Een eenvoudige en goedkope methode voor het bepalen Koude Gevoeligheid en aanpassing in Muizen
March 17th, 2015
De Cold Plantar Assay (CPA) meet de koudsensitiviteit tussen 30 °C en 5 °C en kan ook koudaanpassing meten. Dit protocol beschrijft hoe de CPA te gebruiken om koudgevoeligheid, analgesie en aanpassing bij muizen te meten.
Het algemene doel van deze procedure is om de kouderesponsiviteit van muizen te meten. Dit wordt bereikt door eerst het glas af te koelen of op te warmen tot de gewenste temperatuur. De tweede stap is om de muizen te acclimatiseren totdat ze in rust zijn.
De derde stap is om droog ijspoeder in een pellet in een spuit te comprimeren. De laatste stap is om de muizen te testen met behulp van het droog ijspellet en een stopwatch om de onttrekkingslatentie te meten. Uiteindelijk wordt de koude planter assay gebruikt om kouderesponsiviteit en aanpassing bij vrij bewegende muizen te meten.
Het belangrijkste voordeel van onze assay ten opzichte van bestaande assays zoals de acetontest en de koude plaattest, is dat we zowel overgevoeligheid als analgese op baseline kunnen testen onder verschillende omgevingsomstandigheden. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de kouderesponsiviteit van de muizen. Het kan ook worden gebruikt in andere systemen zoals de aap en de rat en de mens. Het demonstreren van de procedure zal Daniel Brenner zijn, een afgestudeerde student in mijn laboratorium.
Na het reinigen van het glazen oppervlak, bevestigt u de T-type filamentthermokoppelsonde met laboratoriumtape aan het oppervlak in het midden van de glazen plaat. Plaats de dierenkooien op de glazen plaat in een rechte lijn langs het midden. Draai vervolgens de thermokoppelsonde door de centrale dierenkooi en sluit deze aan op de datalogger.
Zet de datalogger aan en deactiveer de automatische uitschakelingsfunctie. Verbind de datalogger met de computer met de meegeleverde kabel. Scheid de dierenkooien met zwarte inzetstukken om visuele interacties tussen de muizen te voorkomen en plaats spiegels onder het glas om de onderkant van de kooi te kunnen bekijken.
Om te beginnen met testen, plaats aluminium dozen op de glazen plaat aan beide kanten van de dierenkooi op een vaste afstand. Als u bij 30 graden Celsius test, sluit u verwarmde watercirculators aan op de aluminium dozen die 0,25 inch van de dierenkooi zijn geplaatst. Vul de dozen halfvol met water terwijl de afvoergaten zijn dichtgeplugd.
Plaats de circulators zodanig dat het hete water uit de aluminium dozen direct terug in het reservoir van de circulator aan elke kant druipt. U moet water toevoegen aan elke circulator. Zodra de metalen dozen zijn gevuld, stelt u de circulators in op 45 tot 60 graden Celsius en vult u de aluminium dozen met een gestadige stroom heet water.
Wanneer de glazen het gewenste temperatuurbereik bereiken, plaatst u de muizen in de kooi op de plaat. Laat de muizen acclimatiseren aan het apparaat en de temperatuur. Deze muizen zullen zich gedurende 2,5 uur acclimatiseren.
Wanneer het einde van de acclimatisatieperiode nadert, vult u een ijsemmer ongeveer halfvol met droog ijs en gebruikt u een hamer of mallet om het droog ijs tot poeder te pletten. Doe dit buiten de gedragsruimte om de muizen niet te storen. Gebruik vervolgens een scheermes of schaar om de bovenkant van een drie milliliter spuit af te snijden.
Gebruik vervolgens een 21 gauge naald om twee sets van drie gaten aan te prikken aan tegengestelde zijden van de spuit om de druk te verminderen die wordt gegenereerd door sublimatie terwijl u het droog ijs terug in de gedragsruimte comprimeert, vult u de spuitkamer halfvol met droog ijspoeder. Houd het gesneden uiteinde van de spuit tegen een vlak object en comprimeer het poeder stevig met behulp van de zuiger. Strek de punt van het gecomprimeerde droog ijspallet uit voorbij de rand van de spuit.
