Name: Rechtop Imaging van Drosophila Egg Chambers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Leer een rechtopstaande beeldvormingsmethode voor het visualiseren van de polen van ontwikkelende Drosophila melanogaster eikamers. Deze techniek onthult de celorganisatie in het folliculaire epitheel met behulp van confocale microscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We waarderen de hulp van leden van de vliegcommunity, met name Dr. Denise Montell, Dr. Lynn Cooley en Dr. Pernille Rorth, voor reagentia. We danken Flybase, het Bloomington Drosophila Stock Center en Developmental Studies Hybridoma Bank voor informatie en het verstrekken van vliegstammen en antilichamen, respectievelijk. LM wordt ondersteund door de Department of Education Grant, Graduate Assistance in the Areas of National Need (GAANN) training fellowship (P200A120017) en door een NIGMS Initiative for Maximizing Student Development Grant (2 R25-GM55036). Een deel van het microscopiewerk werd ondersteund door NSF MRI-subsidie DBI-0722569 en de Keith R. Porter Core Imaging Facility. Onderzoek werd ondersteund door een NSF CAREER Award (1054422) en een Basil O’Connor Starter Scholar Award van de March of Dimes, beide toegekend aan MSG.

1. Dissectie van Ovarioles <ol><li> Breng ongeveer vijftien 2-4 dagen oude vrouwtjes en een paar mannetjes om een ​​frisse vlieg voedsel flacon met toegevoegde actieve droge gist. Gebruik katoen als een plug voor de flesjes, en voeg een paar druppels water aan de katoen om de luchtvochtigheid hoog te houden. </li><li> Plaats flacon in een 25 ° C incubator gedurende 14-16 uur bij podiummonitoren 8-10 ei kamers maximaliseren. OPMERKING: Incubatie varieert afhankelijk van de temperatuur en de gewenste fase. </li><li> Bereid dissectie media, 0,1M KPO 4 en NP40 oplossingen als nodig is voor de volgende dag (zie Materials). </li><li> Verdoven de vliegen met CO2 en onder een dissectie microscoop. Pipet enkele druppels dissectie media in elke holte in het glas depressie glijbaan. </li><li> Houd pincet in elke hand op een ongeveer 30 ° hoek met de tafelblad en oriënteren één vrouwelijke vliegen met de vleugels naar beneden. Met uw niet-dominante hand, pak je de vrouw met behulp van een tang, grijpen haar op de eennterior van de buik, in de buurt van de thorax, en dompel ze in de dissectie media in de depressie dia (Figuur 1A inzet). </li><li> Met de andere tang, pakt het exoskelet op de ventrale achterste van de buik en doorboren. Pak de eierstokken aan het achterste einde, en trek ze uit van de buik en plaats in het vers medium aan de andere kant van de depressie dia. (Figuur 1A inzet). Vermijd elkaar trekken van de darmen. Gooi het karkas. </li><li> Herhaal dit met de andere vrouwelijke vliegen totdat alle eierstokken worden ontleed. Gooi de mannetjes. </li><li> Met een pincet, bezit een eierstok aan het achterste uiteinde (dichtbij de grootste ei kamers), en met de andere hand te gebruiken pincethelften één van de meest voorste ei kamers (germarium) knijpen. (Figuur 1A). </li><li> Langzaam en gestaag, trek een ovariole ketting uit de eierstok schede. Blijven ovarioles individueel ontleden tot alle gewenste ei kamers zijn removed. </li><li> Herhaal stap 1,7-1,8 voor ontleed eierstokken. </li><li> Eenmaal voltooid, overdragen ovarioles naar een 0,6 ml buis met behulp van een plastic transferpipet. </li><li> Laat ovarioles naar de bodem van de buis, dan overgaan tot vaststelling en vlekken stappen. </li></ol> 2. Immunofluorescente (IF) kleuring van Ovarioles <ol><li> Verwijder dissectie media voorzichtig uit ovarioles met een pipet. Zorg ervoor dat u geen ovarioles of ei kamers te verwijderen. Laat ongeveer 50 ul van ovarioles en dissectie media. </li><li> Voeg 50 ul van 16% paraformaldehyde 150 gl 0,1 M KPO 4 buffer in een buis en voeg oplossing ei kamers ze op te lossen. Incubeer terwijl schommelen gedurende 10 min. LET OP: paraformaldehyde is giftig. </li><li> Verwijder fixatief en spoel tweemaal met 0,5 ml NP40 wasbuffer. </li><li> Was tweemaal gedurende 15 min elk bij kamertemperatuur. </li><li> Raadpleeg standaard IF-protocol 15 voor vervolgstappen. <ol><li> Kort na fixatie toevoegenprimaire antilichamen op geschikte verdunningen en geïncubeerd O / N bij 4 ° C. Was in NP40 meerdere malen, voeg dan secundaire antilichamen (1: 200 verdunningen). </li><li> Was verscheidene malen in NP40, voeg DAPI (1: 1000) gedurende 10 min en herhaal wasbeurten. Zodra IF protocol is voltooid, voeg 200 pl 50% glycerol in PBS met ei kamers en laat zitten bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. </li><li> Verwijder oplossing, deze vervangen door 70% glycerol in PBS, en dek af met folie. Plaats monster bij 4 ᵒC tot klaar voor montage. Ondertussen, verder met stap 3. </li></ol></li></ol> 3. Advance Voorbereiding van Glycerine Jelly Slides <ol><li> Meet minstens 4 ml glycerine gelei met een spatel en vul een glazen celcultuur buis naar het halverwege merk. Smelt glycerine gelei in een waterbad bij 55 ° C gedurende 30 min. </li><li> Giet een kleine druppel glycerol, ongeveer 300 ul, uit de voorraad oplossing op twee objectglaasjes. Met een tissue, glycerol uitgespreid in een dunne layer over elk van de schuiven. Dit verschaft een basis en maakt gemakkelijke verwijdering van glycerine gelei in stap 5.6. </li><li> Snijd de tip van een gefilterde 1.000 III pipettip. Gebruik cut pipettip 1000-1500 pi warme glycerine gelei overdragen langzaam aan elke microscoop dia. Zorg om bellen te voorkomen. </li><li> Laat glycerine jelly dia zitten 5 minuten bij kamertemperatuur te stellen. </li><li> Plaats elke glycerine gelei dia in 60 mm × 15 mm petrischaal en afdekken met folie. Plaats bij 4 ° CO / N. Eventueel opslag glycerine jelly dia tot 5 dagen bij 4 ° C. </li></ol> 4. Montage Egg Chambers <ol><li> Met behulp van monsters uit stap 