Name: Synchronisatie van Caulobacter crescentus Voor Onderzoek van de bacteriële cel Cyclus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Leer de synchronisatie van Caulobacter crescentus voor microbiologisch onderzoek met differentiële dichtheidscentrifugatie. Deze methode isoleert snel zwermercellen voor biochemische analyses en microscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken de leden van het Shapiro-lab en Erin Schrader voor hun opmerkingen over het manuscript. De auteurs erkennen de financiële ondersteuning van: NIH postdoctorale beurs F32 GM100732 aan JMS en NIH-subsidies R01 GM51426 en R01 GM32506 aan LS.

1. Grootschalige Synchrony - Optimaal voor Western Blot, microarray / RNA-Seq, en ander materiaal Intensive Testen <ol><li> Uit een vriezer voorraad of een bord, groeien een 5 ml O / N cultuur van stam NA1000 door schudden bij 28 ° C in PYE medium. </li><li> Inoculeer 0,5 ml van de cellen van stap 1 in 25 ml M2G (tabellen 1-2) en schud bij 28 ° C totdat de kweek een OD 600 tussen 0,5 en 0,6 bereikt. </li><li> Te enten de cellen in 1 L van M2G en schudden bij 28 ° C. </li><li> Zodra OD 600 bereikt 0,5-0,6, bevestigen de aanwezigheid van swarmer cellen met behulp van vloeibare gemonteerd fase microscopie. Spot 1 ui van cellen op een glasplaatje, dek af met een deksel slip, en het beeld van fase microscopie. Controleer de aanwezigheid van swarmer cellen door visualiseren zwemmen snel cellen in de populatie. </li><li> Spin cellen gedurende 15 min bij 7 kxg bij 4 ° C in een JA-10 rotor. </li><li> Verwijder het supernatant en voeg 180 ml koud M2 (tabellen 1-2) en voorzichtig resuspend alle cellen met behulp van een serologische pipet. Gooi losjes afgedraaid cellen; ze zijn predivisional en gestalkt cellen. </li><li> Voeg 60 ml koud Colloïdaal siliciumdioxide-oplossing (zorg ervoor dat de Colloïdaal siliciumdioxide schorsing meng goed voor het toevoegen aan de cellen) en meng de celsuspensie goed. </li><li> Giet de celsuspensie in acht 30 ml buizen en draaien gedurende 30 min bij 6.4 kxg bij 4 ° C in een JA-20 rotor. OPMERKING: Men moet twee verschillende bands te zien; de swarmer band is de onderste band terwijl gestalkt / predivisional cellen zijn in de top-band (Figuur 1B). </li><li> Aspireren zorgvuldig de topband uit en verwijder de vloeistof tot ~ 1 cm boven de swarmer band (de onderste band). </li><li> (Kritiek) Met behulp van een Pasteur pipet, verwijder voorzichtig de swarmer band en plaats in een schone buis. Om wegspoelen de Colloidal silica, boven de buis met koud M2 en centrifugeren gedurende 10 min bij 6.4 kxg bij 4 ° C in een JA-20 rotor. </li><li> Gooi de supernatant voorzichtig en resuspendeer decellen in 20 ml koude M2 ​​en centrifugeren gedurende 10 min bij 6.4 kxg bij 4 ° C in een JA-20 rotor. </li><li> Resuspendeer de pellets in 30 ml koud M2 en meet de OD600 met een spectrofotometer blanco met koud M2 medium. Opslaan 1 pl voor fase beeldvorming om te controleren op swarmer cellen; 90-95% van de cellen moet zwermers. </li><li> Spin down de cellen gedurende 5 min bij 6.4 kxg bij 4 ° C in een JA-20 rotor. Resuspendeer cellen in 28 ° C M2G medium zodat de A 600 ~ 0,3-0,4 en beginnen schudden bij 28 ° C. OPMERKING: Typische opbrengsten zijn tussen de 30 en 60 ml van swarmer celcultuur van 1L van niet-gesynchroniseerde cellen. </li><li> Beginnen met het nemen tijdstippen (wild type cultuur zal ongeveer 135-140 minuten duren om te verdelen) 8,9. Op elk tijdstip, het meten van de OD 600. Controleer of de OD 600 na deling is ongeveer 2X de eerste OD 600. </li><li> Voor western blot of genexpressie testen, verwijder 1 ml porties van de culture op de gewenste tijdstippen, het afsluiten bij maximale snelheid in een tafelblad centrifuge gedurende 30 seconden, snel decanteren of zuig het medium en flash bevriezen de celpellet in vloeibare stikstof. Bewaar de cellen bij -80 ° C totdat stroomafwaarts analyse. </li></ol> 2. Kleinschalig Synchrony - Optimaal voor Microscopie <ol><li> Uit een vriezer voorraad of een bord, groeien een 5 ml O / N cultuur schudden bij 28 ° C in M2G. </li><li> Verdunnen in 15 ml M2G (tabellen 1-2) en groeien tot mid-log (OD 600 = 0,5-0,6). </li><li> Spin 6,4 kxg gedurende 10 min bij 4 ° C in een JA-20 rotor, en resuspendeer in 1 ml koude M2 ​​(Tabellen 1-2) overgebracht in een 2 ml microcentrifugebuis. </li><li> Spin op 15 kxg gedurende 3 min in een microcentrifugebuis om cellen pellet, zuig het supernatant, zet de pellet op ijs, en resuspendeer in 900 ul van koude M2. </li><li> Voeg 900 ul koud PVP beklede colloïdale silica en centrifugeren gedurende 20 min bij 15 kxg bij 4 ° C in een microfoonrocentrifuge buis. </li><li> (Kritiek) Zuig of een pipet uit de top gestalkt / predivisional cel band en het verzamelen van de bodem swarmer band in een nieuwe microcentrifugebuis. </li><li> Was de swarmer cellen tweemaal in 1 ml koude M2 ​​tijdens centrifugeren bij 15 kxg gedurende 3 min. </li><li> Voor het centrifugeren, zet de cellen in een voorgekoeld 1 ml glazen reageerbuis en meet de OD 600 van de cellen in vergelijking met een blanco van M2. </li><li> Resuspendeer de laatste cel pellet in 28 ° C M2G bij een OD tussen 0,3-0,4 en schud / roll cellen bij 28 ° C. OPMERKING: Typische opbrengsten zijn tussen de 2 en 4 ml swarmer celkweek. </li><li> Voor microscopie experimenten op de gewenste tijdstippen plaats 1 ul van cellen op een M2G agarose pad voor beeldvorming. </li></ol>

