micro;l, 2 &micro;l to 20 &micro;l, 20 &micro;l to 200 &micro;l, 100 &micro;l to 1,000 &micro;l</td><td>Rainin</td><td>PR-2 PR-20 PR-200 PR-1000</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette tips (assorted sizes)</td><td>VWR international</td><td>30128-376 53503-810 16466-008</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth Base, Miller</td><td>Difco</td><td>241420</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Culture Tubes Borosilicate Glass</td><td>VWR international</td><td>47729-576</td><td></td></tr><tr><td>S-500 Orbital Shaker</td><td>VWR international</td><td>14005-830</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>VWR international</td><td>37001-300</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 10X</td><td>Invitrogen</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000 Spectrophotometer</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>Semimicrovolume Cuvettes</td><td>Bio-Rad</td><td>223-9955</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Capillary Puller</td><td>Kopf Needle Pipette Puller</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.5'' Replacement glass Capillaries for Nanojet II</td><td>Drummond Sientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond Sientific Company</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Syringe</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Mineral Oil, White, light</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>6358-10</td><td></td></tr><tr><td>Minutein pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml&nbsp; Microcentrifuge tubes; Seal Rite</td><td>USA Scientific Inc.</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Motorized Pestle; Talboys Laboratory Stirrer</td><td>Troemner</td><td>103</td><td></td></tr><tr><td>Talboys High Throughput Homogenizer</td><td>OPS Diagnostics</td><td>930145</td><td></td></tr><tr><td>5/32'' Grinding Balls</td><td>OPS Diagnostics</td><td>GBSS 156-5000-01</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie</td><td>Scientific indurstries inc.</td><td>G560</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel Pipettor (10 &mu;l - 300 &mu;l)</td><td>Sartorius</td><td>730360</td><td></td></tr><tr><td>WASP2 Whitley Automated Spiral Plater</td><td>Microbiology International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ProtoCOL automated colony counter / plate counter/ plate reader&nbsp;</td><td>Microbiology International</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>qPCR tubes; Low-Profile 0.2 ml 8-Tube Strips</td><td>Bio-Rad</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td>qPCR caps; Optical Flat 8-Cap Strips</td><td>Bio-Rad</td><td>TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNase-Free DNase</td><td>Promega</td><td>m610a</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV Reverse Transcriptase</td><td>Promega</td><td>m170b</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1240</td><td></td></tr><tr><td>Oligo-dT</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;SsoAdvanced SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5260</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio-Rad</td><td>185-5200</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Ribonuclease Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2115</td><td></td></tr></tbody></table>

systemische bacteriële infectie en afweer phenotypes in<em&gt; drosophila melanogaster</em

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

De fruitvlieg Drosophila melanogaster is een van de belangrijkste model organismen voor het bestuderen van de functie en de evolutie van de afweer. Vele aspecten van de aangeboren immuniteit zijn geconserveerd tussen insecten en zoogdieren, en aangezien Drosophila gemakkelijk genetische en experimenteel kunnen worden gemanipuleerd, krachtig zijn voor het bestuderen van het immuunsysteem en de fysiologische gevolgen van de ziekte. De hier gedemonstreerd maakt infectie van vliegen door het inbrengen van bacteriën direct in de lichaamsholte, omzeilen epitheliale barrières en meer passieve verdediging en waardoor de nadruk op systemische infectie. De procedure omvat protocollen voor het meten van snelheden van gastheer sterfte, systemische pathogenen, en de mate van inductie van het gastheerimmuunsysteem. Deze infectie procedure is goedkoop, robuust en kwantitatief herhaald en kan worden gebruikt in studies van functionele genetica, evolutionaire levensloop en fysiologie.

