Name: Het toepassen van stereotactische injectie techniek om genetische effecten op Animal Gedrag Studie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Leer stereotactische injectietechnieken om genexpressie in muizenhersenen te moduleren en gedragsveranderingen te meten. Deze methode combineert lentivirale injecties met gedragstests voor neurowetenschappelijk onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door American Heart Association Scientist Development Grant en NARSAD Young Investigator Award aan Yingwei Mao.

LET OP: Alle protocollen met dieren werden gevolgd in overeenstemming met het dier zorg richtlijnen van de Pennsylvania State University, IACUC # 44057 1. Lentivirus Production NB: De dag voor transfectie, moet LentiX-293-cellen worden op 80% confluentie. <ol><li> Spoel de cellen met DMEM net vóór transfectie en incuberen in 10 ml DMEM / 10% FBS met penicilline (100 IU / ml) en streptomycine (100 ug / ml) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verdun DNA en Polyethyleenimine (PEI) (1 mg / ml) in 1: 3 verhouding (1 ug DNA: 3 pl PEI) in 1 ml DMEM en vortex gedurende 1 minuut. De hoeveelheid DNA toegevoegd is afhankelijk van de concentratie van het DNA. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min. <ol><li> Gebruik bijvoorbeeld 20 ug plasmide DNA, bestaande uit 10 ug plasmide, 5 ug psPax2 14 plasmide, 5 ug van vesiculair stomatitis virus (VSV) met 60 ul van PEI per schaal. </li></ol></li><li&gt; Meng de DNA-PEI-oplossing en opnieuw met vortexen gedurende 1 min. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min. </li><li> Voeg 1 / 10de volume van de totale kweekmedium DMEM (dwz 1 ml voor 10 ml kweekmedium in een 100 mm schaal). Voeg 1 ml van de DNA-PEI mengsel druppelsgewijs in de schaal en draai de schotel rond tot aan het kweekmedium wordt goed gemengd met de DNA. </li><li> Incubeer gedurende 6 uur bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant. Voeg 5 ml kweekmedium. </li><li> 48 uur na transfectie, verzamel viraal supernatant en centrifugeren bij 627 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C in een 50 ml buis. Filter 30 ml van virale supernatant door een 0,45 pm spuitfilter in een ultracentrifuge buis. </li><li> Voeg steriel water om de buizen in evenwicht, en bedek buizen met kleine stukje parafilm. Spin buizen bij 11.249 xg gedurende 120 min bij 4 ° C. Verwijder vloeistof met een stofzuiger tip. </li><li> Voeg 100 ul koud PBS de buis. Schud de buis bij 4 ° CO / N. </li><li> Om opnieuw op te schorten het virus, pipet tHij PBS toegevoegd in stap 1.8 op de korrel 10 keer, zorg dat u de pellet niet aan te raken met de tip. De pellet zal niet opnieuw worden opgeschort totdat deze is voltooid. </li><li> Aliquot het virus in 10-20 pi per buis, flash-bevriezen in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C. </li></ol> 2. stereotactische injectie 2.1) Voorbereiding van de instrumenten <ol><li> Plaats een schaar, tang stompe uiteinden, een naaldhouder, scalpel, wattenstaafjes en een doek in een gesloten verpakking met een sterilisatie-indicator, en autoclaaf voorafgaand aan de operatie. Daarnaast krijgen 10% povidonjood, 70% ethylalcohol, absorbeerbare hechtingen, een verwarmingselement, kunsttranen, een glazen kraal sterilisator, boormachine, een boor, 2 wegwerpspuiten, een injectiespuit, elektrisch scheerapparaat, pijnstiller (ketoprofen), verdoving (Avertin), handschoenen en een stereotactische apparaat met injectie pomp. </li><li> Maak 1,25% avertin oplossing verse die dag, filter in een steriele kap met behulp van een 0,2 &amp;# 181; m steriele spuit filter, en plaats in een steriele serum flacon. Meng 2,5 g 2,2,2-tribroomethyl alcohol in 5 ml tert-amylalcohol, dan oplossen in 200 ml water. Houd de pH onder 5. 15 </li></ol> 2.2) Bereiding van de muis <ol><li> Dien Avertin gebaseerd op het gewicht van de muis (375 mg / kg). 