Name: Afleiding van zeer gezuiverde Cardiomyocyten van Human geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van kleine moleculen gemoduleerd Differentiatie en Latere Glucose Verhongering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Leer hoe je zuivere cardiomyocyten afleidt uit menselijke iPSCs met kleine moleculen en glucoseverhongering. Deze methode verbetert cardiovasculaire ziekte-modellering en drugsscreening aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de NIH/NHBI (U01 HL099776-5), de NIH Director's New Innovator Award (DP2 OD004411-2), het California Institute of Regenerative Medicine (RB3-05129), de American Heart Association (14GRNT18630016) en de Endowed Faculty Scholar Award van de Lucile Packard Foundation for Children en het Child Health Research Institute bij Stanford (aan SMW). We erkennen ook de financieringsondersteuning van de American Heart Association Predoctoral Fellowship 13PRE15770000, en het National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program DGE-114747 (AS).

OPMERKING: Vendor informatie voor alle reagentia die in dit protocol is opgenomen in tabel 1 en Materialen List. Alle oplossingen en materialen in contact komen met cellen moeten steriel zijn en aseptische techniek moet dienovereenkomstig worden gebruikt. Voer alle incubaties cultuur in een bevochtigde 37 ° C, 5% CO2 incubator tenzij anders vermeld. In dit protocol wordt elk verschil uitgevoerd in 6-well platen, waarbij de hiPSCs worden uitgezet. Volgende differentiatie en zuivering, kunnen cellen worden losgekoppeld en opnieuw uitgeplaat voor downstream gebruik. 1. Medium Bereiding <ol><li> Voor het E8 medium, maak een voorraadoplossing per mediumbestanddeel (NaHCO3, L-ascorbinezuur 2-fosfaat, natrium seleniet, transferrine, insuline, FGF2, TGFB1) en bewaar de oplossing bij -20 ° C. Voeg de juiste hoeveelheid voorraad oplossingen om de fles van DMEM / F12 en filteren om te steriliseren. De oplossing krachtvatie en reactie setup voor de voorraad onderdelen en E8 medium is te vinden in tabel 1. </li><li> Voor de extracellulaire matrix oplossing ontdooien de basaalmembraan matrix (gewoonlijk 10 mg / ml bijgeleverd) bij 4 ° CO / N. Matrigel wordt gebruikt voor pluripotente stamcellen kweek omdat de humane pluripotente stamcellen goed kan hechten aan dit materiaal met de alfa-6-beta-1 integrine 9. Eenmaal ontdooid, maak 2.25 mg (250 ui) monsters op ijs met ijskoude pipetpunten en buisjes en bewaar het bij -80 ° C. <ol><li> Wanneer precoating platen met ECMS, ontdooien en aliquot de extracellulaire matrix-oplossing (ECMS) op ijs. Meng de ECMS en ijskoude DMEM / F12 medium in een verhouding van 1: 200 op ijs. Koel bewaren om voortijdige ECMS stolling te voorkomen. </li></ol></li><li> Voor de RPMI / B27 zonder insuline medium, voeg 10 ml B27 Minus Insuline in 500 ml RPMI media. </li><li> Voor de RPMI / B27 (met insuline) medium, voeg 10 ml B27 supplement (met insulin) en 5 ml Pen-Strep antibioticum in 500 ml RPMI medium. </li><li> Voor de lage glucose medium, voeg 10 ml B27 supplement en 5 ml Pen-streptokokken antibiotica in 500 ml glucose vrij RPMI media. </li><li> Voor het bevriezen / cryopreservatie medium, meng foetaal runderserum met dimethylsulfoxide (DMSO) in een 9: 1 verhouding. Het invriesmedium kan maximaal 1 maand bij 4 ° C. Opmerking: Alle media moeten worden gefilterd en opgeslagen in 4 ° C en binnen 2 weken tenzij anders vermeld. Alle reagens / oplossing volumes hierna gebruikte bestemd voor een enkel putje in een 6-well plaat, tenzij anders vermeld. </li></ol> 2. Pre-coating 6-well platen met ECMS <ol><li> Voeg ECMS door mengen basaalmembraan matrix (bv Matrigel) met ijs-koude DMEM / F12 medium in een verhouding van 1: 200, breng 2 ml vers bereide ECMS aan elk putje van een 6-wells plaat. Elk putje in een 6-wells plaat duurt ongeveer 90 mg ECMS ontvangen. </li><li> Incubeer de ECMS beklede platen gedurende 1 uur bij 37 ° C. Onmiddellijk voorafgaand aan uitplaten cellen zuig DMEM / F12 oplossing uit elk putje. De platen zullen dan klaar zijn om cellen te ontvangen. </li></ol> 3. Het ontdooien van de bevroren hiPSCs OPMERKING: Nauw deze procedure volgen als het kan leiden tot een optimale kweken en downstream differentiatie van hiPSCs in iPSC-CM&#39;s na de vries / dooi cyclus. <ol><li> Dooi een flacon van hiPSCs voor elk putje van een 6-wells plaat. Bereid een 15 ml conische buis met 9 ml koud E8 medium met ROCK-remmer (10 uM) voor elke flacon. ROCK-remmer verbetert hiPSCs overleving na cryopreservatie 10. De injectieflacons van 37 ° C waterbad om de cellen ontdooien tot een ongeveer 5 mm diameter ijs kristal verlaten. </li><li> Spuit de buitenkant van de flesjes met 70% ethanol. Veeg de flesjes met tissue papier voordat ze te verplaatsen naar de steriele laminaire kap. </li><li> Breng de cellen in de voorbereide conische buis. Spoel thij eenmaal flesje met 500 pl E8 medium en breng het medium dat de cellen ontdooid op dezelfde conische buis. Centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 4 min bij 200 x g. </li><li> Zuig de supernatant na centrifugeren en voorzichtig resuspendeer de celpellet met 2 ml E8 medium met ROCK inhibitor (10 uM). Breng de geresuspendeerd cellen om één putje van een 6-wells plaat pre-gecoat met ECMS. </li><li> Vervang het medium met E8 medium zonder ROCK inhibitor na 24 uur kweken. De cellen moeten hebben gehandeld door deze tijd. </li></ol> 4. passage van de hiPSCs <ol><li> Typisch passage hiPSCs na het bereiken van 75% -80% confluentie in een 6-wells plaat. Zuig het kweekmedium. Snel wassen putjes met 1 ml steriele PBS RT. Aspireren PBS. <ol><li> Voeg 500 ul 0,5 mM EDTA of 1x cel losraken oplossing (bijv Accutase) en incubeer gedurende 1-7 minuten bij kamertemperatuur. Geschikte tijd voor EDTA incubatietijd varieert met de iPSC lijn. Verwachten zichtbare krullen o zienr verdikking kolonies rond de randen, aangezien dit dat EDTA of cel losraken oplossing geeft gereed te verwijderen. </li></ol></li><li> Zuig het EDTA of de cel onthechting oplossing. Voeg 1 ml E8 medium aangevuld met 10 uM ROCK inhibitor. Verdringen iPSC kolonies in de put door herhaaldelijk en neer te pipetteren en spuiten kolonies af met een P1000 pipet. Kolonies moet worden opgesplitst in 5-10 celklonten na afloop. </li><li> Breng de kolonies die zijn gesuspendeerd in 1 ml medium met E8 ROCK inhibitor in een 15 ml conische buis. </li><li> Verstoren van de grote cel klonten in kleine groepjes in de E8 medium. Voeg een geschikte