Deze sectie geeft resultaten die kunnen worden verkregen na bacteriële infectie van Drosophila melanogaster. Figuur 1 toont dat infectiedosis afhankelijk van de optische dichtheid van de bacteriële suspensie voor injectie, en dat de toegediende dosis betrouwbaar kan worden geschat door homogeniseren en plateren na injectie vliegt onmiddellijk . Zoals geïllustreerd in figuur 2, kunnen verschillende pathogenen maken verschillende ontvangende mortaliteit (Figuur 2A) en gastheer sterfte kan dosisafhankelijke (Figuur 2B) zijn. Belangrijk Dit protocol maakt verschillende soorten infecties te verwezenlijken: Providencia rettgeri is een chronische, subletale infectie die aanhoudt gedurende 20 dagen of langer (figuur 3A) te veroorzaken. Echter, andere bacteriën zoals Escerichia coli zal vooral worden door de gastheer vlieg binnen zes uur na infectie (Figuur 3B) gewist. Inductie van de immune systeem kan worden geschat door middel van RNA isolatie en vervolgens qRT-PCR antibacterieel peptide transcripten (figuur 4A en B). Analoog maar kwantitatief minder, vliegen die GFP onder de controle van antimicrobiële peptide-gen promoters kunnen worden gebruikt voor inductie van het immuunsysteem (figuur 4C) te visualiseren. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig1.jpg" /> . Figuur 1: Het bepalen van Infectieuze Dosis Vliegen werden geïnjecteerd met 50 nl van bacteriesuspensies die een reeks van optische dichtheden (,0001-,05). De vliegen werden onmiddellijk gehomogeniseerd en uitgeplaat op het aantal bacteriële ingevoerd door de injectie te bepalen. Initiële bacteriële belasting sterk correleert met de eerste OD geïnjecteerd (r 2 = 0,96) <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig2.jpg" /> <strong&gt; Figure 2:. overleving na injectie van bacteriële pathogenen Vijf tot zeven dagen oude mannetjes werden geïnjecteerd met 50 nl van hetzij bacteriële suspensie of steriele media en gecontroleerd op overleving. (A) wildtype vliegen werden geïnjecteerd met ongeveer 5000 bacteriën van één van drie verschillende soorten. De snelheid van de gastheer sterfte is sterk afhankelijk van de bacteriële soorten gebruikt voor infectie. (B) Wildtype vliegen werden geïnjecteerd met drie verschillende doses van Enterococcous faecalis - 50, 500, en 5000 bacteriën per vliegen. Vliegen sterven sneller wanneer besmet met hogere besmettelijke doses (C) een immuunsysteem mutant en zijn wild-type isogene controle lijn werden geïnjecteerd met ongeveer 500 Burkholderia cepacia. Een paarsgewijze Log-Rank vergelijking blijkt dat het wild-type fly overleeft de infectie significant beter dan de mutant (χ 2 = 59,02, df = 1, p &lt;0,0001). Figuur 3:. Van bacteriën na injectie vliegen werden geïnjecteerd met bij benadering (A) 5000 P. rettgeri (B) 3.400 E. coli. Aantal bacteriën werd bepaald onmiddellijk na injectie en op verschillende latere tijdstippen. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt de bacteriële verontreiniging van een enkele vlieg. E. coli wordt snel geklaard uit uitgedaagd hosts terwijl P. rettgeri blijft voor de rest van het leven van de gastheer ,. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig4.jpg" /> Figuur 4: Inductie van Immune genexpressie na injectie. (A) vliegen werden geïnjecteerd met 50 nl van P. rettgeri of steriel PBS in hetzij de buik of de borstkas, of werden terzijde ongemanipuleerde links van CO <sub&gt; 2 anesthesie. Zes uur na de infectie werden vliegen verzameld voor RNA-isolatie en expressie van de Diptericin A gen werd bepaald met qRT-PCR. (A) Expressie niveaus grafiek weergegeven als de verhouding van Diptericin A transcript rp49 transcript en geschaald zodat de CO 2 besturing wordt gedefinieerd als een expressieniveau van 1. De staven stellen de gemiddelde en standaardfout van verhoudingen van elke omstandigheid (n = 4). (B) Expressie niveaus grafiek weergegeven als 2 ΔΔCT de gemiddelde CT-waarde van CO 2 aesthesia control vliegen gebruikt als standaard niet-geïnduceerde toestand. De staven stellen de gemiddelde en standaardfout van ΔΔC T van elke omstandigheid (n = 4). Hoewel er geen verschil in inductie transcript vanwege injectieplaats, vergeleken panelen A en B toont hoe de ΔΔC T-werkwijze mogelijk kunnen overschatten inductie levels. (C) Vliegen die GFP onder controle van de promoter Diptericin werden geïnjecteerd met 50 nl van P. rettgeri (OD = 0,1) en vervolgens afgebeeld 7 dagen later. De GFP-paneel toont de expressie van GFP in het buikvet lichaam van geïnfecteerde vliegen, met vermelding van de activering van de Diptericin A promoter in bacterieel besmette vliegen, maar niet-media geïnjecteerd controles. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Gen </td><td> Vooruit </td><td> Reverse </td></tr><tr><td> rp49 (ook wel rpL32) </td><td> 5 &#39;AGGCCCAAGATCGTGAAGAA 3&#39; </td><td> 5 &#39;GACGCACTCTGTTGTCGATACC 3&#39; </td></tr><tr><td> Diptericin A </td><td> 5 &#39;GCGGCGATGGTTTTGG 3&#39; </td><td> 5 &#39;CGCTGGTCCACACCTTCTG 3&#39; </td></tr><tr><td> Drosomycin </td><td> 5 &#39;CTGCCTGTCCGGAAGATACAA 3 &#39; </td><td> 5 &#39;TCCCTCCTCCTTGCACACA 3&#39; </td></tr><tr><td> Defensine </td><td> 5 &#39;GAGGATCATGTCCTGGTGCAT 3&#39; </td><td> 5 &#39;TCGCTTCTGGCGGCTATG 3&#39; </td></tr><tr><td> Attacin A </td><td> 5 &#39;CGTTTGGATCTGACCAAGG 3&#39; </td><td> 5 &#39;AAAGTTCCGCCAGGTGTGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Metchnikowan </td><td> 5 &#39;AACTTAATCTTGGAGCGATTTTTCTG 3&#39; </td><td> 5 &#39;ACGGCCTCGTATCGAAAATG 3&#39; </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Primers voor qRT-PCR.

