Een snelle en betrouwbare Pipeline voor Bacteriële Transcriptome Analyse Case study: Serine-afhankelijke genregulatie in Streptococcus pneumoniae
25 april 2015
Dit manuscript beschrijft het gebruik van de nieuwste technologie die wordt geleverd door DNA-microarrays. Microarrays geven een overzicht van de transcriptomische veranderingen in bacteriën die ontstaan onder specifieke omstandigheden. Bovendien benadrukken we hoe gemakkelijk grote hoeveelheden gegevens kunnen worden geanalyseerd door gebruik te maken van handige, in eigen beheer ontwikkelde softwarepakketten.
Het algemene doel van deze procedure is om een overzicht te geven van de transcriptomische veranderingen in bacteriën die ontstaan onder een specifieke conditie. Dit wordt bereikt door eerst bacteriële cellen onder een specifieke conditie te laten groeien en te oogsten. Vervolgens wordt totaal RNA geïsoleerd uit de geoogste cellen en wordt CDNA gemaakt van het RNA.
Daarna worden de CDNA's gelabeld en gehybridiseerd op in-house gemaakte micro assay slides. Ten slotte wordt de slide gewassen waarna de slides worden gescand en geanalyseerd. Uiteindelijk wordt de microarray gebruikt om de transcriptomische veranderingen in bacteriële cellen onder de specifieke conditie te tonen.
Het belangrijkste voordeel van de DNA microarray-technologie boven andere bestaande methoden voor het bestuderen van genexpressie zoals QPCR of northern blotting, is dat het een globaal overzicht geeft van alle transcriptomische veranderingen die onder een specifieke conditie optreden. Het is snel, betrouwbaar en relatief goedkoop. Het demonstreren van de procedure zal worden gedaan door Mohammed Sal en Airon Manzu, PSD-studenten uit mijn laboratorium in moleculaire genetica Na het ontdooien, s pmo, ED 39 cel pelletten en Resus schorten in 400 microliter van te volgens het tekstprotocol, bereid het volgende in RNA-vrije schroefdopbuizen, 0,5 gram glaskorrels, 50 microliters van 10%SDS 500 microliters van eerder bereid fenol chloroform en de geresuspendeerde cel pelletten.
Om de cellen te breken, plaats de buizen in een bead beater en homogeniseer twee keer gedurende 60 seconden, waarbij ze tussen de pulsen één minuut op ijs worden geplaatst, en centrifugeer vervolgens de monsters bij 10.000 Gs en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Breng de bovenste fase over naar een verse buis en centrifugeer met 500 microliters chloroform i a, a en centrifugeer gedurende vijf extra minuten. Pipetteer 500 microliters van de bovenste fase naar verse buizen.
Voeg twee volumes lysis bindbuffer toe en meng door op en neer te pipetteren. Gebruik vervolgens een RNA isolatiekit om totaal RNA te isoleren volgens het protocol van de fabrikant om besmette DNA uit het RNA te verwijderen. Voeg 100 microliters van D a's een mix toe en incubeer bij 15 tot 25 graden Celsius gedurende 20 tot 30 minuten.
Gebruik de RN a's kit om het gereinigde RNA te wassen en elueren in een volume van 50 microliter om de anknielingreactie uit te voeren in 300 microliter PCR buizen. Meng totaal RNA met twee microliters van willekeurige monomeren en gebruik nuclease-vrij water indien nodig om het volume op 18 microliter te brengen. Incubeer het anknielingmengsel gedurende vijf minuten bij 70 graden Celsius.
Koel vervolgens de reacties af bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en draai snel voordat u de buizen gedurende ten minste één minuut op ijs legt. Om CDNA terug te transcriberen, bereid de omgekeerde transcriptiemix voor, combineer 18 microliters van de mix met 12 microliters van master mix en incubeer de reactie bij 42 graden Celsius gedurende twee tot 16 uur. Degradeer het mRNA van de reactie door drie microliters van 2,5 molar en een OH toe te voegen en plaats het gedurende ongeveer 15 minuten bij 37 graden Celsius.
Voeg vervolgens 15 microliters van twee molar heeps vrije zuur toe om de NAOH te neutraliseren. Gebruik vervolgens PCR opruimingskolommen om het CDNA te zuiveren met een spectrofotometer, meet de CDNA-concentratie om het CDNA te labelen. Voeg vijf microliters van een am mean reactieve kleurstof toe aan 20 tot 60 nanogram per microliter van CDNA.
Plaats het mengsel in het donker en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 60 tot 90 minuten voordat u PR opruimingskolommen gebruikt om de kleurstof gelabelde CDNA te zuiveren, eluerend in 50 microliters van evolutiebuffer met een spectrofotometer, zorg ervoor dat de concentratie van gelabeld CDNA ten minste 0,5 pico mol per microliter is in een totaal volume van 50 microliter. Na het voorbereiden van shy buffer, volgens het tekstprotocol, verwarm de buffer gedurende ten minste 30 minuten op 68 graden Celsius. Om het monster voor te bereiden, combineer gelijke hoeveelheden van gelabelde CDNA's, gebruik vervolgens vacuüm concentratoren op hoge temperatuur om het volume te verminderen tot zeven microliters of minder.
Gelijktijdig, om lifter slips schoon te maken om het achtergrondsignaal te verminderen, gebruik zeep en veel kraanwater, gevolgd door 100% ethanol na het drogen van de lifter slips, plaats er een op een slide met de witte Teflon bekleding naar beneden. Los vervolgens de gedroogde kleurstof monsters op in zeven microliters van H2O en incubeer gedurende twee minuten bij 94 graden Celsius. Voeg onmiddellijk 35 microliters van voorverwarmd shy buffer toe, meng voorzichtig en draai met maximale snelheid gedurende één minuut.