hoeveelheid E8 media remmer aan de celsuspensie om de cellen te verdunnen. De media volume toevoegen verdunning afhankelijk van de celdichtheid en het aantal putten worden gezaaid. Idealiter zou een 80% confluente putje hiPSCs verdund 1:12. <ol><li> Voeg 11 ml E8 medium met ROCK-remmer op de bestaande 1 ml van cell oplossing in genoemde 15 ml conische buis met een 1:12 verdunning te verkrijgen. </li></ol></li><li> Verder vermaal de cel klonten in kleine cel fragmenten (ongeveer 50-200 cellen in elk fragment is het beste). Voorkomen dat over-triturating als dit vermindert celoverleving. </li><li> Zuig ECMS uit de pre-gecoate platen en voeg 2 ml geresuspendeerd cellen in elk putje. Ongeveer 100.000 cellen per putje van een 6-wells plaat is ideaal. Doel om de cellen gelijkmatig doseren rond de put om clustering van cellen in het midden van de put te vermijden. </li><li> Na 24 uur kweken, vervang het medium met E8 medium zonder ROCK-remmer. Verander het kweekmedium elke 24 uur tot cellen 80% samenvloeiing. Vervolgens worden de cellen weer klaar voor passage. Het duurt meestal 3-6 dagen tussen passages tot 80% samenvloeiing bereiken. </li></ol> 5. Bevriezing hiPSCs OPMERKING: Nauw deze procedure volgen als het kan leiden tot een optimale kweken en downstream differentiatie van hipSC&#39;s in iPSC-CM&#39;s na de vries / dooi cyclus. <ol><li> Labelen cryogene buizen met de cellijn naam, het type cel, passage nummer, en invriezen datum. Als algemene richtlijn, gebruikt u een flesje voor elk putje van een 6-wells plaat. Bereid een 15 ml conische buis gevuld met 9 ml E8 medium met ROCK-remmer (10 uM). Bereid invriesmedium met 90% FBS en 10% DMSO, en houdt het bij 4 ° C tot gebruik. </li><li> Zuig het kweekmedium, voeg 500 ul 0,5 mM EDTA of 1x cel losraken oplossing en incubeer gedurende 2-7 minuten bij kamertemperatuur. De duur van de blootstelling EDTA of mobiele onthechting oplossing varieert van cellijn tot cellijn. </li><li> Aspireren EDTA of mobiele onthechting oplossing. Voeg 1 ml E8 medium. </li><li> Verdringen iPSC kolonies in de goed door en neer te pipetteren en spuiten kolonies af met een P1000 pipet. Kolonies mogen niet worden gebroken in kleinere dan 100 celklonten. Breng de geschorste cellen naar de voorbereide conische buis met E8. Centrifugeer bij RT gedurende 4 min bij 200 x g. </li><li> Zuig het supernatant en voeg 500 ul koud freezing medium om de pellet. Resuspendeer de pellet door pipetteren 1-2 keer. Celoverleving wordt verbeterd door hem cellen in grote massa. </li><li> Breng de geresuspendeerde cellen in een gemerkte cryogene buis. Bewegen snel de flesjes in een bevriezing container met isopropanol, die zal zorgen voor geleidelijke afkoeling. De container met cellen bij -80 ° C gedurende 24 uur, vervolgens over de cellen vloeibare stikstof voor langdurige opslag. </li></ol> 6. Cardiale differentiatie van humane iPSC OPMERKING: Alle media moeten op zijn minst bij RT wanneer toegevoegd. <ol><li> Na dissociatie met EDTA of 1x cel onthechting oplossing, zaad ongeveer 100.000 menselijk iPSCs op ECMS gecoat 6 putjes voor differentiatie (dezelfde stappen als cel passage procedures). Wanneer de cellen te bereiken 85% samenvloeiing, veranderen de middellange tot RPMI / B27 zonder insuline medium met 6uM GSK3-beta-remmer CHIR99021 (CHIR) en te onderhouden voor 48 uur. </li><li> Na 48 uur, vervang de CHIR bevattende kweekmedium met RPMI / B27 zonder insuline medium en laat staan ​​voor 24 uur (tot dag 3). </li><li> Op dag 3, veranderen de media om RPMI / B27 zonder insuline met 5 uM Wnt-remmer IWR1 en onderhouden voor 48 uur (tot dag 5). OPMERKING: Wnt remming kan ook worden geprobeerd op andere kleine molecule verbindingen, zoals beschreven in eerdere studies 11. IWR1 werd gekozen boven andere kleine molecule inhibitoren Wnt vanwege de toegenomen bereik waarin is aangetoond effectief in het remmen Wnt signalering 11 zijn. </li><li> Op dag 5, verandert het medium terug naar RPMI / B27 zonder insuline medium en laat voor 48 uur (tot en met dag 7). </li><li> Op dag 7, vervang het medium met RPMI / B27 medium (met insuline) en vervang medium om de 3 dagen daarna met hetzelfde medium. Spontane kloppen van hartspiercellen moet eerst duidelijk zichtbaar zijn op ongeveer dag 8 tot dag10. </li></ol> 7. Zuivering van Human Cardiomyocytes door Glucose Verhongering <ol><li> Op dag 10 na differentiatie, wijzigt het medium in elk putje van de 6-well plaat 2 ml lage glucose medium en de cellen behouden in dit medium gedurende 3 dagen (tot dag 13). </li><li> Op dag 13, terug cellen om RPMI / B27 medium (met insuline). </li><li> Eventueel replate cardiomyocyten vóór de tweede ronde van glucose honger te helpen los niet- cardiomyocyten van de kweekplaat, waardoor gemakkelijker dissociatie van niet- cardiomyocyten in glucose uithongering. <ol><li> Op dag 13, aspireren medium, eenmaal wassen met PBS, en dissociëren de cellen in enkele cellen met 500 ul cel dissociatie enzym gedurende 5 min bij 37 ° C. Specifiek, na 5 min enzym behandeling, gebruik 1.000 ul pipet handmatig cardiomyocyten van de 6-well plaat dissociëren door herhaaldelijk trekken de cel dissociatie enzym en sproeien tegen cardiomyocyte monolaag. Tot 30 pipetteren herhalingen kan worden verplicht om de hartspiercellen distantiëren in enkele cellen. </li><li> Nadat cellen gedissocieerd en in eencellige vorm verzamel alle cellen in een 15 ml conische buis gevuld met 5 ml van RPMI / B27-medium met insuline verdund uit de cel dissociatie enzym en centrifugeer gedurende 4 min bij 200 x g. Zuig en gooi het supernatant. </li><li> Resuspendeer de cellen met 2 ml RPMI / B27 medium en plaat op een nieuw ECMS-beklede 6-wells plaat. Typisch, hogere samenvloeiing van hartspiercellen helpt met celoverleving tijdens opnieuw platen. Streven naar 2 miljoen cellen per nieuwe 6-well schotel voor optimale overlevingskansen replate tijdens opnieuw platen. </li></ol></li><li> Op dag 14, verandert het weer als 2 ml van laag glucose medium voor een tweede glucosedeprivatie cyclus. De cultuur van de cellen in deze laag glucose staat voor 3 dagen. De meeste niet-cardiomyocyten zal sterven in dit lage glucose kweekomstandigheid. </li><li> Op dag 17, veranderen de middellange tot 2 ml RPMI / B27 medium met insuline. De resterende cellen wordt sterk gezuiverde cardiomyocyten. Deze hartspiercellen kunnen worden gebruikt voor gen-expressie analyse, drug screening, metaboolanalyse en diverse andere stroomafwaarts assays. </li></ol>

