Gedroogde bloed vlekken - voorbereiden en verwerken voor gebruik in immunoassay en moleculaire technieken

Het algemene doel van deze procedure is om een gestandaardiseerd protocol te bieden voor het voorbereiden en verwerken van gedroogde bloedvlekken die vervolgens worden gebruikt in immunoassays en in moleculaire technieken. Dit wordt bereikt door eerst capillair bloed te nemen en dit over te brengen naar een filterkaart. De tweede stap is om de bloedvlekken een nacht te laten drogen en om zes millimeter uitsnijdingen uit de cirkels van de filterkaart te verkrijgen.

Vervolgens wordt de extractie van gedroogde bloed uit de uitsnijdingen bereikt door deze in buffer onder te dompelen op een schuddende shaker gedurende minimaal vier uur. De hemolytische EIT's worden vervolgens bevrijd van puin door centrifugatie. De laatste stap is om de geklaarde EIT's te analyseren op serologische en moleculaire markers van infecties met het Hepatitis B, hepatitis C en humaan immunodeficiëntie virus door middel van commercieel verkrijgbare immunoassays en moleculaire technieken.

Het idee om bloed op een filterkaart te verzamelen ontstond een eeuw geleden. Desondanks zullen mensen die deze methode voor de eerste keer gebruiken, zelfs vandaag de dag vaak worstelen omdat de gehele pre-analytische fase, die de voorbereiding en verwerking van gedroogde bloedvlekken voor hun uiteindelijke analyse omvat, voor bijna alle toepassingen van gedroogde bloedvlektesten niet is gestandaardiseerd. Gezien deze achtergrond, stellen we een uitgebreid gestandaardiseerd stapsgewijs protocol voor voor de voorbereiding en verwerking van gedroogde bloedvlekken die vervolgens worden gebruikt in immuunassay en moleculaire technieken.

Visuele demonstratie van deze methodologie lijkt cruciaal, aangezien verschillende stappen zoals het afnemen van capillair bloed niet gemakkelijk te leren zijn. Het is correct. Overdracht naar de filterkaarten of de voorbereiding van geschikte uitsnijdingen uit de drukte zijn niet eenvoudig te leren en bijgevolg zullen personen die de techniek voor de eerste keer gebruiken ongetwijfeld baat hebben bij visuele representatie.

Capillair bloed zal worden afgenomen van Nico's vinger door een technicus van ons laboratorium die de procedure van verwerking demonstreert. De verkregen bloedvlekken zullen worden afgenomen door technicus ko, die al vele jaren werkt in ons laboratorium voor moleculair biologische diagnostiek. Voor huidpunctie. Doe eerst een paar wegwerpbare latex handschoenen aan.

Voor de huidpunctie moet de patiënt zijn of haar handen opwarmen. De vinger wordt intensief gemasseerd om de bloedstroom richting de bovenste punctieplaats te verhogen. Reinig vervolgens de huid van de palmaire kant van de distale falanx van de derde of vierde vinger van de niet-schrijvende hand met een geschikt desinfectiemiddel en puncteer de huid met een veiligheidslancet voor eenmalig gebruik.

De vingers moeten zo worden gehouden dat de zwaartekracht het verzamelen van bloed op de vingertop vergemakkelijkt. Veeg het eerste druppeltje bloed af met een gaasje omdat het mogelijk teveel weefselvloeistof bevat. Na het opnieuw masseren van de vinger om de bloedstroom op de punctieplaats te verhogen, brengt u de volgende druppel over naar een van de cirkels van een filterkaart zonder de vingertop direct op het oppervlak aan te raken.

Laat de volgende grote druppel capillair bloed zich op de vingertop vormen en verzamel deze in de volgende cirkel. Ga zo verder totdat alle benodigde cirkels zijn gevuld of de bloedstroom tijdens het verzamelen stopt. Laat het bloed door capillaire krachten in de textuur van de filter worden gedrenkt.

Pers of melk de vinger niet te veel als de bloedstroom niet voldoende is om alle vereiste cirkels van de filterkaart te vullen. Als de bloedstroom stopt, plaats dan een verband op de vingertop, voer een tweede huidpunctie uit op een andere vinger als er meer bloed nodig is voor het onderzoek om de bloedvlekken te laten drogen, leg de filterkaarten op een schone papieren handdoek in een biohazard veiligheidskabinet en laat ze drogen, bij voorkeur een nacht bij kamertemperatuur. Bij afwezigheid van een externe warmtebron, wanneer het droogproces voltooid is, hebben de bloedvlekken een uniform donkerbruine kleur en zijn er geen rode gebieden meer zichtbaar voor opslag.

Plaats de filterpapieren kaart in een enkele gasdichte ritssluitingszak met een tot twee droogzakjes om de monsters te beschermen tegen vocht. Breng deze zak zo snel mogelijk over naar een vriezer met een temperatuur van min 20 graden Celsius of lager. Als er onder veldcondities geen vriezers beschikbaar zijn, is opslag bij min vier graden Celsius of zelfs bij kamertemperatuur haalbaar gedurende maximaal 14 dagen.

Boor een punt uit met een eenmalig te gebruiken zes millimeter apparaat uit elke met bloed doordrenkte cirkel van de graad 9 0 3 filterkaart overbrenging, alle gedroogde bloedvlekken van een enkele patiënt naar een putje van de 12. Vul de put met fosfaatgebufferd zoutwater bevattend 0,05% tween 20 en 0,08% Natrium azide. Herhaal deze stappen om een tweede reeks gedroogde bloedvlek EIT's te verkrijgen om moleculaire analyses uit te voeren.

Plaats vervolgens de celcultuurplaat op een laboratorium shaker en laat de gedroogde bloedvlekken gedurende minimaal vier uur of bij voorkeur een nacht zachtjes elueren. De volgende dag zijn de vlekken bijna vrij van bloed en zijn er hemolytische supernatanten gevormd. Breng deze EIT's over naar microcentrifugebuisjes en onderwerp ze vervolgens aan centrifugatie gedurende twee minuten bij 10.500 keer G om te bevrijden.

De supernatanten van eventueel gevormd puin tijdens Ellucian gecentrifugeerde EIT's zijn nu klaar om te worden gebruikt voor de beoogde analyses. De eerste reeks EIT's wordt overgebracht naar cups voor serologisch onderzoek. De tweede reeks wordt overgebracht naar microbuisjes voor PCR-analyse.

Onderzoek de EIT's op markeringen van hepatitis B-virus, hepatitis C-virus en HIV-infectie met behulp van commercieel verkrijgbare assays en volg de respectieve instructies van de fabrikant zorgvuldig. Ten slotte worden de resultaten van het serologische onderzoek op de volledig geautomatiseerde analyzer weergegeven op het scherm van het systeem. De effectiviteit van het voorgestelde protocol voor de voorbereiding en verwerking van gedroogde bloedvlekken werd