15 Injecteer de muis met de avertin via een intraperitoneale (IP) injectie en vervolgens weer plaatsen zijn kooi tot volledig onder narcose. </li><li> Geef een pijnstiller via IP-injectie (ketaprofen, 5 mg / kg), en plaats kunsttranen op de ogen van de muis om uitdroging te voorkomen. </li><li> Zorg ervoor dat de muis is volledig in slaap door knijpen hun voet. Als de muis reageert op de voet knijpen, geef meer verdovingsmiddel (in doseringen van 50 pi). Scheer het hoofd van de muis met behulp van een elektrisch scheerapparaat. Scheer de omgeving (gewoonlijk onmiddellijk achter de oren, de bovenkant van de snuit) te opereren, en het omliggende gebied. </li><li> Plaats de muis into de stereotactische apparaat. Grendel de voortanden op de voorste klem, en laat de klem en draai het zodat de kaak is volledig veilig. </li><li> Steek het oor bars in de gehoorgang volledig stabiliseren het hoofd. Wees voorzichtig niet aan het oor bars steek te ver, dat het binnenoor kunnen beschadigen. Zodra dit voltooid is, zal het lichaam van de muis kunnen enigszins worden bewogen zonder verstoring van de positie van de weg. </li><li> Plaats een verwarmingselement onder de muis om de lichaamstemperatuur van de muis reguleren gedurende de procedure. </li><li> Reinig de chirurgische gebied grondig. Met behulp van een wattenstaafje, wrijf 10% povidonjodium in een cirkelvormige beweging, vanaf het midden van de chirurgische site en naar buiten toe. Gebruik vervolgens een wattenstaafje 70% ethylalcohol wrijven op de operatieplaats op dezelfde manier. Herhaal tweemaal. </li></ol> 2.3) De eerste incisie <ol><li> Zodra de muis wordt klaargestoomd, open de steriele apparatuur zak. Change handschoenen voordat Touching van de instrumenten. Neem de steriele doek en plaats de instrumenten op het doek. Als een instrument raakt een niet-steriele oppervlak, gebruik dan de glazen kraal sterilisator gedurende 15 sec om het te steriliseren. </li><li> Neem de scalpel in de dominante hand en blunt-end tang in de niet-dominante hand. Gebruik het stompe einde forceps voorzichtig grijpen de huid van de muis en een insnijding met de scalpel. Begin de incisie ongeveer 1,5 cm boven de oren (naar de neus) en zich uitstrekken tot ongeveer 0,5 cm onder de oren. Verleng de incisie verticaal door het midden van het hoofd van de muis aan bregma blootgesteld (Figuur 1). </li><li> Zodra bregma wordt gevisualiseerd, neem een ​​steriele katoenen tip om voorzichtig te verwijderen geen bloed die het oppervlak van de schedel. Gebruik twee katoen tips om de huid te duwen in de richting van de zijkant van het hoofd. </li></ol> 2.4) Apparatuur Setup <ol><li> Nadat geen bloed wordt verwijderd van het oppervlak van de schedel en bregma duidelijk zichtbaar, bereid de spuit (concentratie van 10 8 TU / ml, volume van 1 ui). In de zuurkast, vul de spuit met het virus te injecteren. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen zijn binnen. Plaats de spuit in de stereotactische apparaat, om ervoor te zorgen dat het volledig is beveiligd. </li><li> Langzaam de spuit totdat deze vlak boven het oppervlak van de schedel, waardoor het uiteinde van de steriele naald wordt ingesteld op het snijpunt van bregma en de interaurale lijn. Stel dit punt als nul, en het bepalen van de coördinaten van dit punt. </li><li> Afhankelijk van de hersenen interessegebied, variëren de stereotactische coördinaten. Bepaal de coördinaten met behulp van een hersenatlas 4. Zodra de coördinaten zijn bepaald, verplaats de naald van de spuit om die coördinaten te passen. Richt de dentate gyrus met de coördinaten: M / L = +/- 1 mm, A / P = -1,82 mm. Laat de naald recht boven de schedel te visualiseren waar het gat moet worden geboord. </li><li> Verhoog de spuit iets, neem de boor en plaats de boor bit direct boven de doelstelling boorlocatie op ongeveer een 45 ° hoek met de schedel. Begin boren, en houdt het boren tot aan de schedel geeft manier. Wanneer de schedel geeft wijze kan een daling in weerstand gedetecteerd. Wees voorzichtig niet te boren in de hersenen, om zo corticale schade te voorkomen. </li><li> Neem een ​​steriele katoenen tip en veeg geen bloed uit de buurt van het gat. </li><li> Laat de spuit, zodat de tip zit direct op het oppervlak van de hersenen (niet de schedel). Zet de D / V coordinaat (diepte) op 0. Laat de injectiespuit naar