<ol><li>Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiovascular+disease+modeling+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4 (6), 150(2013).</li>
<li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 108 (3), 407-414 (2001).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li>
<li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+optimization+of+activin%2Fnodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+as+an+in+vitro+model+for+coxsackievirus+B3-induced+myocarditis+and+antiviral+drug+screening+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform.</a> Circulation Research. 115 (6), 556-566 (2014).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li>
<li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (12), 127-137 (2013).</li>
<li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+self-renewal+of+human+pluripotent+stem+cells+on+human+recombinant+laminin-511%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 611-615 (2010).</li>
<li>Li, X., Meng, G., Krawetz, R., Liu, S., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ROCK+inhibitor+Y-27632+enhances+the+survival+rate+of+human+embryonic+stem+cells+following+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+And+Development%22%5BJournal%5D)">The ROCK inhibitor Y-27632 enhances the survival rate of human embryonic stem cells following cryopreservation.</a> Stem Cells And Development. 17 (6), 1079-1085 (2008).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+promotes+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%3A+the+matrix+sandwich+method%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method.</a> Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).</li>
<li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+de+novo+cardiomyocytes%3A+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Het verkrijgen van een grote hoeveelheid zeer zuivere-iPSC afgeleide cardiomyocyten cruciaal voor fundamenteel cardiale onderzoek als klinische en translationele toepassingen. Cardiale differentiatie protocollen enorme verbeteringen ondergaan in de afgelopen jaren, overgang van embryoid body gebaseerde werkwijzen die gebruik cardiogene groeifactoren 2, sandwich werkwijzen 12 matrix, en uiteindelijk naar kleine moleculen gemoduleerd en monolaag-gebaseerde methoden 5. Van de bovengenoemde ...