2.5, pipet meerdere 3 pl druppels ei kamers in 70% glycerol aan weerszijden van een glycerine gelei glijbaan. Doorgaan pipetteren 3 pl druppels totdat alle ei kamers zijn op deze dia. Zorg ervoor dat elke druppel bevat ten minste tien ei kamers. Verhit ondertussen een cultuur buis van glycerine gelei in een 55 ° C waterbad. </li><li> Plaats de glycerine gelei dia met ei kamers onder een dissectie microscoop. Stel vergroting zodat slechts één druppel ei kamers in het gezichtsveld (figuur 1B). </li><li> Met behulp van een 30 gauge naald als een lepel, pak je de gewenste stadium ei kamer. Indien nodig, aparte gewenste ei kamers van een ovariole keten met de naald als een mes. </li><li> Om vuil die kunnen interfereren met de beeldvorming te voorkomen, brengt u de ei kamer op de tweede glycerine gelei glijbaan, met de voorste naar links kijkt (figuur 1E -1). Herhaal dit tot er minstens zeven ei kamers opgesteld in een kolom (figuur 1C). </li><li> Vorm nieuwe kolommen van zeven tot alle gewenste ei kamers worden overgedragen naar de tweede glycerine gelei dia. </li><li> Scheur een klein stukje weefsel en twist. Gebruik dit om het overtollige PBS-glycerol absorberen uit het ei kamers door lichtjes aanraken van elk een. Zorg ervoor dat geen ei kamers te verwijderen. </li><li> Snijd detip van een gefilterde 200 ul pipetpunt. Gebruik dit om 150 ul overdragen van glycerine gelei om alle kolommen van ei kamers te dekken. OPMERKING: De hoeveelheid glycerine gelei nodig kolommen dekken is gebaseerd op ei kamer fasen en het aantal kolommen. Bedrag kan worden aangepast. </li><li> Laat gemonteerd ei kamers zitten gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur totdat de bovenste laag van glycerol gelei volledig gestold (figuur 1D). </li><li> Plaats dia van gemonteerde ei kamers in een 60 mm × 15 mm petrischaal en afdekken met folie. Bewaren bij 4 ° CO / N om de glycerine gelei lagen samen te stollen (plaats in het donker als er bezorgdheid over fotobleking). </li></ol> 5. Voorbereiding van Egg Chambers for Imaging <ol><li> Plaats dia van gemonteerde ei kamers onder een dissectie microscoop. Stel vergroting zodat slechts één kolom ei kamers in het gezichtsveld. </li><li> Met behulp van een hoek van 45 ° miniatuur scalpel, snijd een straight lijn langs de rechterkant van de eerste kolom van ei kamers (dicht bij de achterste zijde van het ei kamers). (Figuur 1D-E) </li><li> Vervolgens bezuiniging de eerste ei kamer boven en onder de laatste ei kamer in de kolom. Op dit punt de kolom ei kamers aan drie zijden worden afgesneden. </li><li> Met een microknife, doorsnede is langs de linkerkant van de kolom zo dicht mogelijk bij de voorste kant van het ei kamers (figuur 1E -3). </li><li> Pipet 100 ul koud 1X PBT over de kolom cut. </li><li> Gebruik een ronde randen spatel om de overtollige glycerine gelei rond drie zijden van de snede kolom van ei kamers en gooi te verwijderen, en de rest op de dia. </li><li> Plaats de spatel in de snede gemaakt aan de anterieure zijde van ei kamers en scheiden de kolom uit de primaire glycerine gelei blok. </li><li> Bereiden monsters voor een van beide omgekeerd (5.8.1) of rechtop (5.8.2) microscopie. <ol><li> Voor omgekeerde microscoop: Transfer tHij kolom van ei kamers om een ​​dekglaasje met anterieure zijde van ei kamers naar beneden. Herhaal stap 5,2-5,8 totdat alle kolommen glycerine gelei verwijderd en gemonteerd. Voeg een paar druppels van 50% PBS-Glycerol op elk blok van ei kamers om te voorkomen dat ze uitdrogen. Afbeelding ei kamers direct aan het dekglaasje. </li><li> Voor Upright Microscoop: Breng de kolom van ei kamers om een ​​microscoop dia met de anterieure zijde naar boven. Herhaal de stappen 5,2-5,9 totdat alle kolommen van glycerine gelei zijn verwijderd en gemonteerd op de microscoop dia&#39;s. Voeg een paar druppels van 50% PBS-Glycerol op elk blok van ei kamers en deksel blokken met een # 1 ½ dekglaasje. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hudson, A. M., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying oogenesis.</a> Methods. 68 (1), 207-217 (2014).</li>
<li>Bastock, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila oogenesis.</a> Curr Biol. 18 (23), R1082-R1087 (2008).</li>
<li>Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+follicle+cells%3A+morphogenesis+in+an+eggshell%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell.</a> Semin Cell Dev Biol. 19 (3), 271-282 (2008).</li>
<li>Bilder, D., Haigo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+morphogenetic+repertoire%3A+perspectives+from+the+Drosophila+egg%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Expanding the morphogenetic repertoire: perspectives from the Drosophila egg.</a> Dev Cell. 22 (1), 12-23 (2012).</li>
<li>Montell, D. J., Yoon, W. H., Starz-Gaiano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+choreography%3A+mechanisms+orchestrating+the+collective+movement+of+border+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Group choreography: mechanisms orchestrating the collective movement of border cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (10), 631-645 (2012).</li>
<li>Spradling, A. C., Bate, M., Marinez-Arias, A. Developmental genetics of oogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpradling%2C+AC+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-70 (1993).</li>
<li>Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Border-cell+migration%3A+the+race+is+on%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Border-cell migration: the race is on.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 13-24 (2003).</li>
<li>Silver, D., Geisbrecht, E., Montell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+JAK%2FSTAT+signaling+throughout+border+cell+migration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Requirement for JAK/STAT signaling throughout border cell migration in Drosophila.</a> Development. 132 (15), 3483-3492 (2005).</li>
