Name: EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in water per cultuur en RT-qPCR. Deel III. Virus Detectie door RT-qPCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Leer enterovirus en norovirus detecteren in water via RT-qPCR volgens EPA Methode 1615. Deze gestandaardiseerde methode gebruikt centrifugale ultrafiltratie en real-time PCR voor betrouwbare viruskwantificatie in drink- en oppervlaktewater.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Dr. Eric Rhodes voor het voorbereiden van de klonen die zijn gebruikt bij de ontwikkeling van de standaardcurve reagens, Brian McMinn voor assistentie bij de verwerking van monsters, Larry Wymer voor statistische analyse, Dr. Mark Borchardt, U.S. Department of Agriculture, Marshfield, WI, voor het leveren van de Sabin poliovirus serotype 3 gebruikt in deze studie en Dr. H. W. Virgin, Washington University, St. Louis, MO, voor muis norovirus. De auteurs danken ook Gretchen Sullivan voor assistentie bij de voorbereiding van laboratorium stock reagentia, Dr. Mohammad Karim voor de vermenigvuldiging van muis norovirus stock, en lokale particuliere puteigenaren en nutsbedrijven voor het toestaan van het verzamelen van watermonsters. Hoewel dit werk werd beoordeeld door de EPA en goedgekeurd voor publicatie, hoeft dit niet noodzakelijkerwijs de officiële beleidslijn van de Agentschap weer te geven. Vermelding van handelsnamen of commerciële producten vormt geen goedkeuring of aanbeveling voor gebruik.