Primaire menselijke cardiomyocyten moeilijk te verkrijgen vanwege de vereiste invasieve cardiale biopsies moeilijk dissociëren tot enkele cellen, en vanwege de slechte lange termijn overleving van de cel in kweek. Gezien dit gebrek aan primaire menselijke hartspiercellen, patiënt-specifieke humane geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleide cardiomyocyte (iPSC-CM) technologie is beschouwd als een krachtig alternatief cardiomyocyte bron voor fundamenteel onderzoek, evenals klinisch en translationeel toepassingen zoals de ziekte van modellering en drugs discovery 1. Vroege pogingen in differentiërende pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten toegepast differentiatie protocollen met embryo lichamen (EB&#39;s), maar deze methode is inefficiënt produceren cardiomyocyten omdat vaak minder dan 25% van de cellen in een EB zijn slaan cardiomyocyten 2,3. Relatief, een monolaag gebaseerde differentiatie protocol met de cytokines activine A en BMP4 vertoonde een hoger rendement dan EBS, maarDit protocol is nog relatief inefficiënt, vereist kostbare groeifactoren en werkt alleen in een beperkt aantal humane pluripotente stamcellijnen 4. Onlangs werd een zeer efficiënte, iPSC monolaag gebaseerde hartspierceldifferentiatie protocol ontwikkeld door moduleren Wnt / β-catenine signalering 5. Deze iPSC-CM&#39;s te uiten troponine T en alpha actinine, twee sarcomeer eiwitten die standaard markers van hartspiercellen 6 zijn. Het protocol beschrijft hier is een aanpassing van deze kleine moleculen gebaseerde, feeder cel-vrij, monolaag differentiatie methode 5,7. Wij zijn in staat om te verkrijgen verslaan hartspiercellen uit hiPSCs na 7-10 dagen (figuur 1). Overeenkomstig een hartspierceldifferentiatie resulteert in 50% verslaan cellen consistent immunokleuring blijkt dat er een populatie van niet- cardiomyocyten die negatief voor cardiomyocyt- specifieke merkers zoals cardiaal-specifieke troponine T en alfa-actinine zijn. Om further zuiveren cardiomyocyten en niet- cardiomyocyten elimineren, werden heterogene gedifferentieerde celpopulaties blootgesteld aan honger glucose door ze te behandelen met een extreem lage glucose kweekmedium voor meerdere dagen (figuur 2). Deze behandeling selectief kunnen de niet-cardiomyocyten wegens het vermogen van cardiomyocyten, maar geen niet-cardiomyocyten, lactaat als primaire energiebron metaboliseren om te overleven in een lage glucose omgeving 8. Na deze zuiveringsstap wordt een 40% toename in de verhouding van hartspiercellen op niet- cardiomyocyten waargenomen (Figuur 3, Figuur 4) en deze cellen kunnen worden gebruikt voor stroomafwaartse genexpressie analyse, ziektemodel en screeningstesten voor geneesmiddelen.

