Name: Geperforeerde Patch-clamp-opname van de muis olfactorische sensorische neuronen in Intact neuroepithelium: functionele analyse van neuronen uiten van een geïdentificeerd Odorant Receptor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Leer de perforated patch-clamp-techniek om membraaneigenschappen van olfactorische sensorische neuronen te meten in intact neuroepithelium van muizen. Deze methode karakteriseert functionele eigenschappen van OSN's op membraanniveau.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Peter Mombaerts bedanken voor de genereuze gift van OR-GFP muizen; Anne Lefranc en de CSGA dierenfaciliteit voor uitstekende dierenverzorging. Financiering werd verstrekt door CNRS via een ATIP en ATIP Plus-subsidie, door Conseil Régional de Bourgogne (FABER en PARI-subsidies), door Université de Bourgogne (BQR-programma).

Dit protocol volgt het dier zorg richtlijnen van de Université de Bourgogne en werd goedgekeurd door de Université de Bourgogne ethische commissie. 1. Dieren <ol><li> Gebruik genetisch gemanipuleerde OR-IRES-tauGFP muizen verkrijgbaar bij de Jackson Laboratory. Deze muizen werden ontwikkeld Dr. Peter Mombaerts &#39;laboratorium teneinde axon targeting en ontwikkeling van het olfactorische systeem 19 te analyseren. Bijvoorbeeld, de MOR23-IRES-tauGFP lijn, stock nummer 006.643, draagt ​​de officiële stamnaam B6; 129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ; Ook de SR1-IRES-tauGFP lijn, stock nummer 6717 draagt ​​de officiële naam B6; 129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJ. </li><li> Met betrekking tot de leeftijd van de dieren: voor een beter resultaat van het protocol, dieren worden gebruikt tussen 2 en 4 weken. In deze leeftijdsgroep, de dissectie is makkelijker (zachtere botten, steviger reukepitheel) en de dendritische knoppen zijn bigger vergelijken oudere dieren. </li></ol> 2. Voorbereiding van de elektroden en oplossingen <ol><li> Voor de stimulerende pipetten: aankoop prepulled stimulerende pipetten. Anders handmatig te bereiden. <ol><li> Met behulp van een vlam, buig zes 1 mm glazen pipetten op ongeveer 1 cm van de punt. Plaats deze zes pipetten plus een straight 7 e in 1,5 cm krimpslang te versterken door een oogje. </li><li> Warmte krimpen de slang aan op de vaten met elkaar verbonden te houden. Bevestig een extra warmte-krimpkous aan het andere uiteinde van de vaten. Trek deze stimulerende pipet met een multi-barrel puller. </li><li> Voeg wat witte vloeistof lijm rond het oogje aan de gebogen tips versterken. Laten drogen O / N. </li></ol></li><li> Bereid 1 of 2 L normale Ringer&#39;s extracellulaire oplossing (in mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO 4 1,3, CaCl2 2, NaHCO 3 26, NaH 2 PO 4 1,25, glucose 15, pH 7,6 en 305 mOsm). Houd bij 4 ° Ctot gebruik. </li><li> Bereid intracellulaire voorraadoplossing (in mM) KCl 70, KOH 53, methaansulfonzuur 30, EGTA 5, HEPES 10, 70 sucrose; pH 7,2 (KOH) en 310 mOsm. Bewaar bij 4 ° C tot gebruik. Goed voor enkele weken. </li><li> Bereid intracellulaire opname oplossing met nystatine ex tempore (op het laatste moment) alvorens experiment. <ol><li> Weeg 3 mg nystatine, voeg 50 pl DMSO; vortex 20 sec dan ultrasone trillingen 2-3 min tot volledig verwaterd. </li><li> Voeg 20 pl DMSO-nystatine oplossing in 5 ml intracellulaire voorraadoplossing. Vortex 20 sec, dan ultrasone trillingen 3 min. Bewaar deze oplossing bij 4 ° C en beschermen tegen direct licht, nystatine is lichtgevoelig. Deze oplossing kan gedurende enkele uren. Vervang elke dag. </li><li> Zodra de reukepitheel preparaat onder de microscoop, neemt een deel van deze oplossing in een 1 ml spuit met een vlam langwerpige gele punt aan de elektroden te vullen; beschermen tegen direct licht. Eenmaal bij kamertemperatuur, de oplossing nystatineniet stabiel; vervang de oplossing in de 1 ml elk uur spuit of houdt het in ijs. </li></ol></li><li> Trek de opname elektroden met een trekker te lange nek en een kleine tip (~ 2 micrometer) te verkrijgen met een weerstand van 15-20 MQ met de interne nystatine-oplossing. </li><li> Bereid geurstof oplossing 0,5 M in DMSO onder zuurkast; aliquot en bewaar bij -20 ° C tot gebruik. Verdun geurstof in Ringer&#39;s oplossing tot de gewenste concentratie. Vul de stimulerende pipet. </li></ol> 3. Bereiding van reukepitheel Opmerking: OR-IRES-tauGFP muizen drukken de tauGFP onder de controle van de OR promoter. In deze muizen worden alle neuronen uiting van de OR plaats gelabeld met GFP. Dit protocol