Opmerking: Gebruik datasheets om alle stappen van het protocol te volgen; bijvoorbeeld informatiebladen worden gegeven in de aanvullende materialen Tables S2-S4. 1. Standard Curve Voorbereiding <ol><li> Bereid een werkvoorraad van de standaardcurve reagens (bijv gepantserde RNA EPA-1615) door verdunnen van de door de fabrikant aan een concentratie van 2,5 x 10 8 deeltjes / ml (2,5 x 10 8 GC / ml) met behulp TSM concentratie III buffer. Verdeel de werkvoorraad in 250 ul fracties met 1,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C. OPMERKING: Zie aanvullende materialen protocol Stap S1 voor instructies over het voorbereiden van werkvoorraden van virus en plasmiden voor het gebruik als alternatieve standaard curve reagentia. </li><li> Ontdooien van één of meer van de werkvoorraad porties. Bereid vijf 10-voudige seriële verdunningen gebruikt 1,5 ml microcentrifuge buizen, waardoor concentraties van 2,5 x 10 7, 2,5 x 10 6, 2,5 x10 5, 2,5 x 10 4 en 2,5 x 10 3 GC / ml. <ol><li> Maak de eerste verdunning door toevoeging van 25 ul van de 2,5 x 10 8 GC / ml werkvoorraad tot 225 ul van TSM III buffer. Mix voor 5-15 sec met behulp van een vortex mixer. </li><li> Bereid de volgende verdunning door toevoeging van 25 ul van de bereide in stap 1.2.1 tot 225 gl TSM III buffer verdunnen. Meng opnieuw en verder een soortgelijk proces om de volgende drie 10-voudige verdunningen te bereiden. </li></ol></li><li> Pak het RNA uit de standaard curve werkvoorraad en de vijf verdunningen onmiddellijk volgens de procedure in paragraaf 3. </li></ol> 2. Tertiaire Concentratie <ol><li> Bereid een centrifugale concentrator (30.000 moleculair gewicht cut-off) voor elk door toevoegen van ten minste 10 ml 1 x PBS, 0,2% runderserumalbumine (BSA) aan de bovenste monsterkamer verzamelde monster. Zorg ervoor dat oplossing heeft de dunne kanaal concentratie kamer gevuld, en houd dan O / N bij 4 ° C. <ol><li&gt; Gooi het fluïdum. Spoel de concentrator één keer met ten minste 10 ml steriel reagens kwaliteit water om overtollig BSA te verwijderen en vervolgens het water te verwijderen. </li></ol></li><li> Voeg een hoeveelheid secundaire water concentraat uit elk monster gelijk is aan S, de Assay Sample Volume in afzonderlijke centrifugale concentrators. <ol><li> Bereken S met behulp van Vergelijking 1, <img alt="Vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq1.jpg" /> Waarbij D de jaargang van Original Water monster geanalyseerd, TSV is de totale steekproef Volume en FCSV is de Final Geconcentreerde Sample Volume. Zie aanvullend materiaal S2 voor een voorbeeld van de berekening van S. </li></ol></li><li> Centrifuge Elk monster bij 3.000-6.000 xg bij 4 ° C in een swinging bucket rotor gedurende 20 - 30 min. Controleer het volume in de dunne kanaal concentratie kamer. <ol><li> Indien het volume groter is dan 400 pl, opnieuw centrifugeer gedurende 20 minuten of langer. Doorgaan centrifugeren totdat het monster in the dunne kanaal concentratiekamer is teruggebracht tot minder dan 400 pl. Gebruik de bovenstaande niet verwijderen. </li></ol></li><li> Was de zijkanten van de centrifugale concentrator met 1 ml steriele 0,15 M natriumfosfaat, pH 7-7,5 virus, te verhogen. Centrifugeer opnieuw bij 3.000-6.000 xg en 4 ° C totdat het monster is teruggebracht tot minder dan 400 pl. Herhaal deze wasstap een extra tijd. </li><li> Met een 100-200 pi micropipet nauwkeurig meten en breng elke geconcentreerd monster op een 1,5 ml microcentrifugebuis (dwz overdracht 200 ul aan de microcentrifugebuis en meet de resterende concentraat door aanpassing van de micropipet totdat de resterende vloeistof volledig kan worden opgemaakt in de pipet tip). Voeg 0,15 M natriumfosfaat, pH 7-7,5, om het uiteindelijke volume op 400 ± 2 ul passen. </li><li> Extract nucleïnezuur direct door te gaan naar stap 3. Houd elke geconcentreerde monsters die niet kunnen worden processed onmiddellijk bij 4 ° C voor niet meer dan 24 uur. </li></ol> 3. Nucleïnezuurisolatie <ol><li> Voeg 200 gl extractiebuffer bereid zoals beschreven in stap 3,3 en 200 ul van de tertiaire concentraat uit elk monster van stap 2,5 of standaardcurve verdunning van Stap 1,3 tot scheiden gelabelde 1,5 ml microcentrifuge buisjes. Freeze overgebleven tertiaire concentraten bij of beneden -70 ° C. Extraheer de nucleïnezuren uit elk monster zoals door de nucleïnezuurextractie fabrikant kit voor de rotatie protocol voor bloedmonsters met de volgende uitzonderingen. </li><li> Heeft protease niet toe te voegen aan de watermonsters of gebruik het met het nucleïnezuur extractie kit geleverd extractiebuffer. </li><li> Bereid extractiebuffer met carrier RNA <ol><li> Voeg 310 ul van carrier RNA verdunningsbuffer een flesje dat 310 ug carrier RNA. Mengen op te lossen en vervolgens verdelen in 6 porties met ongeveer 50 pl. Bewaren bij -20° C. </li><li> Voeg 28 ul van ontdooide carrier RNA per ml van de extractiebuffer een carrier RNA-concentratie van 0,027 pg / pl te verkrijgen. Gebruik de drager-RNA gewijzigd extractiebuffer in de plaats van die met de winning kit geleverd. </li></ol></li><li> Bereid een stamoplossing elutiebuffer door het toevoegen ribonuclease (RNase) Inhibitor tot een uiteindelijke concentratie van 400 eenheden / ml aan de met de extractie kit elutiebuffer. <ol><li> Elueer RNA van het nucleïnezuur bindende spinkolom door het plaatsen van 50 ui elutiebuffer met RNase inhibitor in de kolom. Wacht 1 minuut en centrifugeer bij 6000 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur. </li><li> Herhaal stap 3.4.1 en vervolgens te verwijderen en gooi de kolom. </li></ol></li><li> Bereid hoeveelheden van de RNA-extracten uit stap 3.4.2. Bereid 6 monsters van de standaard curve werkvoorraad en elke standaard curve verdunning die ten minste 15 ul elk. Bereid 4 aliquots van alle RNA-monsters met ten minste22 pl elk. Sla een aliquot van elk monster en de standaard curve controles bij 4 ° C of ze kunnen worden verwerkt door reverse transcriptie binnen 4 uur; Anders manier alle monsters bij of beneden -70 ° C. </li></ol> 4. Reverse transcriptie (RT) <ol><li> Bereid 100 uM voorraadoplossing van elke oligonucleotide primer en probe in tabel 1 opgesomd door toevoeging van een volume van PCR-grade water aan elk flesje via een hoeveelheid (in microliter) gelijk aan tien keer het aantal nanomolen (nmol) van het oligonucleotide in de flesje (zoals aangegeven op de flacon etiket of in de productbeschrijving van de fabrikant (bv, resuspendeer een primer met 36,3 nmol in 363 pi). Meng op te lossen. <ol><li> Verdun de 100 uM oplossingen 1:10 met PCR-kwaliteit water tot 10 uM werkende oplossingen voor te bereiden. </li></ol></li><li> Bereid RT Master Mix 1 en 2 in een schone kamer met behulp van de gids in tabel 2. Pipetteer 16,5 ul van RT Master Mix 1 voor elke PCR-plaat en met behulp van een multichannel pipet. </li><li> Dooi, als bevroren, de nucleïnezuur fragmenten van elk veld monster en Lab Versterkte Sample Matrix (LFSM, dat wil zeggen, gezaaid water matrix monster). <ol><li> Verdun elk veld en LFSM sample 1: 5 en 1:25 in elutiebuffer die 400 eenheden / ml RNase inhibitor. </li><li> Dooi, als bevroren, maar niet verdunnen Lab Versterkte Blank (LFB, dat wil zeggen, een positieve kwaliteitscontrole met zaadjes reagenskwaliteit water), Lab blanco (LRB, dwz een negatieve kwaliteitscontrole met behulp van reagenskwaliteit water), Performance Evaluation (PE , dat wil zeggen, gezaaid reagenskwaliteit watermonsters gebruikt om laboratorium prestaties voorafgaand aan de start van een studie), de Test van prestaties (PT evalueren; dat wil zeggen, gezaaid reagenskwaliteit watermonsters met titers onbekende een analist die worden gebruikt om de laboratoria te evalueren tijdens een studie ), NA Batch negatieve extractie controle, of gewonnen RNA uit de standaard curve set. </li></ol&gt; </li><li> Plaats 6,7 ul van het RNA uit elk monster, controle en standaard curve in afzonderlijke PCR putjes, met drievoudige putjes voor monsters en controles en dubbele putten voor standaard curves (zie figuur S1 voor een RT plaat voorbeeld). <ol><li> Plaats 6,7 ul van elutiebuffer in afzonderlijke PCR putjes voor geen template controle (NTC). Omvatten 2-8 NTC per RT plaat, met behulp van twee voor het eerste monster en vervolgens twee meer voor elke vierde extra monster. </li><li> Verdeel de negatieve extractie en NTC controles in de hele plaat. </li></ol></li><li> Verzegeling van de PCR-plaat met een hittebestendige plaat sealer. Meng de monsters voor 5-10 seconden en centrifugeer bij ≥ 500 xg kort. </li><li> Incubeer de plaat gedurende 4 min bij 99 ° C en koel daarna snel tot 4 ° C in een thermische cycler. Weer centrifuge bij ≥ 500 xg kort. </li><li> Verwijder voorzichtig de plaat afdichting en voeg dan 16,8 ul van RT Master Mix 2 aan elk putje. Seal de plaat opnieuw met een hittebestendige plaat sealer, gevolgd door mengen en kort centrifugeren bij ≥ 500 x g. </li><li> Plaats de plaat in een thermocycler en looptijd van 15 minuten bij 25 ° C, gevolgd door 60 min bij 42 ° C, 5 min bij 99 ° C, en vervolgens door een 4 ° C hold cyclus. </li><li> Werkwijze onmiddellijk of binnen 8 uur door qPCR (stap 5) en bewaar monsters bij of beneden -70 ° C totdat ze kunnen worden verwerkt. WINKEL monsters die kunnen worden verwerkt binnen 8 uur bij 4 ° C. </li></ol> 5. real-time kwantitatieve PCR (qPCR) <ol><li> Bepaal de gemiddelde hepatitis G Cq waarde voor elke partij van hepatitis G reagens voorafgaand aan het uitvoeren van elke proefmonsters. <ol><li> Uitvoeren van een RT-bepaling via 10 duplo bereid zoals beschreven voor NTC controles (stap 4.1.1). Voer het hepatitis G qPCR assay zoals hieronder beschreven (Stappen 5.2 tot 5.5.3). Bereken de gemiddelde waarde van de Cq 10 duplo&#39;s. </li><li> Pas het hepatitis G reagens hoeveelheid RT Master Mix 1 (tabel 2), Indien nodig, tot een gemiddelde Cq waarde tussen 25 en 32 eenheden ontvangen. Compenseren verhoogd of verlaagd door het volume van het water veranderen hoeveelheid toegevoegd aan de RT Master Mix 1 uiteindelijke volume op 16,5 ul per test te houden. </li><li> Bevestig eventuele aanpassingen door te herhalen stappen 5.1.1 tot 5.1.2 en verandering tabel 2 van de aangepaste hoeveelheden weerspiegelen. </li></ol></li><li> Voorbereiden qPCR mastermengsels in een schone kamer met behulp van de geleiders in Tabel 3 voor enterovirus, Tabel 4 en Tabel 5 voor norovirus genogroup I, tabel 6 voor norovirus genogroup II, tabel 7 voor muizen norovirus (norovirus genogroup V), en Tabel 8 voor hepatitis G. Mix elke master mix en centrifugeer bij ≥ 500 xg kort. </li><li> Voeg de PCR mastermengsels aan de juiste putjes van een label optische reactie plaat, met behulp van 14 pi per putje en afzonderlijke platen voor elke qPCR assay (zie Figuur S2 </stronG&gt; een mogelijke lay-out voor een qPCR assay gebaseerd op het RT layout in figuur S1). </li><li> Ontdooi de RT plaat van stap 4.8 bij RT, als bevroren. Meng met behulp van een plaat mixer en centrifugeer bij ≥ 500 xg kort. </li><li> Verdeel 6 pl van de geschikte cDNA aan de juiste putjes van de optische reactieplaat. Meng de monsters in de optische reactie plaat en centrifugeer bij ≥ 500 xg kort. <ol><li> Voer het hepatitis G qPCR test op het onverdunde en verdunde veld en LFSM monsters voordat u alle andere qPCR assays. Gebruik de laagste verdunning van het veld of LFSM steekproef die is &lt;1 Cq waarde groter dan de gemiddelde hepatitis G Cq waarde voor het enterovirus en norovirus qPCR assays. </li><li> Stel de kwantitatieve PCR thermocycler software volgens de instructies van de fabrikant. Identificeren van de standaard curve monsters als normen en voor elk standaard curve verdunning, voert de genomische kopie waarden aangegeven in tabel 9. </li><li&gt; Voer de plaat in de kwantitatieve PCR thermal cycler gedurende 10 min bij 95 ° C, gevolgd door 45 cycli van 15 sec bij 95 ° C en 1 minuut bij 60 ° C. </li></ol></li><li> Bepalen of elke standaard curve aan de acceptabele waarden in tabel 10. Zie aanvullende materialen sectie S3 voor voorbeelden. <ol><li> Bereken de totale standaarddeviatie (StdDev) voor de standaard curve met behulp van Vergelijking 2, <img alt="Vergelijking 2" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq2.jpg" /> waarbij Cq is de waarde gerapporteerd voor elke standaardcurve repliceren, Cq is de gemiddelde waarde voor elke set van herhalingen, #Cq is het totale aantal Cq waarden voor alle standaard controle herhalingen die positieve waarden (dat wil zeggen, niet onbepaald) hebben, en # Stds is het aantal standaard controles die positieve waarden hebben. </li><li> Als de kwantitatieve PCR thermische cycler software niet berekenen de helling voor elke standaard curve, het berekenen van de helling met behulp van Vergelijking 3,60; <img alt="Vergelijking 3" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq3.jpg" /> waarbij Cq is het gemiddelde van de hoogste en laagste gebruikte verdunningen en log GC is de log van de genomische kopie waarde van de hoogste en laagste verdunningen gebruikt in tabel 9. </li><li> Bereken de R2 waarde met Vergelijking 4. <img alt="Vergelijking 4" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq4.jpg" /> waarbij Cq is het gemiddelde van alle waarden en Cq Log GC de gemiddelde Log GC voor elke herhaling. </li><li> Bereken het% Efficiency met Vergelijking 5: <img alt="Vergelijking 5" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq5.jpg" /></li></ol></li><li> Noteer de GC-waarden berekend door de thermische cycler software voor alle monsters op basis van standaard curven die aan de in tabel 10 criteria en de gemiddelde GC waarden voor elk monster. Herhaald elke monsters met standaard bochten die niet voldoen aan de criteria van <strong&gt; Tabel 10 of wanneer een negatieve controles (LRB, NA Batch negatieve extractie controle, of NTC) zijn positief. Opnieuw verwerken elke monsters die niet aan de criteria voldoen of vals positieve controles tijdens de herhaling. </li><li> Bepaal de GC per liter (GC L) voor elk monster met behulp van Vergelijking 6: <img alt="Vergelijking 6" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq6.jpg" /> waarbij GC is het gemiddelde genomische kopij van stap 5,7, de factor &quot;199&quot; is de totale verdunningsfactor voor volumereducties die tijdens de tertiaire concentratie RNA-extractie en RT-qPCR stappen DF = verdunningsfactor die compenseert voor remming en D is het volume van Original Water Sample getest in liters. Zie supplementaire materialen sectie S4 voor een voorbeeld van de berekening van GC L. </li><li> Bereken de totale GC van LFB en LRB monsters door GC gemiddelde waarde uit stap 5.5 vermenigvuldigen met 199 en te delen door 0,3. </li></ol>