<ol><li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-level+design+of+bacterial+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">System-level design of bacterial cell cycle control.</a> FEBS Lett. 583, 3984-3991 (2009).</li>
<li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+and+conservation+pattern+of+whole-cell+control+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The architecture and conservation pattern of whole-cell control circuitry.</a> J. Mol. Biol. 409, 28-35 (2011).</li>
<li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bacterial+cell-cycle+regulatory+network+operating+in+time+and+space%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A bacterial cell-cycle regulatory network operating in time and space.</a> Science. 301, 1874-1877 (2003).</li>
<li>Ptacin, J. L., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiating+bacterial+mitosis%3A+understanding+the+mechanism+of+ParA-mediated+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Initiating bacterial mitosis: understanding the mechanism of ParA-mediated chromosome segregation.</a> Cell Cycle. 9, 4033-4034 (2010).</li>
<li>Evinger, M., Agabian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Envelope-associated+nucleoid+from+Caulobacter+crescentus+stalked+and+swarmer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Envelope-associated nucleoid from Caulobacter crescentus stalked and swarmer cells.</a> J. Bacteriol. 132, 294-301 (1977).</li>
<li>Tsai, J. W., Alley, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+of+the+Caulobacter+McpA+chemoreceptor+is+cell+cycle+regulated+by+a+ClpX-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Proteolysis of the Caulobacter McpA chemoreceptor is cell cycle regulated by a ClpX-dependent pathway.</a> J. Bacteriol. 183, 5001-5007 (2001).</li>
<li>Marks, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+basis+of+laboratory+adaptation+in+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The genetic basis of laboratory adaptation in Caulobacter crescentus.</a> J. Bacteriol. 192, 3678-3688 (2010).</li>
<li>Ely, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genetics of Caulobacter crescentus.</a> Methods Enzymol. 204, 372-384 (1991).</li>
<li>Williams, B., Bhat, N., Chien, P., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClpXP+and+ClpAP+proteolytic+activity+on+divisome+substrates+is+differentially+regulated+following+the+Caulobacter+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">ClpXP and ClpAP proteolytic activity on divisome substrates is differentially regulated following the Caulobacter asymmetric cell division.</a> Mol. Microbiol. 93, 853-866 (2014).</li>
<li>Quon, K. C., Yang, B., Domian, I. J., Shapiro, L., Marczynski, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+control+of+bacterial+DNA+replication+by+a+cell+cycle+regulatory+protein+that+binds+at+the+chromosome+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Negative control of bacterial DNA replication by a cell cycle regulatory protein that binds at the chromosome origin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 120-125 (1998).</li>
<li>Laub, M. T., Chen, S. L., Shapiro, L., McAdams, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+directly+controlled+by+CtrA%2C+a+master+regulator+of+the+Caulobacter+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Genes directly controlled by CtrA, a master regulator of the Caulobacter cell cycle.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 4632-4637 (2002).</li>
<li>Quon, K. C., Marczynski, G. T., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+by+an+essential+bacterial+two-component+signal+transduction+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control by an essential bacterial two-component signal transduction protein.</a> Cell. 84, 83-93 (1996).</li>
<li>Ferullo, D. J., Cooper, D. L., Moore, H. R., Lovett, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+synchronization+of+Escherichia+coli+using+the+stringent+response%2C+with+fluorescence+labeling+assays+for+DNA+content+and+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Cell cycle synchronization of Escherichia coli using the stringent response, with fluorescence labeling assays for DNA content and replication.</a> Methods. 48, 8-13 (2009).</li>
<li>Degnen, S. T., Newton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+replication+during+development+in+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromosome replication during development in Caulobacter crescentus.</a> J. Mol. Biol. 64, 671-680 (1972).</li>
<li>Bates, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Escherichia+coli+baby+cell+column%3A+a+novel+cell+synchronization+method+provides+new+insight+into+the+bacterial+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Escherichia coli baby cell column: a novel cell synchronization method provides new insight into the bacterial cell cycle.</a> Mol. Microbiol. 57, 380-391 (2005).</li>
<li>Abel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-modal+distribution+of+the+second+messenger+c-di-GMP+controls+cell+fate+and+asymmetry+during+the+caulobacter+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Bi-modal distribution of the second messenger c-di-GMP controls cell fate and asymmetry during the caulobacter cell cycle.</a> PLoS Genet. 9, e1003744(2013).</li>
<li>Johnson, R. C., Ely, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+spontaneously+derived+mutants+of+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Isolation of spontaneously derived mutants of Caulobacter crescentus.</a> Genetics. 86, 25-32 (1977).</li>
<li>Britos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+response+to+carbon+starvation+in+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Regulatory response to carbon starvation in Caulobacter crescentus.</a> PLoS One. 6, e18179(2011).</li>
<li>Boutte, C. C., Crosson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+logic+of+stringent+response+regulation+in+Caulobacter+crescentus%3A+starvation+signalling+in+an+oligotrophic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The complex logic of stringent response regulation in Caulobacter crescentus: starvation signalling in an oligotrophic environment.</a> Mol. Microbiol. 80, 695-714 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De bacteriële celcyclus is een fundamenteel proces in het leven en is belangrijk voor de studie van groei en als doelwit voor antibiotica van de volgende generatie. Hier beschrijven we gedetailleerd de snelle synchronisatieprocedures voor C. crescentus NA1000, een modelorganisme voor de studie van de bacteriële celcyclus en asymmetrische celdeling. Deze methode is geschikt voor western blot, genexpressieprofilering en fluoresceringmicroscopie-assays om de ruimtelijk-temporele regulatie van de bacteriële celcyclu...

