Name: Generatie Lymfatische micropartikels en Detectie van hun proapoptotische Effect op epitheelcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Leer de productie van lymfatische micropartikels uit T-lymfocyten en hun proapoptotische effecten op luchtwegepitheelcellen. Deze methode maakt grootschalige in vitro-generatie mogelijk voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk wordt ondersteund door subsidies van de Canadese Institutes of Health Research (178.918), Fonds de recherche en santé du Québec - Vision Health Research Network.

OPMERKING: Man C57BL / 6 muizen (5-7 weken oud) zijn van Charles River Laboratories International, Inc. (St-Constant, Quebec, Canada.) En gemanipuleerd volgens de protocollen door de CHU Sainte-Justine Animal Care Comité is goedgekeurd. Mouse bronchiale weefselexplantaten een goede bron van primaire bronchiale epitheelcellen onderzoeken van de pro-apoptotische effecten van LMPs op epitheelcellen. Dit protocol beschrijft de in vitro generatie van LMPs, alsmede een werkwijze voor het detecteren van apoptotische epitheelcellen op LMPs behandelde bronchiale weefselexplantaten. Het protocol bestaat uit 3 delen. 1. LMPs Productie en karakterisering OPMERKING: Om besmetting te voorkomen, ervoor zorgen dat alle in dit experiment gebruikte materialen zijn steriel of geautoclaveerd. Voer alle stappen bij kamertemperatuur in een bioveiligheidskast onder steriele voorwaarde, tenzij anders aangegeven. 1.1) Stimulatie en verzamelen van parlementsleden9 <ol><li> Ontdooi een portie van 10 miljoen CEM T-cellen in een 37 ° C waterbad. Verdun 10 ml voorverwarmd serumvrij medium hematopoietische zoals X-VIVO, in een 15 ml steriele buis en centrifugeer bij 200 gx 5 min. Zuig het supernatant en resuspendeer cellen in 5 ml voorverwarmde medium. </li><li> Overdracht cellen in een T75 weefselkweekfles (voor suspensie cellen) met 15 ml voorverwarmd medium hematopoietische zoals X-VIVO en incubeer gedurende 4 dagen in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% CO2. </li><li> Na 4 dagen, breng dan het kweekmedium en de cellen in een T175 weefselkweek kolf die 100 ml vers medium. Verder incuberen van de cellen gedurende 72 uur onder dezelfde omstandigheden totdat zij zijn gegroeid tot een dichtheid van 2 miljoen cellen / ml. </li><li> Gelijkmatig verdeeld over vier cellen T175 kolven die elk 150 ml vers medium en verder celkweek tot cellen gekweekt (ongeveer 48 uur incubatie) tot een dichtheid van 2 miljoen / ml. </li><li&gt; Verzamel cellen van elke door centrifugatie bij 200 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer 300 x 10 6 cellen in een nieuw T175 kolf met 150 ml vers medium tot 2 miljoen / ml celdichtheid handhaven. </li><li> Voeg actinomycine D (opgelost in DMSO bij 2 mg / ml) aan het medium tot een eindconcentratie van 0,5 ug / ml en geïncubeerd gedurende 24 uur. </li><li> Breng al het kweekmedium in 50 ml conische buizen en spin neer de cellen bij 750 g gedurende 5 min. Breng het supernatant in 50 ml conische buizen en centrifugeer bij 1500 xg gedurende 15 min tot grote cel fragmenten verwijderen. </li><li> Breng de bovenstaande vloeistof in een fles van 250 ml en ultracentrifuge bij 12.000 xg gedurende 50 min. Verwijder het supernatant en het verzamelen van pellets. </li><li> Wash LMPs verrijkte pellets met 40 ml steriele PBS in een 50 ml buis door centrifugatie bij 12.000 xg gedurende 50 min. Herhaal deze stap twee keer. </li><li> Verzamel de laatste wasbeurt supernatant; het zal worden gebruikt als dragercontrole. Hang de LMPs pellets in 1ml PBS en overbrengen in een 1,5 ml steriele microbuisjes. Aliquot en bewaar geïsoleerd LMPs bij -80 ° C (meerdere gratis dooi-cycli te vermijden). </li></ol> 1.2) Karakterisering van de parlementsleden via FACS-analyse 4 <ol><li> Bereid 2 monsters van annexine buffer, 1 met en de andere zonder CaCl2: Hepes 10 mM, NaCl 140 mm, plus of min 5 mM CaCl2. </li><li> Filter annexine buffer en FACS stroming omhullingfluïdum met een 0,22 urn filter om deeltjes te verwijderen. </li><li> Verdun 1 pl LMPs in 44 pi annexine buffer met 5 mM CaCl2 in een FACS buis. Maak een andere buis met 1 pl LMPs in 44 gl annexine buffer zonder CaCl2 (negatieve controle). </li><li> Voeg 5 ul van annexinV-Cy5 in elke buis en meng goed. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Stop de reactie door het verdunnen van het mengsel met 400 ul FACS stroming sheath vloeistof in elke buis. </li><li> Voeg 10 ul (200.000 kralen) van 7 micrometer tellen beads suspensie als interne standaard in elke buis een absolute telling te verkrijgen. </li><li> Vestigen poorten van de relatieve grootte (FSC-H, PMT E00, log schaal) en relatieve granulariteit (SSC-H, PMT 325, log schaal) dot perceel aan de flowcytometer behulp-size gekalibreerde fluorescerende kralen van 1 micrometer (poort 1) en het tellen van kralen poort bij 7 micrometer (poort 2). </li><li> Analyseer de LMPs monster op FSC-H / SSC-H plot met behulp van de gevestigde poorten en FL-4-kanaals voor annexine (PMT 765, log schaal) dot plot, door het verwerven van een signaal tot 20.000 tellen van kralen in poort 2 worden bereikt. </li><li> Bepaal de positieve annexinV gebeurtenissen van LMPs in annexine buffer met CaCl2 en daarna aftrekken de gebeurtenissen van LMPs in annexine buffer zonder CaCl2 (negatieve controle). </li><li> Bereken het absolute aantal MPs basis van de volgende vergelijking: <img alt="Vergelijking 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52651/52651eq1.jpg" /></li></ol> 1.3) Bepaling van MP PProtein Concentratie (Bradford Assay) <ol><li> Bereid 5 seriële verdunningen van een standaard eiwit 1,25-20 ug / ml. Pipet 800 pi van elke standaard en monster-oplossing in een schone reageerbuis in tweevoud. Voeg 200 ul van Bradford kleurstofreagens aan elke buis. Meng goed, dan incuberen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Meet absorptie bij 595 nm. Bepaal de eiwitconcentratie van LMPs met de lineaire regressie van standaardcurve. </li></ol> 2. bronchiale weefselexplantaten en LMPs Behandeling OPMERKING: Let vooral op de steriele werkomgeving, en aseptisch bereiden de oplossingen en medium gebruikt in volgende experimenten. Om de volledige genezing Medium bereiden, voeg 1 ml Tissue Healing Medium Supplementen met Serum (ontdooid op ijs) tot 100 ml Tissue Healing Medium en meng goed. 2.1) Voorbereiding van de bronchiale weefselexplantaten <ol><li> Voordat kweken, krassen 6 gebieden van 1 cm 2elk aan de rand van het oppervlak van elk 100 mm weefselkweekplaat met een scalpel. Coat elk gekrast 100 mm weefselkweekplaat met 2 ml van de kweekschaal bekledingsoplossing en incubeer de schotel in een bevochtigde CO2 incubator O / N bij 37 ° C. Vacuüm zuig het overtollige oplossing en vul de schaal met 15 ml Tissue Wassen Medium. </li><li> Euthanaseren C57BL / 6-muizen (5-7 weken oud) van CO2 inhalatie volgens de protocollen van de dierlijke zorg ethische commissie goedgekeurd. </li><li> Aseptisch ontleden longweefsel met scalpel, Dumont super fijne pincet, en chirurgische schaar. Verwijder voorzichtig parenchym en bloedvaten. Plaats longweefsel in ijskoud Tissue Wassen Medium voor transport naar het laboratorium, indien van toepassing. </li><li> Verder ontleden bronchus ondergedompeld in de Tissue wasmedium en scheid de bronchus met een diameter van 1 tot 2,5 mm uit perifere longweefsel. Slice bronchiale weefsels in ~ 5 mm dik bronchiale ringen met een scalpel. </li&gt; <li> Gebruik een scheppende beweging met de steriele gebogen microdissecting pincet te halen de bronchiale fragmenten en plaats ze op de krassen van de gerechten. </li><li> Verwijder de Tissue Wassen Medium, en incubeer de fragmenten bij KT ~ 5 min om hen in staat stellen zich te houden aan de gerechten. </li><li> Voeg 10 ml van volledige genezing Medium om elk gerecht en plaats ze in een gecontroleerde atmosfeer modulaire incubator kamer. Spoel de kamer met hoge O2 gasmengsel (70% O2, 25% N2 en 5% CO2). Plaats de kamer in een tafelmodel orbitale incubator en schud bij 37 ° C. Schud de kamer voor 24 uur bij 10 cycli per minuut om het medium te tussenpozen stroom over de fragmenten. </li><li> Na 24 uur incubatie, observeert de weefselexplantaten onder een fase-contrast omgekeerde lichtmicroscoop. Selecteer bronchiale explants met complete, fijn haar beweging en levendige bronchusepitheel voor volgende LMPs behandeling. </li></ol>2.2) LMPs Behandeling <ol><li> Bereid compleet groeimedium als volgt: dooi groeimedium supplementen met serum en fibroblast-remmer op ijs. Voeg 1 ml van het kweekmedium supplementen serum en 200 ui fibroblast remmer 100 ml groeimedium; meng goed. Verwarm het volledige groeimedium bij 37 ° C gedurende 10 min vóór gebruik. </li><li> Verdun geïsoleerd LMPs in een nieuwe steriele Eppendorf