Synchronisatie van Caulobacter crescentus Voor Onderzoek van de bacteriële cel Cyclus
8 april 2015
Synchronisatie van bacteriële cellen is essentieel voor studies van de bacteriële celcyclus en ontwikkeling. Caulobacter crescentus kan worden gesynchroniseerd door middel van dichtheidscentrifugatie, wat een snelle en krachtige tool biedt voor studies van de bacteriële celcyclus. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de synchronisatie van Caulobacter-cellen.
Het algemene doel van deze procedure is om Coob backer zwermcellen te isoleren om een gesynchroniseerde celcultuur te vestigen. Dit wordt bereikt door eerst een gemengde cultuur van coob backer cellen te laten groeien, en vervolgens de groei kortstondig te stoppen door de cellen in koud medium op te schorsen. De tweede stap is om de zwermcellen te scheiden door differentiële dichtheidscentrifugatie.
De volgende stap is om de zwermcellen op te schorsen in warm medium, wat de cellen toestaat om de celcyclus te betreden. Ten slotte kunnen de geïsoleerde zwermcellen gedurende de hele celcyclus worden gevolgd door biochemische analyses of microscopie. Het grote voordeel van deze techniek boven andere methoden, zoals de baby cel machine, is dat cellen snel kunnen worden geïsoleerd en voldoende hoeveelheden kunnen worden verkregen voor biochemische studies.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van de celbiologie, zoals wat de controle over chromosoomsegregatie en de asymmetrische celdelingscyclus bepaalt. Om te beginnen, inoculeer vijf milliliter PYE medium met bacteriën van een plaat van colo backer CSIS stam, NA 1000. Laat de cultuur een nacht groeien bij 28 graden Celsius met schudden, breng de volgende dag 0,5 milliliter van de nachtcultuur over naar een flacon met 25 milliliter M twee G medium, en schud de flacon bij 28 graden Celsius totdat de cultuur een optische dichtheid tussen 0,5 en 0,6 bereikt.
Verdun vervolgens de cultuur in een liter M twee G medium om de gewenste startoptische dichtheid te verkrijgen en schud de flacon bij 28 graden Celsius wanneer de optische dichtheid van de cultuur 0,5 bereikt. Pipetteer één microliter van de cultuur op een plaatje, en bedek het vloeistofoppervlak met een dekglas. Beeld de cellen af met fasecontrastmicroscopie om de aanwezigheid van snel zwemmende zwermcellen te bevestigen. Breng de cultuur over in een steriele centrifugeerbuis en centrifugeer de cellen gedurende 15 minuten bij 7.000 keer G bij vier graden Celsius.
Gooi vervolgens de losjes gepelletiseerde cellen weg bij het afgieten van het supernatant en voeg 180 milliliter koud M twee medium toe. Gebruik een serologische pipet om de cellen voorzichtig op te schorsen. Voeg vervolgens 60 milliliter koud colloïdaal silica-oplossing toe aan de celsuspensie en meng goed.
Giet de celsuspensie in acht 30 milliliter buizen en centrifugeer ze gedurende 30 minuten bij 6.400 keer G. Stel in op vier graden Celsius. Verwijder voorzichtig de buisjes uit de centrifuge en controleer of de buis twee duidelijke banden bevat.
De onderste band bevat de zwermcellen en de pre-delingscellen bevinden zich in de bovenste band. Aspibeer vervolgens voorzichtig de bovenste band en de vloeistof tot ongeveer een centimeter boven de onderste band. Gebruik een pasteur pipet om de zwermband te verwijderen en breng deze over in een schone buis.
Vul de buis met koud M twee medium en centrifugeer de buis vervolgens om de colloïdale silica weg te wassen. Gooi vervolgens voorzichtig het supernatant weg en schud de cellen op in 20 milliliter koud M twee medium centrifugeer. Opnieuw om de cellen te pellen, schud de pellets op in 30 milliliter koud M twee medium en meet vervolgens de optische dichtheid van de suspensie.
Plaats één microliter van de celsuspensie op een microscoopglas en gebruik fasecontrastbeeldvorming om te controleren op zwermcellen. Centrifugeer vervolgens de cellen en schud ze op in M twee G medium tot een optische dichtheid tussen 0,3 en 0,4. Incubeer de cultuur met schudden bij 28 graden Celsius voor westerse plot of genexpressie-assays.