<ol><li>Borchardt, M. A., Spencer, S. K., Kieke, B. A., Lambertini, E., Loge, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viruses+in+nondisinfected+drinking+water+from+municipal+wells+and+community+incidence+of+acute+gastrointestinal+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Viruses in nondisinfected drinking water from municipal wells and community incidence of acute gastrointestinal illness.</a> Environ. Health Perspect. 120 (9), 1272-1279 (2012).</li>
<li>Ye, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+detection+of+enteric+viruses+in+source+water+and+treated+drinking+water+in+Wuhan%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR detection of enteric viruses in source water and treated drinking water in Wuhan, China.</a> Curr. Microbiol. 65 (3), 244-253 (2012).</li>
<li>Williamson, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+viruses+in+New+Zealand+drinking-water+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Enteric viruses in New Zealand drinking-water sources.</a> Water Sci. Technol. 63 (8), 1744-1751 (2011).</li>
<li>Lambertini, E., Borchardt, M. A., Kieke, B. A., Spencer, S. K., Loge, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+of+viral+acute+gastrointestinal+illness+from+nondisinfected+drinking+water+distribution+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Risk of viral acute gastrointestinal illness from nondisinfected drinking water distribution systems.</a> Environ. Sci. Technol. 46 (17), 9299-9307 (2012).</li>
<li>Chigor, V. N., Okoh, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+RT-PCR+detection+of+hepatitis+A+virus%2C+rotaviruses+and+enteroviruses+in+the+Buffalo+River+and+source+water+dams+in+the+Eastern+Cape+Province+of+South+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Environ.+Res.+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Quantitative RT-PCR detection of hepatitis A virus, rotaviruses and enteroviruses in the Buffalo River and source water dams in the Eastern Cape Province of South Africa.</a> Int. J. Environ. Res. Public Health. 9 (11), 4017-4032 (2012).</li>
<li>Fout, G. S., Martinson, B. C., Moyer, M. W., Dahling, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+reverse+transcription-PCR+method+for+detection+of+human+enteric+viruses+in+groundwater%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A multiplex reverse transcription-PCR method for detection of human enteric viruses in groundwater.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69 (6), 3158-3164 (2003).</li>
<li>Hewitt, J., Bell, D., Simmons, G. C., Rivera-Aban, M., Wolf, S., Greening, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastroenteritis+outbreak+caused+by+waterborne+norovirus+at+a+New+Zealand+ski+resort%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Gastroenteritis outbreak caused by waterborne norovirus at a New Zealand ski resort.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73 (24), 7853-7857 (2007).</li>
<li>Jack, S., Bell, D., Hewitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+contamination+of+a+drinking+water+supply+at+a+hotel+resort%5BTitle%5D)+AND+%22New+Zealand+Med.+J%22%5BJournal%5D)">Norovirus contamination of a drinking water supply at a hotel resort.</a> New Zealand Med. J. 126 (1387), 98-107 (2013).</li>
<li>Anderson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+waterborne+outbreak+of+Norwalk-like+virus+among+snowmobilers-Wyoming%2C+2001%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">A waterborne outbreak of Norwalk-like virus among snowmobilers-Wyoming, 2001.</a> J. Infect. Dis. 187 (2), 303-306 (2003).</li>
<li>Parshionikar, S. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waterborne+outbreak+of+gastroenteritis+associated+with+a+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Waterborne outbreak of gastroenteritis associated with a norovirus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69 (9), 5263-5268 (2003).</li>
<li>U.S. Environmental Protection Agency Office of Water. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22820-F-12-058%3A+Recreational+Water+Quality+Criteria%22">820-F-12-058: Recreational Water Quality Criteria</a>. , 1-63 (2012).</li>
<li>Wade, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapidly+measured+indicators+of+recreational+water+quality+and+swimming-associated+illness+at+marine+beaches%3A+a+prospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health%22%5BJournal%5D)">Rapidly measured indicators of recreational water quality and swimming-associated illness at marine beaches: a prospective cohort study.</a> Environ. Health. 9, 66(2010).</li>
<li>Fout, G. S., et al. Method 1615: Measurement of enterovirus and norovirus occurrence in water by culture and RT-qPCR (EPA/600/R-10/181). , U. S. Environmental Protection Agency. 1-91 (2012).</li>
<li>Cashdollar, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Evaluation+of+EPA+Method+1615+for+Detection+of+Enterovirus+and+Norovirus+in+Water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development and Evaluation of EPA Method 1615 for Detection of Enterovirus and Norovirus in Water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (1), 215-223 (2013).</li>
<li>Gibson, K. E., Schwab, K. J., Spencer, S. K., Borchardt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+and+mitigating+inhibition+during+quantitative+real+time+PCR+analysis+of+viral+nucleic+acid+extracts+from+large-volume+environmental+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Measuring and mitigating inhibition during quantitative real time PCR analysis of viral nucleic acid extracts from large-volume environmental water samples.</a> Water Res. 46 (13), 4281-4291 (2012).</li>
<li>Fuentes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+multiplex+one-step+qRT-PCR+for+hepatitis+A+virus%2C+norovirus+GI+and+GII+quantification+in+bivalve+mollusks+and+water%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Standardized multiplex one-step qRT-PCR for hepatitis A virus, norovirus GI and GII quantification in bivalve mollusks and water.</a> Food Microbiol. 40, 55-63 (2014).</li>
<li>Coudray, C., Merle, G., Martin-Latil, S., Guillier, L., Perelle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+extraction+methods+for+the+detection+of+hepatitis+A+virus+in+lettuces+using+the+murine+norovirus+as+a+process+control%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of two extraction methods for the detection of hepatitis A virus in lettuces using the murine norovirus as a process control.</a> J. Virol. Methods. 193 (1), 96-102 (2013).</li>
<li>Sen, K., et al. EPA 815-B-04-001: Quality assurance/quality control guidance for laboratories performing PCR analyses on environmental samples. , U.S. Environmental Protection Agency. 1-56 (2004).</li>
<li>Schlueter, V., Schmolke, S., Stark, K., Hess, G., Ofenloch-Haehnle, B., Engel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcription-PCR+detection+of+hepatitis+G+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reverse transcription-PCR detection of hepatitis G virus.</a> J. Clin. Microbiol. 34 (11), 2660-2664 (1996).</li>
<li>De Leon, R., Shieh, C., Baric, R. S., Sobsey, M. D. Detection of enteroviruses and hepatitis A virus in environmental samples by gene probes and polymerase chain reaction. Proc. Water Qual. Technol. Conf. 1990 Nov 11-15, , 833-853 (1990).</li>
<li>Monpoeho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+enterovirus+RNA+in+sludge+samples+using+single+tube+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Quantification of enterovirus RNA in sludge samples using single tube real-time RT-PCR.</a> BioTechniques. 29 (1), 88-93 (2000).</li>
<li>Jothikumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+detection+of+noroviruses+by+using+TaqMan-based+one-step+reverse+transcription-PCR+assays+and+application+to+naturally+contaminated+shellfish+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive detection of noroviruses by using TaqMan-based one-step reverse transcription-PCR assays and application to naturally contaminated shellfish samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71 (4), 1870-1875 (2005).</li>
<li>da Silva, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+removal+of+noroviruses+during+wastewater+treatment%2C+using+real-time+reverse+transcription-PCR%3A+different+behaviors+of+genogroups+I+and+II%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of removal of noroviruses during wastewater treatment, using real-time reverse transcription-PCR: different behaviors of genogroups I and II.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73 (24), 7891-7897 (2007).</li>
<li>Butot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+various+real-time+RT-PCR+assays+for+the+detection+and+quantitation+of+human+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of various real-time RT-PCR assays for the detection and quantitation of human norovirus.</a> J. Virol. Methods. 167 (1), 90-94 (2010).</li>
<li>Loisy, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+RT-PCR+for+norovirus+screening+in+shellfish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time RT-PCR for norovirus screening in shellfish.</a> J. Virol. Methods. 123 (1), 1-7 (2005).</li>
<li>Reynolds, K. A., Gerba, C. P., Pepper, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+infectious+enteroviruses+by+an+integrated+cell+culture-PCR+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of infectious enteroviruses by an integrated cell culture-PCR procedure.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62 (4), 1424-1427 (1996).</li>
<li>Ming, H. X., Zhu, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantification+of+infectious+enterovirus+from+surface+water+in+Bohai+Bay%2C+China+using+an+integrated+cell+culture-qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Pollut.+Bull%22%5BJournal%5D)">Rapid quantification of infectious enterovirus from surface water in Bohai Bay, China using an integrated cell culture-qPCR.</a> Mar. Pollut. Bull. 62 (10), 2047-2054 (2011).</li>
<li>Parshionikar, S., Laseke, I., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+propidium+monoazide+in+reverse+transcriptase+PCR+to+distinguish+between+infectious+and+noninfectious+enteric+viruses+in+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of propidium monoazide in reverse transcriptase PCR to distinguish between infectious and noninfectious enteric viruses in water samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (13), 4318-4326 (2010).</li>
<li>Sanchez, G., Elizaquivel, P., Aznar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+of+infectious+hepatitis+A+viruses+by+propidium+monoazide+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Environ.+Virol%22%5BJournal%5D)">Discrimination of infectious hepatitis A viruses by propidium monoazide real-time RT-PCR.</a> Food Environ. Virol. 4 (1), 21-25 (2012).</li>
<li>Kim, S. Y., Ko, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+propidium+monoazide+to+distinguish+between+viable+and+nonviable+bacteria%2C+MS2+and+murine+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Lett.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Using propidium monoazide to distinguish between viable and nonviable bacteria, MS2 and murine norovirus.</a> Lett. Appl. Microbiol. 55 (3), 182-188 (2012).</li>
<li>Fout, G. S., Schaefer, F. W. 3rd, Messer, J. W., Dahling, D. R., Stetler, R. E. EPA/600/R-95/178: ICR Microbial Laboratory Manual, I.1-ApD-23. , U.S. Environmental Protection Agency. (1996).</li>
<li>Abbaszadegan, M., Stewart, P., LeChevallier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+detection+of+viruses+in+groundwater+by+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A strategy for detection of viruses in groundwater by PCR.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65 (2), 444-449 (1999).</li>
<li>Lambertini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+of+enteroviruses%2C+adenoviruses%2C+and+noroviruses+from+drinking+water+by+use+of+glass+wool+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Concentration of enteroviruses, adenoviruses, and noroviruses from drinking water by use of glass wool filters.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74 (10), 2990-2996 (2008).</li>
<li>Rodriguez, R. A., Thie, L., Gibbons, C. D., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+the+effects+of+environmental+inhibition+in+quantitative+real-time+PCR+detection+of+adenovirus+and+norovirus+in+recreational+seawaters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Reducing the effects of environmental inhibition in quantitative real-time PCR detection of adenovirus and norovirus in recreational seawaters.</a> J. Virol. Methods. 181 (1), 43-50 (2012).</li>
<li>Iker, B. C., Bright, K. R., Pepper, I. L., Gerba, C. P., Kitajima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+commercial+kits+for+the+extraction+and+purification+of+viral+nucleic+acids+from+environmental+and+fecal+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of commercial kits for the extraction and purification of viral nucleic acids from environmental and fecal samples.</a> J. Virol. Methods. 191 (1), 24-30 (2013).</li>
<li>Fey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+real-time+PCR-based+approach+for+accurate+quantification+of+bacterial+RNA+targets+in+water%2C+using+Salmonella+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Establishment of a real-time PCR-based approach for accurate quantification of bacterial RNA targets in water, using Salmonella as a model organism.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3618-3623 (2004).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+electropositive+filtration+for+recovering+norovirus+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Water+Health%22%5BJournal%5D)">Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water.</a> J. Water Health. 9 (1), 27-36 (2011).</li>
<li>Kim, M., Ko, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+the+inhibitory+effects+of+salt%2C+humic+acid%2C+and+heavy+metals+on+the+recovery+of+waterborne+norovirus+by+electropositive+filters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Water+Health%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of the inhibitory effects of salt, humic acid, and heavy metals on the recovery of waterborne norovirus by electropositive filters.</a> J. Water Health. 11 (4), 613-622 (2013).</li>
<li>Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+electropositive+filter+for+concentrating+enteroviruses+and+noroviruses+from+large+volumes+of+water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).</li>
<li>Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+positively+charged+alumina+nanofibre+cartridge+filters+for+the+primary+concentration+of+noroviruses%2C+adenoviruses+and+male-specific+coliphages+from+seawater%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater.</a> J. Appl. Microbiol. 109 (2), 635-641 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Grootschalige nationale studies van virale besmetting van de bron en het drinken van water vereisen het gebruik van meerdere analytische laboratoria. Onder deze omstandigheden een standaardmethode is nodig om te verzekeren dat de gegevens die door de verschillende laboratoria vergelijkbaar. Er zijn vele gepubliceerde moleculaire methoden voor virusdetectie, maar heel weinig gestandaardiseerde moleculaire methoden. EPA Method 1615 is een gestandaardiseerde methode speciaal ontwikkeld voor de detectie van enterovirus en norovirus in water matrices door RT-qPCR. Gestandaardiseerde moleculaire methoden zijn beschikbaar voor virusdetectie in voedingsmiddelen (CEN / ISO TS 15216-1 en CEN / ISO TS 15216-2, 7 april 2013) 16,17 en zijn toegepast op de detectie van hepatitis A-virus en norovirus in het voorjaar water 16. Alle standaard methoden moeten kwaliteit prestaties controles en criteria voor de inter- minimaliseren en intra-laboratorium variatie en vals positieve gegevens als gevolg van laboratorium verontreiniging bevatten. Om verder te verminderen valse gegevens, EPA Methode 1615 volgt begeleiding EPA&#39;s op moleculaire methoden, 18, ​​die de scheiding van het werk bepaalt tijdens de verwerking en een manier work flow. Het omvat een hepatitis G 1,19 interne controle en procedures om vals-negatieve resultaten te wijten aan remmers van RT-qPCR 15 minimaliseren. Het maakt gebruik van kwantitatieve bepalingen met gestandaardiseerde hoeveelheden van zowel water bemonsterd en geanalyseerd water zodat alle gegevensveld uitgedrukt in genome kopieën per liter van het veld of drinkwater bemonsterd. Hoewel efficiënte enkele buis (eenstaps) RT-PCR testen zijn in de handel verkrijgbaar, de werkwijze met opzet heeft gescheiden assays. Dit heeft het nadeel van het minimaliseren van de hoeveelheid monster die onderzocht kunnen worden in elke reactie, maar geeft meer flexibiliteit bij het gebruik van meerdere primer sets. RT-qPCR testen worden beperkt door en alleen zo goed als de primers en probes gebruikt en waarschijnlijk geen primer set zal alle virusvarianten binnen een groep op te sporen. Het enterovirus primer set werd gekozen omdathet richt de geconserveerde 5&#39;-niet-coderende gebied, 20,21 detecteert diverse enterovirus serotypen en virussen gedetecteerd door te worden geassocieerd met gezondheidseffecten van gebruik van onbehandeld grondwater 1. Twee primer sets worden gebruikt voor de detectie van genogroup ik Norovirussen 22,23. De eerste werd gekozen vanwege de sterke correlatie tussen gezondheidseffecten bij jonge kinderen en gedetecteerd virus 1. De tweede genogroup ik primer ingesteld en de primer die wordt gebruikt voor genogroup II noroviruses werden gekozen omdat ze op te sporen de meest uiteenlopende stammen 24,25. Ondanks de grote voordelen van qPCR en RT-qPCR procedures om viraal RNA in water, zijn er verschillende beperkingen. Ten eerste, zowel infectieuze en niet-infectieuze virusdeeltjes, waaronder die geïnactiveerd door ontsmettingsmiddelen, kan worden versterkt door deze procedures. De resultaten van Borchardt suggereren dat dit minder een probleem voor onbehandeld grondwater from aquifers vergelijkbaar met die in de gemeenschappen onderzochte dan ontsmette oppervlaktewater 1. Voor virussen die gekweekt Dit probleem kan worden overwonnen met behulp van PCR in combinatie met kweek 26,27. Het probleem is ook gericht bepaalde virussen door het gebruik van nucleïnezuur verknopingsmiddelen 28-30. Deze laatste benadering is effectief voor virussen geïnactiveerd door hypochloriet en niet effectief voor mensen geïnactiveerd door UV. Een tweede beperking van deze moleculaire procedures is dat het volume van geconcentreerde monster die typisch kunnen worden getest veel kleiner zijn dan voor procedures cultuur 6,31. Dit probleem wordt vaak door substitueren ofwel een polyethyleen-glycol gebaseerde procedure voor de standaard secundaire concentratie organische uitvlokken, waardoor het monster kan worden geresuspendeerd in een kleiner volume, of door toevoeging van een tertiair monster concentratiestap 6,32,33 . Methode 1615 gebruikt CENTRIFUGAL ultrafiltratie tertiaire concentratie bieden. Centrifugale ultrafiltratie verwijdert water en componenten minder dan 30.000 Dalton waardoor zowel de concentratie van virussen in testmonsters en een verlaging laag molecuulgewicht remmers van moleculaire assays. Deze tertiaire concentratiestap resulteert in een algehele concentratiefactor van&gt; 10 5 voor elk virus dat aanwezig is in het water werd getest. Een derde beperking is de aanwezigheid van inhibitoren van moleculaire procedures milieumonsters. Hoewel tal van benaderingen van remmers te verwijderen zijn ontwikkeld, geen aanpak is effectief voor alle water matrices en virustypes 6,34,35, waardoor het gebruik van interne controles ontwikkeld om het niveau van de remming van essentieel belang te schatten. Het hepatitis G reagens dat in deze werkwijze voldoet aan deze eis door een constant niveau van viraal RNA in alle reacties en een RT-qPCR assay voor remming schatten. Wanneer de beste van de tHij remmer verwijdering benaderingen niet aan remming verwijderen, monster concentraten kan zolang virus concentraties hoger dan inhibitor concentraties 14,15 worden verdund. De hierin beschreven standaardkromme procedure voor- en een belangrijke beperking. Een voordeel is dat het gebruikte reagens levert alle noodzakelijke componenten in één reagens, waardoor een regeling te gebruiken voor alle assays. Dit reagens is vooral een voordeel voor norovirus assays. Norovirus deeltjes kan alleen worden verkregen van geïnfecteerde individuen waardoor het erg moeilijk om virale deeltjes te verkrijgen voor gebruik als standaarden. Een belangrijk voordeel is dat het een RNA-standaard voor gerichte RNA-virussen in een reagens, zoals met een RNA standaard essentieel voor kwantificatie van RNA 36. Toch is het vermogen om virus nauwkeurig te kwantificeren beperkt doordat matrix die niet in aanmerking worden genomen. Dit betekent dat de genomische kopieaantal waarden kan niet absoluut worden beschouwd en moet alleen worden overwogen in relatieve termen. Het wordt aanbevolen dat een voldoende aantal standaard curve werkvoorraad porties (stap 1.2) bereid zijn om volledige studies. Bijvoorbeeld, elk 250 pi aliquot voldoende reagens voor 6 RT platen. Indien bekend is dat een studie analyse van 500 monsters vereisen, zou een minimum van 12 monsters vereist (500 samples / 7 monsters per plaat RT / 6 RT platen per portie). EPA Method 1615 is een op prestaties gebaseerde methode. Veel fabrikanten gelijkwaardige reagentia hierin vermeld en deze reagentia kunnen zolang de prestatiecriteria voldaan worden vervangen. De standaardkromme, die ook als RT-qPCR positieve controle is waardevol bij de prestaties oplossen problemen. Prestaties kunnen afnemen als gevolg van de afbraak van RNA, reagens houdbaarheid, het falen van diepvriezers, kalibratie en technische fout. Prestaties kwesties moeten verdachteed als standaard curves verschillen van die getoond in figuur 4 of als ze niet voldoen aan de prestatie-eisen voor standaard curves. De RT-qPCR test is zeer robuust; complete mislukking is waarschijnlijk het gevolg van onjuiste behandeling van RNA of een technische fout (bijvoorbeeld een vermist reagens). Grote zorg moet worden genomen bij de behandeling van RNA-monsters tussen extractie en de RT stap om RNA degradatie te verminderen van ribonucleasen. Poliovirus terugvorderingen van grond en reagenskwaliteit wateren en muizen norovirus terugvorderingen uit grondwater ontmoette de EPA Method 1615 prestaties acceptatiecriteria (tabel 11) en zijn vergelijkbaar met die gerapporteerd door anderen 33,37,38. Muizen norovirus terugvorderingen van LFB monsters waren veel lager dan die van poliovirus en zou niet het poliovirus-specifieke acceptatiecriteria hebben ontmoet. De redenen voor de lagere muizen norovirus herstel van reagenskwaliteit water zijn onbekend. Vergelijkbaar met de resultaten hierin Karim en Colleagues meldde een herstel voor norovirus GI.1 van 4% ten opzichte van leidingwater 39. Lee et al. 37 gerapporteerde gemiddelde terugvorderingen voor muizen norovirus en menselijke norovirus GII.4 van 18% en 26% ten opzichte van gedestilleerd water met behulp van disc filters, respectievelijk. Met vergelijkbare voorwaarden Lee en collega&#39;s, Kim en Ko waargenomen terugvorderingen van 46% en 43% voor deze virussen, respectievelijk 38. Gibbons et al. 40 verkregen ongeveer 100% terugwinning van menselijke norovirus GII.4 uit zeewater, maar Kim Ko 38 gevonden dat de toevoeging van zout aan gedestilleerd water bij concentraties gelijk aan of hoger dan zeewater aanzienlijk verminderde terugwinning van de murine virus resulteerde in ongeveer een tweevoudige reductie GII.4 herstel.