<li>Ghiglione, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+cytokine+receptor+Domeless+controls+border+cell+migration+and+epithelial+polarization+during+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Drosophila cytokine receptor Domeless controls border cell migration and epithelial polarization during oogenesis.</a> Development. 129 (23), 5437-5447 (2002).</li>
<li>Denef, N., Schüpbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning%3A+JAK-STAT+signalling+in+the+Drosophila+follicular+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Patterning: JAK-STAT signalling in the Drosophila follicular epithelium.</a> Curr Biol. 13 (10), R388-R390 (2003).</li>
<li>Beccari, S., Teixeira, L., Rørth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JAK%2FSTAT+pathway+is+required+for+border+cell+migration+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The JAK/STAT pathway is required for border cell migration during Drosophila oogenesis.</a> Mech Dev. 111 (1-2), 115-123 (2002).</li>
<li>Montell, D., Rorth, P., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((slow+border+cells%2C+a+locus+required+for+a+developmentally+regulated+cell+migration+during+oogenesis%2C+encodes+Drosophila+C%2FEBP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">slow border cells, a locus required for a developmentally regulated cell migration during oogenesis, encodes Drosophila C/EBP.</a> Cell. 71 (1), 51-62 (1992).</li>
<li>Xi, R., McGregor, J., Harrison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gradient+of+JAK+pathway+activity+patterns+the+anterior-posterior+axis+of+the+follicular+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A gradient of JAK pathway activity patterns the anterior-posterior axis of the follicular epithelium.</a> Dev Cell. 4 (2), 167-177 (2003).</li>
<li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+wave+of+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A new wave of cellular imaging.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).</li>
<li>McDonald, J., Pinheiro, E., Kadlec, L., Schupbach, T., Montell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+EGFR+ligands+participate+in+guiding+migrating+border+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple EGFR ligands participate in guiding migrating border cells.</a> Dev Biol. 296 (1), 94-103 (2006).</li>
<li>Van de Bor, V., Zimniak, G., Cérézo, D., Schaub, S., Noselli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+localisation+of+cytokine+mRNA+is+essential+for+JAK%2FSTAT+activation+during+cell+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Asymmetric localisation of cytokine mRNA is essential for JAK/STAT activation during cell invasiveness.</a> Development. 138 (7), 1383-1393 (2011).</li>
<li>Hayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glypicans+regulate+JAK%2FSTAT+signaling+and+distribution+of+the+Unpaired+morphogen%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Glypicans regulate JAK/STAT signaling and distribution of the Unpaired morphogen.</a> Development. 139 (22), 4162-4171 (2012).</li>
<li>Airoldi, S. J., McLean, P. F., Shimada, Y., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+protein+movement+in+syncytial+Drosophila+follicle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Intercellular protein movement in syncytial Drosophila follicle cells.</a> J Cell Sci. 124 (Pt 23), 4077-4086 (2011).</li>
<li>Rørth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+gain-of-function+genetics+in+Drosophila%29%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Systematic gain-of-function genetics in Drosophila).</a> Development. 125 (6), 1049-1057 (1998).</li>
<li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies%3A+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).</li>
<li>Shimada, Y., Burn, K. M., Niwa, R., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+response+of+protein+localization+and+microtubule+organization+to+nutrient+stress+during+Drosophila+early+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversible response of protein localization and microtubule organization to nutrient stress during Drosophila early oogenesis.</a> Dev Biol. 355 (2), 250-262 (2011).</li>
<li>Quiñones-Coello, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+strategies+for+protein+trapping+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Exploring strategies for protein trapping in Drosophila.</a> Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).</li>
<li>Buszczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+carnegie+protein+trap+library%3A+a+versatile+tool+for+Drosophila+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies.</a> Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).</li>
<li>Belu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upright+imaging+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Upright imaging of Drosophila embryos.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li>
<li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-on+imaging%3A+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Dev Dyn. 237 (11), 3252-3259 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Hier wordt een methode beschrijven we te monteren en het imago kleine, ontwikkelen ei kamers van een end-on perspectief. Gemeenschappelijke technieken voor beeldvorming ei kamers zijn geoptimaliseerd voor een zijdelings uitzicht en in de eerste plaats maken een nauwkeurige visualisatie van medio-laterale follikel cellen na kleuring met fluorescerende antilichamen. Het gebruik van Z-stacks of 3-D reconstructies helpt bij het ​​bekijken van meerdere focale vlakken, maar is nog steeds onvoldoende voor subcellulaire resolut...

