Biofunctionalized Pruisisch blauw nanopartikels voor Multimodaal Molecular Imaging Toepassingen
April 28th, 2015
Dit protocol beschrijft de synthese van biofunctionele Pruisisch blauwe nanodeeltjes en hun gebruik als multimodale, moleculaire beeldvormingsmiddelen. De nanodeeltjes hebben een kern-schaal ontwerp waarbij gadolinium- of mangaanionen in de nanodeeltjekern MRI-contrast genereren. De biofunctionele schaal bevat fluoroforen voor fluorescentiebeeldvorming en targeting liganden voor moleculaire targeting.
Het algemene doel van deze procedure is om biofunctionele Pruisisch blauwe nanodeeltjes te synthetiseren voor gebruik als multimodale moleculaire beeldvormingsmiddelen. Dit wordt bereikt door eerst Pruisisch blauwe nanodeeltjes te synthetiseren die ofwel gadolinium- of mangaanionen bevatten, die het MRI-signaal verbeteren. De tweede stap is om fluorescent avadon aan het oppervlak van de nanodeeltjes te hechten, wat fluorescent beeldvormingscapaciteit verleent.
Vervolgens worden de met avadon beklede nanodeeltjes biofunctioneel gemaakt met de gewenste celgerichte biotinyleren antilichamen. Een laatste stap is om een kwaliteitscontrole uit te voeren op de biofunctionele nanodeeltjes door hun grootte zetapotentiaal en temporele stabiliteit te meten. Uiteindelijk worden de biofunctionele nanodeeltjes gebruikt in multimodale moleculaire beeldvormingstoepassingen om een specifieke doelpopulatie cellen binnen een mengsel te visualiseren met behulp van fluorescentiebeeldvorming en MRI.
Huidige commerciële beeldvormingsmiddelen zijn doorgaans enkelvoudig en bieden resolutie op anatomisch niveau. Pruisisch blauwe nanodeeltjes combineren twee complementaire beeldvormingsmodi MRI en fluorescentie en maken moleculaire beeldvorming en subcellulaire niveaus mogelijk. De toepassingen van multimodale nanodeeltjes strekken zich uit naar de diagnose van kanker en ontstekingsziekten, naast het monitoren van hun behandelingsreacties.
Dit komt omdat biofunctionele nanodeeltjes zich kunnen richten en binden aan een populatie cellen binnen een specifiek gebied van het lichaam. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de diagnose en respons op behandeling van kanker en ontstekingsziekten, kan deze ook worden toegepast op andere pathologische aandoeningen die zullen profiteren van de gevoeligheid en specificiteit van moleculaire beeldvorming. Met behulp van fluorescentie en MRI hadden we eerst het idee om deze nanodeeltjes te produceren toen we vaststelden dat Pruisisch blauw en FDA-goedgekeurd middel voor humane orale consumptie stabiel kon worden gesynthetiseerd met behulp van een syntheseschema van één deel en robuust biofunctioneel kon worden gemaakt met behulp van standaard bioconjugatietechnieken.
Om te beginnen, bereid een 5 miljoen molaire oplossing van kaliumhexa sanoferraat twee in vijf milliliter gedeïoniseerd water om oplossing A te maken, repareer vervolgens oplossing B die 2,5 millimolair ijzer driechloride en 2,5 millimolair mangaan. Tweechloride in 10 milliliter gedeïoniseerd water voor de synthese van mangaan Pruisisch blauwe nanodeeltjes. Andere nanodeeltjes kunnen worden gesynthetiseerd zoals aangegeven in het tekstprotocol. Breng oplossing B over naar A in een ronde bodemkolf en roer de oplossing bij 1000 RPM bij kamertemperatuur.
Gebruik een peristaltiekpomp om oplossing A druppelsgewijs toe te voegen in het vat met een snelheid van 10 milliliter per uur. Na het toevoegen van oplossing A, roer het mengsel nog eens 30 minuten bij 1000 RPM. Breng vervolgens een milliliter aliquots van het mengsel over in microcentrifugebuisjes en voeg 0,2 milliliter van vijf milli natriumchloride toe aan elke buis.