Kwantitatieve PCR (qPCR; zie aanvullende materialen voor de definities van de termen die in dit handschrift) en reverse transcriptie-qPCR (RT-qPCR) zijn waardevolle instrumenten voor het opsporen en kwantificeren van de menselijke enterische virussen in het milieu en het drinken van water, en vooral voor veel virussen doen niet repliceren of repliceren slecht in celkweek systemen. Beide instrumenten hebben aangetoond dat veel virustypes die aanwezig zijn in het milieu en het drinken van water in de hele wereld 1-6 zijn. Hun gebruik in combinatie met de sequentie van geamplificeerde genomische fragmenten in ziekteuitbarsting onderzoek heeft aangetoond voor watergedragen virusoverdracht voorzien, zoals zij hebben aangetoond dat het virus in het drinkwater identiek aan die loods uitbraak van patiënten 7-10. Zowel qPCR en RT-qPCR zijn nuttige hulpmiddelen voor de volksgezondheid. Bijvoorbeeld gegevens uit studies uitgevoerd door het Amerikaanse Environmental Protection Agency (EPA) liet een sterke relatietween indicator metingen door qPCR en gezondheidseffecten in recreatieve wateren. Als gevolg hiervan, EPA&#39;s laatste 2012 Recreational Water Quality Criteria bevat een qPCR methode voor het bewaken van recreatieve stranden 11,12. Borchardt en collega&#39;s vonden ook een sterke relatie tussen acute gastro-enteritis bij gemeenschappen door onbehandeld grondwater en virus in grondwater zoals gemeten met RT-qPCR 1. Het doel van dit document is de moleculaire testcomponent EPA Method 1615 13,14 beschrijven. Deze test maakt gebruik van RT-qPCR om een ​​kwantitatieve schatting van enterovirus en norovirus genoom kopieën (GC) per liter gebaseerd op het oorspronkelijke volume van het milieu of het drinken van water gepasseerd te bieden via een elektropositieve filter. Een overzicht van de moleculaire procedure is weergegeven in figuur 1 punt. Protocol 1 geeft de procedures voor het bereiden van de standaardcurve. Deze standaarden worden bereid uit een reagens dat een RN bevatEen kopie van de doelsequentie van de primer / probe sets. Hoofdstuk 2 beschrijft de tertiaire concentratie procedure. Sectie 3 geeft de procedure voor het extraheren van RNA van de geconcentreerde water- en controlemonsters. Het RNA uit elk monster wordt reverse getranscribeerd met behulp drievoud assays en willekeurige primers om prime de transcriptie (hoofdstuk 4). Het cDNA uit elke reverse transcriptie reactie in vijf afzonderlijke virus-specifieke testen die in drievoud geanalyseerd door qPCR (afdeling 5 Figuur 2). De assay maakt gebruik van primers en probes uit de wetenschappelijke literatuur (tabel 1) die zijn ontworpen om vele enterovirussen en noroviruses en een reagens dat hepatitis G RNA monsters die remmend RT-qPCR 15 identificeren detecteren.