de gewenste diepte, gebaseerd op de hersenatlas coördinaten. Om de dentate gyrus, stelt D / V bereiken -1,79 mm. </li><li> Begin het injecteren met een snelheid van 0,2 ul / min. Let zodat de injectiespuit niet lager glijden dan de gewenste diepte. In dat geval voorzichtig omhoog de spuit aan de gewenste diepte weer. </li><li> Nadat de injectie is voltooid, wacht ongeveer 2 minuten zodat achtergebleven virus is geabsorbeerd. Langzaam verhogen de spuit en gebruik een wattenstaafje om eventuele li verwijderenquid uit de injectieplaats. </li><li> Herhaal dit voor het andere halfrond. </li></ol> 2.5) Hechten <ol><li> Verwijder de steriele hechtdraad en naald uit de verpakking en greep de naald met behulp van de naald houders. Geconfronteerd met de puntige kant van de naald weg van de naald houder. Houd het stompe uiteinde pincet in de niet-dominante hand en gebruiken grip de huid van de muis. Begin met de dominante hand. </li><li> Duw de hechtdraad door de huid en met de stompe uiteinden tang om de huid aan de overkant van de incisie te grijpen. Trek het hechtmateriaal door tot ongeveer 0,75 inch blijft. </li><li> Loslaten van de naald, en gebruik de stompe-end tang om de hechting rond de naald houder één keer wrap, dan, pak de 0,75 inch resterende hechtdraad met de naald houder, en trek de hechtdraad door middel, zodat de naald en naaldhouder komen op de zijkant van de kop tegenover die waaraan zij oorspronkelijk waren. Dit moet een knoop te vormen. </li><li> Herhaal deze stapdrie keer, afwisselend de zijkant van de kop de naaldhouder belandt telkens wanneer. </li><li> Snijd de hechtdraad en herhaal stappen 2.5.1-2.5.3 totdat de incisie wordt gesloten. </li></ol> 2.6) postoperatieve zorg <ol><li> Verwijder voorzichtig het oor bars van de muis en verwijder haar kaak uit de voorste klem. </li><li> Houd de muis op de verwarming pad totdat hij wakker en beweegt rond op zijn eigen. Bewaken van de muis dagelijks, en houd en oog uit voor tekenen van pijn, zoals het niet verzorging, eten of drinken. Geef extra pijnstillende wanneer dat nodig wordt geacht. </li></ol> 3. Open Field Test 3.1) instellen <ol><li> Verkrijgen van een leeg plein, plastic arena met afmetingen van 50 cm x 50 cm, met 50 cm hoge muren (maar kan iets groter zijn). Reinig de arena met 70% ethylalcohol vóór het begin van het experiment. Zorg ervoor dat de ethylalcohol volledig droog is voordat u een muis in de arena. </li><li> Plaats de arena op devloer, en proberen te zorgen voor de verlichting is ingesteld op schaduwen en verblinding te minimaliseren. </li><li> Bij gebruik van tracking software, plaatst u de camera rechtstreeks overhead van het open veld, ongeveer 1,5 ft boven het open veld (ver genoeg om de volledige Encompass de hele arena, maar dicht genoeg om een ​​duidelijk beeld van de muis hebt). </li><li> Het opzetten van een zone in het centrum van de doos (ongeveer een oppervlakte van 30 cm x 30 cm). 16 Om een zone instellen, klikt u op het tabblad zone 1 in het zijpaneel. <ol><li> Selecteer een vorm schets in het bovenste paneel, en een overzicht van de perimeter van het centrum zone. Selecteer voegen zone, en klik op de binnenkant van het centrum zone. Met behulp van het programma prompts, de naam van de zone (dit zal worden aangeduid als &#39;centrum&#39; voor deze procedure). Als de gedrags-test zal worden gescoord door de hand, zorg ervoor dat de onderkant van het veld is verdeeld in 10 cm x 10 cm pleinen, gemarkeerd met tape. </li></ol></li><li> Stel de software, zodat de instellingen correct zijn, en de muis is gemakkelijk visible op het scherm. Dit te bereiken door aanpassing van de detectie-instellingen op de machine overeenkomen met het testen arena (licht) en muis kleur te vertonen. OPMERKING: Als de instellingen juist zijn, moet het systeem volgen alleen de muis, en geen schaduwen of urine / ontlasting. De specifieke software instellingen zijn afhankelijk van de verlichting van de arena en de kleur van de muis. </li></ol> 3.2) Acclimatisering en Test <ol><li> Verplaats experimentele muizen in de gedrags kamer 1 uur vóór de test om ze wennen aan hun