Studie van Drosophila melanogaster heeft grote inzichten in de genetische regulatie van diverse verschijnselen. Met name is er uitgebreid onderzoek ei ontwikkeling, omdat oögenese biedt handelbaar manier om veel verschillende ontwikkelingsprocessen, waaronder weefsel patronen, cel polariteit, celcyclus schakelen en translationele regulering 1,2,3,4 onderzoeken. Een belangrijke morfogene gebeurtenis tijdens oögenese is de specificatie verwerving van motiliteit en migratie van een set cellen genaamd grens cellen (beoordeeld in 5). Aangezien celmigratie is een belangrijk kenmerk van dierlijke morfogenese en omdat de genetische regulatie van dit proces is goed geconserveerd mechanismen vastgesteld vliegen waarschijnlijk belangrijk in andere contexten zijn. Zo onderzoeken we de moleculaire controle van de grens cel migratie. Voor onze studies hebben we een nieuwe methode om de voorste polen ontwikkelen eieren observeren ontwikkeldwaar de grens cellen ontstaan, te onderzoeken hoe ze zich ontwikkelen in detail. In de eierstok, ei kamers in verschillende ontwikkelingsstadia bestaan ​​langs ketens genaamd ovarioles, die zijn ingekapseld in een dunne omhulling (Figuur 1A). Elk ei kamer zal gaan om een ​​ei te vormen. Tijdens oögenese, moet een aantal verschillende celtypen te ontwikkelen op een gecoördineerde manier. De D. melanogaster ei kamer bestaat uit 16 kiembaan cellen, waaronder één eicel, omgeven door een single-layer folliculair epitheel 6. Een klein aantal gespecialiseerde cellen, genaamd poolcellen, ontstaat op de voorste en achterste polen van het epitheel. De 6-8 grens cellen ontstaan ​​in de voorste epitheel van het ei kamer, veroorzaakt door de polaire cellen 5,7. Medio oögenese (fase 9), de grens cellen los te maken van hun buren en migreren tussen de verpleegkundige cellen om de eicel te bereiken op de achterkant van het ei kamer 5,7. Deze beweging moet worden bereiktterwijl de grens cellen blijven in een cluster rond twee niet-polaire beweeglijke cellen, waardoor dit een soort collectieve celmigratie. Succesvolle migratie van de grens celcluster zorgt voor een goede ontwikkeling van de micropyle van de eierschaal, die nodig is voor bevruchting. De voorste polaire cellen instrueren grens lot van de cel door het activeren van een signaaltransductie cascade. Polar cellen scheiden een cytokine, Unpaired (UPD), dat bindt aan een transmembraan receptor, Domeless (DOME), op aangrenzende follikel cellen tijdens fase 8 van eicelontwikkeling 8,9. De binding van UPD veroorzaakt Janus tyrosine kinase (JAK) tot fosforylering het Signal Transducer en Activator van de transcriptie (STAT) 8,10,11. STAT dan naar de kern om transcriptie te activeren. Langzaam Border Cells (SLBO) is een transcriptiefactor die een directe transcriptionele doel van STAT en is ook vereist voor grens celmigratie 12. Zijdelings uitzicht ei kamers geven thoed STAT activiteit wordt geregeld in een gradiënt over de voorste epitheel 8,11,13. Follikelcellen dichtst bij de polaire cellen de hoogste niveaus van geactiveerde STAT aldus worden zij rand cellen en binnenvallen aangrenzende kiemlijn weefsel. Om te begrijpen hoe de grens cellen worden gespecificeerd binnen en losmaken van het epitheel, moeten we om te zien hoe het weefsel wordt georganiseerd. Als we ei kamers bekijken vanuit een anterieure-on perspectief, zouden we radiale symmetrie van STAT activiteit verwachten in de follikel cellen rondom de polaire cellen. Een eindaanzicht ook beter verschillen van membraaneiwitten en cel-cel-interfaces tonen vóór en tijdens losmaken dan vergeleken cellen in verschillende beeldvlakken. Omdat ei kamers zijn langwerpig en aan elkaar steel cellen, zij regelen op objectglaasjes lateraal, waardoor het moeilijk om de voorste architectuur observeren. Zo veel informatie over de cellen bij de polen van de ei kamer heeftis afgeleid uit een zijdelings uitzicht. Hoewel sommige informatie kan worden verkregen via algoritmische 3-D reconstructies van optische secties, lichtverstrooiing, fotobleken, en de armere grenzen van de resolutie in de Z-as te maken van deze informatie minder gedetailleerd en betrouwbaar in de afwezigheid van dure technieken als super-resolutie microscopie 14 . Andere soorten doorsnede Beeldvormende (bijvoorbeeld elektronenmicroscopie of microtoom snijden) dat uitgebreide manipulatie van weefsels, zoals uitdroging, waardoor de kans op artefacten. Zo, een nieuwe methode om de afbeelding D. ontwikkelden we melanogaster ei kamers terwijl rechtop. Deze methode heeft zijn nut al bewezen in het ophelderen hoe beweeglijke cellen zijn gedoemd (zie Representatieve resultaten en Manning et al, onder review), en zal waarschijnlijk meer in het algemeen waardevol in studies van andere aspecten van oögenese zijn.