<table><tbody><tr><td>1.5 ml tube chamber</td><td>Diversified Biotech</td><td>CHAM-3000</td><td></td></tr><tr><td>1 &deg;C cool brick</td><td>Diversified Biotech</td><td>BRIK-2501</td><td></td></tr><tr><td>10x PCR Buffer II and 25-mM MgCl2</td><td>Life Technologies</td><td>N8080130</td><td></td></tr><tr><td>-20 &deg;C freezer</td><td>VWR</td><td>97043-346</td><td>Moet een handmatige ontdooiingsvriezer zijn</td></tr><tr><td>-70 &deg;C of koudere vriezer</td><td>Thermo Scientific</td><td>MBF700LSAO-E</td><td></td></tr><tr><td>96-well chamber</td><td>Diversified Biotech</td><td>CHAM-1000</td><td></td></tr><tr><td>Absolute ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-100</td><td></td></tr><tr><td>Armored RNA EPA-1615</td><td>Asuragen</td><td>Op bestelling</td><td>Gebakken voor het kwantificeren van de RT-qPCR-test</td></tr><tr><td>Armored RNA Hepatitis G virus</td><td>Asuragen</td><td>42024</td><td></td></tr><tr><td>Autoclaaf</td><td>Steris</td><td>Amsco Lab Series</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety cabinet</td><td>NuAir Laboratory Equipment Supply</td><td>Labgard 437 ES</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Affymetrix</td><td>10856</td><td>Kristalkwaliteit of beter</td></tr><tr><td>Buffer AVE</td><td>Qiagen</td><td>1026956</td><td>Carrier RNA verdunningsbuffer</td></tr><tr><td>Buffer AVL</td><td>Qiagen</td><td>19073</td><td>Extractie buffer</td></tr><tr><td>Carrier RNA</td><td>Qiagen</td><td>Niet van toepassing</td><td>Gebruik carrier RNA geleverd met Buffer AVL</td></tr><tr><td>Centrifuge flessen</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-562-23 of 05-562-26</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge rotors</td><td>Beckman Coulter</td><td>339080, 336380</td><td></td></tr><tr><td>Cool safe box</td><td>Diversified Biotech</td><td>CSF-BOX</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Promega</td><td>P1171</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler&reg; 480 Probes Master kit</td><td>Roche Diagnostics</td><td>4707494001</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge buizen</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-682-550</td><td>Gebruik ribonuclease- en deoxyribonuclease-vrije buizen met snap caps</td></tr><tr><td>Microcide III</td><td>Fitzgerald</td><td>99R-103</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'A' film</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>HSA5001</td><td>Hittebestendig</td></tr><tr><td>Microseal 'F' film</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>MSA1001</td><td>Vriesbestendig</td></tr><tr><td>Mini-plate spinner</td><td>Labnet International</td><td>MPS1000</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette</td><td>Rainin</td><td>L8-20</td><td></td></tr><tr><td>Multi-tube chamber</td><td>Diversified Biotech</td><td>CHAM-5000</td><td></td></tr><tr><td>Optical reaction plate</td><td>Life Technologies</td><td>4314320</td><td></td></tr><tr><td>PCR nucleotide mix</td><td>Promega</td><td>U1515</td><td></td></tr><tr><td>PCR plate</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>HSS9601</td><td></td></tr><tr><td>PCR-grade water</td><td>Roche</td><td>3315932001</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>U.S. Biological</td><td>D9820</td><td></td></tr><tr><td>Plate mixer</td><td>Scientific Industries</td><td>MicroPlate Genie</td><td></td></tr><tr><td>Prionex gelatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G0411</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>Bevat buffers AW1 (eerste wasbuffer), AW2 (tweede wasbuffer), AE (elutiebuffer); ethanol moet worden toegevoegd aan buffers AW1 en AW2 voor gebruik; Gebruik de Buffer AL niet die bij het pakket is geleverd</td></tr><tr><td>Quantitative PCR thermal cycler</td><td>Life Technologies</td><td>4351405</td><td></td></tr><tr><td>Random primer</td><td>Promega</td><td>C1181</td><td></td></tr><tr><td>Reagent Reservoir</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-381-27E</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>367501</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2515 of N2615</td><td></td></tr><tr><td>ROX reference dye</td><td>Life Technologies</td><td>12223</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II of III Reverse Transcriptase</td><td>Life Technologies</td><td>18064-022 of 18080044</td><td></td></tr><tr><td>Surgical gloves</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-058-800</td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler</td><td>Life Technologies</td><td>4314879</td><td></td></tr><tr><td>Trisma base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 20 centrifugal concentrator units</td><td>Sartorius-Stedim</td><td>VS2022</td><td></td></tr></tbody></table>

