Biofunctionalized Pruisisch blauw nanopartikels voor Multimodaal Molecular Imaging Toepassingen

Het algemene doel van deze procedure is het synthetiseren van biofunctionaliseerde Pruisisch blauw-nanodeeltjes voor gebruik als multimodale moleculaire beeldsvormingsmiddelen. Dit wordt bereikt door eerst Pruisisch blauw-nanodeeltjes te synthetiseren die gadolinium- of mangaanionen bevatten, welke het MRI-signaal versterken. De tweede stap bestaat uit het binden van fluorescerend avadon aan het oppervlak van de nanodeeltjes, wat de mogelijkheid tot fluorescentiebeeldvorming verleent.

Vervolgens worden de avadon-gecoate nanodeeltjes biofunctionaliseert met de gewenste biotinylated antilichamen voor celtargeting. Een laatste stap is het uitvoeren van een kwaliteitscontrole op de biofunctionaliseerde nanodeeltjes door hun grootte, zetapotentieel en temporele stabiliteit te meten. Uiteindelijk worden de biofunctionaliseerde nanodeeltjes ingezet in multimodale moleculaire imaging-toepassingen om een specifieke doelpopulatie cellen binnen een mengsel te visualiseren met behulp van fluorescentie-imaging en MRI.

Huidige commerciële beeldvormingsmiddelen zijn doorgaans enkelvoudig en bieden resolutie uitsluitend op anatomisch niveau. Pruisisch blauw nanodeeltjes combineren twee complementaire beeldvormingsmodaliteiten, MRI en fluorescentie, en maken moleculaire beeldvorming op subcellulair niveau mogelijk. De toepassingen van multimodale nanodeeltjes strekken zich uit tot de diagnose van kanker en inflammatoire ziekten, naast het monitoren van de respons op behandelingen.

Dit komt omdat biofunctionaliserende nanodeeltjes een populatie cellen binnen een specifiek gebied van het lichaam kunnen targeten en eraan kunnen binden. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de diagnose van kanker en inflammatoire ziekten en de reactie op een behandeling, kan deze ook worden toegepast op andere pathologische aandoeningen die baat hebben bij de gevoeligheid en specificiteit van moleculaire beeldvorming. Met behulp van fluorescentie en MRI kwam het idee voor het produceren van deze nanodeeltjes voort uit de vaststelling dat Pruisisch blauw, een door de FDA goedgekeurd middel voor menselijke orale consumptie, stabiel gesynthetiseerd kon worden via een eentraps syntheseschema en robuust biofunctionaliseerde kon worden met standaard bioconjugatietechnieken.

Bereid eerst een 5 mM oplossing van kaliumhexacyanoferraat(II) in 5 mL gedeïoniseerd water om oplossing A te maken. Bereid vervolgens oplossing B, bestaande uit 2,5 mM ijzer(III)chloride en 2,5 mM mangaan(II)chloride in 10 mL gedeïoniseerd water voor de synthese van mangaan-Pruisisch blauw nanodeeltjes. Andere nanodeeltjes kunnen worden gesynthetiseerd zoals aangegeven in het tekstprotocol. Overbreng oplossing B naar een rondbodemkolf en roer de oplossing bij 1000 RPM op kamertemperatuur.

Voeg met een peristaltische pomp oplossing A druppelsgewijs toe aan het vat met een snelheid van 10 milliliters per uur. Nadat de toevoeging van oplossing A is voltooid, wordt het mengsel gedurende nog eens 30 minuten geroerd bij 1000 RPM. Breng vervolgens aliquots van één milliliter van het mengsel over in microcentrifugebuisjes en voeg aan elk buisje 0,2 milliliters van vijf milli natriumchloride toe.

Centrifugeer de buisjes bij 20 000 ×g gedurende ten minste 10 minuten en verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant, zodat het pellet met nanodeeltjes overblijft. Voeg daarna één milliliter gedeïoniseerd water toe aan elk pellet. Gebruik een microtip om de nanodeeltjes door middel van sonicatie gelijkmatig in de oplossing te suspenderen.

Was de nanodeeltjes nog ten minste drie keer om componenten van de initiële reactie uit de suspensie te verwijderen na de laatste centrifugatie, resuspendeer de nanodeeltjes in één milliliter gedeïoniseerd water nadat de nanodeeltjes zijn gecoat met fluorescerend den zoals beschreven in het tekstprotocol, en haal de voorraden biotinylated antilichamen uit de koelkast. Gebruik anti neuron glial antigen two en anti-human eotaxin three. Breng het biotinylated antilichaam over naar een 0,2 micro nylon microfugefilter en centrifugeer de buis vervolgens bij 14.000 ×g gedurende 10 minuten.

Voeg vervolgens minder dan of gelijk aan 0,05 milligram antilichaam per milligram Aden-gecoate nanodeeltjes toe en dek de buisjes af met aluminiumfolie om ze tegen licht te beschermen. Incubeer de buisjes gedurende twee tot vier uur bij vier graden celsius onder voorzichtig schudden. Voeg na het binden van de antilichamen 10 microliters van een nanodeeltjesmonster met een concentratie van één milligram per milliliter toe aan 990 microliters gedeïoniseerd water in een wegwerpplastic buisje; sluit het buisje en vortex deze om te mengen.