<table><tbody><tr><td>0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer)</td><td></td><td></td><td>Voeg 3,1 g van NaH2PO4&bull;H2O en 10,9 g van Na2HPO4 (watervrij) toe aan gedestilleerd H2O om een volume van 1 L te maken. De pH van de uiteindelijke oplossing zal 7,4 zijn. Deze buffer kan tot 1 maand worden bewaard bij 4&deg;C.</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde waterige oplossing, EM-kwaliteit</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>methanolvrij om GFP-fluorescentie te behouden</td></tr><tr><td>30G x 1/2 inch naald</td><td>VWR</td><td>BD305106</td><td>Regelmatige snede</td></tr><tr><td>Actieve Drooggist</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-103</td><td>Om vrouwelijke vliegen te vetten</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine</td><td>PAA-celkweekbedrijf</td><td>A15-701</td><td>Gebruikt in NP40 Wash Buffer</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td>Dumostar-legering, biologiepunt; scherpe punten zijn essentieel voor ovariolen dissectie</td></tr><tr><td>DAPI (4′,6-Diamidino-2-fenylindole dihydrochloride)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>5 mg/ml stockoplossing</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td>Toegevoegd om dissectiemedium aan te vullen (10%)</td></tr><tr><td>Glas kweekbuisje</td><td>VWR</td><td>47729-576</td><td>14 ml</td></tr><tr><td>Glas Depression Slides</td><td>VWR</td><td>470019-020</td><td>1,2 mm dik, dubbele holte</td></tr><tr><td>Glycerin Jelly</td><td>Electron Microsocpy Sciences</td><td>17998-10</td><td>Montagemedium</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>IBI Scientific</td><td>IB15760</td><td>70% in PBS</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3021-500ML</td><td>(uitwisselbaar voor Nonidet P-40) Gebruik in NP40 Wash Buffer</td></tr><tr><td>Leica Fluorescent Stereoscoop</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica SP5 Confocale Microscoop</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>40x/0.55NA droge objectief</td></tr><tr><td>Micro spatel</td><td>VWR</td><td>82027-518</td><td>Roestvrij staal</td></tr><tr><td>Microscoopglas</td><td>VWR</td><td>16004-368</td><td>75x25x1 mm</td></tr><tr><td>NP40 Wash Buffer</td><td></td><td></td><td>50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0,5% Ipegal, 1 mg/ml BSA en 0,02% natriumaziet</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td>Toegevoegd om dissectiemedium aan te vullen (0,6X)</td></tr><tr><td>Petrischaal- Polysterine, steriel</td><td>VWR</td><td>82050-548</td><td>60 B x 15 H mm</td></tr><tr><td>Fosfaatbufferzoutoplossing</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813-10PAK</td><td>10 verpakkingen Poeder</td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat dibasisch</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786-500G</td><td>Gebruikt in 0,1 M KPO4 Buffer</td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat monobasisch</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791-500G</td><td>Gebruikt in 0,1 M KPO4 Buffer</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Schneider's Insect Medium</td><td>Life Technologies</td><td> 11720018</td><td>Met L-glutamine en natriumbicarbonaat</td></tr><tr><td>Natriumaziet</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>Gebruikt in fluorescente antilichaamkleuring</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014-500G</td><td>Gebruikt in NP40 Wash Buffer</td></tr><tr><td>TRIS-HCl</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70144</td><td>1 M TRIS-HCl, pH 7,4</td></tr><tr><td>Volocity 3D Image Analysis Software</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Voor het verwerken van confocale Z-stacks</td></tr></tbody></table>