Drosophila melanogaster is een uitstekend modelorganisme voor het bestuderen van aangeboren immuunsystemen en de fysiologische gevolgen van infectie en ziekte. Dit protocol beschrijft hoe robuuste en kwantitatief herhaalbare bacteriële infecties aan D. melanogaster kunnen worden toegediend, en hoe vervolgens de ernst van de infectie kan worden gemeten en de immuunrespons van de gastheer kan worden gekwantificeerd.

Systemische bacteriële infectie en afweer Phenotypes in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

Het algemene doel van deze procedure is om robuuste en herhaalbare bacteriële infecties te leveren aan drosophila, melanogaster, en vervolgens de ernst van de infectie te meten en de immuunrespons van de gastheer te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst de bacteriële infectie in de vliegen te brengen met behulp van een nano-injector. Post-mortaliteit kan na de infectie worden gevolgd en de systemische bacteriële belasting kan op elk moment worden bepaald door geïnfecteerde vliegen te homogeniseren en het aantal aanwezige bacteriën te meten.De immuunverdediging van de gastheer kan ook worden gekwantificeerd door de expressieniveaus van antibacteriële peptidegenen te meten, wat uiteindelijk leidt tot kwantificering en karakterisering van bacteriële infectie. Bij drosophila melanogaster kan worden getest hoe genetische en omgevingsfactoren de immuuncompetentie van de vlieg beïnvloeden. Deze methode kan worden gebruikt om belangrijke vragen op het gebied van insectenimmuniteit te beantwoorden, zoals hoe gastheer-genetische en omgevingsfactoren de immuuncapaciteit beïnvloeden of hoe verschillende bacteriën variëren in hun infectiekinetica. Hoewel we deze methode gebruiken om de immuunverdediging van drosophila melanogaster tegen bacteriële infectie te meten, kan deze ook worden toegepast op andere insecten en kan gebruik maken van andere soorten pathogenen zoals virussen of schimmels.Een veel voorkomend probleem dat mensen ervaren wanneer ze deze methode voor het eerst leren, is dat ze mogelijk te veel letsel veroorzaken bij vliegen, wat kan resulteren in een buitensporig hoge mortaliteit, zelfs in controles. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal voor het leren van infectie met minimale schade aan de vlieg. Aangezien onze gastheersoort oph melanogaster zo klein is, moet de infectie onder de microscoop worden uitgevoerd, wat de initiële complexiteit van de techniek toevoegt.Wij geloven echter dat een kleine demonstratie van de techniek deze toegankelijk zal maken, zelfs voor wetenschappers die slechts beperkte ervaring hebben met vliegen. Om het experiment te beginnen, selecteer een enkele kolonie van een eerder bereide masterplaat en inoculeer een fles met steriele medium. Laat de bacteriën overnacht bij 37 graden Celsius groeien tot stationaire fase.Zodra de cultuur de stationaire fase heeft bereikt, pel de cellen voorzichtig uit 600 microliter van de cultuur in een tafelcentrifuge gedurende drie minuten bij 5.000 keer. G, gooi vervolgens de Rena en Resus weg. Suspendeer de bacteriën in 1000 microliter steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS.Verdun vervolgens de gesuspendeerde cellen in steriele PBS om de gewenste absorptie van 600 nanometer te bereiken en gebruik deze suspensie om de vliegen te infecteren. Bereid een glazen naald voor door een lenen silicaatglas capillair te trekken en gebruik een pincet om de punt van de