Bepaal vervolgens de gemiddelde grootte van de nanodeeltjes met een dynamische lichtverstrooiingsmeting (dynamic light scattering) bij een meethoek van 173 graden. Begin met het bereiden van suspensies van 10 milliliter cellen in PBS met een concentratie van ongeveer 100.000 cellen per milliliter; voor buizen met gemengde culturen waarin verschillende ratio's van elke cellijn aanwezig zijn, dienen deze te worden bereid zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg twee milliliter 5% BSA aan elke buis toe om de cellen te blokkeren en aspecifieke binding te minimaliseren. Voeg vervolgens één milliliter biofunctionaliseerde nanodeeltjes met een concentratie van één milligram per milliliter aan elke buis toe en incubeer het mengsel gedurende één uur.

Spoel vervolgens de cellen vrij van ongebonden nanodeeltjes door de buisjes vijf minuten te centrifugeren bij 1000 ×g en de pellets opnieuw te resuspenderen in één milliliter PBS. Herhaal dit proces nog minstens tweemaal. Fixeer de cellen met 10% formaldehyde in PBS en voeg vervolgens 10 µg/mL phalloidine en mithrylacridine (DAPI) in PBS toe om de cellen te kleuren, incubeer de buis 30 minuten op ijs en spoel de cellen daarna met PBS.

Laad vervolgens het monster in de flowcytometer en analyseer 10.000 gegatede cellen van elk monster. Een soortgelijke procedure om cellen die gebonden zijn aan fluorescente nanodeeltjes te visualiseren met behulp van laserconfocale microscopie wordt beschreven in het tekstprotocol. Laat de cellen in T 75-flessen groeien tot ongeveer 80% confluentie en spoel vervolgens het medium van de cellen af met vijf milliliter PBS.

Voeg vijf milliliter 1% BSA in PBS toe en blokkeer de cellen gedurende één uur. Voeg vervolgens vijf milliliter nanodeeltjes gecoat met antilichamen in een concentratie van 0,5 milligram per milliliter toe aan de kolf en incubeer de cellen één uur om de nanodeeltjes te laten binden. Spoel de cellen daarna drie keer af met vijf milliliter PBS om niet-gebonden nanodeeltjes te verwijderen.

Voeg vervolgens twee milliliter 0,25% tripsine-EDTA-oplossing toe en incubeer de cellen vijf minuten om de cellen van de fles los te maken. Voeg acht milliliter DMEM toe om de trypsine te neutraliseren en breng de celsuspensie vervolgens over in centrifugebuizen. Centrifugeer deze bij 1000 ×g gedurende vijf minuten om de cellen te pelletteren.

Haspireer vervolgens het supernatant en resuspendeer de cellen in één milliliter PBS. Voeg één milliliter 10% formaldehyde in PBS toe om de cellen te fixeren en breng daarna 100 µL van elk monster over in afzonderlijke putjes van een 96-wells vlakbodemplaat. Voeg 100 µL gesmolten 1% agarose in gedeïoniseerd water toe aan elk putje en meng door herhaaldelijk met de pipet op en neer te zuigen.

Laat de gel 12 uur lang stollen bij vier graden Celsius om een phantom te verkrijgen. Nadat de gel is gestold, wordt de phantom in een horizontale drie T klinische magneet geplaatst naast een massief blok 2%agar van 150 centimeter kubiek. Bevestig vervolgens de phantom en het agablok in het midden van een achtkanalen HD hersenspoel. Gebruik voor het meten van de relaxatietijden coronale coupes van 0,5 millimeter dik, genomen op middel hoogte van de 96-well plaat. Dynamische lichtverstrooiingsmetingen werden gebruikt om de hydrodynamische diameter van de gegenereerde nanodeeltjes te bepalen. Stabiliteitsstudies bevestigden de langetermijnstabiliteit van de nanodeeltjes in zowel watergebaseerde als celmediumgebaseerde experimenten.

Laserconfocale microscopie toonde aan dat fluorescente nanodeeltjes geladen met antilichamen voor EOT three specifiek bonden aan het oppervlak van EOL one-cellen. Wanneer antilichamen voor een NG two werden gebruikt, bonden deze specifiek aan het oppervlak van BSG-neurosferen. De bio-gefunctionaliseerde nanodeeltjes waren in staat om een populatie doelcellen succesvol fluorescent te labelen, zoals gemeten via flowcytometrie.

Bovendien waren de nanodeeltjes in staat om een specifieke subpopulatie cellen in een mengsel te targeten, zelfs bij lage ratio's van targetcellen ten opzichte van controlecellen. Tot slot verhoogden bio-gefunctionaliseerde nanodeeltjes het MRI-contrast van getargete cellen; cellen behandeld met nanodeeltjes geladen met een nng. Twee antilichamen vertoonden hyperintensiteit in de T1-gewogen sequenties in vergelijking met cellen behandeld met controledeeltjes.

In tegenstelling hiermee vertoonden de A NNG twee nanodeeltjes een hypo-intensiteit in de T twee gewogen sequenties vergeleken met de controledeeltjes. De synthese van biofunctionaliseerde Pruisisch blauw nanodeeltjes kan binnen twee dagen worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd.

Vergelijkbaar met deze procedure kunnen de nanodeeltjes worden gefunctionaliseerd met verschillende biopolymeren en targeting-liganden om nieuwe ziekten en nieuwe condities te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u Pruisisch blauw nanodeeltjes synthetiseert voor fluorescentie- en beeldvormingsapplicaties om celpopulaties te labelen. Vergeet niet om strikt de veiligheidsrichtlijnen en standaardprocedures te volgen voor het uitvoeren van studies in de klinische MRI-magneet.