epa method 1615. meting van enterovirus en norovirus voorkomen in water per cultuur en rt-qpcr. deel iii. virus detectie door rt-qpcr

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA-methode 1615 meet enterovirussen en norovirussen die aanwezig zijn in milieu- en drinkwater. Deze methode is ontwikkeld met als doel een gestandaardiseerde methode te hebben voor gebruik in meerdere analytische laboratoria tijdens monitoringperiode 3 van de Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Hierin presenteren we het protocol voor het extraheren van virale ribonucleïnezuur (RNA) uit watermonsterconcentraten en voor het kwantitatief meten van enterovirus- en norovirusconcentraties met behulp van reverse transcriptie-kwantitatieve PCR (RT-qPCR). Virusconcentraties voor de moleculaire test worden berekend in termen van genomische kopieën van viraal RNA per liter op basis van een standaardcurve. De methode gebruikt een aantal kwaliteitscontroles om de gegevenskwaliteit te verhogen en om interlaboratorium- en intralaboratoriumvariaties te verminderen. De methode is geëvalueerd door de virusrecuperatie te onderzoeken uit grond- en reagenswater van reagentiekwaliteit, die gezaaid waren met poliovirus type 3 en muis-norovirus als surrogaat voor humane norovirussen. De gemiddelde poliovirusrecuperatie was 20% in grondwater en 44% in reagenswater van reagentiekwaliteit. De gemiddelde muis-norovirusrecuperatie met de RT-qPCR-test was 30% in grondwater en 4% in reagenswater van reagentiekwaliteit.