Verwijder elke 10 tot 30 minuten een milliliter aliquot gedurende ongeveer 140 minuten totdat de optische dichtheid van de cultuur verdubbelt. Gebruik een tafelcentrifuge om de cellen gedurende 30 seconden te centrifugeren en aspibeer vervolgens snel het medium weg. Vries de celpellets in vloeibare stikstof en bewaar ze bij min 80 graden Celsius voor kleinschalige synchronie. Inoculeer vijf milliliter M twee G medium met NA 1000 cellen en laat de cellen een nacht groeien met schudden bij 28 graden Celsius de volgende dag.
Verdun de cultuur in 15 milliliter M twee G medium en laat de cellen groeien tot de optische dichtheid tussen 0,5 en 0,6 is. Centrifugeer de cellen en schud ze op in één milliliter koud M twee medium. Breng de cellen over in een twee milliliter microcentrifugebuisje, pelleet de cellen door centrifugatie en aspibeer het supernatant.
Plaats vervolgens de buis op ijs en schud het celpellet op in 900 microliter koud M twee medium. Voeg vervolgens 900 microliter koud PVP-gecoat colloïdaal silica toe en centrifugeer de buis gedurende 20 minuten. Aspibeer voorzichtig de bovenste pre-delingscelband en verzamel vervolgens de onderste zwermcelband in een nieuwe microcentrifugebuis.
Was de zwermcellen twee keer in één milliliter koud M twee medium terwijl je centrifugeert gedurende drie minuten tussen elke wassing, vlak voor de laatste centrifugatie. Plaats de celsuspensie in een voorgekoeld glas testbuisje van één milliliter en meet de optische dichtheid van de cellen. Breng vervolgens de cellen over in een microfugebuisje en centrifugeer na centrifugatie.
Resuspendeer tenslotte het laatste celpellet in voorverwarmd M twee G medium met een optische dichtheid tussen 0,3 en 0,4 en schud de cellen bij 28 graden Celsius. Als microscopie gewenst is, plaats één microliter van de cultuur op een M twee G aerospaadje op de geschikte tijdstippen. Differentiële dichtheidscentrifugatie van een asynchrone cultuur geeft twee banden van cellen.
De onderste band bevat zwermcellen, die een hogere dichtheid hebben, en de bovenste band bevat voorraad- en pre-delingscellen, die een lagere dichtheid hebben. De optische dichtheid van de cultuur neemt gedurende de celcyclus ongeveer twee keer toe. Gedurende deze tijd ondergaan zwermcellen differentiatie tot voorraadcellen, die vervolgens repliceren en asymmetrische celdeling ondergaan.
Bij elke deling ontstaat een nieuwe zwermcel en de ouder
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor de synchronisatie van Caulobacter crescentus-cellen, wat essentieel is voor het bestuderen van de bacteriële celcyclus. De methode omvat het isoleren van swarmer-cellen via dichtheidsgradientcentrifugatie, waardoor onderzoekers deze cellen gedurende hun gehele ontwikkeling kunnen volgen.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Microbiologie
- Celbiologie
- Bacteriële celcyclus
Achtergrond
- Synchronisatie van bacteriële cellen is essentieel voor nauwkeurige studies.
- Caulobacter crescentus kan worden gesynchroniseerd met behulp van dichtheidscentrifugatie.
- Deze methode biedt een snel instrument voor het bestuderen van bacteriële ontwikkeling.
- Inzicht in de celcyclus is cruciaal voor diverse biologische onderzoekstoepassingen.
Doel van de studie
- Om een gesynchroniseerde cultuur van Caulobacter crescentus swarmercellen te vestigen.
- Om biochemische assays en microscopische studies te faciliteren.
- Om bestaande methoden voor celisolatie te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Groei van een gemengde cultuur van Caulobacter-cellen.
- Stoppen van de groei door cellen te resuspenderen in koud medium.
- Scheiding van swarmer-cellen via differentiële densiteitscentrifugatie.
- Resuspenderen van geïsoleerde swarmer-cellen in warm medium om de celcyclus te initiëren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van swarmercellen voor gesynchroniseerde kweek.
- Vermogen om cellen gedurende de gehele celcyclus te volgen met behulp van diverse technieken.