<table><tbody><tr><td>Matrigel (9-12 mg/ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>RPMI media</td><td>Invitrogen</td><td>11835055</td><td></td></tr><tr><td>Glucose free RPMI media</td><td>Invitrogen</td><td>11879-020</td><td></td></tr><tr><td>B27 Minus Insulin</td><td>Invitrogen</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement (w/ insulin)</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Pen-strep antibiotic</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovien serum</td><td>BenchMark</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>ROCK inhibitor Y-27632</td><td>EMD Millipore</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Thermo Fisher</td><td>508306</td><td></td></tr><tr><td>IWR1</td><td>Sigma</td><td>I0161</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Cell lifter</td><td>Fisher</td><td>08-100-240</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>Fisher (NUNC tubes)</td><td>375418</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme</td><td>Invitrogen</td><td>12563-011</td><td></td></tr></tbody></table>

afleiding van zeer gezuiverde cardiomyocyten van human geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van kleine moleculen gemoduleerd differentiatie en latere glucose verhongering

Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Humane geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CMS) hebben een belangrijke bron van cellen aan het ontbreken van primaire cardiomyocyten beschikbaar voor fundamenteel onderzoek en translationeel toepassingen pakken geworden. Om hiPSCs naar cardiomyocyten onderscheiden, zijn verschillende protocollen, waaronder embryoid body (EB) gebaseerde differentiatie en groeifactor inductie ontwikkeld. Echter, deze protocollen zijn inefficiënt en zeer variabel in hun vermogen om gezuiverd cardiomyocyten genereren. Onlangs heeft een klein molecuul gebaseerd protocol gebruik te maken van modulatie van de Wnt / β-catenine signalering werd aangetoond dat cardiale differentiatie met een hoge efficiëntie te bevorderen. Met dit protocol, meer dan 50% -60% van de gedifferentieerde cellen waren troponine-positieve hartspiercellen werden consistent waargenomen. Voor een nog grotere zuiverheid cardiomyocyten werden de gedifferentieerde cellen blootgesteld aan glucose honger specifiek elimineren niet- cardiomyocyten gebaseerd op de metabolische verschils tussen cardiomyocyten en niet- cardiomyocyten. Met deze selectie strategie, we consequent een toename van meer dan 30% in een verhouding van hartspiercellen op niet- cardiomyocyten als een populatie van gedifferentieerde cellen verkregen. Deze zeer gezuiverde hartspiercellen moet de betrouwbaarheid van de resultaten uit menselijke iPSC-gebaseerde in vitro ziekte modelstudies en screeningstesten voor geneesmiddelen te verbeteren.

De morfologische veranderingen tijdens iPSC differentiatie. De iPSC gekweekt in voedingsvrije platen groeide als platte, tweedimensionale kolonies. Bij het ​​bereiken van ongeveer 85% samenvloeiing, werden hiPSCs behandeld met 6 uM CHIR voor differentiatie (figuur 1A). Aanzienlijke hoeveelheden van celdood, een normaal en veel voorkomend verschijnsel, werden waargenomen na 24 uur van CHIR behandeling. Na twee dagen van CHIR behandeling, de hiPSCs verder diff...

Hier beschrijven we een robuust protocol voor de afstamming van menselijke cardiomyocyten dat klein molecuul-gemoduleerde cardiogene differentiatie combineert met glucosedeprivatie-gemedieerde zuivering van cardiomyocyten, waardoor het mogelijk wordt om gezuiverde cardiomyocyten te produceren voor het modelleren van hart- en vaatziekten en voor geneesmiddelenonderzoek.

Afleiding van zeer gezuiverde Cardiomyocyten van Human geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van kleine moleculen gemoduleerd Differentiatie en Latere Glucose Verhongering