omgeving. Laat de muizen in hun kooi voor de acclimatisatie. </li><li> Zet de camera naar tape de gedrags-taak en plaats de muis naar het midden voorkant van de arena, zodat de muis wordt geconfronteerd met de muur. </li><li> Stel de timer voor 5 min, en stap uit de buurt van de arena. Als het mogelijk is, verlaat de kamer om zo de muis niet per ongeluk beïnvloeden. </li><li> Zodra 5 min zijn up, verwijder de muis en plaats ze in hun kooi. </li><li> Gebruik 70% ethylalcohol om grondig reinigen van het veld alvorens tot de volgende muis. Zorg ervoor dat de ethylalcohol is volledig gedroogd. </li></ol> 3.3) Scoren <ol><li> Beschouw de muis als in het midden van het veld wanneer alle vier poten in het midden 30 cm x 30 cm. </li><li> Kwantificeren tijd doorbrengt de muis in het centrum. Ook bepalen deze keer met behulp van tracking software (zoals Noldus ethovison). <ol><li> Om dit te doen, ga naar het tabblad analyse, en klik op &quot;beweging&quot; onder analyse profielen. Verwijder de categorieën momenteel ingesteld, en selecteer vervolgens &quot;in de zone&quot; onder het tabblad locatie. Selecteer het centrum zone. Selecteer vervolgens &quot;analyse output&quot; (onder het tabblad resultaten) om de resultaten te bekijken. Een tabel met de tijd onbeweeglijk voor elke proef moeten verschijnen. </li></ol></li><li> Anders, de score van de OFT met de hand. Het open gebied te 25 10 cm x 10 cm vierkantjes beschreven op de bodem van de ope hebbenn veld (zoals aangegeven in stap 3.1.3). Kwantificeren tijd doorbrengt de muis in het centrum, naast het aantal binnenkomsten in het midden van de arena. 16 Opmerking: Het centrum 30 cm x 30 cm gebied wordt beschouwd als het centrum van het open veld. Een muis wordt geacht bewoont het middengebied als alle vier poten in de 30 x 30 cm area. </li></ol> 4. Gedwongen Swim Test OPMERKING: Laat een minimum van vijf dagen tussen behavioral taken. 4.1) instellen <ol><li> Zorg voor een 2 L duidelijk emmer, en vul met 22 ° C water. Zet de emmer op een tafel, en proberen te zorgen voor de verlichting is ingesteld op schaduwen en verblinding te minimaliseren. </li><li> Bij gebruik van tracking software, plaatst u de camera rechtstreeks overhead van de emmer. </li><li> Zet software zodanig dat de muis gemakkelijk zichtbaar op het scherm. </li></ol> 4.2) Acclimatisering en Test <ol><li> Verplaats experimentele muizen in de behavioral roOM 1 uur vóór de test om de omgeving acclimatiseren. Laat de muizen in hun kooi voor de acclimatisatie. </li><li> Zet de camera naar tape de gedrags-taak. Zachtjes, plaatst u de muis in het midden van de emmer water. Zorg ervoor dat de muis niet te laten vallen. Langzaam de muis, zodat de voorste voeten eerst raak het water. Neem zorg aan hun hoofd verhinderen dompelen. </li><li> Stel de timer gedurende 6 min en stap vanaf de gedrags gebied. </li><li> Zodra 6 min zijn up, verwijder de muis uit de emmer, en veeg het overtollige water voordat u de muis terug in hun kooi. </li></ol> 4.3) Scoren <ol><li> Bij gebruik van tracking software, ingesteld procent immobiliteit tot 11%, zoals voorgesteld door Noldus (dit moet de standaardinstelling zijn), om tijd te kwantificeren drijvende vs. zwemmen. </li><li> Te kwantificeren met behulp van het tracking systeem, ga naar het tabblad analyse en klik op verkeer op grond van de analyse profielen. Verwijder de categorieën momenteel stellen en selecteer vervolgens mobiliteit staat, opde linker zijpaneel (onder het individuele gedrag). Stel immobiliteit tot 11%. </li><li> Selecteer spoor visualisatie, onder het tabblad resultaten. Selecteer analyse uitgang (onder het tabblad resultaten) om de resultaten te bekijken. Een tabel met de tijd onbeweeglijk voor elke proef moeten verschijnen. </li><li> Als de hand scoren, het meten van de tijd dat de muis besteedt zwemmen of klimmen, en de hoeveelheid tijd die de muis besteedt immobiel. Bovendien meet de latentie om de eerste keer onbeweeglijk. Zie figuur 2 in Results Section. </li></ol>