is aangepast voor UPR uitgedrukt in alle zones. Echter, dissecties en opnames zijn gemakkelijker voor de ultraperifere regio&#39;s, uitgedrukt in de dorsale zone. <ol><li> Verdoven het dier door injectie van een mengsel van ketamine en xylazine (150 mg / kg en 10 mg / kg bodgewichtspercenten, respectievelijk). Onthoofding kunnen worden uitgevoerd met een scherpe schaar voor jonge muizen of met een goed onderhouden knaagdier guillotine voor oudere muizen. <ol><li> Met behulp ring ontleden schaar maken een longitudinale mediale incisie door de dorsale huid. Verwijder de huid van elkaar te trekken. Met behulp van de schaar, knip de onderkaak aan de kaak gewricht. Verwijder de bovenste voortanden door een coronale snede evenwijdig met de tanden. </li><li> Voeg een coronale snede van de kop achter de ogen en houdt slechts het voorste deel van de weg. Dompelen in ijskoude Ringer oplossing voor ontleding onder het toepassingsgebied. </li></ol></li><li> Ontleden onder de scope: in de buikzijde, maak een longitudinale snede langs de bovenkaak / de tanden. Snijd de dorsale bot in lengterichting, na de dorso-laterale zijde van de neusholte. Verwijder de meeste botten en gehemelte; breng het septum en het epitheel verbonden in Ringer geoxygeneerde bij kamertemperatuur. </li><li> Voor de finale dissectie: Vlak voor het begin van de opnamesessie, afpellen het epitheel van de onderliggende septum met een tang. Maak het epitheel met een pincet en twee 4-5 mm schaar sneden (gebruik microvannas scharen) en het voorste deel van het septum, waar de hechting is sterker. <ol><li> Verwijder de vomeronasal orgel zorgvuldig door te snijden het uit langs de dorsale verbinding met de septale epitheel. Breng de epitheel naar een opname kamer met de slijmlaag naar boven; flat in de kamer met een harp houden. </li></ol></li><li> Installeer kamer onder een rechtopstaande microscoop uitgerust met fluorescentie optiek en een gevoelige camera. Visualiseer de voorbereiding op het computerscherm bij een hoge vergrotingsfactor door een 40X water-immersie objectief (numerieke opening 0,8) en een extra 2X of 4X vergroting bereikt door een vergrootglas. Perfuseren continu met zuurstofrijk Ringer bij RT (1-2 ml / min). </li></ol> 4. Opname Session <ol><li> Zoeken naar fluorescerende cel: prikkelen de voorbereiding op 480nm voor EGFP, die licht in het 530-550 nm uitzendt; richten een dendritische knop die betrouwbaar zichtbaar in fluorescentie en onder felle veld. </li><li> Vul elektrode met intracellulaire oplossing nystatine; Verwijder luchtbellen door voorzichtig te tikken op de elektrode. </li><li> Plaats elektrode op elektrodehouder, overdruk in de pipet toe te passen; Weerstand moet 15-20 MQ zijn. </li><li> Breng elektrode nabij de cel; eens weerstand bereikt ~ 40 MQ, laat positieve druk en toe te passen lichte onderdruk een gigaseal bereiken. </li><li> Zodra afdichting is bereikt, stelt de membraanpotentiaal op ongeveer -75 mV; </li><li> Wanneer de cel wordt geopend, verder met stimulatieprotocollen, farmacologische behandelingen. Om de respons op één geurstof stimulatie, verslag 200-500 msec van spontane activiteit meten stimuleren van 500 msec en de respons van de cel tot 10 sec 13. Voor farmacologische behandelingen, perfuseren de farmacologische middelen bijde gewenste concentratie 20. </li></ol> 5. Data Analysis <ol><li> Analyseer stromen opgewekt door stimulatie geurstof als volgt: de maximale amplitude, de opkomst-tijd (tijd die nodig is om 90% van de maximum amplitude bereikt, in msec), de totale stroom (oppervlak onder de curve in Pas), het tijdstip 50% (tijd tussen de aanvang en de offset van de responsie op 50% van de maximum amplitude, in msec). <ol><li> Met behulp van de piek transductie stromingen (maximale amplitude bereikt) bij verschillende concentraties, tekenen en past een dosis-respons curve met behulp van de Hill vergelijking: I = Imax / (1 ​​+ (K 1/2 / C) n), waar ik vertegenwoordigt de piekstroom , imax de maximale respons in verzadigende concentraties, K1 / 2 de concentratie waarbij de helft van de maximale respons werd bereikt, C de concentratie geurstof en n de Hill-coëfficiënt. </li></ol></li><li> Analyseer opnames van membraanpotentiaal in de huidige klem voor de maximale depolarisatie, de total potentiaal opgewekt (oppervlakte onder de curve in mVsec); opnemen spontane spiking activiteit meer dan 30 sec tot 1 min opnamen; opnemen prikkelbaarheid door de spikes uitgelokt door injectie van stromingen (5-10 jaar). </li></ol>