buis met PBS tot een LMPs stock bereid in een concentratie van 800 ug / ml. </li><li> Voeg 0,5 ml compleet groeimedium aan elk putje van een 12-well weefselkweek platen. </li><li> Overdracht van de geselecteerde bronchiale explantaten met de gebogen microdissecting tang van het vorige protocol (paragraaf 2.1) aan elk putje van de weefselkweek plaat. </li><li> Label de cultuur plaat op de juiste wijze te LMPs behandeling putten en controle putten identificeren. Voeg 25 ul LMPs voorraad in elkaar LMPs behandeling goed (voor een uiteindelijke concentratie van 40 ug / ml) en 25 pi controle over het voertuig (zie LMP<html> en productie) aan de controleputjes. </li><li> Verdere incubatie in een gecontroleerde atmosfeer modulaire incubator kamer bij 37 ° C onder zacht schudden. </li><li> Na 24 uur, wassen explants 3 keer met PBS en ga verder met de volgende stap (4% paraformaldehyde [PFA] fixatie). </li></ol> 3. Histopathologisch onderzoek 3.1) Bereid de volgende oplossingen voordat u verder gaat naar de volgende stappen <ol><li> Bereid 1x PBS buffer door het mengen van 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,76 mM KH 2PO 4, pH 7,4. </li><li> Ter voorbereiding 4% PFA, los 20 g PFA in 400 ml water, verwarmd tot 60 ° C onder roeren; voeg enkele druppels 10 M NaOH om de oplossing te verwijderen. Voeg vervolgens 1x PBS buffer en het volume tot 500 ml en de pH op 7,4 stellen. Filter en de hoeveelheid; bewaren bij -20 ° C. </li><li> Bereid de volgende uitdroging of rehydratatie reagentia; 100%, 90%, 70%, 50% ethanol en xyleen. </li></ol>e_step &quot;&gt; 3.2) Explantatie Fixatie en Tissue Sectie deparaffinisatie <ol><li> Plaats elk explantaat in een gemerkte microcentrifugebuis van 1,5 ml van 4% PFA en geïncubeerd O / N bij 4 ° C. Twee keer Spoel de explantaten met 1x PBS. </li><li> Dehydrateer explantaten via een alcohol reeks (70% ethanol: 3 keer 30 minuten elk, 90% ethanol: 2 keer 30 minuten elk, 100% ethanol: 3 keer 30 minuten elk, vervolgens xyleen: 3 keer 20 min elk). Voer alle stappen bij RT in een zuurkast. </li><li> Verankeren weefselexplantaten in paraffine bij 58 ° C in een oven. Bereid 5 pm dikke coupes met behulp van een rotatiemicrotoom. </li><li> Drijven de secties in een 56 ° C waterbad, en monteer vervolgens de secties op het label histologische coupes. Plaats de objectglaasjes handmatige kleuring rekken en droog bij 65 ° C gedurende 1 uur. Laat de dia afkoelen bij kamertemperatuur. </li><li> Dompel de rekken in 4 opeenvolgende vlek gerechten met xyleen gedurende 10 minuten elk om paraffine te verwijderen. Dompel het rekken in een ethanol serie xyleen te verwijderen 100%, daarna 95%, then 80%, daarna 70%, daarna 50% ethanol (5 min voor elke stap). Spoel de rekken met kraanwater gedurende 5 minuten om ethanol te verwijderen. </li></ol> 3.3) Hematoxyline en eosine (H &amp; E) kleuring <ol><li> Blijven werken met de vaste weefsel secties; Plaats het rek in een kleuring schotel gevuld met Mayer&#39;s hematoxyline gedurende 15 min. Spoel het rek met leidingwater om Hematoxyline verwijderen gedurende 20 min. </li><li> Plaats in gedestilleerd water gedurende 30 sec.Place in 95% ethanol gedurende 30 sec. Plaatsen in Eosine Y oplossing kleuring schotel voor 1 min. Dehydrateer door 2 verandering van 95% ethanol, 100% ethanol en xyleen gedurende 2 minuten elk. </li><li> Voer een snelle controle onder een microscoop zodat overmaat eosine verwijderd. Leg 2 tot 3 druppels montage medium (Fisher SP15-100) op elke dia, dek af met een deksel glas. </li></ol> 3.4) In Situ Cell Death Detection: TUNEL Assay <ol><li> Voordat u begint, bereiden proteinase K werkende oplossing: 20 ug / ml in10 mM Tris / HCl, pH 7,4. </li><li> Herhaal de stappen 1 tot 5 van paragraaf 3.2 (Explantatie fixatie en weefsel sectie deparaffinisatie). De glaasjes met gedeïoniseerd H2O Spoel </li><li> Dompel de dia&#39;s met 1x PBS gedurende 10 min. Giet de overtollige PBS. Incubeer weefselcoupes gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met proteinase K werkoplossing. Spoeling glijdt tweemaal met 1x PBS. </li><li> Voer de TUNEL assay zoals beschreven in de instructiehandleiding van celdood detectie kit. Monteer met behulp van montage medium, en dekglaasje handmatig met dekglaasjes. </li><li> Analyseer monsters onder een lichtmicroscoop. Gebruik Image Pro 4.5 de apoptotische cellen in bruine kleur analyseren. </li></ol>