naald af te breken om een opening van 50 micrometer diameter te creëren. Plaats vervolgens de plafond-O-ring en de witte spacer met de grote kuil naar buiten op de metalen plunjer van de injector.Vul de glazen naald met minerale olie met behulp van een spuit met een naald van 30 gauge. Plaats vervolgens de gevulde glazen naald door de collet en plaats de grotere O-ring rond de basis ervan, een millimeter van het stompe uiteinde van de naald. Schuif de naald op de metalen plunjer en draai voorzichtig de collet vast totdat deze vastzit.Verwijder het minerale olie uit de injector, laat een klein volume olie in de naald achter om als barrière te dienen tussen de injector en de bacteriële suspensie. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen zijn in de minerale olie, de bacteriële suspensie of tussen de twee vloeistoffen. Stel vervolgens de injector in op het gewenste injectievolume.Breng voorzichtig de punt van de capillaire naald in een buis met steriele PBS en druk op de vulknop op de injector om de injectornaald te vullen om wondcontroles te genereren. Injecteer verdoofde vliegen met steriele PBS in de voorste buik op het ventrale laterale oppervlak. Plaats de geïnjecteerde vliegen in verse flesjes met nieuw medium en leg de flesjes op hun zijkant om te voorkomen dat de vliegen vast komen te zitten aan het voedsel voordat ze herstellen van hun anesthesie. Vervolgens wordt het resterende steriele medium uit de injector geëjecteerd en wordt dezelfde naald opnieuw gevuld met de bacteriële suspensie.Herhaal de procedure en injecteer de vliegen met de bacteriële suspensie. Als alternatief kan de infectie worden toegediend door een septische pinprik. Om de infectiepin voor te bereiden, smelt u het uiteinde van een micropipettip van 200 microliter en steekt u een insect mnuchin-pin van 0,15 millimeter in het gesmolten plastic.Laat het plastic stollen zodat de pin op zijn plaats wordt gehouden met 0,5 centimeter pin die uit het plastic steekt. Verdoof vliegen met kooldioxide en prik de vliegen in de sternale pleuraplaat van de thorax met de naald, waarbij u de hechtingsplaatsen van de vleugels en de poten vermijdt. Verwijder de vliegen van de minutia-pin met behulp van zachte pincetten. Zorg ervoor dat u de pin tussen het prikken van elke vlieg in de bacteriële suspensie doopt.Plaats de geprikte vliegen in een verse fles met nieuw vliegmedium en leg de fles op zijn zijkant totdat alle vliegen zijn hersteld van de anesthesie. Plaats een subset van de geïnfecteerde vliegen in afzonderlijke microcentrifugebuisjes op ijs. Voeg 250 microliter PBS toe aan elke buis en gebruik een stamper om de vliegen te homogeniseren.Plateer vervolgens het homogenaat op een LB-aerate met behulp van een spiraalplateerder. Als alternatief kan het homogenaat worden geplateerd door seriële verdunning. Breng elk vlieghomogenaat over naar de eerste rij van een 96.Welplaat en vul elk wel van de resterende rijen met 90 microliter PBS met behulp van een multikanaals pipet. Neem 10 microliter uit de eerste rij die vlieghomogenaat bevat en verdeel het homogenaat in de tweede rij. Pipet het omhoog en omlaag minstens 10 keer om het homogenaat grondig te mengen.Neem vervolgens 10 microliter van

systemic-bacterial-infection-immune-defense-phenotypes-drosophila

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Sluipwesp (parasitaire) wespen vormen een belangrijke klasse van natuurlijke vijanden van veel insecten...

