Het toepassen van stereotactische injectie techniek om genetische effecten op Animal Gedrag Studie
10 mei 2015
Stereotactische injectie van lentivirussen uiten cDNAs of shRNAs kan genexpressie moduleren in specifieke hersengebieden van muizen. Hier presenteren we een protocol om stereotactische injecties te combineren met gedragsproblemen taken, zoals het open veld Test (OFT) en de Gedwongen Swim Test (FST).
Het algemene doel van deze procedure is om te beoordelen hoe het moduleren van de expressie van een gen in een doelgebied het gedrag van dieren beïnvloedt. Dit wordt bereikt door eerst een lentivirus te creëren om de expressie van het doelgen te moduleren. De tweede stap is om stereotactische injectie te gebruiken om het lentivirus in een specifiek hersengebied van een ER-knaagdier te injecteren.
Vervolgens kunnen gedragingen zoals angst en depressie kwantitatief worden gemeten met behulp van gevestigde gedragsparadigma's. De laatste stap is het uitvoeren van histologie om de juiste injectieplaats te bevestigen. Uiteindelijk kunnen stereotactische injectie gecombineerd met gedragsbeoordeling laten zien hoe een specifiek gen in een doelgebied het gedrag van muizen kan beïnvloeden.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat wetenschappers de expressie van een enkel gen in een klein gericht gebied kunnen veranderen en vervolgens gedragsveranderingen bij muizen kunnen evalueren. Om deze procedure te beginnen, plaatst u een verdovingsmuis in het stereotactische apparaat, klept de voorste kiezen aan de voorste klem en bevestigt de kaak. Plaats vervolgens de oorstaven in de gehoorgangen om het hoofd volledig te stabiliseren.
Plaats vervolgens een verwarmingskussen onder de muis om zijn lichaamstemperatuur te reguleren. Gedurende de hele procedure, breng kunsttranen op de ogen van het knaagdier aan om uitdroging te voorkomen. Daarna, reinig het chirurgische gebied grondig door eerst 10%povidoon jodium met een wattenstaafje in cirkelvormige bewegingen te wrijven.
Wrijf vervolgens 70%ethylalcohol op dezelfde manier op de chirurgische plaats. Herhaal deze reinigingsprocedure nog twee keer. Zodra de muis is voorbereid, opent u de zak met steriel materiaal.
Verwissel de handschoenen voordat u de instrumenten aanraakt. Neem vervolgens het steriel doek en leg de instrumenten erop. Grijp nu voorzichtig de huid van de muis met de bloedeindtang en maak een incisie met een scalpel.
Begin de incisie ongeveer 1,5 centimeter boven de oren en verleng deze tot ongeveer 0,5 centimeter onder de oren om de bgma bloot te leggen. Zodra de bgma zichtbaar is, gebruikt u een steriele wattenstaafje om voorzichtig al het bloed dat de oppervlakte van de schedel bedekt, te verwijderen. Gebruik vervolgens twee wattenstaafjes om de huid naar de zijkanten van het hoofd te duwen.
Vervolgens vult u in de afzuigkap een spuit met het te injecteren virus. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in zitten. Plaats vervolgens een spuit in het stereotactische apparaat en zorg ervoor dat deze goed vastzit.
Daarna laat u de spuit langzaam zakken tot deze zich direct boven het oppervlak van de schedel bevindt. Beweeg vervolgens de punt van de steriele spuitnaald naar de kruising van B bgma en de inter rurale lijn. Stel dit punt als nul in.
Stel vervolgens de coördinaten van het gebied van belang in. Verplaats de naald van de spuit naar de doelsite die moet worden geboord. Plaats vervolgens de boorstift direct boven de doelsite onder een hoek van 45 graden ten opzichte van de schedel en begin met boren.
Zorg ervoor dat u niet in de hersenen boort om corticale schade te voorkomen. Reinig vervolgens al het bloed uit het gat met een steriele wattenstaaf. Laat de spuit zakken zodat de punt recht op het oppervlak van de hersenen zit.
Stel de DV-coördinaat op nul en laat vervolgens de spuit zakken tot de gewenste diepte. Begin nu met de injectie met een snelheid van 0,2 microliter per minuut. Wacht na afloop van de injectie ongeveer twee minuten om er zeker van te zijn dat alle resterende virussen zijn opgenomen.