<ol><li>Tushuizen, M. E., Diamant, M., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-derived+microparticles+in+the+pathogenesis+of+cardiovascular+disease%3A+friend+or+foe%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-derived microparticles in the pathogenesis of cardiovascular disease: friend or foe.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 4-9 (2011).</li>
<li>Martinez, M. C., Tual-Chalot, S., Leonetti, D., Andriantsitohaina, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticles%3A+targets+and+tools+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Microparticles: targets and tools in cardiovascular disease.</a> Trends Pharmacol Sci. 32 (11), 659-665 (2011).</li>
<li>Benameur, T., Andriantsitohaina, R., Martinez, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+plasma+membrane-derived+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rep%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of plasma membrane-derived microparticles.</a> Pharmacol Rep. 61 (1), 49-57 (2009).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytic+microparticles+inhibit+angiogenesis+by+stimulating+oxidative+stress+and+negatively+regulating+VEGF-induced+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lymphocytic microparticles inhibit angiogenesis by stimulating oxidative stress and negatively regulating VEGF-induced pathways.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 294 (2), 467-476 (2008).</li>
<li>Yang, C., Gagnon, C., Hou, X., Hardy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+lipoprotein+receptor+mediates+anti-VEGF+effect+of+lymphocyte+T-derived+microparticles+in+Lewis+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Low density lipoprotein receptor mediates anti-VEGF effect of lymphocyte T-derived microparticles in Lewis lung carcinoma cells.</a> Cancer Biol Ther. 10 (5), 448-456 (2010).</li>
<li>Angelillo-Scherrer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-derived+microparticles+in+vascular+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-derived microparticles in vascular homeostasis.</a> Circ Res. 110 (2), 356-369 (2012).</li>
<li>Maeno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+Cells+are+required+for+inflammation+and+destruction+in+cigarette+smoke-induced+emphysema+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD8+ T Cells are required for inflammation and destruction in cigarette smoke-induced emphysema in mice.</a> J Immunol. 178 (12), 8090-8096 (2007).</li>
<li>Qiu, Q., Xiong, W., Yang, C., Gagnon, C., Hardy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte-derived+microparticles+induce+bronchial+epithelial+cells%27+pro-inflammatory+cytokine+production+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte-derived microparticles induce bronchial epithelial cells' pro-inflammatory cytokine production and apoptosis.</a> Mol Immunol. 55 (3-4), 220-230 (2013).</li>
<li>Martin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shed+membrane+particles+from+T+lymphocytes+impair+endothelial+function+and+regulate+endothelial+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Shed membrane particles from T lymphocytes impair endothelial function and regulate endothelial protein expression.</a> Circulation. 109 (13), 1653-1659 (2004).</li>
<li>Shet, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sickle+blood+contains+tissue+factor-positive+microparticles+derived+from+endothelial+cells+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes.</a> Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).</li>
<li>Mause, S. F., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticles%3A+protagonists+of+a+novel+communication+network+for+intercellular+information+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Microparticles: protagonists of a novel communication network for intercellular information exchange.</a> Circ Res. 107 (9), 1047-1057 (2010).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-proliferative+and+anti-tumour+effects+of+lymphocyte-derived+microparticles+are+neither+species-+nor+tumour-type+specific%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Anti-proliferative and anti-tumour effects of lymphocyte-derived microparticles are neither species- nor tumour-type specific.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li>
<li>Soleti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticles+harboring+Sonic+Hedgehog+promote+angiogenesis+through+the+upregulation+of+adhesion+proteins+and+proangiogenic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Microparticles harboring Sonic Hedgehog promote angiogenesis through the upregulation of adhesion proteins and proangiogenic factors.</a> Carcinogenesis. 30 (4), 580-588 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Kamerleden zijn actieve bemiddelaars van intercellulaire overspraak en hun studie is veelbelovend in veel gebieden van de wetenschap. 11 Deze studie presenteerde een gedetailleerd protocol voor in vitro grootschalige opwekking van LMPs afgeleid van een apoptotische T-cellijn. Deze Kamerleden drukken een groot repertoire van lymfocyten moleculen en zijn biologisch betrokken bij de regulatie van de cellulaire en weefselhomeostase. Echter, LMPs afkomstig van verschillende bronnen kunnen biologisch versc...