<ol><li>Lowe, G., Gold, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+amplification+by+calcium-dependent+chloride+channels+in+olfactory+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nonlinear amplification by calcium-dependent chloride channels in olfactory receptor cells.</a> Nature. 366 (6452), 283-286 (1993).</li>
<li>Ponissery Saidu, S., Dibattista, M., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-induced+responses+recorded+from+olfactory+receptor+neurons+using+the+suction+pipette+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique.</a> J Vis Exp. (62), e3862(2012).</li>
<li>Moss, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+and+biochemical+responses+of+mouse+vomeronasal+receptor+cells+to+urine-derived+compounds%3A+possible+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological and biochemical responses of mouse vomeronasal receptor cells to urine-derived compounds: possible mechanism of action.</a> Chem Senses. 23 (4), 483-489 (1998).</li>
<li>Kaur, A., Dey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+calcium+imaging+of+dissociated+vomeronasal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Live cell calcium imaging of dissociated vomeronasal neurons.</a> Methods Mol Biol. 1068, 189-200 (2013).</li>
<li>Ma, M., Chen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+rat+and+mouse+olfactory+receptor+neurons+from+an+intact+epithelial+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation.</a> J Neurosci Methods. 92 (1-2), 31-40 (1999).</li>
<li>Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors%3A+a+molecular+basis+for+odor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65 (1), 175-187 (1991).</li>
<li>Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+receptor+expression+defines+functional+units+in+the+mouse+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system.</a> J Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).</li>
<li>Bozza, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+class+I+and+class+II+odorant+receptors+to+glomerular+domains+by+two+distinct+types+of+olfactory+sensory+neurons+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mapping of class I and class II odorant receptors to glomerular domains by two distinct types of olfactory sensory neurons in the mouse.</a> Neuron. 61 (2), 220-233 (2009).</li>
<li>Vassalli, A., Rothman, A., Feinstein, P., Zapotocky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minigenes+impart+odorant+receptor-specific+axon+guidance+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Minigenes impart odorant receptor-specific axon guidance in the olfactory bulb.</a> Neuron. 35 (4), 681-696 (2002).</li>
<li>Feinstein, P., Bozza, T., Rodriguez, I., Vassalli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+guidance+of+mouse+olfactory+sensory+neurons+by+odorant+receptors+and+the+beta2+adrenergic+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Axon guidance of mouse olfactory sensory neurons by odorant receptors and the beta2 adrenergic receptor.</a> Cell. 117 (6), 833-846 (2004).</li>
<li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+ligands+for+odorant%2C+vomeronasal+and+taste+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).</li>
<li>Grosmaitre, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SR1%2C+a+mouse+odorant+receptor+with+an+unusually+broad+response+profile%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SR1, a mouse odorant receptor with an unusually broad response profile.</a> J Neurosci. 29 (46), 14545-14552 (2009).</li>
<li>Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+responses+of+olfactory+sensory+neurons+expressing+the+odorant+receptor+MOR23%3A+a+patch+clamp+analysis+in+gene-targeted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1970-1975 (2006).</li>
<li>Lam, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+responsiveness+of+embryonic+mouse+olfactory+sensory+neurons+expressing+the+odorant+receptors+S1+or+MOR23%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odorant responsiveness of embryonic mouse olfactory sensory neurons expressing the odorant receptors S1 or MOR23.</a> Eur J Neurosci. 38 (2), 2210-2217 (2013).</li>
<li>Zhang, J., Huang, G., Dewan, A., Feinstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+stimulus+specificity+and+glomerular+position+in+the+mouse+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Uncoupling stimulus specificity and glomerular position in the mouse olfactory system.</a> Mol Cell Neurosci. 51 (3-4), 79-88 (2012).</li>
<li>Zhang, J., Pacifico, R., Cawley, D., Feinstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+detection+of+amines+by+a+trace+amine-associated+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive detection of amines by a trace amine-associated receptor.</a> J Neurosci. 33 (7), 3228-3239 (2013).</li>
<li>Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+patterns+of+odorant+receptors+and+response+properties+of+olfactory+sensory+neurons+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice.</a> Chem Senses. 34 (8), 695-703 (2009).</li>
<li>Cadiou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+odorant+exposure+induces+peripheral+olfactory+plasticity+at+the+cellular+level%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Postnatal odorant exposure induces peripheral olfactory plasticity at the cellular level.</a> J Neurosci. 34 (14), 4857-4870 (2014).</li>
<li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+wiring+in+the+mouse+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal wiring in the mouse olfactory system.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 713-737 (2006).</li>
<li>Grosmaitre, X., Santarelli, L. C., Tan, J., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+functions+of+mammalian+olfactory+sensory+neurons+as+odor+detectors+and+mechanical+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dual functions of mammalian olfactory sensory neurons as odor detectors and mechanical sensors.</a> Nat Neurosci. 10 (3), 348-354 (2007).</li>
<li>Duchamp-Viret, P., Chaput, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+response+properties+of+rat+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Odor response properties of rat olfactory receptor neurons.</a> Science. 284 (5423), 2171-2174 (1999).</li>
<li>Heydel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-binding+proteins+and+xenobiotic+metabolizing+enzymes%3A+implications+in+olfactory+perireceptor+events%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Odorant-binding proteins and xenobiotic metabolizing enzymes: implications in olfactory perireceptor events.</a> Anat Rec (Hoboken). 296 (9), 1333-1345 (2013).</li>
<li>Pelosi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perireceptor+events+in+olfaction%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Perireceptor events in olfaction).</a> J Neurobiol. 30 (1), 3-19 (1996).</li>
<li>Spehr, M., Wetzel, C. H., Hatt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-phosphoinositides+modulate+cyclic+nucleotide+signaling+in+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">3-phosphoinositides modulate cyclic nucleotide signaling in olfactory receptor neurons.</a> Neuron. 33, 731-739 (2002).</li>
<li>Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+adenylyl+cyclase+inhibits+olfactory+generator+currents+induced+by+%27IP%283%29-odors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by 'IP(3)-odors.</a> J Neurophysiol. 84 (1), 575-580 (2000).</li>
<li>Savigner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+spontaneous+and+odorant-evoked+activity+of+rat+olfactory+sensory+neurons+by+two+anorectic+peptides%2C+insulin+and+leptin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Modulation of spontaneous and odorant-evoked activity of rat olfactory sensory neurons by two anorectic peptides, insulin and leptin.</a> J Neurophysiol. 101 (6), 2898-2906 (2009).</li>
<li>Ukhanov, K., Brunert, D., Corey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide+3-kinase-dependent+antagonism+in+mammalian+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide 3-kinase-dependent antagonism in mammalian olfactory receptor neurons.</a> J Neurosci. 31 (1), 273-280 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Het vermogen van dit protocol om de eigenschappen van een gezonde OSNs correct monitoren sterk afhankelijk van de kwaliteit van de voorbereiding. Daarom zijn de dissectie stappen kritisch. Ten eerste is het essentieel om aandacht te besteden aan de kwaliteit (pH, osmolariteit), zuurstof en temperatuur (ijskoud maar niet ingevroren) van de dissectie medium. Ten tweede moet de manipulatie van het epitheel ontleden gereedschappen zo beperkt mogelijk schade te voorkomen. Tenslotte is het essentieel om een ​​preparaat zo vla...