Hier presenteren we een procedure om enterovirus en norovirus in milieu- en drinkwater te kwantificeren met behulp van reverse transcriptie-kwantitatieve PCR. De gemiddelde virusterugwinning uit grondwater met deze gestandaardiseerde procedure van EPA-methode 1615 was 20% voor poliovirus en 30% voor muur-norovirus.

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in water per cultuur en RT-qPCR. Deel III. Virus Detectie door RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Het algemene doel van deze procedure is het meten van de concentratie van enterovirus en norovirus in water, met behulp van reverse transcriptie kwantitatieve polymerasekettingreactie. Dit wordt bereikt door tertiaire concentratie van virusdeeltjes uit watermonsters via centrifugale ultrafiltratie. Vervolgens worden standaardcurvereagentia voorbereid zoals beschreven in het protocol. Daarna volgt de extractie van nucleïnezuren uit de virale concentraten en de standaardcurve. Vervolgens wordt het virale RNA bij verdunningen van één op vijf en één op vijfentwintig reverse getranscribeerd met behulp van random primers en reverse transcriptase. Ten slotte wordt de amplificatie van viraal cDNA uitgevoerd met virus-specifieke primers en probes in een real-time thermocycler, gevolgd door berekeningen van het aantal genomische kopieën per monster op basis van de standaardcurve.Het belangrijkste voordeel van EPA-methode 1615 ten opzichte van andere gestandaardiseerde methoden zoals ISO 15216 is dat deze specifiek is ontworpen voor watermonsters en een enterovirus-assay bevat. Deze methode kan risicoanalisten in het veld van de milieumicrobiologie voorzien van de huidige stand van zaken bij het bepalen van het risico van virussen in drink- en recreatiewater. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn aan deze methode moeite hebben met de standaardisatie die in de methode is ingebouwd. De methode is zeer gedetailleerd en moet strikt worden gevolgd. Een visuele demonstratie van de methode is cruciaal, omdat zelfs geringe variaties in de methode tot negatieve gevolgen kunnen leiden. De procedure wordt vandaag gedemonstreerd door Nichole Brinkman, Jennifer Cashdollar, Shannon Griffin en mijzelf, Shay Fout. Wij zijn allen professionele medewerkers van het nationale laboratorium voor blootstellingsonderzoek van de EPA in Cincinnati, Ohio.Nadat een standaardcurve is opgesteld volgens het tekstprotocol, wordt voor elk verzameld monster een centrifugeconcentrator voorbereid door ten minste 10 milliliters 1X PBS en 2% BSA toe te voegen aan de bovenste monsterkamer. Na een nacht incuberen, wassen en het toevoegen van de monsters zoals beschreven in het tekstprotocol, wordt elk testmonster in een zwaaiarmrotor gecentrifugeerd bij 3000 to 6000 times g en vier degrees Celsius gedurende twintig tot dertig minuten.Zodra het monster op de juiste wijze is geconcentreerd en is overgebracht naar een nieuw microcentrifugebuisje, voegt u 0,15 molair natriumfosfaatbuffer toe om het uiteindelijke volume aan te passen naar 400 µL plus of minus 2 µL. Om de nucleïnezuren te extraheren, voegt u 200 µL extractiebuffer toe voor een negatieve extractiecontrole en 200 µL van het tertiaire concentraat voor elk testmonster of standaardcurveverdunning toe aan afzonderlijke microcentrifugebuisjes en extraheert u het RNA volgens de aanpassingen in het tekstprotocol van de instructies van de fabrikant van de extractiekit. Na de bereiding van primers en probes zoals beschreven in het protocol, bereidt u reverse transcriptie mastermix één en twee in een cleanroom, zoals hier wordt getoond.Breng met een meerkanaals pipet 16,5 µL van RT master mix one over naar de wells van elke PCR-plaat. Verdun vervolgens de ontdooide veld- en lab-verrijkte monstermatrix of LSFM-monsters in een verhouding van 1:5 en 1:25 met de elutiebuffer van de nucleïnezurextractieset die 400 units per milliliter RNase-remmer bevat. Breng 6,7 µL van de nucleïnezuren van elk testmonster, controle en standaardcurve over naar afzonderlijke wells van de PCR-plaat, waarbij triplicaat wells voor testmonsters en controles en duplicaat wells voor standaardcurves worden gebruikt.Voeg 6,7 µL elutiebuffer toe aan de wells voor de "no template control" of NTC. Neem twee tot acht NTC's per RT-plaat, waarbij er twee worden gebruikt voor het eerste monster en vervolgens twee of meer voor elk vierde aanvullende monster, waarbij de negatieve controles over de plaat worden verdeeld. Gebruik de hittebestendige plaatsealer om de PCR-plaat af te sluiten en zorg ervoor dat elke well stevig is afgesloten. Meng de monsters vervolgens gedurende vijf tot tien seconden voordat ze kort worden gecentrifugeerd bij ≥ 500 ×g.Incubeer de plaat in een thermocycler bij 99 °C gedurende vier minuten. Breng de plaat naar 4 °C en centrifugeer deze vervolgens kort nogmaals. Verwijder daarna voorzichtig de plaatafdichting en voeg 16,8 µL RT master mix twee toe aan elke put. Nadat de plaat is afgedicht en kortstondig is gemengd en gecentrifugeerd, plaatst u de plaat in de thermocycler en voert u het programma uit bij 25 °C gedurende 15 minuten, gevolgd door 42 °C gedurende 60 minuten, 99 °C gedurende vijf minuten, en houd deze tot slot op 4 °C voor maximaal acht uur of bewaar de monsters bij -70 °C voor een langere periode.Bereid in een cleanroom quantitative PCR-mastermixen voor aan de hand van de handleidingen voor enterovirus, norovirus genogroep één, norovirus genogroep twee en hepatitis G. Meng elke mastermix en centrifugeer kort. Voeg vervolgens, zoals in dit voorbeeld wordt getoond, 14 µL van de PCR-mastermixen toe aan de juiste putjes van een gelabelde optische reactieplaat, waarbij voor elke qPCR-assay aparte platen worden gebruikt. Verdeel zes µL van het betreffende cDNA over de juiste putjes. Meng daarna de monsters en centrifugeer kort.Stel de software van de thermocycler in zoals beschreven in het protocol en voer de hepatitis G qPCR-assay uit op de onverdunde en verdunde veld- en lab-verrijkte monstermatrix of LFSM-monsters voordat alle andere qPCR-assays worden uitgevoerd. Vergelijk de gemiddelde Cq-waarde van elk monster met de gemiddelde hepatitis G Cq-waarde die vooraf is bepaald voor elke nieuwe partij hepatitis G-reagens. Gebruik de laagste verdunning van het veld- of LDF-monster die minder dan één Cq-waarde hoger ligt dan de gemiddelde hepatitis G Cq-waarde voor de enterovirus- en norovirus qPCR-assays.Stel de software van de kwantitatieve PCR-thermocycler in volgens de instructies van de fabrikant. Identificeer de monsters van de standaardcurve als standaarden en voer voor elke verdunning van de standaardcurve de hier getoonde genomische kopie-waarden in. Voer de plaat uit bij 95 °C gedurende tien minuten, gevolgd door 45 cycli van 90 °C gedurende 15 seconden en 60 °C gedurende één minuut.Bepaal of elke standaardcurve voldoet aan de aanvaardbare waarden die in deze tabel worden gegeven. Nadat de standaarddeviatie, helling, R-kwadraat en het efficiëntiepercentage zijn berekend volgens de vergelijkingen in het tekstprotocol, noteert u de genomische kopie- of GC-waarden die door de software van de thermocycler zijn berekend voor alle testmonsters op basis van standaardcurves die voldoen aan de in deze tabel gespecificeerde criteria, alsmede de gemiddelde GC-waarden voor elk monster. Bepaal de GC per liter voor elk testmonster met behulp van de volgende vergelijking, waarbij GC het zojuist berekende gemiddelde aantal genomische kopieën is.De factor 199 is de totale verdunningsfactor voor de volumereacties die plaatsvonden tijdens de tertiaire concentraties, RNA-extractie en RT-qPCR-stappen. DF is de verdunningsfactor die compenseert voor inhibitie en D is het volume van de oorspronkelijke watermonsteranalyse in liters.Bereken tot slot de totale GC van de in het laboratorium verrijkte veldblindproef (LFB) en de laboratoriumreagensblindproef (LRB) door de eerder bepaalde gemiddelde GC-waarde te vermenigvuldigen met 199 en te delen door 0,3. In totaal werd de virusrecovery bepaald met behulp van gepaarde veld-LFSM grondwatermonsters uit in totaal zeven monstersets, afgenomen uit drie openbare zuiveringsinstallaties en een particuliere put. De entconcentraties voor de LSFM-monsters waren drie miljoen MPN van poliovirus type drie en vijf miljoen PFU van murine norovirus.Muizen-norovirus werd gebruikt voor de initiële evaluatie in één laboratorium van EPA-methode 1615 omdat het reagens voor de standaardcurve op dat moment niet beschikbaar was. Voor grondwatermonsters was de gemiddelde terugwinning van poliovirus 20% met een standaardfout van 2%, terwijl de gemiddelde terugwinning van muizen-norovirus 30% was met een standaardfout van 3%. Het reguliere veldmonster van grondwater voor elke LFSM bevatte geen detecteerbaar enterovirus of norovirus. Lab-verrijkte blanco's (LFB) en lab-reagensblanco's (LRB) werden gemeten met behulp van geïnoculeerd en niet-geïnoculeerd water van reagenskwaliteit.Het herstel van poliovirus bedroeg gemiddeld 44% met een standaardfout van 1%, terwijl het herstel van muizen-norovirus gemiddeld 4% was met een standaardfout van 0,5%. Deze figuur toont typische standaardcurven voor enterovirus en norovirus genogroep twee. De curve voor norovirus genogroep twee voldoet aan de criteria voor de standaardcurve met een R-kwadraatwaarde van 0,9987, een totale standaarddeviatie van 0,14 en een efficiëntie van 101%. De enteroviruscurve voldoet aan de prestatiecriteria voor de standaardcurve met een R-kwadraatwaarde van 0,9874, een totale standaarddeviatie van 0,58 en een efficiëntie van 103%, maar heeft een ongeveer 100-maal lagere gevoeligheid en dus een hogere detectielimiet dan de noroviruscurven.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe watergedragen enterovirussen en norovirussen kunnen worden geconcentreerd en gedetecteerd met behulp van RT-qPCR. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer acht uur worden uitgevoerd voor monsters met een lage troebelheid. Monsters met een hogere troebelheid kunnen extra tijd vereisen, vooral bij de tertiaire concentratiestap.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om monsters te beschermen tegen RNase-contaminatie voorafgaand aan de reverse transcriptie. Vergeet niet dat PCR een zeer krachtige en nuttige techniek is. Voorzorgsmaatregelen, zoals het scheiden van werkstations en het gebruik van juiste controles, zijn noodzakelijk om vals-positieve en vals-negatieve resultaten te minimaliseren.