Microdeeltjes (MP's) zijn biologisch actieve submicron membraanblaasjes die vrijkomen na celactivatie of apoptose. MP's zijn afgeleid van zowel gezonde als beschadigde cellen en zijn betrokken bij veel fysiologische en pathologische processen.1 MP's zijn niet alleen aangetoond in menselijk plasma, maar ook in inflammatoir en apoptotisch weefsel. De biologische bruikbaarheid van uit celmembranen afkomstige MP's is aangetoond in verschillende omstandigheden, waaronder celsignaleringsmodellen en als farmacologische hulpmiddelen.2,3 We hebben eerder aangetoond dat LMP's afkomstig van T-lymfocyten na stimulatie met actinomycine D (om apoptose te induceren) angiogenese onderdrukken en de overleving en proliferatie van endotheelcellen remmen.4,5 De antiangiogene effecten van LMP's kunnen aanzienlijk variëren afhankelijk van de stimuli die worden gebruikt om T-lymfocyten in vitro te activeren.6
Het luchtwegepitheel functioneert als een beschermende fysische en functionele barrière. Een verhoogd aantal T-lymfocyten in de luchtweg kan bijdragen aan celbeschadiging en ontsteking van de luchtwegen.7 We hebben aangetoond dat LMP's apoptose van humane bronchiale epitheelcellen induceren,8 wat aangeeft dat LMP's de barrièrefunctie van het bronchiale epitheel in vivo kunnen veranderen. Apoptotische cellen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van de TUNEL-methode, die in situ DNA-fragmentatie detecteert.
Het algemene doel van dit protocol is om de in vitro productie van LMP's uit een T-lymfocytcellijn te illustreren en hun pro-apoptotische effect op luchtweg-epitheelcellen aan te tonen. In situ detectie van celdood heeft aangetoond dat LMP's sterk de dood van bronchiale epitheelcellen in de luchtwegen induceren, wat suggereert dat LMP-gemedieerde schade aan het luchtwegepitheel de barrièrefunctie van het beschadigde epitheel kan beïnvloeden.