Olfactorische sensorische neuronen (OSN) vormen de eerste stap van olfactorische waarneming. Gelegen in de olfactorische epithelium langs de neusholte bij knaagdieren, zij de chemische karakterisering van geurstoffen in maatregelen potentialen die via de axon naar de hersenen. Om een ​​beter inzicht olfactorische coderingsmechanismen, moet de transductie en membraaneigenschappen van OSNs karakteriseren. Tot voor kort waren de meeste van de technieken om de eigenschappen van zoogdier OSNs karakteriseren werden op gedissocieerd OSNs 1-4 uitgevoerd. De dissociatie proces maakt gebruik van verschillende mechanische en chemische (dat wil zeggen, enzymen) processen om de ASN&#39;s te bevrijden uit hun omgeving. Deze werkwijzen leiden tot een lage aantal beschikbare cellen voor opnames. Dit lage aantal kan nog kritischer bij GFP gemerkte cellen. Dissociatie wordt ook de lokale cel-cel interacties tussen ASN&#39;s en andere cellen van de reukepitheel die overleefde kunnen versterkenal en modulatie van eigenschappen OSNs &#39;. Om de dissociatie procedure omzeilen, werd een intact preparaat ontwikkeld 5. Elke OSN drukt een olfactorische receptor (OR) geselecteerd uit een groot multigenfamilie 6. Er zijn ~ 1000 UPR uitgedrukt in de belangrijkste olfactorisch epitheel bij de muis. Vanwege het grote aantal OR in wildtype dieren, de kansen om ASN expressie dezelfde record of zeer laag. Om deze beperkingen te overwinnen, gen gerichte muizen zijn verkrijgbaar waarbij alle OSNs expressie een bepaalde of gelabeld met een fluorescent proteïne 7-9. Deze gelabelde OSNs werden gebruikt om functionele analyse doen in gedissocieerde voorbereidingen 7,10,11 met de eerder genoemde nadelen. Een intacte epitheel voorbereiding 5 van genetisch gelabelde muizen omzeilt daarom deze kwesties. Het laat de controle van de activiteit van OSNs uiten precies gedefinieerde ultraperifere regio&#39;s in een omgeving die zo dicht mogelijk bij in vivo mogelijk. Trouwens, patch-clamp opnames van OSNs ook mogelijk nauwkeurige analyse van de membraan eigenschappen, transductieroute farmacologie, ligand / of interacties. Al deze onderwerpen kunnen nauwelijks worden geanalyseerd met behulp van extracellulaire opnames. We gebruikten deze techniek om de reacties van OSNs uiting van de geurstof receptoren SR1 en MOR23 12,13 bewaken. De haalbaarheid van deze techniek werd bevestigd door andere groepen MOR23 expressie OSNs 14 alsmede andere UPR expressie neuronen 15,16. Het bewaken van een bepaalde populatie OSNs kan leiden tot de analyse van de eigenschappen in ander verband zoals de ontwikkeling 14, verouderen 17, geurstof geïnduceerde plasticiteit 18, en de rol van de wijzigingen van Type de geurstof receptor in geur codering 15. Dit protocol geeft dus een krachtig instrument om het toezicht op de functionele eigenschappen van gedefinieerde OSNs op het membraan niveau.