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van een gezuiverde populatie van cardiomyocytecellen afgeleid van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen. Eerst worden menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen gekweekt in een cellaag totdat ze ongeveer 85% confluent zijn. Vervolgens wordt een kleine molecuulverbinding toegevoegd die de Wnt-cel-signaleringsroute activeert, waarna de cellen gedurende twee dagen worden geïncubeerd om de vorming van mesoderm te induceren.Vervolgens wordt een klein molecuul toegevoegd aan de cellen dat de wind-cel-signaleringsroute remt om differentiatie naar cardiaal mesoderm te specificeren. De cellen worden daarna nog twee dagen geïncubeerd. Tegen dag zeven kloppen de gedifferentieerde cardiomyocyten; de heterogene populatie gedifferentieerde cellen wordt vervolgens geïncubeerd in een celkweekmedium met een lage glucoseconcentratie om de cardiomyocyten selectief te zuiveren.Ten slotte worden de cellen visueel geïnspecteerd onder een lichtmicroscoop en geanalyseerd via flowcytometrie om de productie van een sterk gezuiverde populatie kloppende cardiomyocyten te bevestigen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere cardiomyocyte-differentiatieprotocollen die gebruikmaken van kleine moleculen, is dat er een extra stap van glucosedeprivatie wordt toegepast. Hierdoor kunnen we cardiomyocyten zuiveren die in staat zijn om andere energiebronnen van de cel dan glucose te benutten.Niet-cardiomyocyten kunnen selectief worden geëlimineerd uit deze heterogene populatie van gedifferentieerde cellen. Cardiomyocyten kunnen vervolgens worden gebruikt voor downstream-doeleinden, zoals in vitro ziektemodellering of high-throughput drug discovery. Bereid dit experiment voor door zes-wellplaten voor te coaten met extracellulaire matrix-oplossing (ECMS) en door een vial met bevroren menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) te ontdooien, zoals beschreven in de bijbehorende tekst.Na centrifugatie resuspenderen de ontdooide cellen in E eight met rock-remmer. Draag vervolgens de inhoud van het vial over naar één putje van een zes-putjesplaat die vooraf is gecoat met ECMS. Plaats de cellen in een incubator bij 37 °C met 5% CO2.Na 24 uur zullen de cellen zijn geadhereerd. Vervang het medium door E eight medium zonder rock-inhibitor. Ga door met het cultiveren van de cellen en vervang het E eight medium dagelijks.Wanneer de HI PSC's een confluentie van 75 tot 80% bereiken, is het tijd om ze te passeren. Aspireer het cultuurmedium snel. Was de wells met één milliliter steriele PBS op kamertemperatuur en aspireer de PBS.Voeg vervolgens 500 µL 0,5 mM EDTA of een andere celdetachementoplossing toe. Incubeer één tot zeven minuten bij kamertemperatuur; gebruik een microscoopmonitor om het celdetachement te volgen, en aspireer de celdetachementoplossing zodra er zichtbare krulling of verdikking van de koloniën aan de randen optreedt. Voeg daarna 1 mL E8-medium toe, aangevuld met 10 µM ROCK-inhibitor, en pipetteer dit met een P1000 herhaaldelijk op en neer om de hiPSC-koloniën volledig van de plaat los te maken, waarbij vijf tot 10 celclumps ontstaan.Breng de suspensie vervolgens over naar een conische buis van 15 milliliter om de grote celklonters verder te dispergeren. Pipetteer de suspensie op en neer totdat er kleinere klonters zijn gevormd, zoals hier wordt getoond. Verdun vervolgens de cellen 1 op 12 door 11 milliliter E8-medium met ROCK-inhibitor toe te voegen aan de ene milliliter celsuspensie.Aspireer vervolgens het ECMS uit de vooraf gecodeerde platen. Voeg twee milliliter resuspenderde cellen toe aan elke put; ongeveer 100.000 cellen per put van een zes-putsplaat is ideaal. Streef ernaar de cellen gelijkmatig over de put te verdelen om clustering van cellen in het centrum van de put te voorkomen. Plaats de plaat gedurende 24 uur in de incubator.Vervang de volgende dag het medium door E8 zonder ROCK-remmer. Verschoon het medium elke 24 uur totdat de cellen 80% confluent zijn. Gewoonlijk zijn de cellen binnen drie tot zes dagen na dissociatie met EDTA of 1X detachment solution klaar om opnieuw te worden gesubcultured. Zaai ongeveer 100.000 humane iPSCs op met ECM gecoate six-well kweekplaten voor differentiatie.Volg dezelfde stappen als bij HI PSC's; wanneer de cellen een confluentie van 85% bereiken, wordt overgeschakeld op R-P-M-I-B 27-medium zonder insuline, maar met zes micromolair van de GSK drie beta-remmer CHIR 9 9 0 2 1. Incubeer de cellen gedurende 48 uur en onderzoek de cellen dagelijks onder een microscoop.Aanzienlijke hoeveelheden celdood kunnen worden waargenomen na 24 uur CHIR-behandeling. Dit is normaal en wordt vaak gezien na twee dagen behandeling. De HIPS nemen in grootte