Geperforeerde Patch-clamp-opname van de muis olfactorische sensorische neuronen in Intact neuroepithelium: functionele analyse van neuronen uiten van een geïdentificeerd Odorant Receptor
13 juli 2015
Het analyseren van de fysiologische eigenschappen van olfactorische sensorische neuronen kent nog steeds technische beperkingen. Hier registreren we ze door middel van perforated patch-clamp in een intacte voorbereiding van het olfactorische epitheel in gene-targeted muizen. Deze techniek maakt de karakterisering mogelijk van membraaneigenschappen en reacties op specifieke liganden van neuronen die gedefinieerde olfactorische receptoren tot expressie brengen.
Het algemene doel van deze procedure is om veranderingen in membraaneigenschappen van olfactorische sensorische neuronen in reactie op geurstimulussen te meten. Dit wordt bereikt door eerst het olfactorisch epitheel te dissecteren en het over te brengen naar een geperfundeerde kamer. De tweede stap is het lokaliseren en kiezen van een OSN van belang onder de microscoop.
De dendritische knop van de gekozen OSN wordt vervolgens patch geklemd en geanalyseerd terwijl het wordt gestimuleerd met geurstoffen. Uiteindelijk karakteriseert geperforeerd patchklemmen van OSN-dendritische knoppen de functionele eigenschappen van OSN op membraanniveau. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van olfactorische sensorische neuronen, het uitdrukken van gedefinieerde geurreceptoren en ook patchklemopnamen.
Geef informatie over de membraaneigenschappen van deze neuronen. Bereid de stimulerende pipetten voor van een millimeter glas of koop ze voorgebogen aan met behulp van een vlam. Buig zes pipetten ongeveer een centimeter van de punt naar een hoek van 45 graden.
Vervolgens schik de zes gebogen puntpijpetten rond een zevende rechte pijp, gebruik een oogje als leidraad en wikkel ze in hitteschrompfolie. Verwarm de schrompfolie aan het andere uiteinde van de pijpen. Breng meer schrompfolie aan.
Dit maakt een prepo zevenvats stimulerende pijp. Gebruik nu een multivats polare pull voor de zevenvats stimulerende pijp. Na het trekken, versterk de samenstelling met wat witte lijm rond het oogje.
Laat de lijm dan een nacht drogen op de vereiste oplossingen. De Nystatin-oplossing moet vers worden gemaakt net voordat het wordt gebruikt. Wanneer nodig, weeg drie milligram Nystatin af en voeg het toe aan 50 microliters DMSO.
Vervolgens meng de mix gedurende 20 seconden. Soniceer vervolgens de mix gedurende twee tot drie minuten om een volledige verdunning te garanderen. Voeg nu 20 microliters van de mix toe aan vijf milliliters intracellulaire stockoplossing.
Vortex mix gedurende 20 seconden, gevolgd door twee tot drie minuten sonicatie. Koel vervolgens de werkoplossing op ijs en bewaar deze beschermd tegen licht. Op deze manier is de werkoplossing een paar uur goed.
Laad een microfilm-uitgeruste spuit met werkoplossing. Het zal goed zijn voor een uur gebruik totdat het wordt gebruikt. Bewaar echter de geladen spuit door deze op ijs te bewaren.
Trek nu enkele opname-elektroden met lange halzen en openingen van twee micron. Het doel is om een weerstand van 15 tot 20 mega ohm te krijgen zodra het is geladen met Nystatin-oplossing. Laad tenslotte de stimulerende pijp met geurstoffen verdund in ringer.Oplossing.
Voor dit protocol moeten muizen beschikbaar zijn tussen de twee en vier weken oud. In deze presentatie worden muizen gebruikt die of IRES tau GFP tot expressie brengen of IS tau GFP-muizen. Alle neuronen die de gewenste expressie vertonen, worden gelabeld met GFP.
Deze methode kan worden gebruikt voor of uitgedrukt in alle zones. Dissectie en opnames zullen echter gemakkelijker zijn voor OR's die in de dorsale zone worden tot expressie gebracht. Begin met het anesthetiseren en vervolgens onthoofden van een muis.