rechtop imaging van<em&gt; drosophila</em&gt; egg chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenese biedt een ideale context voor het bestuderen van verschillende ontwikkelingsprocessen omdat de eierstok relatief eenvoudig van architectuur is, goed gekarakteriseerd is en vatbaar is voor genetische analyse. Elke eicel bestaat uit kiemcellen omringd door een enkele epitheliale laag van somatische follikelcellen. Subsets van follikelcellen ondergaan differentiatie tijdens specifieke stadia om verschillende celtypen te worden. Standaardtechnieken laten voornamelijk een zijwaartse weergave van eicellen toe, en daarom een beperkt beeld van follikelcellen organisatie en identiteit. Het rechtopstaande beeldvormingsprotocol beschrijft een montagetechniek die een nieuwe, verticale weergave van eicellen mogelijk maakt met een standaard confocale microscoop. Samples worden eerst gemonteerd tussen twee lagen glycerine gel in een laterale (horizontale) positie op een glazen microscoopglas. De gel met ingebedde eicellen wordt vervolgens in blokken gesneden, overgebracht naar een dekglas en omgedraaid om eicellen rechtop te positioneren. Gemonteerde eicellen kunnen worden afgebeeld op een rechtopstaande of omgekeerde confocale microscoop. Deze techniek maakt de studie van follikelcellen specificatie, organisatie, moleculaire markers en eicontwikkeling mogelijk met nieuwe details en vanuit een nieuw perspectief.