en aantal toe en differentiëren verder in de richting van een mesodermaal lot.Vervang het kweekmedium dat CHIR bevat door R-P-M-I-B 27 insuline-medium en incubeer tot dag drie. Wissel op de derde dag het medium naar R-P-M-I-B 27 zonder insuline. Voeg vijf micromolair Wnt-remmer IWR-1 toe en incubeer de cellen gedurende 48 uur.Onderzoek op de vijfde dag de cellen onder een microscoop. De mesodermale cellen moeten zijn gedifferentieerd richting de cardiale lijn en moeten beginnen te coalesceren en karakteristieke vertakkingsstructuren vormen. Vervang het medium door R-P-M-I-B 27 zonder insuline en incubeer de cellen gedurende 48 uur.Op de zevende dag. Vervang het medium elke drie dagen daarna door R-P-M-I-B 27 met insuline; vervang dit met hetzelfde medium tussen de achtste en tiende dag. Spontane samentrekkingen van de cardiomyocyten zullen na 10 dagen differentiatie zichtbaar zijn.Meer dan 50% van de celoppervlakken vertoont samentrekkingen. Echter, kloppende celvellen kunnen vermengd zijn met niet-cardiomycyten; op de 10e dag zullen vertakkingsachtige structuren sterk geprononceerd zijn. Terminaal gedifferentieerde cardiomyocyten zullen vanaf dit punt niet verder prolifereren.Vervang op dag 10 na differentiatie het medium in elke put van de zesputsplaat door twee milliliters medium met een lage glucoseconcentratie en houd de cellen gedurende drie dagen in dit medium tot dag 13. Zet de cellen op dag 13 terug in R-P-M-I-B 27 medium met insuline of, optioneel, om de cellen opnieuw te laten opzwellen, wat de dissociatie van niet-cardiomyocyten tijdens glucoseuithongering vergemakkelijkt.Zuig het medium af en was één keer met PBS. Voeg 500 µL cel-dissociatie-enzym toe en incubeer de cellen gedurende vijf minuten. Gebruik na vijf minuten enzymbehandeling een P 1000 om de cardiomyocyten handmatig te verspreiden tot een enkelcel-suspensie door tot 30 keer op en neer te pipetteren. Nadat de cellen zijn gedissocieerd, worden ze overgebracht naar een conisch buisje van 15 mL.Vul de buis met vijf milliliter R-P-M-I-B 27-medium met insuline om het cel-dissociatie-enzym te verdunnen en centrifugeer vier minuten bij 200 Gs. Aspireer na het centrifugeren het supernatant en gooi dit weg. Resuspendeer de cellen vervolgens in twee milliliter R-P-M-I-B 27-medium en zaai ze uit op een nieuwe, met ECMS gecoate zeswellplaat. Doorgaans wordt de celoverleving verhoogd bij confluentie voor een optimale overleving van de cellen.Zaai 2 miljoen cellen per put in een zes-puts schaal voor de niet-heruitgezaaide cellen. Vervang op de 14e dag het medium opnieuw door twee milliliter glucosearm medium voor een tweede cyclus van glucosegebrek. Houd de cellen nog drie dagen in deze glucosearme toestand.De meeste niet-cardiomyocyten zullen op de 17e dag afsterven. Vervang het medium door twee milliliters R-P-M-I-B 27 met insuline. De resterende cellen zullen sterk gezuiverde cardiomyocyten zijn.Deze cellen kunnen worden gebruikt voor genexpressieanalyse, drugscreening, metabole analyse en diverse andere downstream-assays om de zuiverheid van cardiomyocyten na differentiatie te onderzoeken. De cellen na zuivering via de methode van glucosestarvatie werden gekarakteriseerd met immunokleuring tegen de cardiomyocytenmarkers cardiaal troponine en CTN T. Immunofluorescentiemicroscopie van een onzuiverde populatie gedifferentieerde cellen onthulde dat, hoewel veel cellen CTN T-positief waren (weergegeven in groen), veel cellen geen CTN T-expressie vertoonden, wat wijst op de aanwezigheid van niet-cardiomyocyten op dag 13. In tegenstelling hiermee waren, na een glucosestarvatie van drie dagen beginnend op dag 10, bijna alle cellen op dag 13 CTNT-positief, wat duidt op een succesvolle zuivering van de cardiomyocyten na glucosestarvatie.Deze gegevens werden verder bevestigd met behulp van flowcytometrie-analyse. Zoals in het rood aangegeven, was ongeveer 50% van de cellen die geen glucosegebrek ondergingen tn NT twee positief. Terwijl 90% van de glucose-uitgehongerde cellen tn NT twee positief was.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen kunnen worden gedifferentieerd tot hooggezuiverde populaties cardiomyocyten. Deze gezuiverde cellen kunnen op een high-throughput manier worden geproduceerd voor diverse downstream in vitro toepassingen. Houd bij het kweken van pluripotente stamcellen rekening met het feit dat ze niet tot een confluentie van honderd procent mogen groeien vóór de inductie.Sommige stamcellijnen differentiëren het beste wanneer de initiële confluentie van de pluripotente stamcellen minder dan 85% is. Ten slotte kunnen sommige stamcellijnen sneller of heviger reageren op de stap van glucosedeprivatie. Monitor deze parameters altijd voordat u met nieuwe stamcellijnen werkt.