<ol><li>Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-transgenic+mouse+strain+for+ubiquitous+deletion+of+loxP-flanked+gene+segments+including+deletion+in+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A Cre-transgenic mouse strain for ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells.</a> Nucleic Acids Research. 23 (24), 5080-5081 (1995).</li>
<li>Hirrlinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-cre+complementation+indicates+coincident+activity+of+different+genes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Split-cre complementation indicates coincident activity of different genes in vivo.</a> PLoS One. 4 (1), 1-10 (2009).</li>
<li>Fenno, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cells+with+single+vectors+using+multiple-feature+Boolean+logic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Targeting cells with single vectors using multiple-feature Boolean logic.</a> Nature Protocols. 11 (7), 763-772 (2014).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+sterotaxic+coordinates%22">The mouse brain in sterotaxic coordinates</a>. , Academic Press. San Diego, CA. (2001).</li>
<li>Gould, T. D., Dao, D. T., Kovacsics, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mood+and+anxiety+related+phenotypes+in+mice%3A+the+open+field+test%5BTitle%5D)+AND+%22Humana+Press%22%5BJournal%5D)">Mood and anxiety related phenotypes in mice: the open field test.</a> Humana Press. 42, 1-20 (2009).</li>
<li>Denenberg, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-field+behavior+in+the+rat%3A+W.0hat+does+it+mean%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Open-field behavior in the rat: W.0hat does it mean.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 159, 852-859 (1969).</li>
<li>Bogdanova, O. V., Kanekar, S., D’Anci, K. E., Renshaw, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+behavior+in+the+forced+swim+test%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Factors influencing behavior in the forced swim test.</a> Physiology & Behavior. 118, 227-239 (2013).</li>
<li>Porsolt, R. D., Anton, G., Blavet, N., Jalfre, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+despair+in+rats%3A+A+new+model+sensitive+to+antidepressant+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Behavioral despair in rats: A new model sensitive to antidepressant treatments.</a> European Journal of Pharmacology. 47 (4), 379-391 (1978).</li>
<li>Hunsberger, J., Dunman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+depression-like+and+anxiety-like+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol+Exchange%22%5BJournal%5D)">Animal models for depression-like and anxiety-like behavior.</a> Nature Protocol Exchange. , (2007).</li>
<li>Hommel, J. D., Sears, R. M., Georgescu, D., Simmons, D. L., DiLeone, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+gene+knockdown+in+the+brain+using+viral-mediated+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Local gene knockdown in the brain using viral-mediated RNA interference.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1539-1544 (2003).</li>
<li>Mao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupted+in+schizophrenia+1+regulates+neuronal+progenitor+proliferation+via+modulation+of+GSK3beta%2Fbeta-catenin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disrupted in schizophrenia 1 regulates neuronal progenitor proliferation via modulation of GSK3beta/beta-catenin signaling.</a> Cell. 136 (6), 1017-1031 (2009).</li>
<li>Clark, M. S., Sexton, T. J., McClain, M., Root, D., Kohen, R., Neumai, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+5-HT1B+receptor+in+dorsal+raphe+nucleus+using+herpes+simplex+virus+gene+transfer%2C+increases+anxiety+behavior+after+inescapable+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Overexpression of 5-HT1B receptor in dorsal raphe nucleus using herpes simplex virus gene transfer, increases anxiety behavior after inescapable stress.</a> Journal of Neuroscience. 2 (11), 4550-4562 (2002).</li>