Til vervolgens langzaam een spuit op. Gebruik een wattenstaafje om eventuele vloeistof van de injectieplaats te verwijderen. Naai daarna de huid en verwijder het dier uit het stereotactische systeem.
Houd de muis op het verwarmingskussen totdat hij wakker wordt en geef indien nodig extra pijnstillers. Neem in deze procedure een plastic vierkante arena. Reinig de arena met 70%ethylalcohol voor het experiment.
Plaats vervolgens de arena op de vloer en zorg ervoor dat de verlichting zo is ingesteld dat schaduwen en schittering worden geminimaliseerd. Pas vervolgens de detectie-instellingen aan zodat de muis zichtbaar is op het scherm. Zet daarna de camera aan om de gedragstaak op te nemen en plaats de muis naar het midden van de arena, zodat de muis naar de muur kijkt.
Stel de timer in op vijf minuten en ga weg van de arena of verlaat de kamer. Na vijf minuten brengt u de muis terug naar de kooi. Gebruik 70%ethylalcohol om het veld grondig schoon te maken voordat u naar het volgende dier gaat.
Vul nu een duidelijke emmer van twee liter met water op 22 graden. Plaats de emmer op de vloer en zorg ervoor dat de verlichting zo is ingesteld dat schaduwen en schittering worden geminimaliseerd. Als u trackingsoftware gebruikt, plaatst u de camera direct boven de emmer.
Pas de software-instellingen aan zodat de muis gemakkelijk zichtbaar is op het scherm. Schakel vervolgens de camera in om de gedragstaak op te nemen. Plaats de muis voorzichtig in het midden van de emmer met water, zodat zijn voorpoten eerst het water raken en voorkom dat zijn hoofd onderdompelt. Stel daarna de timer in op zes minuten voordat u wegloopt van het gedragsgebied. Verwijder na zes minuten de muis uit de emmer, veeg overtollig water af en plaats hem terug in de kooi.
Hier is een representatieve hersenslice, die de succesvolle injectie van virus in de dentate gyrus illustreert. Deze figuur toont de hoeveelheid tijd die de controle- en experimentele muizen in het midden van een nieuw open veld doorbrachten. De experimentele muizen brachten significant minder tijd door in het midden van de arena, wat duidt op een angstfenotype, en deze figuur toont de hoeveelheid tijd dat de controle- en experimentele muizen onbeweeglijk zijn in de gedwongen zwemtest.
De experimentele muizen waren niet significant anders dan de controles in de hoeveelheid tijd die onbeweeglijk werd doorgebracht. Na he
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft het gebruik van stereotactische injecties van lentivirussen om de genexpressie in specifieke hersengebieden van muizen te moduleren. Deze injecties worden gecombineerd met gedragsbeoordelingen om de impact op angst- en depressiegerelateerd gedrag te evalueren.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Gedragsbiologie
- Gentherapie
Achtergrond
- Stereotactische injectie maakt nauwkeurige targeting van hersengebieden mogelijk.
- Lentivirussen kunnen genexpressie effectief moduleren.
- Gedragstests zoals de Open Field Test (OFT) en de Forced Swim Test (FST) zijn standaard voor het beoordelen van angst en depressie.
- Het begrijpen van relaties tussen genen en gedrag is cruciaal voor neurowetenschappelijk onderzoek.
Doel van de studie
- Om te beoordelen hoe genmodulatie in specifieke hersengebieden het gedrag beïnvloedt.
- Om gevestigde gedragsparadigma's te gebruiken voor kwantitatieve meting.
- Om de nauwkeurigheid van de injectie te bevestigen via histologische analyse.
Gebruikte methoden
- Creatie van lentivirussen om de expressie van doelgenen te moduleren.
- Stereotactische injectie in specifieke hersengebieden van knaagdieren.
- Gedragsbeoordelingen met behulp van de Open Field Test en de Forced Swim Test.
- Histologische bevestiging van de injectieplaatsen.
Belangrijkste resultaten
- Gedragsveranderingen werden na de injectie kwantitatief gemeten.
- Histologische analyse bevestigde de nauwkeurige targeting van de injectieplaatsen.
- Modulatie van genexpressie beïnvloedde angst- en depressiegedrag.
- De gecombineerde aanpak biedt inzicht in de relaties tussen genen en gedrag.
Conclusies
- Stereotactische injectie in combinatie met gedragsbeoordeling is effectief.