Centrifugeer de buisjes bij 20.000 keer G gedurende ten minste 10 minuten en verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant, waarbij het pellet van nanodeeltjes wordt achtergelaten. Voeg vervolgens een milliliter gedeïoniseerd water toe aan elk pellet. Gebruik een microtip om de nanodeeltjes gelijkmatig in oplossing te suspenderen door middel van sonificatie.
Was de nanodeeltjes nog minstens drie keer om componenten van de initiële reactie uit de suspensie te verwijderen. Na de laatste draai hersuspendeert u de nanodeeltjes in een milliliter gedeïoniseerd water. Nadat de nanodeeltjes zijn gecoat met fluorescent den zoals beschreven in het tekstprotocol, haalt u de biotinyleren antilichaamvoorraden uit de koelkast. Hier gebruiken we anti neuron glial antigeen twee en anti-human eotaxin drie. Breng het biotinyleren antilichaam over naar een 0,2 micro nylon micro fuge filter en centrifugeer vervolgens de buis gedurende 10 minuten bij 14.000 keer G.
Voeg vervolgens maximaal 0,05 milligram van het antilichaam per milligram met avadon beklede nanodeeltjes toe en bedek de buisjes met aluminiumfolie om ze tegen licht te beschermen. Incubeer de buisjes met zacht schudden gedurende twee tot vier uur bij vier graden Celsius. Na het aanhechten van de antilichamen, voegt u 10 microliters van een milligram per milliliter nanodeeltjesmonster toe aan 990 microliters gedeïoniseerd water in een wegwerpbare plastic vetvetcap en meng deze.
Bepaal vervolgens de gemiddelde grootte van de nanodeeltjes met behulp van een dynamisch lichtverstrooiingssysteem met een meethoek van 173 graden. Begin met het bereiden van 10 milliliter suspensies van cellen in PBS met een concentratie van ongeveer 100.000 cellen per milliliter voor gemengde culturen. Buisjes met verschillende verhoudingen van elke cellijn moeten worden bereid zoals beschreven in het tekstprotocol bij twee milliliter 5%BS, A naar elke buis om de cellen te blokkeren en niet-specifieke binding te minimaliseren. Voeg vervolgens een milliliter van een milligram per milliliter, biofunctionele nanodeeltjes toe aan elke buis en incubeer het mengsel gedurende één uur.
Spoel vervolgens de cellen vrij van ongebonden nanodeeltjes door de buisjes gedurende vijf minuten bij 1000 keer G te centrifugeren en de pellets opnieuw te bedekken in een milliliter PBS. Herhaal dit proces nog minstens twee keer. Fixeer de cellen met 10% formaldehyde in PBS en voeg vervolgens 10 microgram per milliliter, zeven amino actin en mycine D in PBS toe om de cellen te kleuren, incubeer de buis gedurende 30 minuten op ijs en spoel vervolgens de cellen met PBS.
Laad vervolgens het monster in de flowcytometer en analyseer 10.000 gegate cellen uit elk monster. Een vergelijkbare procedure om cellen die zijn gebonden aan fluorescente nanodeeltjes te beeldvormen met behulp van laserconfocale microscopie wordt beschreven in het tekstprotocol. Om te beginnen, draag de cellen in T 75 flessen tot ongeveer 80% confluency en spoel vervolgens de cellen vrij van medium met vijf milliliter PBS.
Voeg vijf milliliter 1%
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft de synthese van biofunctioneel gemodificeerde Pruisisch blauwe nanodeeltjes die zijn ontworpen voor multimodale moleculaire beeldvorming. Deze nanodeeltjes verbeteren het MRI-contrast door middel van gadolinium- of mangaanionen en zijn uitgerust met fluoroforen voor fluorescentiebeeldvorming.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Nanodeeltjessynthese
- Moleculaire beeldvorming
- Biomedische toepassingen
Achtergrond
- Pruisisch blauwe nanodeeltjes dienen als beeldvormingsmiddelen.
- Gadolinium en mangaanionen verbeteren het MRI-signaal.