<table><tbody><tr><td>vibration table with Faraday cage</td><td>TMC</td><td>63-500 SERIES</td><td>vereist : isoleert het opnamesysteem van trillingen veroorzaakt door de omgeving (bewegingen van experimentator, trillingen van apparatuur zoals ventilatoren voor het koelen van computers, enz.); kan ook worden gekocht met een Faraday-kooi, of worden uitgerust met een op maat gemaakte Faraday-kooi; deze kooi wordt aanbevolen om elektrische ruis uit de omgeving te voorkomen</td></tr><tr><td>optics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>rechtopstaande microscoop uitgerust met epifluorescentie; vaste of mobiele standaard, afhankelijk van de voorkeur van de gebruiker</td></tr><tr><td>objectives</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFL40XW</td><td>minstens 2 objectieven vereist: een 4X of 10X voor ruwe benadering van de cel; en een 40X-dompeling op lange afstand, bijvoorbeeld Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3,3 MM</td></tr><tr><td>magnifier</td><td>Olympus</td><td>U-TVCAC</td><td>ABSOLUUT VEREIST: geplaatst in de lichtbaan tussen het objectief en de camera; maakt het mogelijk om het beeld op het scherm te vergroten om precies de knop met de opname-elektrode te bereiken</td></tr><tr><td>camera</td><td>Olympus</td><td>DP72</td><td>een goede camera is vereist om de neuronen in fluorescentie evenals in helder veld te zien; de besturingssoftware is eenvoudig en maakt het mogelijk om foto's te maken en live camerabeelden te doen om de benadering van de elektrode naar de cel te controleren. Een ultragevoelige camera is niet nodig</td></tr><tr><td>filters</td><td>Olympus/Chroma</td><td></td><td>afhankelijk van het fluorescente eiwit dat in de muizen wordt gebruikt; voorbeeld voor GFP: excitatie: BP460-490: emissie: HQ530/50m</td></tr><tr><td>amplifier</td><td>HEKA</td><td>EPC10 USB</td><td>bewaakt de stromingen die door de opname-elektrode stromen en bewaakt ook het spuiten door een TTL-signaal naar de spritzer te sturen; de EPC10-opstelling wordt door een computer bestuurd</td></tr><tr><td>software</td><td>HEKA</td><td>Patchmaster</td><td>bestuurt de versterker tijdens het experiment</td></tr><tr><td>micromanipulator</td><td>Sutter</td><td>MP225</td><td>precisiemanipulator, maakt nauwkeurige bewegingen tot 1/10e van een micrometer mogelijk; dit model is zeer stabiel; vermijd hydraulische manipulatoren die kunnen driften</td></tr><tr><td>electrode puller</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td>met een FT345-B brede trog filament; om opnamepijpjes van ongeveer 2&micro;m diameter te bereiden met een lange punt om de cellen te bereiken; de weerstand moet 15 tot 20Mohm zijn met geperforeerde patch clamp-oplossing</td></tr><tr><td>glass</td><td>Sutter</td><td>BF120-69-10</td><td>in onze opnamevoorwaarden is dit glas ideaal voor opnamepijpjes</td></tr><tr><td>recording chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26G</td><td>een kamer is nodig om de voorbereiding onder de microscoop te plaatsen. Om de voorbereiding in het midden van de kamer te houden, moet een net/anker worden gebruikt.</td></tr><tr><td>stimulation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glass</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td>bij groepen van 7 bevestigd, deze pipetten worden gebruikt om voorgespannen stimulerende pipetten te bereiden</td></tr><tr><td>multibarrel puller</td><td>MDI</td><td>PMP-107-Z</td><td>door associatie van trekken en draaien, laat deze puller ons toe om spuitelektroden met 7 vaten voor te bereiden</td></tr><tr><td>precision pressure injector</td><td>Toohey Company</td><td>P/N T25-1-900 Single Channel</td><td>deze precisiedrukinjector controleert de druk die in de multibarrel puller wordt uitgestoten; wordt handmatig of door de versterker bestuurd door een 5V TTLs</td></tr><tr><td>micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>YOU-1</td><td>een grove manipulator is voldoende om de spuitelektrode dicht bij de opnameplaats te brengen</td></tr><tr><td>tubings</td><td>N/A</td><td></td><td>tygon-buizen om de druk van de spuit naar de spuitpijp te brengen</td></tr><tr><td>solutions/perfusion/chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vacuum pump</td><td>gardner denver</td><td>300 series</td><td>een trilmembranepomp is stiller en efficiënter dan andere soorten pompen</td></tr><tr><td>perfusion system</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>zwaartekrachtperfusiesysteem met polyethyleenbuizen om de externe oplossing in en uit de opnamekamer te brengen</td></tr><tr><td>nystatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3503</td><td>verplicht om de interne oplossing voor geperforeerde patch clamp te bereiden</td></tr><tr><td>DIMETHYL SULFOXIDE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td>gebruikt om nystatine op te lossen voor interne oplossing voor geperforeerde patch</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td>extracellulaire oplossing</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td>intracellulaire/extracellulaire oplossing</td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td>extracellulaire oplossing</td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>extracellulaire oplossing</td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63140</td><td>extracellulaire oplossing</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>extracellulaire oplossing</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>extracellulaire oplossing</td></tr><tr><td>EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&prime;,N&prime;-tetraacetic acid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td>interne oplossing</td></tr><tr><td>Potassium hydroxyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1767</td><td>interne oplossing</td></tr><tr><td>Methyl Sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W387509</td><td>intracellulaire oplossing</td></tr><tr><td>Hepes-Na</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7006</td><td>intracellulaire oplossing</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>intracellulaire oplossing</td></tr></tbody></table>

geperforeerde patch-clamp-opname van de muis olfactorische sensorische neuronen in intact neuroepithelium: functionele analyse van neuronen uiten van een geïdentificeerd odorant receptor

