Generatie Lymfatische micropartikels en Detectie van hun proapoptotische Effect op epitheelcellen

Het algemene doel van deze procedure is om de in vitro productie van lymfocytaire microdeeltjes of LMP's van een T-lymfocytcellenlijn te illustreren, en om hun pro-apoptotische effect op luchtweg-epitheelcellen aan te tonen. Dit wordt bereikt door eerst de LMP's te produceren. Vervolgens worden de geïsoleerde LMP's gekarakteriseerd door fax-analyse.

Vervolgens worden de bronchiale weefselexplante gekweekt. Ten slotte wordt LMP-behandeling op bronchiale explante uitgevoerd. Uiteindelijk worden histopathologische onderzoeken zoals hemat, toin, en eosine en NC twee celdooddetectie gebruikt om LMP-geïnduceerde beschadiging van de bronchiale epitheellaag en epitheelcel-apoptose aan te tonen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals isolatie van microdeeltjes uit menselijk perifeer bloed is dat we in staat zijn om grootschalige generatie van microdeeltjes afgeleid van een cellijn in vitro uit te voeren. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat kritische stappen van bronchiale explaan-cultuur niet gemakkelijk te bereiden zijn. Om te beginnen met cultiveren.

CEMT-cellen in vier T 1 75 kolven, elk met 150 milliliter vers medium en incuberen bij 37 graden Celsius tot een dichtheid van 2 miljoen cellen per milliliter. Verzamel de cellen uit elke kolf door centrifugatie bij 200 maal G gedurende vijf minuten, en hergebruik 300 maal 10 tot de zes cellen in een nieuwe T 1 75 kolf met 150 milliliter vers medium. Om de dichtheid van 2 miljoen cellen per milliliter te handhaven, voeg 37,5 microliter actinemycine D toe aan het medium met een uiteindelijke concentratie van 0,5 microgram per milliliter en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur.

Breng al het kweekmedium over in 50 milliliter conische buisjes, en centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 750 maal G. Breng vervolgens het supernatant over in 50 milliliter conische buisjes en centrifugeer bij 1500 maal G gedurende 15 minuten om grote celfragmenten te verwijderen. Breng vervolgens het supernatant over in een 250 milliliter fles en ultracentrifugeer bij 12.000 maal G gedurende 50 minuten.

Gooi vervolgens het supernatant weg en verzamel de pellets. Gebruik 40 milliliter steriel PBS om de LMP-verrijkte pellets in een 50 milliliter buisje te wassen en centrifugeer gedurende 50 minuten bij 12.000 maal G. Herhaal deze stap tweemaal.

Verzamel het supernatant van de laatste was om als vehikelcontrole te worden gebruikt met één milliliter PBS. Suspendeer de pellets en breng over in een 1,5 milliliter steriele microbuisje aliquot en bewaar geïsoleerde LMP's bij negatief 80 graden Celsius. Om microdeeltjes te karakteriseren door fax-analyse, begin met het bereiden van twee monsters van een nexine-buffer, één met calciumchloride en één zonder calcium.

In een faxbuisje, verdun één microliter LMP's in 44 microliters van een nexine-buffer met calciumchloride. Bereid een andere buisje met een nexine-buffer zonder calciumchloride. Voeg vervolgens vijf microliters van een X en V sci vi toe aan elk buisje en meng goed. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.

Na de incubatie, gebruik 400 microliters fax flu sheath vloeistof. Om de reacties te stoppen, voeg 10 microliters van zeven micron tellende kralen suspensie toe als interne standaard in elk buisje. Om een absolute telling te verkrijgen, stel vaste poorten van relatieve grootte, FSCH en relatieve granulariteit SSCH en dot plot op de flowcytometer.

Gebruik gekalibreerd fluorescerende kralen van één micrometer voor poort één en tellende kralen bij zeven micrometer. Voor poort twee, analyseer het LMP-monster op een F-S-C-H-S-S-C-H plot met behulp van de vastgestelde poorten en FL vier kanaal voor de annexine dot plot door een signaal te verwerven totdat 10.000 tellende kralen in poort twee zijn bereikt, bepaal de positieve in ex NV-gebeurtenissen van LMP's in nexine-buffer met calciumchloride en trek de gebeurtenissen van LMP's in nexine-buffer zonder calciumchloride af. Bereken het absolute aantal LMP's op basis van de volgende vergelijking.

Gebruik scalpel dumont superfijne pincetten en chirurgische schaar om asseptisch longweefsel te dissecteren. Verwijder voorzichtig het parenchym en de bloedvaten. Dissecteer verder de bronchus ondergedompeld in het weefselwasmedium en scheid de bronchus met een diameter van één tot 2,5 millimeter van perifere longweefsels.

Gebruik een scalpel om bronchiale weefsels in ongeveer vijf millimeter dikke bronchiale rangen te snijden met een schouwende beweging met de steriele gebogen microdissectiepincetten. Neem de bronchiale fragmenten op en plaats ze op de gekraste gebieden van eerder voorbereide schotels. Volgens het tekstprotocol, verwijder het weefselwasmedium en incubeer fragmenten bij kamertemperatuur gedurende ongeveer vijf minuten om ze te laten hechten aan de schotels.

Voeg 10 milliliter compleet genezingsmedium toe aan elke schotel en plaats ze in een gecontroleerde atmosfeer modulair incubatorkamer met een hoog zuurstofgasmengsel, spoel de kamer, plaats het dan in een orbitale tafelincubator en schud het bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur bij 10 cycli per minuut om het medium te laten intermitteert over de fragmenten stromen. Na de incubatie, observeer de weefselexplaan onder een fasecontrast- en omgekeerde lichtmicroscoop. Selecteer bronchiale explaan met volledige fijne haarbeweging en levendig bronchiaal epitheel voor volgende LMP-behandeling.

Om LMP's te behandelen, tel de net geselecteerde bronchiale explaan en markeer elke put van een 12 putten weefselcultuurplaat. Voor elke explaan breng 0,5 milliliter compleet groeimedium over in een steriele einorbuis. Voeg vervolgens 25 microliters van l en p stock toe per behandelingsexplaan of voeg 25 microliters van controle vehikel toe.

Voor de controleexplaan, meng goed door zachtjes op de buis te tikken. Breng het gemengde medium over in elke put van een gemarkeerde 12 putten weefselcultuurplaat met gebogen