- Fluorescente markering maakt gerichte beeldvorming mogelijk.
- Biofunctioneel modificatie verbetert de specificiteit voor celtargetering.
Doel van de studie
- Het synthetiseren van biofunctioneel gemodificeerde nanodeeltjes voor beeldvorming.
- Het verbeteren van MRI- en fluorescentiebeeldvormingsmogelijkheden.
- Het visualiseren van specifieke celpopulaties in complexe mengsels.
Gebruikte methoden
- Synthese van Pruisisch blauwe nanodeeltjes met gadolinium of mangaan.
- Bevestiging van fluorescent avadon aan de nanodeeltjes.
- Biofunctioneel modificatie met biotinyleerde antilichamen voor targeting.
- Qualiteitscontrole door middel van metingen van grootte, zeta potentiaal en stabiliteit.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle synthese van biofunctioneel gemodificeerde nanodeeltjes.
- Verbeterd MRI-contrast waargenomen met gadolinium/mangaan.
- Fluorescentiebeeldvormingsmogelijkheden bevestigd.
- Qualiteitscontrolemetrieken voldaan voor stabiliteit en grootte.
Conclusies
- Biofunctioneel gemodificeerde Pruisisch blauwe nanodeeltjes zijn effectieve beeldvormingsmiddelen.
- Multimodale beeldvorming maakt een betere visualisatie van doelcellen mogelijk.
- Mogelijke toepassingen in biomedisch onderzoek en diagnostiek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Biofunctionalized Prussian blue nanoparticles (PB NPs) enable multimodal molecular imaging by integrating MRI and fluorescence modalities, supporting high-resolution visualization of targeted cell populations. This dual-mode capability enhances predictive confidence in early discovery and translational research by providing complementary biological and anatomical information. The approach addresses the need for sensitive, specific, and multiplexed imaging agents in preclinical and disease-relevant model systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Supports interrogation of molecular pathways and cell populations using targeted imaging agents.
- Enables functional validation of cell-surface markers through ligand-directed nanoparticle binding.
- Facilitates mechanistic de-risking by confirming target engagement in complex mixtures.
- Improves predictive confidence for advancing imaging biomarkers in discovery pipelines.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, biofunctionalized nanoparticles for quantitative imaging assays.
- Enables reproducible assessment of nanoparticle-cell interactions via flow cytometry and confocal microscopy.
- Supports standardization of imaging readouts for downstream screening workflows.
- Provides scalable platforms for multiplexed evaluation of targeting ligands.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant models for translational biomarker development.
- Enables continuity from in vitro validation to in vivo imaging studies.
- Supports risk-adjusted advancement of imaging agents for disease monitoring and response assessment.
- Facilitates mechanistic insight into nanoparticle biodistribution and target specificity.
Pipeline & Workflow Integration
Biofunctionalized PB NPs fit within the continuum from early discovery through preclinical imaging, bridging target validation and translational research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification via targeted molecular imaging.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers multiplexed readouts (MRI relaxivity, fluorescence intensity) for comparative analysis of targeting efficiency.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by validating imaging agents in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to diverse targeting ligands and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in imaging agent development.
- Operational Value: Standardizes nanoparticle synthesis, functionalization, and quality control for reproducibility.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions for imaging agent advancement and portfolio triage.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of imaging modalities and disease indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanoparticle synthesis, biofunctionalization, and imaging assay development.
- Needs access to MRI, fluorescence imaging, and analytical instrumentation for quality control.
- Demands cross-team standardization of nanoparticle characterization and imaging protocols.
- Adaptable to various targeting ligands and cell models with protocol optimization.
- Stability and toxicity assessments are essential for translational progression.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:25
Synthesis of Manganese Prussian Blue (MnPB) Nanoparticles
4:09
Biofunctionalization and Characterization of MnPB Nanoparticles
5:29
Fluorescent Labeling of Cells with Nanoparticles
6:59
Generating MRI Contrast on Cells with Nanoparticles
9:01
Results: Imaging of Cells Labeled with Prussian Blue Nanoparticles
10:34
Conclusion