<table><tbody><tr><td>LMPs productie en karakterisering</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CEM T cellen&nbsp;</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>CCL-119</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 medium&nbsp;</td><td>Cambrex, Walkersville</td><td>04-744Q</td><td></td></tr><tr><td>Flask T75</td><td>Sarstedt</td><td>83.1813.502</td><td></td></tr><tr><td>Flask T175</td><td>Sarstedt</td><td>83.1812.502</td><td></td></tr><tr><td>Actinomycin&nbsp;D&nbsp;</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>A9415-2mg</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lifetechnologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro;m filter</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Annexin-VCy5</td><td>BD Pharmagen&nbsp;</td><td>559933</td><td></td></tr><tr><td>FACS flow oplossing</td><td>BD Bio-sciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescente microbeads (1 &micro;m)</td><td>Molecular Probes&nbsp;</td><td>T8880</td><td></td></tr><tr><td>Polystereen telbeads (7 &micro;m)</td><td>Bangs laboratories</td><td>PS06N/6994</td><td></td></tr><tr><td>Polypropyleen FACS buizen</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>1 ml pipet</td><td>Fisher</td><td>13-678-11B</td><td></td></tr><tr><td>5 ml pipet</td><td>Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>25 ml pipet</td><td>Ultident</td><td>DL-357551</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml conische polypropyleen microbuis</td><td>Sarstedt</td><td>72.690</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conische polypropyleenbuis</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conische polypropyleenbuis</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.205</td><td></td></tr><tr><td>50 ml hoge snelheid polypropyleen copolymer buis</td><td>Nalgene</td><td>3119-0050</td><td></td></tr><tr><td>250 ml hoge snelheid polypropyleen fles</td><td>Beckman</td><td>356011</td><td></td></tr><tr><td>Proteïne assay (Bradford assay)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Proteïne assay standaard II</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>500-0007</td><td></td></tr><tr><td>Testbuis 16 x 100</td><td>VWR</td><td>47729-576</td><td></td></tr><tr><td>Testbuis 12 x 75</td><td>Ultident</td><td>170-14100005B</td><td></td></tr><tr><td>Cell incubator&nbsp;</td><td>Mandel</td><td>Heracell 150</td><td></td></tr><tr><td>Laagsnelheids centrifuge</td><td>IEC</td><td>Centra8R</td><td></td></tr><tr><td>Hoge snelheids centrifuge</td><td>Beckman</td><td>Avanti J8</td><td></td></tr><tr><td>Hoge snelheids rotor voor 250ml fles</td><td>Beckman</td><td>JLA16.250</td><td></td></tr><tr><td>Hoge snelheids rotor voor 50ml buis</td><td>Beckman</td><td>JA30.50</td><td></td></tr><tr><td>Fow cytometry&nbsp;</td><td>BD Bio-sciences</td><td>FACS Calibur</td><td></td></tr><tr><td>Spectrofotometer</td><td>Beckman</td><td>Series 600</td><td></td></tr><tr><td>Bronchiaal weefsel explanten en secties&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 muizen (5-7 weken oud)&nbsp;&nbsp;</td><td>Charles River Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse Airway PrimaCell&trade; System:</td><td>CHI Scientific, Inc.</td><td>2-82001</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Rib-Back Carbon Steel Scalpel Bladen</td><td>Becton Dickinson AcuteCare</td><td>371310</td><td>#10</td></tr><tr><td>Scalpel Handvat</td><td>Fine Science Tools Inc.&nbsp;</td><td>10003-12</td><td>#7</td></tr><tr><td>fasecontrast omgekeerde microscoop</td><td>Olympus Optical CO., LTD.&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>CK2</td><td></td></tr><tr><td>hoog O2 gas mengsel&nbsp;</td><td>VitalAire Canada Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>modulaire incubator kamer</td><td>Billups-Rothenberg Inc.</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 4000 geïncubeerde orbitale shaker</td><td>Barnstead Lab-Line,&nbsp;</td><td>SHKA4000-7</td><td></td></tr><tr><td>12-wells weefsel kweekplaat</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof weefsel kweek schalen (100 mm)</td><td>Sarstedt, Inc.</td><td>83.1802</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische schaar</td><td>Fine Science Tools Inc.&nbsp;</td><td>14060-09</td><td>Recht, scherp, 9cm lang</td></tr><tr><td>Halfgebogen Graefe pincet</td><td>Fine Science Tools Inc.&nbsp;</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>bevochtigde CO2 incubator</td><td>Mandel Scientific Company Inc.&nbsp;</td><td>SVH-51023421</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Histopathologisch onderzoek&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>formaline formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td>HT5011</td><td></td></tr><tr><td>paraffine</td><td>Fisher scientific&nbsp; International, Inc.</td><td>T555</td><td></td></tr><tr><td>ethyl alcohol</td><td>Merck KGaA, Darmstadt</td><td>EX0278-1</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;glutaraldehyde&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td>G6403</td><td></td></tr><tr><td>Cacodylate</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td>31533</td><td></td></tr><tr><td>microscoopglazen</td><td>VWR Scientific Inc.&nbsp;</td><td>48300-025</td><td>25x75 mm</td></tr><tr><td>Xyleen</td><td>Fisher scientific&nbsp; International, Inc.</td><td>X5-4</td><td></td></tr><tr><td>Mayer's hematoxyline</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td>MHS16</td><td>Trechter met filterpapier&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>HCl&nbsp;</td><td>Fisher scientific&nbsp; International, Inc.&nbsp;&nbsp;</td><td>A144s-500</td><td></td></tr><tr><td>eosine&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td>HT110116</td><td>Trechter met filterpapier&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Permount&trade; Montage Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.&nbsp;</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>glasdeksel</td><td>surgipath medical industries, Inc.</td><td>84503</td><td>24&times;24&nbsp;#1&nbsp;</td></tr><tr><td>TUNEL detectie kit</td><td>In Situ Cell Death Detection, POD</td><td>11 684 817 910</td><td></td></tr><tr><td>oven</td><td>Despatch Industries Inc.</td><td>LEB-1-20</td><td></td></tr><tr><td>roterende Microtome</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td>RM2145</td><td></td></tr><tr><td>filterpapier</td><td>Whatman International Ltd.</td><td>1003150</td><td>#3</td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Nikon Imaging Japan Inc.</td><td>E800</td><td></td></tr><tr><td>kleuring s