De opstaande beeldvormingswerkwijze konden we direct de organisatie van cellen in de voorste folliculaire epithelium zien in stap 8. een algemene merker voor follikel lot van de cel, de ogen Afwezig (EYA) proteïne, alsmede de nucleaire DNA merker DAPI vertoonde zelfs expressie in dit gebied van cellen, en dat voor alle cellen konden worden waargenomen met gelijke kleuring intensiteit (Figuur 2B &quot;). Eiwitten geregeld in reactie op de cytokine UPD toonde echter variabele patronen en expressieniveaus....

De rechtopstaande beeldvormingsmethode die in dit protocol wordt beschreven, maakt de gedetailleerde visualisatie mogelijk van de polen van een zich ontwikkelend Drosophila melanogaster -ei. Deze uiteinden-op-weergave biedt een nieuw perspectief op de arrangementen en morfologieën van meerdere celtypen in het folliculaire epitheel.

Rechtop Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Het algemene doel van deze procedure is om beeldvorming met een hoge resolutie van de polen van drosophila-eikamers mogelijk te maken. Dit wordt bereikt door eerst de ovaria te dissecteren en deze te kleuren met fluorescerende antilichamen. De tweede stap is het identificeren en scheiden van de eikamers van belang.Vervolgens worden de geselecteerde monsters georiënteerd en uitgelijnd, en daarna ingebed in blokken glycerinegelei. De laatste stap is het snijden en draaien van de blokken om de eikamers zo te monteren dat de lange as verticaal staat. Ten slotte wordt confocale microscopie gebruikt om de cellulaire en subcellulaire organisatie aan de polen van de eikamer in kaart te brengen.Epithelium, zoals arrangementen van randcellen. Bestaande methoden om specimens loodrecht op het beeldvlak te bekijken via optische sectie en algoritmische 3D-reconstructie kunnen fotobleking en lichtverstrooiing veroorzaken en bieden een lagere resolutie, wat resulteert in minder nauwkeurige beelden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt om specimens onder een nieuwe hoek te monteren en ze direct te bekijken. We gebruiken deze techniek om de polen van ontwikkelen