Test nu die muizen die alle vier poten in het glas hebben en niet bewegen, maar niet volledig slapen. Gebruik de spiegels om te mikken, druk de vlakke pellet voorzichtig maar stevig tegen het glazen oppervlak onder de achterste poot van de muis. Druk tegelijkertijd op start op een timer.
Wanneer de muis weg beweegt van het afgekoelde glas, hetzij verticaal of horizontaal, stopt u de timer en verwijdert u het droog ijspellet. Als de muis echter heel kort de poot beweegt en vervolgens terugkeert naar het koeloppervlak, blijft u doorgaan met het timen en stimuleren tot de muis een permanente beweging maakt weg. Als de muis niet weg beweegt van het afgekoelde glas, stopt u de stimulus na 20 seconden.
Herhaal deze testprocedure tot er minimaal drie waarden op elke poot van het dier zijn verzameld om muizen bij 17 graden Celsius te testen. Herhaal het experiment zoals net is getoond, maar in plaats van de aluminium dozen te vullen met verwarmd water, gebruikt u nat ijs en plaatst u de dozen ongeveer 0,25 inch van de kooi om muizen te testen. Bij 12 graden Celsius wordt droog ijs gebruikt, maar de dozen worden 1,25 inch van de kooi geplaatst.
Dit alternatieve protocol test de muizen terwijl de temperatuur van de plaat daalt in plaats van nadat deze is gestabiliseerd. Dit stelt ons in staat om de aanpassing van de muizen te testen terwijl deze plaatsvindt Na het opzetten van het apparaat. Voer zoals eerder beschreven het experiment uit om metingen bij kamertemperatuur te doen.
Zodra de basislatenties bij kamertemperatuur zijn gemeten. Gebruik de eerder getoonde procedure om de lege aluminium dozen te vullen met droog ijs en plaats ze 1,25 inch van de kooi aan beide kanten. Ten slotte herhaalt u het experiment om latentiemetingen te doen terwijl de glazen plaat afkoelt.
Metingen zo vaak mogelijk doen. Deze grafiek toont de gemiddelde onttrekkingslatentie voor muizen beginnend bij 12 graden Celsius, 17 graden Celsius, 23 graden Celsius of 30 graden Celsius. De onttrekkingslatenties zijn consistent over alle temperaturen.
Analgetische effecten kunnen worden gemeten met behulp van de koude planter assay zoals hier getoond. Subcutane injectie van 1,5 milligram per kilogram morfine verhoogt de onttrekkingslatentie van muizen 30 minuten na injectie zoals gemeten door een twee-weg innova met Bonferroni post-hoc test 60 minuten na injectie. Er is geen significant verschil tussen morfine geïnjecteerd en saline geïnjecteerd.
Muizen overgevoeligheid kan hier ook worden gemeten. Intraplantaire injectie van 10 microliters van volledige fros adjuvant verminder
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
De Cold Plantar Assay (CPA) is een methode die wordt gebruikt om de reactie op kou bij muizen te meten, waarbij hun reactie op temperaturen van 30 °C tot 5 °C wordt beoordeeld. Dit protocol maakt ook de evaluatie van koude aanpassing, overgevoeligheid en analgesië mogelijk.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Gedragsanalyse
- Diermodellen
Achtergrond
- De CPA is ontworpen om de pijnrespons op koude stimuli te beoordelen.
- Het is cruciaal voor het begrijpen van mechanismen van koude overgevoeligheid en analgesië.
- De test omvat het acclimatiseren van muizen om nauwkeurige metingen te garanderen.
- Koude aanpassing kan ook via deze methode worden beoordeeld.
Doel van de Studie
- Om kouderesponsiviteit bij vrij bewegende muizen te meten.
- Om koude overgevoeligheid en analgesië te evalueren.
- Om koude aanpassing over tijd te beoordelen.
Gebruikte Methoden
- Afkoeling of opwarming van glas tot de gewenste temperatuur.
- Acclimatiseren van muizen totdat ze in rust zijn.
- Het comprimeren van droog ijs poeder tot een pellet voor testen.
- Meten van de terugtreklatentie met een stopwatch tijdens de test.