De bacteriële celcyclus regelt zowel de replicatie van het genoom en de verdeling van dochtercellen. Belangrijker nog, zoals resistentie tegen antibiotica is een groeiende bedreiging voor de volksgezondheid, de bacteriële cel cyclus presenteert een onaangeboorde doelwit voor antibiotica ontwikkeling. In de bacterie Caulobacter crescentus, elke celcyclus leidt tot een asymmetrische verdeling, waarbij twee dochtercellen van verschillende lot (figuur 1A) 1,2. Een dochter cel erft een flagellum en is beweeglijk, terwijl de andere dochter erft een steel en is sessile. Een geïntegreerde genetische circuit controleert voortgang van de celcyclus en lot van de cel door gentranscriptieregulatie, fosfo-signalering, en gereguleerde proteolyse 3. Bovendien chromosoom replicatie en gelijktijdige scheiding opbrengst dochtercellen die precies één kopie van het chromosoom 4 bevatten. Belangrijk is, kunnen deze twee celtypen snel worden gescheiden door colloidal silica deeltjesdichtheid centrifugatie in de synchroniseerbaar NA1000 stam 07/05 waardoor de isolatie van de swarmer cellen van de rest van de populatie met hoge opbrengsten (Figuur 1B). Geïsoleerd swarmer cellen dan verder synchroon door asymmetrische celdeling. Hier hebben we detail het gebruikte protocol voor het synchroniseren van Caulobacter stam NA1000. Wij bieden protocollen en gemeenschappelijke tips voor probleemoplossing voor zowel groot- als kleinschalige synchronisaties. Deze experimentele procedure biedt een krachtig instrument om de spatiotemporele controle van de Caulobacter celcyclus en lot van de cel te ondervragen.