Om precipitaatjes te pelleren, verwarm de sonde gedurende ongeveer vijf minuten voorafgaand aan het laden. Om de slide en lifter slip te assembleren, plaats de hybridisatie slide houder op een warmteblok bij 50 graden Celsius. Plaats DNA microarray slides met de lifter slip op de verwarmde hybridisatie slide houder en verwarm de slide met de lifter slip gedurende een minuut.
Voeg vervolgens zo snel mogelijk 40 microliters van het monsters doel toe aan het einde van de slide. Laat de vloeistof stromen tussen de glazen oppervlakken door capillaire kracht. Verwijder nu de voorverwarmde hybridisatie cassette uit de hybridisatie oven en sluit de machine.
Plaats vervolgens filterpapier gedrenkt in drie milliliters van twee XSSC in de hybridisatie cassette. Plaats voorzichtig de hybridisatie slide houder met slides in de hybridisatie cassette. Sluit de hybridisatie cassette en plaats het terug in de hybridisatie oven en incubeer gedurende 16 tot 18 uur.
Voor het wassen van de slides, bereid verse was buffers een, twee en drie en plaats ze bij 30 graden Celsius. Om ervoor te zorgen dat het SDS oplost wanneer de incubatie voltooid is, dompel de slides zo snel mogelijk onder in een Falcon buis gevuld met 50 milliliters van was buffer, een totdat het glas op de bodem
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit manuscript beschrijft het gebruik van state-of-the-art technologie, geleverd door DNA-microarrays, om transcriptomische veranderingen in bacteriën te analyseren. Het proces omvat het kweken van bacteriële cellen onder specifieke omstandigheden, het isoleren van totaal RNA, en het gebruik van intern ontwikkelde software voor data-analyse.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Genomics
- Bioinformatica
Achtergrond
- DNA-microarrays zijn krachtige hulpmiddelen voor het bestuderen van genexpressie.
- Transcriptomische analyse helpt bij het begrijpen van bacteriële reacties op omgevingsveranderingen.
- Interne software kan de analyse van grote datasets vergemakkelijken.
- Dit onderzoek richt zich op een specifieke conditie die bacteriële cellen beïnvloedt.
Doel van het onderzoek
- Om een overzicht te geven van transcriptomische veranderingen in bacteriën.
- Om de effectiviteit van DNA-microarrays bij het analyseren van genexpressie aan te tonen.
- Om de eenvoud van data-analyse met behulp van aangepaste software te benadrukken.
Gebruikte methoden
- Groei en oogst van bacteriële cellen onder specifieke omstandigheden.
- Isolatie van totaal RNA uit geoogste cellen.
- Conversie van RNA naar cDNA.
- Labeling en hybridisatie van cDNA's op microarray slides.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van RNA en conversie naar cDNA.
- Effectieve hybridisatie van cDNA's op microarray slides.
- Analyse onthulde significante transcriptomische veranderingen.
- Data-analyse werd gestroomlijnd met behulp van interne software.
Conclusies
- DNA-microarrays zijn effectief voor het bestuderen van bacteriële transcriptomiek.
- Aangepaste software verbetert de mogelijkheden voor data-analyse.
- Deze methodologie kan worden toegepast op verschillende bacteriële studies.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
DNA microarray technology enables rapid, cost-effective global transcriptome profiling in bacterial systems, supporting target validation and mechanistic de-risking in antimicrobial discovery. By capturing genome-wide transcriptional responses to environmental stimuli such as nutrient availability, the method provides predictive confidence in pathway modulation and gene regulatory networks. This facilitates early-stage hypothesis triage and portfolio prioritization in antibacterial R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional responses to serine availability, clarifying gene regulatory networks in S. pneumoniae.
- Operational Value: Provides a standardized workflow from cell harvest to data analysis using optimized RNA isolation and labeling protocols.
- Predictive Value: Identifies differentially expressed genes with ≥2-fold change and p<0.001, supporting confidence in target modulation under defined conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, genome-wide expression profiles enabling comparison of transcriptional states across growth conditions.
- Operational Value: Utilizes homemade microarray slides and standardized hybridization/wash buffers to ensure reproducibility and low background signal.
- Scalability: Supports parallel processing of multiple samples via vacuum concentration and automated scanning for downstream analysis.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links in vitro transcriptional responses to potential in vivo relevance by modeling nutrient stress conditions encountered during infection.
- Mechanistic De-risking: Clarifies serine-dependent gene regulation, reducing uncertainty in target essentiality and pathway inhibition strategies.
- Preclinical Alignment: Enables identification of co-regulated gene clusters that may represent druggable pathways or virulence modulators.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis generation in target validation and informing lead identification through mechanistic insights into bacterial adaptation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional target validation by revealing condition-specific transcriptional reprogramming.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs suitable for assay readiness and cross-condition comparison in antimicrobial screening campaigns.
- Analytics: Employs Microprep for preprocessing and Cyber-T for statistical analysis, enabling robust identification of significant expression changes.
- Translational Research: Connects laboratory observations to pathogenic relevance by modeling host-associated metabolic pressures.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for transcriptome profiling across bacterial strains and growth conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in gene regulation studies through unbiased, global expression profiling.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized RNA quality checks, dye labeling thresholds, and slide washing protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early evidence of target engagement and pathway modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by highlighting condition-specific essential genes and regulatory hubs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial culture, RNA handling, and microarray hybridization techniques.
- Dependent on access to microarray scanning equipment and spectrophotometric quantification tools.
- Necessitates cross-team standardization of RNA isolation, labeling efficiency, and data preprocessing workflows.
- Involves adaptation considerations when extending to Gram-negative or fastidious bacterial models.
- Limited by the requirement for prior sequence knowledge to design homemade microarray probes.