epa-method-1615-measurement-enterovirus-norovirus-occurrence-water

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Een stap RT-PCR voor de detectie en genogroup identificatie van Norovirus isolaten van kinderen ontlasting dat primers en TaqMan probes specifiek voor de open reading frame 1 (ORF1)-ORF2 grensgebied, de geconserveerde regio van de Norovirus genoom gebruikt beschreven. Een niet-commerciële, kosteneffectieve RNA-extractie methode wordt beschreven.

Detectie en Genogrouping van Norovirussen van Children&#39;s Krukken Door Taqman een stap RT-PCR

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

EPA-methode 1615 gebruikt een elektropositieve filter om enterovirussen en norovirusessen te concentreren in milieu- en drinkwater. Dit manuscript beschrijft de procedure voor het verzamelen van monsters voor analyse volgens Methode 1615.

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in water per cultuur en RT-qPCR. I. Het verzamelen van Virus Samples

Hier presenteren we een procedure om totale cultiveerbare virussen te meten met behulp van de Buffalo Green Monkey niercel lijn. De procedure biedt een gestandaardiseerd hulpmiddel voor het meten van het voorkomen van infectieuze virussen in milieu- en drinkwater.

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in Water per cultuur en RT-qPCR. II. Totaal kweekbare Virus Assay

Een op macrofoam gebaseerde bemonsteringsmethodologie werd ontwikkeld en geëvalueerd voor de detectie en kwantificering van norovirus op harde oppervlakken in het milieu.

Swab Sampling Methode voor de detectie van humane Norovirus op oppervlakken

Er werd een benadering ontwikkeld voor het identificeren van optimale virale concentratiecondities voor kleine watermonsters met behulp van spikes van humaan adenovirus. De hier beschreven technieken worden gebruikt om concentratieparameters voor andere virale doelen te identificeren en worden toegepast op grootschalige virale concentratie-experimenten.

Een klein volume Procedure voor Virale Concentratie van het Water

Productie afvalwater (PBW) werd behandeld met cuprisch oxide nanodeeltjes (CuO-NP's) en cellulaire toxiciteit werd beoordeeld in gekweekte menselijke cellen. Het doel van dit protocol was om het native milieumonster te integreren in een celkweekformaat waarbij de veranderingen in toxiciteit als gevolg van CuO-NP behandeling werden beoordeeld.

Verwijdering van Trace Elements van Cupric Oxide Nanodeeltjes van Uranium<em&gt; In Situ</em&gt; Herstel Bleed Water en het effect op levensvatbaarheid van de cellen

We introduceren de VacuSIP, een eenvoudige, niet-invasieve en betrouwbare methode voor schoon en nauwkeurig puntsampling van water. Het systeem werd ontwikkeld en geëvalueerd voor de gelijktijdige verzameling van het water dat wordt ingeademd en uitgeademd door benthische suspensie-voeders in situ, om de verwijdering en uitscheiding van deeltjes en opgeloste verbindingen schoon op te meten.

VacuSIP, een verbeterde INEX Methode voor het<em&gt; In Situ</em&gt; Meten van Particulate en opgeloste componenten verwerkt door Active Suspension Voeders

Dit protocol diagnose Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia weefsels met behulp van de RT-PCR methodes. De hele methode is beschreven van weefsel dissectie totaal RNA extractie, gevolgd door de cDNA synthese en opsporing van TiLV door conventionele PCR of kwantitatieve PCR dsDNA bindend een bindende fluorescerende kleurstof gebruiken.

Detectie van Tilapia Lake Virus met behulp van conventionele rechts-PCR en SYBR groene RT-qPCR

Een microplot ontwerp voor 15N tracer onderzoek wordt beschreven om meerdere in-season plant en bodem bemonstering gebeurtenissen tegemoet te komen. Voor de analyse van 15 N worden bodem- en verwerkingsprocedures voor monsters, met inbegrip van slijp- en weegprotocollen, voor 15N-analyse naar voren gebracht.

Microplot Ontwerp en Plant en Bodem Monster Voorbereiding voor 15Stikstof Analyse

Leer enterovirus en norovirus detecteren in water via RT-qPCR volgens EPA Methode 1615. Deze gestandaardiseerde methode gebruikt centrifugale ultrafiltratie en real-time PCR voor betrouwbare viruskwantificatie in drink- en oppervlaktewater.

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in water per cultuur en RT-qPCR. Deel III. Virus Detectie door RT-qPCR (Video) | JoVE Journal

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in water per cultuur en RT-qPCR. Deel III. Virus Detectie door RT-qPCR

Meer video's verkennen