Belangrijkste Resultaten
- De CPA meet effectief de kouderesponsiviteit bij muizen.
- Resultaten wijzen op verschillende niveaus van koude overgevoeligheid en analgesië.
- Koude aanpassing kan worden gekwantificeerd door herhaalde metingen.
- De methode is betrouwbaar voor het beoordelen van pijnresponsen op koude stimuli.
Conclusies
- De Cold Plantar Assay is een waardevol hulpmiddel voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Het biedt inzichten in koudegevoeligheid en pijnmechanismen.
- Toekomstige studies kunnen deze methode gebruiken om analgetische behandelingen te onderzoeken.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
The Cold Plantar Assay (CPA) provides a cost-effective, quantitative method for assessing cold sensitivity and adaptation in murine models, supporting early-stage target validation in analgesic discovery. By enabling measurement of both hypersensitivity and analgesia under controlled thermal conditions, the assay enhances predictive confidence in preclinical pain research and informs go/no-go decisions for therapeutic candidates targeting neuropathic or inflammatory pain pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of thermal nociception pathways and functional validation of targets involved in cold hypersensitivity and analgesia.
- Operational Value: Supports biological de-risking by quantifying withdrawal latency changes in response to pharmacological or genetic manipulations.
- Predictive Value: Generates reproducible behavioral readouts that aid in portfolio triage of analgesic candidates based on mechanism-specific effects on cold sensitivity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, unambiguous withdrawal latency measurements suitable for high-fidelity compound screening across temperature gradients.
- Operational Value: Facilitates assay reproducibility and scalability through defined acclimation, stimulation, and timing protocols using accessible materials like dry ice and glass plates.
- Platform Utility: Enables evaluation of test compounds for analgesic efficacy and adverse sensory effects, supporting lead optimization in pain therapeutics.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models temperature-dependent sensory adaptation, allowing study of thermosensory plasticity relevant to clinical conditions like neuropathic pain and cold allodynia.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical phases by providing quantifiable, translatable endpoints for assessing drug-induced changes in thermal perception.
- Risk Mitigation: Supports mechanistic de-risking by distinguishing true analgesic effects from nonspecific motor or sedative confounds through temperature-specific behavioral profiling.
Pipeline & Workflow Integration
The CPA fits within the discovery-to-preclinical continuum, serving as a phenotypic screening tool for target engagement and functional validation in pain research programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of ion channels (e.g., TRPM8) and GPCRs involved in cold transduction, enabling mechanistic insight into thermal pain pathways.
- Screening: Delivers quantitative, temperature-dependent withdrawal latency outputs that allow comparison of compound effects across multiple thermal challenge points.
- Analytics: Generates latency metrics amenable to statistical analysis (e.g., two-way ANOVA with post-hoc testing), enabling robust comparison of treatment groups.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by modeling adaptive thermosensory responses, informing dose selection and therapeutic window estimation.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform across analgesic discovery projects due to low cost, minimal equipment needs, and compatibility with freely behaving murine models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in thermal pain phenotyping.
- Operational Value: Delivers high reproducibility and low technical variability through standardized acclimation and stimulation procedures.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of mechanism-specific analgesic profiles, reducing late-stage failure due to lack of target engagement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their ability to modulate cold hypersensitivity or analgesia without affecting baseline thermoregulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in behavioral neuroscience and rodent handling to ensure consistent acclimation and accurate latency measurement.
- Depends on basic laboratory equipment including glass plates, dry ice, syringes, thermocouple probes, and data loggers for temperature monitoring.
- Necessitates standardization across teams for acclimation duration, stimulus application force, and withdrawal criteria to ensure cross-site reproducibility.
- Involves adaptation considerations when translating to other species (e.g., rats) or environmental conditions, as thermal sensitivity thresholds vary by model.
- Limited by the need for careful dry ice handling and ventilation controls due to sublimation hazards and potential confounding effects from CO2 exposure.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:14
Preparing the Testing Plate and Enclosures
2:03
Performing the Cold Plantar Assay (CPA) at Fixed Temperatures
5:10
Testing the Mice During Cold Adaptation
5:54
Results: Measuring Analgesia and Hypersensitivity Using the Cold Planar Assay
8:00
Conclusion