Het resultaat van dit protocol hangt af van de kwaliteit van de dissectie. Deze dissectiestappen moeten zo kort mogelijk zijn en precies zijn. Gebruik dissectiescharen om een longitudinale snede langs de dorsum te maken om de operatie te beginnen.
Trek de huid uit elkaar om het te verwijderen. Snijd vervolgens langs de onderkaak en maak een coronale snede parallel aan de tanden. Verwijder zo de bovenste snijtanden.
Maak nu een coronale snede rond het hoofd, achter de ogen, gooi het achterste deel weg en breng het voorste gedeelte over naar ijskoude ringers. Gebruik nu onder een dissectiemicroscoop het septum binnen vijf tot tien minuten geïsoleerd. Begin met een longitudinale snede langs de ventrale kant.
Snijd vervolgens de dorsale botten longitudinaal langs de dorsale laterale kant van de neusholte. Vervolgens verwijdert u het grootste deel van de botten en het verhemelte. Breng het geïsoleerde septum over en bevestig het epitheel op een container met geoxideerde ringers bij kamertemperatuur.
Maak binnen vijf minuten de laatste voorbereidingen voor opname. De oplossing mag niet te warm zijn, anders ziet de voorbereiding er beschadigd uit. Om toegang te krijgen tot het neuro-epitheel voor opname.
Schilfer eerst het epitheel van het onderliggende septum met pincetten. Snijd vervolgens het voorste uiteinde van het septum om het epitheel los te maken met micro Vanna-schaar. Verwijder nu voorzichtig het vomer nasale orgaan.
Snij het eraf waar het dorsaal is bevestigd. Het geïsoleerde epitheel kan nu naar de opnamekamer worden verplaatst, met de slijmzijde naar boven. Eenmaal op zijn plaats, gebruik een harp om het weefsel plat te maken.
Breng vervolgens de kamer over naar een staande microscoop. Beeld het neuro-epitheel onder een 40 x water-immersie objectief terwijl het continu wordt geperfundeerd met verse ringers op kamertemperatuur. Om te beginnen zoek naar de cellen van belang, die in dit geval EGFP tot expressie brengen, dus 480 nanometer licht wordt gebruikt om te scannen naar cellen die licht uitzenden in het bereik van 530 tot 550 nanometer.
De doelgerichte dendritische knoppen en osn wanneer beoordeeld bij 80 tot 160 x onder helder veld, moeten duidelijk te onderscheiden zijn van de ondersteunende cellen. Laad nu de elektrode met een S-statine-oplossing. Tik eventuele bubbels die zich vormen uit en bevestig de elektrode aan de houder.
Breng nu wat positieve druk aan. De verwachte weerstand is tussen 15 en 20 mega ohm. Breng vervolgens de elektrode naar de cel terwijl de positieve druk wordt gehandhaafd.
Wanneer de weerstand toeneemt tot ongeveer 40 mega ohm, laat de druk los en breng een lichte negatieve druk aan. Als er een giga seal wordt
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie richt zich op het meten van de fysiologische eigenschappen van olfactorische sensorische neuronen (OSN's) met behulp van geperforeerde patch-clamptechnieken. Door OSN's in een intact olfactorisch epitheel van genetisch gemodificeerde muizen te analyseren, kunnen onderzoekers membraaneigenschappen en reacties op specifieke odoranten karakteriseren.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschap
- Olfactie
- Elektrofysiologie
Achtergrond
- Olfactorische sensorische neuronen spelen een cruciale rol bij het reukvermogen.
- Technische beperkingen hebben de analyse van hun fysiologische eigenschappen in de weg gestaan.
- Perforated patch-clamp technieken maken een gedetailleerde karakterisering van de membraneigenschappen mogelijk.
- Gen-getargete muizen bieden een model voor het bestuderen van specifieke olfactorische receptoren.
Doel van de studie
- Om veranderingen in de membraaneigenschappen van OSN's als reactie op odoranten te meten.
- Om functionele eigenschappen van OSN's op membraanniveau te karakteriseren.
- Om kernvragen binnen het vakgebied van de olfactie te beantwoorden.
Gebruikte methoden
- Dissectie van het reukepitheel.
- Overdracht van het epitheel naar een perfusiekamer.
- Microscopische selectie van de relevante OSN's.