<li>Tasan, R. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+central+and+basolateral+amygdala+are+critical+sites+of+neuropeptide+Y%2FY2+receptor-mediated+regulation+of+anxiety+and+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The central and basolateral amygdala are critical sites of neuropeptide Y/Y2 receptor-mediated regulation of anxiety and depression.</a> Journal of Neuroscience. 30 (18), 6282-6290 (2010).</li>
<li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titration+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protoc+Hum+Gen%22%5BJournal%5D)">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Current Protoc Hum Gen. 12 (12.10), (2007).</li>
<li>Carter, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetizing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Anesthetizing mice.</a> Methods Mol Biol. 18, 135-136 (1993).</li>
<li>Alachkar, A., Jiang, D., Harrison, M., Zhou, Y., Chen, G., Mao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+EJC+factor+RBM8a+regulates+anxiety+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">An EJC factor RBM8a regulates anxiety behaviors.</a> Current Molecular Medicine. 13 (6), 887-899 (2013).</li>
<li>Bernal, J., Baldwin, M., Gleason, T., Kuhlman, S., Moore, G., Talcott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+rodent+survival+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Surgery%22%5BJournal%5D)">Guidelines for rodent survival surgery.</a> Journal of Investigative Surgery. 22, 445-451 (2009).</li>
<li>Wahlsten, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+ready+for+testing.+Mouse+Behavioral+Testing%3A+How+to+use+mice+in+behavioral+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Academic+Press%22%5BJournal%5D)">Getting ready for testing. Mouse Behavioral Testing: How to use mice in behavioral neuroscience.</a> Academic Press. , 133-141 (2011).</li>
<li>Kheirbek, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+control+of+learning+and+anxiety+along+the+dorso-ventral+axis+of+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential control of learning and anxiety along the dorso-ventral axis of the dentate gyrus.</a> Neuron. 6 (77), 955-968 (2013).</li>
<li>Snyder, J. S., Soumier, A., Brewer, M., Pickel, J., Cameron, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+hippocampal+neurogenesis+buffers+stress+responses+and+depressive+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adult hippocampal neurogenesis buffers stress responses and depressive behaviors.</a> Nature. 476 (7361), 458-461 (2011).</li>
<li>Sik-Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+neuronal+vascular+endothelial+growth+factor+expression+by+cAMP+in+the+dentate+gyrus+of+the+hippocampus+is+required+for+antidepressant-like+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Induction of neuronal vascular endothelial growth factor expression by cAMP in the dentate gyrus of the hippocampus is required for antidepressant-like behaviors.</a> Journal of Neuroscience. 29 (26), 8493-8505 (2009).</li>
<li>Miller, D. G., Adam, M. A., Miller, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+by+retrovirus+vectors+occurs+only+in+cells+that+are+actively+replicating+at+the+time+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene transfer by retrovirus vectors occurs only in cells that are actively replicating at the time of infection.</a> Molecular and Cellular Biology. 10 (8), 4239-4242 (1990).</li>
<li>Rubinson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lentivirus-based+system+to+functionally+silence+genes+in+primary+mammalian+cells%2C+stem+cells+and+transgenic+mice+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference.</a> Nature Genetics. 33, 401-406 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Succesvolle stereotactische injecties afhankelijk van drie factoren: het houden van de muis in leven, het instellen van het juiste nulpunt voor coördinaten (tip van de naald op de kruising van bregma en de interaurale lijn), en het instellen van de juiste diepte aan het nulpunt (tip van de naald alleen aanraken van de buitenzijde van het hersenweefsel). De levensvatbaarheid van de muizen belang. Chirurgie overleving kan worden geholpen door ervoor te zorgen dat de muis goed is verdoofd en krijgt voldoende pijnstillende....