<table><tbody><tr><td>PVP Coated Colloidal Silica (Percoll)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4937</td><td></td></tr><tr><td>Colloidal Silica (Ludox AS-40)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>420840</td><td></td></tr><tr><td>JA10 Rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>369687</td><td></td></tr><tr><td>JA20 Rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>334831</td><td></td></tr><tr><td>Ferrous Sulfate Chelate Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0518</td><td></td></tr><tr><td>30 ml Centrifuge Tubes</td><td>Corning</td><td>8445</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>EMD</td><td>SX0720-1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>VWR</td><td>BDH9268-500G</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Amresco</td><td>0621-500g</td><td></td></tr></tbody></table>

synchronisatie van<em&gt; caulobacter crescentus</em&gt; voor onderzoek van de bacteriële cel cyclus

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

De celcyclus is belangrijk voor groei, genoomreplicatie en ontwikkeling in alle cellen. Bij bacteriën hebben studies van de celcyclus zich grotendeels gericht op niet-gesynchroniseerde cellen, waardoor het moeilijk wordt om de temporele gebeurtenissen die nodig zijn voor celcyclusprogressie, genoomreplicatie en deling te ordenen. Caulobacter crescentus biedt een uitstekend modelsysteem voor de bacteriële celcyclus waarbij cellen snel kunnen worden gesynchroniseerd in een G0-toestand door dichtheidscentrifugering. Experimenten met celcyclussynchronisatie zijn gebruikt om de moleculaire gebeurtenissen die chromosoomreplicatie en -segregatie regelen vast te stellen, om een genetisch regulatief netwerk te karteren dat de celcyclusprogressie regelt en om de totstandkoming van polaire signaalcomplexen te identificeren die nodig zijn voor asymmetrische celdeling. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de snelle synchronisatie van Caulobacter NA1000-cellen. Synchronisatie kan worden uitgevoerd in een grootschalige opzet voor genexpressieprofilering en western blot-assays, evenals in een kleinschalige opzet voor microscopie of FACS-assays. De snelle synchroniseerbaarheid en hoge celopbrengsten van Caulobacter maken dit organisme tot een krachtig modelsysteem voor studies van de bacteriële celcyclus.

Synchronisatie levert doorgaans twee banden van de cellen (Figuur 1B): het swarmer band, die een hogere dichtheid heeft, en een gestalkt / predivisional cel band van lagere dichtheid. Te zorgen voor een efficiënte synchronisatie gemeenschappelijke controles omvatten het toezicht op de OD 600 en het meten van de niveaus van Ctra eiwit door western blot op verschillende celcyclus tijdstippen. De OD 600 moet stijgen ongeveer 2-voudig tijdens de celcyclus (Figuur 2). D...

Synchronisatie van bacteriële cellen is essentieel voor studies van de bacteriële celcyclus en ontwikkeling. Caulobacter crescentus kan worden gesynchroniseerd door middel van dichtheidscentrifugatie, wat een snelle en krachtige tool biedt voor studies van de bacteriële celcyclus. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de synchronisatie van Caulobacter-cellen.