- Deze methode kan de rol van specifieke genen in gedrag verduidelijken.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op dit protocol voor verdere inzichten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Dit protocol maakt nauwkeurige genetische analyse van hersengebieden mogelijk om vast te stellen hoe specifieke genen angst- en depressiegerelateerd gedrag bij muizen moduleren. Door stereotactische lentivirale toediening te combineren met kwantitatieve gedragsmatige read-outs, ondersteunt het de validatie van targets en mechanistische risicoreductie bij neurowetenschappelijk onderzoek. De aanpak biedt voorspellende zekerheid bij het koppelen van moleculaire targets aan fenotypische uitkomsten, wat bijdraagt aan besluitvorming in een vroeg stadium van de portfolio bij de ontwikkeling van geneesmiddelen voor het centrale zenuwstelsel.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt hypothesetoetsing van genfuncties in gedefinieerde neurale circuits mogelijk om de biologische mechanismen ten grondslag aan gedrag te verduidelijken.
- Operationele waarde: Biedt een gerichte, reversibele methode om genexpressie te moduleren zonder wijdverspreide hersenschade, waardoor de doelspecificiteit wordt verbeterd.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt fenotypische screening door genetische manipulatie te koppelen aan kwantificeerbaar gedrag gerelateerd aan angst en depressie.
Screening & assay-ontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Stelt gestandaardiseerde gedragsparadigma's (OFT, FST) vast als kwantitatieve, reproduceerbare meetwaarden voor genetische of farmacologische modulatie.
- Schaalbaarheid: De chirurgische en injectieworkflow kan worden aangepast voor studies met een hogere doorvoersnelheid over meerdere doellocaties of virale constructen.
- Datakwaliteit: Histologische bevestiging garandeert on-target aflevering, waardoor variabiliteit wordt verminderd en het vertrouwen in de gedragsgegevens toeneemt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeeld: Modelleert endofenotypen gerelateerd aan angst en depressie, wat translationele afstemming van biomarkers bij CZS-stoornissen mogelijk maakt.
- Preklinische continuïteit: Ondersteunt mechanistische follow-up van target hit tot in vivo validatie in ziekte-relevante neurale circuits.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Faciliteert go/no-go evaluaties door target-gedragsrelaties te de-risken voordat er wordt geïnvesteerd in verbindingen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van doelhypothese naar fenotypische validatie, waardoor iteratieve testen van genetische modulatoren in gedragsrelevant hersengebieden mogelijk worden gemaakt.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothese-gestuurd onderzoek naar genfuncties in specifieke hersengebieden om de betrokkenheid van signaalpaden bij gedrag te verduidelijken.
- Screening: Genereert kwantitatieve, gestandaardiseerde gedragsoutputs die vergelijking tussen genetische of experimentele condities mogelijk maken.
- Analytiek: Produceert meetbare afhankelijke variabelen (tijd in het centrum, duur van immobiliteit) waardoor statistische vergelijking tussen controle- en experimentele groepen mogelijk is.
- Translationeel onderzoek: Verbindt moleculaire manipulatie met gedragsfenotypes met face-validiteit voor menselijke modellen van angst en depressie.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Het stereotactische-gedragsplatform kan worden hergebruikt voor meerdere genen, hersenregio's of gedragsassays, wat de operationele efficiëntie verhoogt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in het doelwit door mechanistische ambiguïteit te verminderen via circuitspecifieke genetische modulatie.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde chirurgische, injectie- en gedragstestenprocedures.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege risicovermindering van CNS-doelwitten mogelijk te maken vóór screeningscampagnes van verbindingen.
- Impact op portfolio: Informeert de risicogecorrigeerde prioritering van doelwitten door genetische drijvers van gedragsrelevante fenotypes te valideren.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in stereotactische chirurgie, de omgang met virussen en gedragstesten bij knaagdieren.
- Afhankelijk van steriele chirurgische instrumenten, een stereotactisch frame, microspuiten en systemen voor gedragsregistratie.
- Vereist standaardisatie tussen de teams voor chirurgie, histologie en gedragswetenschappen voor consistente resultaten.
- Er moet rekening worden gehouden met variabiliteit in virustiter, injectievolume en postoperatief herstel tussen verschillende diermodellen.
- Beperkt tot acute of subchronische gedragsevaluatie; chronische effecten vereisen longitudinale onderzoeksontwerpen.