De muis is op grote schaal gebruikt in neurobiologie omdat het gemakkelijk genetisch te manipuleren. Gene knockout technieken kunnen de onderzoekers te onderzoeken hoe elke genetische factor vormen muis gedrag. Bovendien is het cre-loxP systeem een waardevol instrument voor weefsel- en cel type- specifiek gen knockout muizen, die onderzoekers in staat stelt bestudering van genfunctie in verschillende weefsels. 1 In de praktijk, expressiepatronen van cre promoters zijn moeilijk te beheersen , en tot nu toe veel gevestigde cre stuurprogramma&#39;s zijn niet regio-specifieke expressie bereikt. 2,3 Alternatief stereotactische injectie is een methode die specifieke hersengebieden van de volwassen muis gericht. Door het injecteren van genetisch gemanipuleerde virussen die cDNA of shRNA kan regiospecifieke modulering van genexpressie bereikt. Hoewel de omvang van de hersenen van elke muis varieert, kan de locatie van specifieke hersengebieden worden bepaald met behulp van stereotactische coördinatienates ingesteld van oriëntatiepunten op de schedel van de hersenen van muizen. De meest gebruikte monumenten zijn bregma, lambda, en de interaurale lijn. Met coördinaten verkregen uit een hersenatlas kan 4 de exacte locatie van elk hersengebied worden geïdentificeerd door de antero-posterior (A / P), mediaal-lateraal (M / L) en dorsale-ventrale (D / V) as van bregma / interaurale lijn kruising. Typisch Virussen geïnjecteerd in de hersenen van muizen gelabeld met ofwel rood of groen fluorescent eiwit (RFP en GFP), waardoor injecties kan worden bevestigd door fluorescentie microscopie. Behavioral evaluaties van muizen zijn vooral nodig voor fundamenteel onderzoek van psychiatrische stoornissen. Symptomen van psychiatrische stoornissen bij patiënten betrekken meestal abnormaal gedrag. Sommige van deze menselijke gedragingen evolutionair geconserveerd en kan direct worden nagebootst en waargenomen in de muis. Bijvoorbeeld kan depressie worden gemodelleerd in de muis door meting behavioral wanhoop. Mensen met een depressie often het gevoel alsof ze niets doen zal ooit helpen, een symptoom dat uiteindelijk kan leiden tot zelfmoord. Bij knaagdieren, kan deze worden gemodelleerd met behulp van de temperatuur zwemtest (FST), die de hoeveelheid tijd die een muis zwemmen versus drijvend in een plas water (gezien vanaf opgeven) meet. Dit paradigma is gevalideerd door het redden van het fenotype met anti-depressiva. 7,8,9 Muizen die anti-depressiva hebben ontvangen zal aanzienlijk minder tijd immobiel te besteden in vergelijking met onbehandelde controles. Een andere gedragstest, het Open Gebied Test (OFT) is ontworpen om voortbeweging beoordelen muizen, en bovendien kan worden gebruikt om de angstige fenotype bij muizen geanalyseerd. 5,6 Deze test is gebaseerd op de vooronderstelling dat muizen zich veiliger ze dichtbij aan de wand in een nieuw open veld. Wild-type muizen zal uiteindelijk verkennen van de nieuwe omgeving, zoals ze zijn nieuwsgierige dieren. Echter, minder tijd in het midden van het veld geeft angst bij de muis, omdat de muis niet in staat om de initia overwinnenl angst veroorzaakt door een nieuwe omgeving. De angst van de muis, zoals gekwantificeerd door de hoeveelheid tijd doorgebracht in het centrum van een open veld, vergelijkbaar met de klinische angst bij mensen, die in vele psychiatrische stoornissen. De combinatie van stereotactische injecties van gedragsparadigma&#39;s is een nieuwe manier om doelgericht hersengebied de expressie van een specifiek gen te wijzigen. Het effect van gemoduleerde genexpressie op muis gedrag kan dan worden