generatie lymfatische micropartikels en detectie van hun proapoptotische effect op epitheelcellen

Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells

De belangstelling voor de biologische rol van cel-membraan afgeleide blaasjes in cel-cel communicatie is de afgelopen jaren toegenomen. Microdeeltjes (MPs) zijn een dergelijk type van vesicles, variërend in diameter van 0,1 urn tot 1 urn, en kenmerkend schuur van het plasmamembraan van eukaryote cellen die activering of apoptose. Hier beschrijven we de generering van T-lymfocyten afkomstige microdeeltjes (LMPs) van apoptotische CEM T-cellen gestimuleerd met actinomycine D. LMPs worden geïsoleerd door een meerstaps proces differentiële centrifugatie en gekarakteriseerd met behulp van flowcytometrie. Het protocol stelt ook een in situ celdood detectiemethode voor aantonen van de pro-apoptotische effect van LMPs op bronchiale epitheelcellen afkomstig uit muizen primaire luchtwegen bronchiale weefselexplantaten. Hierin beschreven werkwijzen verschaffen een reproduceerbare werkwijze voor het isoleren overvloedige hoeveelheden LMPs van apoptotische lymfocyten in vitro. LMPs afgeleidop deze wijze kan worden gebruikt om de kenmerken van diverse ziektemodellen evalueren en farmacologie en toxicologie getest. Aangezien het luchtwegepitheel biedt een beschermende fysieke en functionele barrière tussen de buitenomgeving en het onderliggende weefsel, gebruik van bronchiale weefselexplantaten plaats geïmmortaliseerde epitheliale cellijnen een effectief model voor het onderzoek ter luchtwegen luchtwegweefsel.

LMPs werden gekenmerkt met annexine V-kleuring 10 door fluorescentie-geactiveerde cel sortering (FACS) analyse en gated met behulp van 1 micrometer kralen, waarin 97% van de parlementsleden (≤1 micrometer) waren annexine-V-Cy5 positief (figuur 1A en 1B). Typisch, ongeveer 2,5 mg LMPs werden verkregen na dit protocol. Bronchiale weefselexplantaten van C57BL / 6 muizen werden blootgesteld aan het voertuig en LMPs behandeling. Histopathologische analyse van bronchiale secties toonde het effect v...

Celhuid werpen microdeeltjes (MPs) actief biologische blaasjes die kunnen worden geïsoleerd en de pathofysiologische effecten onderzocht in verschillende modellen. Hier beschrijven we een werkwijze voor het genereren MPs afgeleid van T-lymfocyten (LMPs) en voor het aantonen van hun pro-apoptotische effect op epitheelcellen.

Generatie Lymfatische micropartikels en Detectie van hun proapoptotische Effect op epitheelcellen

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles ...

Het algemene doel van deze procedure is om de in vitro productie van lymfocytische micropartikels of LMP's uit een T-lymfocytcellijn te illustreren, en hun pro-apoptotische effect op luchtwegepitheelcellen aan te tonen. Dit wordt bereikt door eerst de LMP's te produceren. Vervolgens worden de geïsoleerde LMP's gekarakteriseerd via fax-analyse.Vervolgens worden de explantaten van het bronchiale weefsel gekweekt. Ten slotte wordt de LMP-behandeling op de bronchiale explantaten uitgevoerd. Uiteindelijk worden histopathologische onderzoeken, zoals hematoxyline, eosine en NC-detectie van celdood, gebruikt om aan te tonen dat LMP schade aan de bronchiale epitheellaag en apoptose van epitheelcellen induceert.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de isolatie van micropartikels uit menselijk perifeer bloed, is dat we in staat zijn om op grote schaal micropartikels afgeleid van een cellijn in vitro te genereren. Over het algemeen zullen personen die onbekend zijn met deze methode moeite hebben, omdat de kritieke stappen van de bronchiale explantaatcultuur niet eenvoudig voor te bereiden zijn. Om de cultuur te starten.Breng CEMT-cellen aan in

generation-lymphocytic-microparticles-detection-their-proapoptotic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Hierin beschrijven we protocollen voor het oogsten van muizen-alveolaire macrofagen, die aangeboren immuunsysteem cellen woonachtig zijn in de longen, en de behandeling van hun activering in reactie op de co-cultuur met polyanhydride nanodeeltjes.