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Het analyseren van de fysiologische reacties van olfactorische sensorische neuronen (OSN) wanneer gestimuleerd met specifieke liganden is van cruciaal belang om de basis van olfactorische-gedreven gedrag en hun modulatie begrijpen. Deze coderende eigenschappen hangen sterk af van de initiële interactie tussen geurmoleculen en de olfactorische receptor (OR) uitgedrukt in de ASN. De identiteit, specificiteit en ligand spectrum van de uitgedrukt of zijn kritisch. De kans op het ligand van de OR uitgesproken vinden in een OSN binnen het epitheel willekeurig gekozen is zeer laag. Om deze uitdaging aan te pakken, dit protocol maakt gebruik van genetisch gelabelde muizen die het fluorescente eiwit GFP onder de controle van de promotor van gedefinieerde ultraperifere regio&#39;s. OSNs wordt in een strakke en georganiseerde epitheel langs de neusholte met naburige cellen hun rijping en functie beïnvloeden. Hier wordt een methode beschrijven we een intacte reukepitheel te isoleren en op te nemen door middel van patch-clamp opnames van de eigenschappen van OSNs expressing gedefinieerd geurstof receptoren. Het protocol kan men OSN membraaneigenschappen karakteriseren terwijl de invloed van het naburige weefsel. Analyse van de patch-clamp resultaten levert een exacte kwantificering van ligand / of interacties, transductieroutes en farmacologie, OSNs &#39;codering eigenschappen en hun modulatie op het membraan niveau.

Het resultaat van dit protocol afhankelijk van de kwaliteit van de dissectie. Deze dissectie stappen moeten kort (minder dan 10 tot 15 min) en nauwkeurige (dat wil zeggen, tot schade van het epitheel te voorkomen) zijn. De Figuur 1 illustreert hoe een ideale voorbereiding eruit ziet op verschillende niveaus vergroting. Bij een lage vergroting onder felle gebied van de verschillende celtypen (zoals knoppen van OSNs, ondersteunende cellen) zijn te onderscheiden (figuur 1A). Op he...

Het analyseren van de fysiologische eigenschappen van olfactorische sensorische neuronen kent nog steeds technische beperkingen. Hier registreren we ze door middel van perforated patch-clamp in een intacte voorbereiding van het olfactorische epitheel in gene-targeted muizen. Deze techniek maakt de karakterisering mogelijk van membraaneigenschappen en reacties op specifieke liganden van neuronen die gedefinieerde olfactorische receptoren tot expressie brengen.