Synchronisatie van<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Voor Onderzoek van de bacteriële cel Cyclus

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van Coob backer-swarmercellen om een gesynchroniseerde celcultuur op te zetten. Dit wordt bereikt door eerst een gemengde cultuur van coob backer-cellen te kweken en vervolgens de groei kortstondig te stoppen door de cellen te resuspenderen in koud medium. De tweede stap bestaat uit het scheiden van de swarmercellen middels differentiële densiteitscentrifugatie.De volgende stap is om de zwermcellen opnieuw te suspenderen in warm medium, waardoor de cellen de celcyclus kunnen ingaan. Ten slotte kunnen de geïsoleerde zwermcellen gedurende de gehele celcyclus worden gevolgd met behulp van biochemische assays of microscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals de baby cell machine, is dat cellen snel kunnen worden geïsoleerd en in voldoende hoeveelheden kunnen worden vermenigvuldigd voor biochemische studies.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de celbiologie, zoals wat de chromosoomsegregatie en de asymmetrische celdelingscyclus aanstuurt. Begin met het inoculeren van 5 mL PYE-medium met bacteriën van een plaat met colo backer CSIS-stam, NA 1000. Laat de cultuur gedurende de nacht groeien bij 28 °C onder schudcondities; breng de volgende dag 0,5 mL van de overnight-cultuur over naar een kolf met 25 mL M2G-medium en schud de kolf bij 28 °C totdat de cultuur een optische dichtheid tussen 0,5 en 0,6 bereikt.Verdun vervolgens de cultuur in één liter M2G-medium om de gewenste begin-optische dichtheid te verkrijgen en schud de kolf bij 28 °C. Wanneer de optische dichtheid van de cultuur 0,5 bereikt, pipetteer dan 1 µL van de cultuur op een objectglas en dek de vloeistof vervolgens af met een dekglas. Beeld de cellen af via fasiscontrastmicroscopie om de aanwezigheid van snel zwemmende zwermcellen te bevestigen. Overbreng de cultuur naar een steriele centrifugebuis en centrifugeer de cellen vervolgens bij 7.000 ×g gedurende 15 minuten bij 4 °C.Verwijder vervolgens de losse celpellet bij het afgieten van het supernatant en voeg 180 milliliters koud M two medium toe. Gebruik een serologische pipette om de cellen voorzichtig te resuspenderen. Voeg daarna 60 milliliters koude colloïdaal silica-oplossing toe aan de celsuspensie en meng dit goed.Giet de celsuspensie in acht buizen van 30 milliliter en centrifugeer deze 30 minuten lang bij 6.400 ×g. Stel de temperatuur in op vier graden Celsius. Verwijder de buizen voorzichtig uit de centrifuge en controleer de buis op twee duidelijke banden.De onderste band bevat de zwermcellen en de predivisionele cellen bevinden zich in de bovenste band. Aspireer vervolgens voorzichtig de bovenste band en de vloeistof tot ongeveer één centimeter boven de onderste band. Gebruik een Pasteurpipet om de zwemband te verwijderen en over te brengen naar een schone buis.Vul de buis met koud M two-medium en centrifugeer de buis vervolgens om de colloïdale silica weg te wassen. Verwijder daarna voorzichtig het supernatant en resuspendeer de cellen in 20 milliliters koud M two-medium. Centrifugeer opnieuw om de cellen te pelletteren, resuspendeer de pellets in 30 milliliters koud M two-medium en meet vervolgens de optische dichtheid van de suspensie.Breng één µL van de cellsuspensie aan op een microscopiepreparaat en gebruik fasecontrastbeeldvorming om op zwermcellen