derivation-highly-purified-cardiomyocytes-from-human-induced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We hebben een protocol voor de inductie van cardioblasts rechtstreeks van pluripotente menselijke embryonale stamcellen gehouden onder bepaalde voorwaarden met kleine moleculen, die afleiding van een groot aanbod van menselijke voorouders hart-en functionele cardiomyocyten voor hart-en reparatie mogelijk maakt.

Efficiënte Afleiding van de Mens Cardiac precursoren en cardiomyocyten uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

Pluripotente stamcellen, hetzij embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen vormen een waardevolle bron van menselijke gedifferentieerde cellen, zoals cardiomyocyten. Hier zullen we ons richten op de cardiale inductie van iPS cellen, laten zien hoe ze te gebruiken om functionele menselijke hartspiercellen te verkrijgen via een embryoid lichamen-gebaseerd protocol.

Generatie van Human Cardiomyocytes: Een Differentiatie Protocol van Feeder-vrije Human geïnduceerde pluripotente stamcellen

Het artikel beschrijft de gedetailleerde methodologie efficiënt onderscheiden humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten door het selectief moduleren van de Wnt route, gevolgd door flow cytometrie analyse van referentiemarkeringen aan homogeniteit en identiteit van de bevolking beoordelen.

High Efficiency differentiatie van humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten en karakterisering door flowcytometrie

Hier presenteren we een robuust, snel en schaalbaar protocol voor cardiomyocytedifferentiatie voor humane pluripotente stamcellen (hPSC's). Cardiomyocyten die met deze grootschalige methode worden verkregen, kunnen voldoende celgetallen leveren voor hun effectieve gebruik in modellering van menselijke hart- en vaatziekten, high-throughput geneesmiddelenonderzoek en mogelijk klinische toepassingen.

Grootschalige productie van cardiomyocyten van menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een zeer reproduceerbare Small-Molecule Based Differentiatie Protocol

Elektrofysiologische karakterisering van cardiomyocyten afgeleid van humane Pluripotente Stamcellen (hPSC-CM's) is van cruciaal belang voor cardiovasculaire modellering en voor het bepalen van geneesmiddelreacties. Dit protocol geeft de nodige informatie om hPSC-CM's op multi-elektrode arrays te scheiden en te platen, hun veldpotentiaal te meten en een methode voor het analyseren van QT- en RR-intervallen.

Elektrofysiologische analyse van humane Pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hPSC-CM&#39;s) met behulp van multi-elektrode arrays (MEA&#39;s)

Dit artikel bevat een set van protocollen voor de ontwikkeling van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide hartspier (hipsc-cm) netwerken gekweekt op multi well mea platen om reversibel elektroporate de celmembraan voor actie potentiële metingen. Opnamen met hoge doorvoer worden via dezelfde cellocaties herhaaldelijk over dagen verkregen.

Humane iPSC-afgeleide cardiomyocyte netwerken op multi well micro-elektrode arrays voor terugkerende actie potentiële opnames

Hier beschrijven en valideren we een methode voor het consequent genereren van robuuste menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardio myocytes en karakteriseren hun functie. Deze technieken kunnen helpen bij het ontwikkelen van mechanistisch inzicht in signalering trajecten, bieden een platform voor grootschalige drug screening, en betrouwbaar model cardiale ziekten.

Generatie van ventriculaire-achtige HiPSC-afgeleide cardio myocyten en hoogwaardige celpreparaten voor de karakterisering van calcium behandeling

Hier beschrijven we een eenvoudig te gebruiken methodologie om 3D zelfgeassembleerde cardiale microtissue-arrays te genereren die zijn samengesteld uit vooraf gedifferentieerde door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten, cardiale fibroblasten en endotheelcellen. Deze gebruiksvriendelijke en laagcellige techniek die nodig is om cardiale microtissues te genereren, kan worden geïmplementeerd voor ziektemodellering en vroege stadia van medicijnontwikkeling.

Fabricage van 3D cardiale microtissue arrays met behulp van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten, cardiale fibroblasten en endotheelcellen

Deze methode kan worden gebruikt om sarcomere verkorting te onderzoeken met behulp van pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten met fluorescerende sarcomere-eiwitten.

Sarcomere Verkorting van Pluripotente Stamcel-Afgeleide Cardiomyocyten met behulp van Fluorescerende-Tagged Sarcomere Eiwitten.

Hier presenteren we een protocol om menselijke cardiomyocyten robuust te genereren en uit te breiden uit perifere mononucleaire bloedcellen van patiënten.

Generatie en uitbreiding van menselijke cardiomyocyten uit mononucleaire bloedcellen van de patiënt

Leer hoe je zuivere cardiomyocyten afleidt uit menselijke iPSCs met kleine moleculen en glucoseverhongering. Deze methode verbetert cardiovasculaire ziekte-modellering en drugsscreening aanzienlijk.

Afleiding van zeer gezuiverde Cardiomyocyten van Human geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van kleine moleculen gemoduleerd Differentiatie en Latere Glucose Verhongering (Video) | JoVE Journal

Afleiding van zeer gezuiverde Cardiomyocyten van Human geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van kleine moleculen gemoduleerd Differentiatie en Latere Glucose Verhongering

Meer video's verkennen