Geperforeerde Patch-clamp-opname van de muis olfactorische sensorische neuronen in Intact neuroepithelium: functionele analyse van neuronen uiten van een geïdentificeerd Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Het algemene doel van deze procedure is om veranderingen in de membraaneigenschappen van olfactorische sensorische neuronen te meten als reactie op geurstimuli. Dit wordt bereikt door eerst het olfactorische epitheel te dissekeren en over te brengen naar een perfusiekamer. De tweede stap is het lokaliseren en selecteren van een OSN van belang onder de microscoop.De dendritische knobbel van de gekozen OSN wordt vervolgens via patch-clamp gefixeerd en geanalyseerd terwijl deze wordt gestimuleerd met geurstoffen. Uiteindelijk karakteriseert geperforeerde patch-clamp van OSN dendritische knobbels de functionele eigenschappen van de OSN op membraanniveau. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de olfactie, zoals het registreren van olfactorische sensorische neuronen die gedefinieerde geurreceptoren tot expressie brengen, evenals patch-clamp registraties.Verstrek informatie over de membraaneigenschappen van deze neuronen. Bereid de stimulerende pipetten voor uit glas van één millimeter of koop ze voorgestrokken met een vlam. Buig zes pipetten ongeveer één centimeter vanaf de punt in een hoek van 45 graden.Plaats vervolgens de zes gebogen pipetpunten rond een zevende rechte pipet, waarbij een oogje als gids dient, en wikkel deze in krimpkous. Verwarm de krimpkous aan het andere uiteinde van de pipetten. Breng extra krimpkous aan.Hiermee wordt een stimulerende pipet met zeven kanalen gemaakt. Trek nu de stimulerende pipet met zeven kanalen uit met behulp van een meerkanaals polar puller. Versterk de assemblage na het trekken met wat witte lijm rond het oogje.Laat de lijm vervolgens een nacht drogen voordat de benodigde oplossingen worden toegevoegd. De Nystatine-oplossing moet vers worden bereid vlak voor gebruik. Weeg bij behoefte 3 mg Nystatine af en voeg dit toe aan 50 µL DMSO.Vortex vervolgens het mengsel gedurende 20 seconden. Sonicate daarna het mengsel gedurende twee tot drie minuten om een volledige verdunning te garanderen. Voeg nu 20 µL van het mengsel toe aan vijf milliliter intracellulaire voorraadoplossing.Vortex de mix gedurende 20 seconden, gevolgd door twee tot drie minuten sonicatie. Koel de werkoplossing vervolgens op ijs en bewaar deze lichtafgeschermd. Op deze manier blijft de werkoplossing enkele uren houdbaar.Vul een spuit uitgerust met een microfilm met de werkopleossing. Deze is een uur lang bruikbaar nadat deze is klaargemaakt. Bewaar de gevulde spuit echter op ijs.Trek nu enkele registratie-elektroden met lange halzen en openingen van twee micron. Het doel is om een weerstand van 15 tot 20 mega ohm te verkrijgen zodra ze zijn gevuld met Nystatine-oplossing. Vul tenslotte de stimuleringspipet met geurstof verdund in Ringer-oplossing.Zorg dat er voor dit protocol muizen beschikbaar zijn in de leeftijd van twee tot vier weken. In deze presentatie worden muizen gebruikt die or IRES tau GFP tot expressie brengen door gebruik te maken van or IS tau GFP-muizen. Alle neuronen die de or van belang tot expressie brengen, zullen worden gelabeld met GFP.Deze methode kan worden gebruikt voor of uitgedrukt in alle zones. Echter zullen dissecties en opnames eenvoudiger zijn voor OR's die in de dorsale zone tot expressie komen. Begin met het anesthetiseren en vervolgens het onthoofden van een muis.Het resultaat van dit protocol is afhankelijk van de kwaliteit van de dissectie. Deze dissectiestappen moeten zo kort mogelijk en nauwkeurig zijn. Om de operatie te beginnen, gebruikt u dissectiescharen om een longitudinale snede langs het dorsum te maken.Trek de huid uit elkaar om deze te verwijderen. Snijd vervolgens langs de onderkaak en maak een coronale snede parallel aan de tanden. Verwijder zo de bovenste snijtanden.Maak nu een coronale doorsnede rond de kop, achter de ogen, gooi het posterieure deel van de kop weg en breng het anterieure gedeelte over naar ijskoude Ringer-oplossing. Isoleer nu onder een dissectiemicroscoop het septum binnen vijf tot 10 minuten. Begin met een longitudinale incisie langs de ventrale zijde.Snijd vervolgens de dorsale beenderen longitudinaal langs de dorsolaterale zijde van de neusholte. Verwijder daarna het grootste deel van de beenderen en het palatum. Overbreng het geïsoleerde septum en het vastgehechte epitheel naar een container met gezuursde Ringers-oplossing bij kamertemperatuur.Maak binnen vijf minuten de laatste voorbereidingen voordat u begint met de registratie. De oplossing mag niet te warm zijn, anders zal de preparaat er beschadigd uitzien. Om toegang te krijgen tot het neuro-epitheel voor de registratie.Pel eerst het epitheel van het onderliggende septum met een pincet. Knip vervolgens met micro-Vanna scharen het voorste uiteinde van het septum door om het epitheel los te maken. Verwijder nu voorzichtig het vomeronasale orgaan.Snijd het los op de plek waar het dorsaal is bevestigd. Het geïsoleerde epitheel kan nu naar de registratiekamer worden verplaatst met de slijmzijde naar boven. Gebruik een harp om het weefsel plat te drukken zodra het op zijn plaats ligt.Kamer de kamer vervolgens over naar een rechtopstaande microscoop. Visualiseer het neuro-epitheel onder een 40 x waterimmersie-objectief terwijl het continu wordt geperfundeerd met verse ringersoplossing bij kamertemperatuur. Begin met het zoeken naar de cellen van belang, die in dit geval EGFP tot expressie brengen, waarbij licht van 480 nanometer wordt gebruikt om te scannen naar cellen die licht emitteren in het bereik van 530 tot 550 nanometer.De doelorgaan dendritic knobs en osn moeten, wanneer ze bij 80 tot 160 x onder helderveldverlichting worden bekeken, duidelijk te onderscheiden zijn van de ondersteunende cellen. Vul de elektrode nu met een S statin-oplossing. Tik eventuele luchtbellen die ontstaan eruit en bevestig de elektrode aan de houder.Breng nu enige positieve druk aan. De verwachte weerstand ligt tussen 15 en 20 mega ohm. Breng vervolgens de elektrode naar de cel terwijl de positieve druk gehandhaafd blijft.Wanneer de weerstand stijgt tot ongeveer 40 mega ohm, laat dan de druk los en breng een lichte negatieve druk aan. Als er een giga-seal is gevormd, moet het membraanpotentiaal worden geklemd op ongeveer negatief 75 millivolt. Nu de cel open is, kan er met het experiment worden voortgegaan.Pas stimulatie, protocollen en perfusie met farmacologische behandelingen toe waar nodig om te testen met een enkele geurstof. Registreer 200 tot 500 milliseconden aan spontane activiteit. Dien de geurstof gedurende 500 milliseconden toe en meet vervolgens de responsen gedurende maximaal 10 seconden volgens het beschreven protocol.MOR 23-expresserende neuronen, gelabeld met EGFP, werden gepatcht en gestimuleerd met verschillende concentraties al. In de current clamp-modus is lyal een ligand voor MOR 23. Alternatief werden de cellen gesimuleerd in de voltage clamp-modus.Bij opnames in voltage-clampmodus werden verschillende kenmerken gemonitord. Om de respons te kwantificeren, zoals klassiek in de elektrofysiologie gebeurt met behulp van de maximale amplituderespons, werd de dosis-responscurve uitgezet met de Hill-vergelijking. Deze resultaten geven informatie over de coderingseigenschappen van elke OSN, waaronder de detectiedrempel, de temporele dynamiek, het dynamisch bereik en het verzadigingsniveau.Zodra deze techniek onder de knie is, kan het dissectiegedeelte binnen 10 tot 15 minuten worden voltooid. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u de functionele eigenschappen van olfactorische sensorische neuronen die specifieke geurreceptoren tot expressie brengen in muizen kunt onderzoeken.