te controleren. Centrifugeer vervolgens de cellen en resuspendeer deze in M2G-medium tot een optische dichtheid tussen 0,3 en 0,4. Incubeer de cultuur onder schudcondities bij 28 °C voor western blots of genexpressie-assays.Verwijder aliquots van één milliliter elke 10 tot 30 minuten gedurende ongeveer 140 minuten, totdat de optische dichtheid van de cultuur is verdubbeld. Gebruik een tafelcentrifuge om de cellen 30 seconden te centrifugeren en aspireer vervolgens snel het medium. Vries de celpellets in vloeibare stikstof in en bewaar deze bij negatief 80 graden Celsius. Inoculeer voor kleinschalige synchronisatie vijf milliliter M2G-medium met NA1000-cellen en kweek de cellen gedurende de nacht onder schudcondities bij 28 graden Celsius. De volgende dag.Verdun de cultuur in 15 milliliters M twee G-medium en kweek de cellen tot de optische dichtheid tussen 0,5 en 0,6 ligt. Centrifugeer de cellen en resuspendeer deze vervolgens in één milliliter koud M twee-medium. Breng de cellen over naar een microcentrifugebuis van twee milliliter, pellet de cellen door centrifugatie en aspireer het supernatant.Plaats de buis vervolgens op ijs en resuspendeer de celpellet in 900 µL koud M2-medium. Voeg daarna 900 µL koude PVP-gecoat colloïdaal silica toe en centrifugeer de buis gedurende 20 minuten. Aspireer voorzichtig de bovenste pre-divisionele celband en verzamel vervolgens de onderste swarmer-band in een nieuwe microcentrifugebuis.Was de zwermcellen twee keer in één milliliter koud M2-medium, waarbij tussen elke wasbeurt drie minuten wordt gecentrifugeerd, vlak voor de laatste centrifugeerstap. Plaats de celsuspensie in een vooraf gekoelde glazen reageerbuis van één milliliter en meet de optische dichtheid van de cellen. Draag de cellen vervolgens over naar een microcentrifugebuis en centrifugeer na de overdracht.Reese, resuspendeer het uiteindelijke celpellet in voorverwarmd M twee G medium tot een optische dichtheid tussen 0,3 en 0,4 en schud de cellen bij 28 °C. Indien microscopie gewenst is, breng dan op de juiste tijdstippen één µL van de cultuur aan op een M twee G aeros-pad. Dichtheidsgradiëntcentrifugatie van een asynchrone cultuur levert twee celbanden op.De onderste band bevat swarmercellen, die een hogere dichtheid hebben, en de bovenste band bevat stocked- en pre-divisionele cellen, die een lagere dichtheid hebben. De optische dichtheid van de cultuur neemt gedurende de celcyclus ongeveer tweevoudig toe. Tijdens deze periode differentiëren swarmercellen tot stockedcellen, waarna de stockedcellen repliceren en een asymmetrische celdeling ondergaan.Aangezien elke deling resulteert in een nieuwe swarmercel en de ouderlijke stocked-cel, is een western blot voor de hoofdregulator van de celcyclus CTRA een nuttige controle om de synchronisatie te verifiëren; CTRA blokkeert de DNA-replicatie in swarmercellen en wordt afgebroken bij DNA-replicatie. CTRA wordt vervolgens later in de celcyclus gesynthetiseerd, wat de herinitiatie van DNA-replicatie voorkomt en de transcriptie van veel ontwikkelingsgenen activeert. Dit oscillerende patroon van CTRA-proteineniveaus duidt op een succesvolle synchronisatie.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u callback- of NA 1000-cellen synchroniseert om de bacteriële celcyclus te onderzoeken. Deze procedures voor celsynchronisatie kan in één tot twee uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om snel te werken.