upright-imaging-of-drosophila-egg-chambers

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Mesoscopische fluorescentie tomografie opereert buiten de grenzen van de penetratie-weefsel snijden fluorescentie microscopie. De techniek is gebaseerd op multi-projectie verlichting en een foton transport beschrijving. Tonen we aan in-vivo het hele lichaam 3D-visualisatie van de morfogenese van GFP-expressie vleugel imaginaire schijven...

Mesoscopische Fluorescentie Tomografie voor In-vivo Imaging van de ontwikkelingslanden Drosophila</em

Drosophila hemocytes verspreiden over het geheel van de zich ontwikkelende embryo. Dit protocol laat zien hoe te monteren en het imago van deze migraties met behulp van embryo's met fluorescent gelabelde hemocytes.

Live-beeldvorming van Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migraties

Hier presenteren wij een montage protocol voor...

Rechtop beeldvorming van Drosophila Embryo&#39;s

Drosophila popstadium Buik Immunohistochemie

Voorbereiden Individuele Drosophila Egg Chambers voor Live Imaging

Immuunkleuring is een effectieve techniek voor het visualiseren van specifieke celtypen en eiwitten in weefsels. Door het gebruik van sonicatie vermindert het hier beschreven protocol de noodzaak om Drosophila melanogaster weefsels van laat-stadium embryo's en larven te dissekeren voordat immunokleuring wordt uitgevoerd. We bieden een efficiënte methodologie voor de immunokleuring van formaldehyde-gefixeerde hele larven.

-Sonicatie vergemakkelijkt immunofluorescentiekleuring van Late-fase embryonale en larvale<em&gt; Drosophila</em&gt; Weefsels<em&gt; In Situ</em

Dit protocol presenteert een efficiënte methode voor het beeldvormen van het levende Drosophila pupale oogneuro-epitheel. Deze methode compenseert voor weefselbeweging en ongelijke topologie, verbetert de visualisatie van celgrenzen door het gebruik van meerdere GFP-gelabelde junctie-eiwitten en maakt gebruik van een eenvoudig te monteren beeldvormingsopstelling.

Live-beeldvorming van de Drosophila Pupal Eye

Een protocol van gehele immuunkleuring op bladluisembryo's wordt gepresenteerd, waarin kritieke omstandigheden voor het verminderen van achtergrondkleuring en het verhogen van weefseldoorlaatbaarheid worden behandeld. Deze omstandigheden zijn specifiek ontwikkeld voor effectieve detectie van eiwitexpressie in de embryonale weefsels van bladluizen.

Identificatie van de kritische Voorwaarden voor Immunokleuring in de erwtenbladluis Embryo&#39;s: Toenemende Tissue permeabiliteit en Afnemende Achtergrond kleuring

Dit artikel beschrijft een aanpasbare ex vivo protocol voor het visualiseren van Ca 2+ tijdens ei activering in Drosophila.

Beeldvorming Calcium in<em&gt; Drosophila</em&gt; Bij Egg Activering

Dit protocol is ontworpen voor de beeldvorming en analyse van de dynamiek van celoriëntatie en weefselgroei in de Drosophila abdominale epithelia terwijl de fruitvlieg een metamorfose ondergaat. De hier beschreven methodologie kan worden toegepast op de studie van verschillende ontwikkelingsstadia, weefsels en subcellulaire structuren in Drosophila of andere modelorganismen.

Beeldvorming en analyse van weefseloriëntatie en groeidynamiek in de ontwikkeling van Drosophila Epithelia tijdens pupale stadia

Leer een rechtopstaande beeldvormingsmethode voor het visualiseren van de polen van ontwikkelende Drosophila melanogaster eikamers. Deze techniek onthult de celorganisatie in het folliculaire epitheel met behulp van confocale microscopie.

Rechtop Imaging van

Meer video's verkennen