perforated-patch-clamp-recording-mouse-olfactory-sensory-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De electroolfactogram (EOG), de opname is een informatieve, gemakkelijk te voeren, en betrouwbare manier te beoordelen olfactorische functie op het niveau van het reukepitheel. Dit protocol beschrijft een recording setup, muis weefsel voorbereiding, het verzamelen van gegevens, en de elementaire data-analyse.

Het analyseren Reacties van Mouse Olfactorische sensorische neuronen Met behulp van de Air-fase Electroolfactogram opnemen

Olfactorische receptor neuronen (ORNs) om te zetten geur signalen eerst in een receptor stroom die op zijn beurt actiepotentialen die worden overgebracht naar de tweede orde neuronen in de bulbus olfactorius triggers. Hier beschrijven we de zuig-pipet techniek om tegelijkertijd op te nemen van de geurstof-geïnduceerde receptor huidige en actiepotentialen van muis ORNs.

Odorant-geïnduceerde responsen Opgenomen van olfactorische receptor neuronen met behulp van de zuignap Pipet Techniek

This video demonstrates electrophysiological recording of olfactory sensory neurons (OSNs) in mice using a perforated patch-clamp technique. The olfactory epithelium, containing OSNs with fluorophore-tagged odor receptors, is isolated from a mouse and secured in a recording chamber. A recording pipette is clamped to the dendritic knob of an OSN, and nystatin within the pipette perforates the membrane to form electrical connectivity with the cell. Finally, another pipette is used to deliver an...

Perforated Patch-Clamp Recording of Olfactory Sensory Neurons in Mice

The protocol video describes establishing a whole-cell patch clamp for electrophysiological recording from the sensory neurons of the vomeronasal organ (VNO) in mice. A coronal VNO slice with fluorescently labeled sensory neurons is placed in a recording setup. A labeled neuron is patched with a recording pipette in a whole-cell configuration for electrophysiological recording in response to chemical stimuli.

Establishing a Whole-Cell Patch Clamp for Electrophysiological Recording from Vomeronasal Sensory Neurons

We tonen variaties van de extracellulaire multi-unit opname techniek om geur-reacties van de consument te karakteriseren in de eerste drie fasen van de ongewervelde olfactorische pad. Deze technieken kunnen gemakkelijk worden aangepast aan ensemble activiteit onderzocht andere neurale systemen.

Multi-unit Opname Methoden om neurale activiteit karakteriseren in de Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfactorische Circuits

Een effectieve Manual Uitbenerij methode om Intact Mouse neusweefsel bereiden met Bewaarde Anatomische Organisatie

Cilia van olfactorische sensorische neuronen bevatten eiwitten van de signaaltransductiecascade, maar een gedetailleerde ruimtelijke analyse van hun verdeling is moeilijk in cryosecties. We beschrijven hier een geoptimaliseerde aanpak voor hele montage-etikettering en en face visualisatie van ciliaire eiwitten.

Hele Mount Labeling van Cilia in het Main Olfactorische Systeem van Muizen

Hier beschrijven we een fysiologische aanpak die identificatie en diepgaande analyse van een gedefinieerde populatie van sensorische neuronen in acute coronale weefselsneden van het vomeronasale orgaan van de muis mogelijk maakt, met behulp van opnames met gehele cel patch-clamp.

Een grondige fysiologische analyse van Defined Cell Populaties in Acute Tissue Slices van de Muis Vomeronasal

Karakterisering van de functie van odorant receptoren serveert een onmisbaar onderdeel in het proces van deorphanization. Beschrijven we een methode voor het meten van de activering van odorant receptoren in real time via een kamp assay.

Live-cel meting van Odorant Receptor activering met behulp van een Real-time cAMP Assay

Olfactorische zintuiglijke neuronen vormen een grote verscheidenheid aan axon-sorterende moleculen om een ​​goede neurale schakeling te vormen. Dit protocol beschrijft een immunohistochemische kleuring methode om combinatorische expressies van axon-sorterende moleculen te visualiseren bij de axon termini van olfactorische sensorische neuronen.

Viervoudige Immunostaining van de Olfactorische Lamp voor Visualisatie van Olfactorische Sensorische Axon Moleculaire Identiteitscodes

Leer de perforated patch-clamp-techniek om membraaneigenschappen van olfactorische sensorische neuronen te meten in intact neuroepithelium van muizen. Deze methode karakteriseert functionele eigenschappen van OSN's op membraanniveau.

Geperforeerde Patch-clamp-opname van de muis olfactorische sensorische neuronen in Intact neuroepithelium: functionele analyse van neuronen uiten van een geïdentificeerd Odorant Receptor (Video) | JoVE Journal

Geperforeerde Patch-clamp-opname van de muis olfactorische sensorische neuronen in Intact neuroepithelium: functionele analyse van neuronen uiten van een geïdentificeerd Odorant Receptor

Meer video's verkennen