- Patch clamp-registratie van de dendritische knobbel tijdens stimulatie met geurengstoffen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle registratie van de membraaneigenschappen van OSN's.
- Karakterisering van OSN-responsen op specifieke geurstoffen.
- Inzichten in de functionele eigenschappen van gedefinieerde olfactorische receptoren.
- Demonstratie van de effectiviteit van geperforeerde patch-clamp technieken.
Conclusies
- De methode biedt een waardevolle tool voor het bestuderen van olfactorische sensorische neuronen.
- Het verbetert het begrip van de olfactorische verwerking op cellulair niveau.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze bevindingen om olfactorische mechanismen verder te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Precieze functionele analyse van olfactorische sensorische neuronen (OSN's) die gedefinieerde geurreceptoren tot expressie brengen, maakt target-validatie met een hoge betrouwbaarheid mogelijk in de sensorische biologie. Kwantitatieve patch-clamp-metingen in intact neuroepitheel leveren voorspellende gegevens over ligand-receptorinteracties, wat bijdraagt aan mechanische risicoreductie en translationele continuïteit voor neurofarmacologische portfolio's. Deze aanpak versterkt beslissingen in de vroege ontdekkingsfase door receptoridentiteit te koppelen aan functionele responsprofielen in een fysiologisch relevante context.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe ondervraging van de functie van geureceptoren mogelijk in de context van natuurlijk weefsel.
- Ondersteunt biologische risicovermindering door de specificiteit van liganden en de drempelwaarden voor receptoractivatie te kwantificeren.
- Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de selectie van targets door middel van kwantitatieve elektrofysiologische resultaten.
- Biedt mechanisch inzicht in receptor-gemedieerde signaleringspaden die relevant zijn voor sensorische modulatie.
Screening & Assayontwikkeling
- Stelt gevalideerde, reproduceerbare elektrofysiologische assays vast voor functionele screening van liganden.
- Levert kwantitatieve dosis-responsgegevens ter ondersteuning van standaardisatie en schaalbaarheid van de assay.
- Maakt betrouwbare evaluatie mogelijk van de effecten van verbindingen op gedefinieerde receptor-expresserende neuronen.
- Bereidt robuuste biologische systemen voor op downstream farmacologisch profileren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt functionele read-outs uit aan ziekte-relevante sensorische paden voor de ontwikkeling van translationele biomarkers.
- Behoudt de weefselarchitectuur, wat de continuïteit ondersteunt van ontdekking tot preklinische validatie.
- Levert risico-gecorrigeerde gegevens voor het verder ontwikkelen van targets voor sensorische modulatie in preklinische modellen.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie voor portfolio's van neuroactieve verbindingen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert zich op de interface van vroege ontdekking en lead-identificatie en vormt een brug van doelwitvalidatie naar preklinisch onderzoek in de sensorische neurowetenschappen.
- Discovery Biology: Kwantificeert receptor-ligandinteracties en verheldert sensorische signaleringspaden in natuurlijk weefsel.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve elektrofysiologische output voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Biedt dosis-responscurves, detectiedrempels en metingen van het dynamische bereik voor comparatieve analyse.
- Translational Research: Handhaaft de fysiologische context voor biomarker-afstemming en preklinische continuïteit.
- Enterprise Reuse: Biedt een herbruikbaar platform voor functionele analyse van diverse receptor-ligand systemen in de sensorische biologie.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij target-validatie.
- Operationele waarde: Standaardiseert functionele assays en verbetert de reproduceerbaarheid over experimenten heen.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en verbetert de kapitaalefficiëntie door risico's bij targets in een vroeg stadium te minimaliseren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en voortgang van programma's voor sensorische modulatie mogelijk.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in elektrofysiologie en neuroanatomische dissectie.
- Vereist gespecialiseerde patch-clamp instrumentatie en fluorescentiemicroscopie.
- Maakt standaardisatie van weefselpreparatie en registratieprotocollen tussen teams noodzakelijk.
- Aanpassingen kunnen nodig zijn voor verschillende receptortypes of weefselzones.
- De kwaliteit van de preparatie en de levensvatbaarheid van het weefsel zijn cruciaal voor een betrouwbare gegevensverwerving.