- Demonstratie van de voordelen van deze methode ten opzichte van traditionele technieken.
- Voorziening van een gedetailleerd protocol zodat onderzoekers de studie kunnen repliceren.
Conclusies
- Het protocol maakt een efficiënte synchronisatie van Caulobacter crescentus mogelijk.
- Deze methode verbetert de bestudering van bacteriële celcycli.
- Het biedt een waardevol instrument voor biochemische studies en microscopieonderzoek.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Synchronisatie van Caulobacter crescentus maakt een nauwkeurige temporele analyse van gebeurtenissen in de bacteriële celcyclus mogelijk, wat bijdraagt aan mechanische risicoreductie en targetvalidatie in de vroege ontdekkingsfase. Deze aanpak biedt betrouwbare, reproduceerbare biologische systemen voor het ontleden van regulatoire netwerken en proteïnedynamiek die relevant zijn voor bacteriële groei en deling. De schaalbaarheid en de kwantitatieve outputs van deze methode maken het tot een herbruikbaar platform voor portfolio-brede onderzoeken naar de bacteriële celcyclus.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar celcyclusregulerende paden en eiwitfuncties in gesynchroniseerde populaties mogelijk.
- Ondersteunt functionele target-validatie door gecontroleerde perturbatie en meting van celcyclusgebeurtenissen mogelijk te maken.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door de sequentie en afhankelijkheid van moleculaire gebeurtenissen te verduidelijken.
- Biedt voorspellende zekerheid voor downstream studies naar bacteriële groei en deling.
Screening & assayontwikkeling
- Genereert gevalideerde, gesynchroniseerde celpopulaties voor kwantitatieve biochemische assays en microscopie.
- Verbetert de reproduceerbaarheid van assays door biologische variabiliteit in de celcyclusstatus te minimaliseren.
- Maakt standaardisatie van read-outs mogelijk, zoals proteïne-oscillatie (bijv. CTRA) en celdelingsmarkers.
- Bereidt robuuste biologische systemen voor op compound-screening of studies naar genetische perturbatie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt bacteriële celcyclusmodellen af met translationeel onderzoek naar celdeling en genoomreplicatie.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie van antibacteriële targets.
- Biedt een platform voor risico-gecorrigeerde voortgang van interventies die de celcyclus moduleren.
- Biedt voorspellende risicoreductie voor strategieën ter remming van bacteriële groei.
Pipeline- & workflowintegratie
Dit synchronisatieprotocol sluit aan bij de overgang van vroege ontdekking naar assay-ontwikkeling, waardoor hypothese-gestuurde studies naar de regulatie van de bacteriële celcyclus mogelijk worden gemaakt en de identificatie van lead-verbindingen voor antibacterieel onderzoek wordt ondersteund.
- Ontdekkingsbiologie: Faciliteert het testen van nulp hypothesen en het verduidelijken van pathways door specifieke fasen van de celcyclus te isoleren.
- Screening: Levert reproduceerbare, gesynchroniseerde populaties voor de ontwikkeling van kwantitatieve assays en screening-gereedheid.
- Analytica: Biedt meetbare resultaten zoals eiwitoscillatie en de timing van celdeling voor vergelijkende analyse.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen mechanistische inzichten en preklinische modellen van bacteriële groei en deling.
- Hergebruik binnen de organisatie: Vestigt een schaalbare, gestandaardiseerde workflow voor herhaald gebruik in studies naar de bacteriële celcyclus.
Operationele & Enterprise Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanische ambiguïteit in onderzoek naar de bacteriële celcyclus.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van gesynchroniseerde celpreparaten.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door robuuste target-validatie mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van antibacteriële targets en strategieën voor de modulering van de celcyclus.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in bacteriële culturen, dichtheidsgradientcentrifugatie en het ontwerp van kwantitatieve assays.
- Toegang tot centrifugatieapparatuur, microscopie en analytische platforms voor de analyse van eiwit- en genexpressie is noodzakelijk.
- Standaardisatie van synchronisatie- en assayprotocollen tussen teams is vereist voor reproduceerbaarheid.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende bacteriële stammen of modelsystemen.
- Een snelle uitvoering is cruciaal om de synchronisatie te behouden en biologische variabiliteit te minimaliseren.