Oogsten Murine alveolaire macrofagen en evalueren van cellulaire activatie geïnduceerd door polyanhydride Nanodeeltjes

This video demonstrates the generation and isolation of T lymphocyte-derived microparticles, LMPs, from T lymphocytes following treatment with actinomycin-D.

Isolation of Microparticles Derived from Apoptotic T Lymphocytes In Vitro

This video demonstrates a method to induce apoptosis in the Jurkat cells — a human T lymphocyte leukemia cell line. The cells are exposed to ultraviolet C (UVC) radiation, which causes extensive DNA damage and leads to apoptotic cell death.

An In Vitro Technique for UV Irradiation-Mediated Generation of Apoptotic T Cells

We beschrijven een werkwijze voor het precisie-cut Lung Schijfjes (PCLS) en immunokleuring ze naar de lokalisatie van diverse immuun celsoorten te visualiseren in de longen. Ons protocol kan worden uitgebreid tot de locatie en de functie van vele verschillende celtypen te visualiseren onder verschillende omstandigheden.

Precisie-cut Mouse Lung Slices Live Pulmonary visualiseren van dendritische cellen

Nieuwe protocollen worden hier beschreven om te isoleren en karakteriseren van deeltjes afgeleid van mens en muis neutrofiele granulocyten. Deze protocollen gebruiken ultracentrifugatie en stroom cytometry immunoblotting technieken voor het analyseren van microparticle inhoud, en ze kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van de rol van deeltjes afgeleid van verschillende celtypes in cellulaire functie.

Isolatie en karakterisatie van neutrofiele afkomstige deeltjes voor functionele Studies

De hier ingevoerde protocol kunnen karakterisering van de homing longcapaciteit van primaire menselijke lymfocyten in vivo inflammatoire voorwaarden. Pulmonaire infiltratie van adoptively overgedragen menselijke immune cellen in een muismodel van allergische ontsteking kan worden beeld en gekwantificeerd door licht vel fluorescentie microscopie van chemisch gewiste longweefsel.

Geavanceerde Imaging van longkanker Homing menselijke lymfocyten in een experimenteel In Vivo Model van allergische ontsteking op basis van licht vel microscopie

Dit manuscript beschrijft een protocol om te bepalen of blootstelling aan ozon, een criterium luchtverontreinigende stof, in vivo alveolaire macrofaag-efferocytose belemmert. Dit protocol maakt gebruik van veelgebruikte reagentia en technieken en kan worden aangepast aan meerdere modellen van long letsel om de effecten op alveolaire macrofaag efferocytose te bepalen.

In vivo beoordeling van alveolaire macrofaag Efferocytose na blootstelling aan ozon

Gecombineerde ozon- en bacteriële endotoxine blootgestelde muizen vertonen wijdverspreide celdood, waaronder die van neutrofielen. We zagen cellulaire aanpassingen zoals verstoring van cytoskelet lamellipodie, verhoogde cellulaire expressie van complexe V ATP synthase subeenheid β en angiostatine in broncho-alveolaire lavage, onderdrukking van de immuunrespons van de longen en vertraagde neutrofiele rekrutering.

Visualiseren van long cellulaire aanpassingen tijdens gecombineerde ozon en LPS geïnduceerde murine acute longletsel

Hier wordt een reproduceerbare, betaalbare en robuuste methode gepresenteerd voor de isolatie en uitbreiding van primaire bronchiale epitheelcellen voor biobanking op lange termijn en het genereren van gedifferentieerde epitheelcellen door cultuur op de lucht-vloeistofinterface.

Het isoleren van bronchiale epitheelcellen uit gereseceerd longweefsel voor biobanking en het opzetten van goed gedifferentieerde lucht-vloeistof interfaceculturen

Hier beschrijven we een in vitro model voor het isoleren en differentiëren van luchtwegepitheelcellen van muizen, waarbij we ons richten op hun acclimatisatie aan chronisch sigarettenrookextract (CSE). Het model kan worden gebruikt om de multi-omics-impact van CSE uitgebreid te karakteriseren, wat mogelijk inzicht geeft in de cellulaire reacties onder chronische blootstelling aan rook.

In vitro model voor het bestuderen van differentiatie en veranderingen van multi-omics op muizen luchtwegepitheelcellen gestimuleerd met sigarettenrookextract

Leer de productie van lymfatische micropartikels uit T-lymfocyten en hun proapoptotische effecten op luchtwegepitheelcellen. Deze methode maakt grootschalige in vitro-generatie mogelijk voor immunologisch onderzoek.

Generatie Lymfatische micropartikels en Detectie van hun proapoptotische Effect op epitheelcellen

Meer video's verkennen