synchronization-caulobacter-crescentus-for-investigation-bacterial

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We hebben onlangs melding gemaakt van een nieuwe benadering voor het genereren van fluorogene DNAzyme probes die kan worden toegepast op het opzetten van een eenvoudige, "mix-and-lezen" TL-test voor bacteriële detectie. Deze speciale DNA probes katalyseren de splitsing van een chromofoor gemodificeerde DNA-RNA chimère substraat in aanwezigheid van ruwe extracellulaire mengsel (CEM) door een bepaald bacterie, waardoor vertaling bacteriële detectie in fluorescentiesignaal generatie. In dit...

Detectie van bacteriën met behulp van fluorogene DNAzymes

Het ontwerp van een synthetische operon codeert voor zowel de secretoire inrichting en de structurele monomeren Curli vezels beschreven. Overproductie van deze amyloïden en hechtende polymeren kan een meetbare versterking van de hechting van...

Techniek Adherent Bacteriën door het creëren van een synthetische Curli Operon

Source: Murata, K. et. al., Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the synchronous cultivation of cyanobacteria under light-dark cycles to study circadian-regulated DNA compaction. Fluorescence microscopy reveals condensed DNA at defined time points, confirming cell cycle alignment across the population.

Cyanobacterial Culture Synchronization and DNA Compaction Driven by Light-Dark Cycles

Inzicht in de functie van essentiële processen bij bacteriën is uitdagend. Fluorescentie microscopie met doelgroepen gerichte kleurstoffen kan belangrijke inzicht verwerven in de cel van de microbiële groei en celcyclus progressie. Hier, wordt Agrobacterium tumefaciens gebruikt als een model bacterie Markeer methoden voor levende cellen imaging voor karakterisering van essentiële processen.

Cel fluorescentie microscopie als waarnemer van essentiële processen tijdens microbiële celgroei bij te wonen

Bacteriële cellen zijn ruimtelijk zeer georganiseerd. Volg deze organisatie na verloop van tijd in traag groeiende Myxococcus xanthus cellen en werd een set-up voor fluorescentie live-cel beeldbewerking met hoge Spatio resolutie gedurende enkele generaties ontwikkeld. Met deze methode kon Spatio dynamiek van belangrijke eiwitten voor chromosoom segregatie en celdeling worden vastgesteld.

Fluorescentie Live-cel beeldvorming van de Complete vegetatieve celcyclus van de langzaam groeiende sociale bacterie Myxococcus xanthus

Hier wordt beschreven, is een methode voor het analyseren van bacteriële genexpressie in dierlijke weefsels op een cellulair niveau. Deze methode biedt een bron voor de studie van de fenotypische verscheidenheid die zich voordoen binnen een bacteriële bevolking in antwoord op het milieu weefsel tijdens een infectie.

Een fluorescentie gebaseerde methode om te studeren van bacteriële genregulatie in geïnfecteerde weefsels

Dit artikel biedt een stapsgewijze handleiding om de eiwit subcellulaire lokalisatie dynamiek te onderzoeken en morfologische veranderingen te monitoren met behulp van hoge-resolutie fluorescentiemicroscopie in Bacillus subtilis en Staphylococcus aureus.

Live-cel fluorescentiemicroscopie om Subcellulaire eiwit lokalisatie en celmorfologie veranderingen in bacteriën te onderzoeken

Dit werk presenteert een microscopiemethode die live beeldvorming van een enkele cel Escherichia coli mogelijk maakt voor analyse en kwantificering van het stochastische gedrag van synthetische gencircuits.

Continue meting van biologische ruis in Escherichia Coli met behulp van time-lapse microscopie

Veel bacteriën gebruiken flagella-gedreven beweeglijkheid om door hun omgeving te navigeren en gunstige omgevingen te koloniseren, zowel individueel als als collectief. Hier wordt het gebruik aangetoond van drie gevestigde methoden die motiliteit als selectietool gebruiken om componenten / paden te identificeren die bijdragen aan zwem- en zwermmotiliteit.

Onderzoek naar flagella-gedreven beweeglijkheid in Escherichia coli door drie gevestigde technieken in een serie toe te passen

Antibioticapersistentie beschrijft het vermogen van kleine subpopulaties binnen een gevoelige isogene populatie om tijdelijk hoge doses bacteriedodende antibiotica te verdragen. Het huidige protocol combineert benaderingen om het fenotype van antibioticapersistentie op moleculair en cellulair niveau te karakteriseren na blootstelling van Escherichia coli aan dodelijke doses ofloxacine.

Populatie- en eencellige analyse van antibioticapersistentie in Escherichia coli

Een uitdaging bij het analyseren van gesynchroniseerde tijdreeksexperimenten is dat de experimenten vaak verschillen in de duur van het herstel van synchronie en de celcyclusperiode. De metingen van verschillende experimenten kunnen dus niet in geaggregeerde vorm worden geanalyseerd of gemakkelijk worden vergeleken. Hier beschrijven we een methode voor het afstemmen van experimenten om fasespecifieke vergelijkingen mogelijk te maken.

Uitlijning van gesynchroniseerde tijdreeksgegevens met behulp van het karakteriserende Loss of Cell Cycle Synchrony Model voor vergelijkingen tussen experimenten

Leer de synchronisatie van Caulobacter crescentus voor microbiologisch onderzoek met differentiële dichtheidscentrifugatie. Deze methode isoleert snel zwermercellen voor biochemische analyses en microscopie.

Synchronisatie van

Meer video's verkennen