Een inleiding tot sluipwespen van<em&gt; Drosophila</em&gt; En de Antiparasite immuunrespons

Om een ​​verband tussen de immuunrespons en gedrag te begrijpen, beschrijven we een methode om locomotorisch gedrag te meten...

Kwantitatieve meting van de immuunrespons en Sleep in<em&gt; Drosophila</em

This video demonstrates the nano-injection of bacterial suspension into the fly body cavity, resulting in bacterial multiplication and infection. The fly's immune response clears some bacteria, while others escape immune clearance and survive within the host causing an infection.

Infecting Flies with Bacterial Suspension Using a Nanoinjector

This video demonstrates a technique to infect Drosophila by introducing a pathogenic bacteria directly into their body cavity. This method bypasses epithelial barriers and other passive defense mechanisms, allowing for the induction of systemic infection. Upon infection, the resulting immune response is assessed by monitoring fly mortality and performing downstream assays.

A Septic Pinprick Technique to Introduce Systemic Bacterial Infection in Flies

In this video, we demonstrate a technique for measuring the E. coli bacterial load after injecting E. coli into the thorax of Drosophila melanogaster.

Measuring E. coli Bacterial Load in Drosophila melanogaster following E. coli Infection

Een methode voor het kweken van Drosophila melanogaster onder axenic en gnotobiotische voorwaarden wordt gepresenteerd. Fly embryo's worden dechorionated in natriumhypochloriet, aseptisch in steriele voeding en grootgebracht in gesloten containers. Inenten van voeding en embryo's met bacteriën leidt tot gnotobiotische verenigingen, en bacteriële aanwezigheid wordt bevestigd door plating whole-body Drosophila homogenaten.

Het grootbrengen de fruitvlieg<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Onder Axenische en gnotobiotische voorwaarden

Deze methode laat zien hoe om te visualiseren pathogen invasie in insect cellen met driedimensionale (3D) modellen. Hemocytes van Drosophila larven waren besmet met virale of bacteriële pathogenen, ex vivo of in vivo. Besmette hemocytes werden vervolgens vast en gekleurd voor imaging met een confocal microscoop en de daaropvolgende 3D cellulaire wederopbouw.

Winning van Hemocytes van Drosophila melanogaster larven voor microbiële infectie en analyse

Dit protocol wordt beschreven methoden om mondeling bloot en de fruitvlieg Drosophila melanogaster met bacteriële pathogenen infecteren, en voor het meten van het aantal infectieuze bacteriën schuur na infectie van de darm. Verder beschrijven we het effect van immuun mutanten op vliegen overleving na mondelinge bacteriële infectie.

Mondelinge bacteriële infectie en Shedding bij Drosophila melanogaster

Dit protocol beschrijft een in vivo fagocytose assay in volwassen Drosophila melanogaster te kwantificeren fagocytensysteem erkenning en goedkeuring van de microbiële infecties.

Beoordeling van de cellulaire immuunrespons van de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, met behulp van een In Vivo fagocytose Assay

Dit protocol beschrijft een in vivo test van fagocytose die wordt gebruikt om het vermogen van jonge en oude Drosophila melanogaster hemocyten te beoordelen en te kwantificeren..

Beoordeling van het leeftijdsspecifieke phagocytische vermogen van volwassen drosophila melanogaster Hemocyten met behulp van een In Vivo Phagocytosis Assay

Drosophila melanogaster volwassen vliegen zijn uitgebreid gebruikt als modelorganismen om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan antimicrobiële aangeboren immuunresponsen van de gastheer en microbiële infectiestrategieën. Om het D. melanogaster larvestadium als aanvullend of alternatief modelsysteem te promoten, wordt een larvale injectietechniek beschreven.

Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol

Leer hoe je systemische bacteriële infecties induceert bij Drosophila melanogaster en de immuunrespons kwantificeert. Deze methode meet infectieernst en genexpressie van antimicrobiële peptiden.

Systemische bacteriële infectie en afweer Phenotypes in

Meer video's verkennen