bepaald. In tegenstelling tot volledige hersenen knockout Deze werkwijze is bijzonder nuttig omdat het alleen gericht specifieke hersengebieden. Daarnaast worden stereotactische injecties typisch uitgevoerd in de volwassen wildtype muis derhalve endogene genexpressie wordt gehandhaafd gedurende ontwikkelingsstadia. Deze methode zal het verwarren effect te vermijden als het gen vereist is voor overleving tijdens de embryonale en postnatale ontwikkelingsstadium. Een belangrijke beperking is dat de experimentele muizen moeten throug gaanh een invasieve chirurgie, waarbij de schedels van muizen te openen. Bovendien wordt de mate van modulatie gen bepaald door de titer en de efficiëntie van het virus. Het virus moet worden geïnjecteerd in de juiste regio middels stereotactische coördinaten, waarbij speciale instrumenten vereist. Controle van de juiste injectieplaats kan alleen worden voltooid post mortem. Deze werkwijze is eerder gebruikt om de betrokkenheid van een specifiek gen in verschillende neurologische aandoeningen testen. Virale gemedieerde RNAi gericht op het Th-gen (waardoor dopamine te synthetiseren) werd geïnjecteerd in de substantia nigra compacta en locomotorische gedragsanalyse uitgevoerd. 10 Een andere studie gebruikte stereotactische injectie van een lentivirus silencing DISC1 te muisgedrag dan worden geëvalueerd schizofrenie. Knockdown van DISC1 geleid tot meer beweging in reactie op de nieuwigheid (parallellen positieve symptomen bij schizofrenie), en een grotere onbeweeglijkheid in deFST. 11 Evenzo is de aanvullende studie bleek dat 5-HT1B overexpressie geleid tot meer verkenningsgedrag in het OFT, in overeenstemming met een anti-angst fenotype met deze methode. 12 Stereotactische injecties cre virus leveren recombinatie induceren in cre-loxP muizen . Deze methode werd gebruikt om de Y2 receptor in de amygdala en de bed kern van de stria terminalis één verwijderen. Bij gedragsanalyse, werden deze muizen blijkt een antidepressieve fenotype wanneer het gen in de centrale amygdala is verwijderd, maar geen fenotype wanneer het gen in de basolaterale amygdala of bed kern van de stria terminalis is verwijderd. 13 Aldus is deze techniek verschaft een uniek instrument om de genetische invloed op dierlijke gedrag bestuderen.

<table><tbody><tr><td>Stereotactic Apparatus item 51725</td><td>Stoelting co.</td><td>51725</td><td></td></tr><tr><td>Quintessential stereotaxic pump&nbsp;</td><td>Stoelting co.</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>Injection Syringe, 65 RN</td><td>Hamilton</td><td>7633-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>PEI&nbsp;</td><td>Polysciences Inc.</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Blunt end forceps</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>Needle holder&nbsp;</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Ram Products Inc</td><td>Microtorque control box, Tech2000 handpiece</td><td>with pedal</td></tr><tr><td>Glass bead sterilizer</td><td>Inotech&nbsp;</td><td>IS-400</td><td></td></tr><tr><td>Absorbable sutures&nbsp;</td><td>Unify</td><td>M-K518r19</td><td>Absorbable, reverse cutting</td></tr><tr><td>Cotton swabs</td><td>VWR</td><td>89031-270</td><td></td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>Gaymar</td><td>T-pump TP-500 PN11184-000</td><td></td></tr><tr><td>Artificial tears</td><td>Rugby</td><td>NDC 0536-6550-91</td><td></td></tr><tr><td>Disposable syringe</td><td>BD Syringe</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>Cloth</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gloves&nbsp;</td><td>Ansell</td><td>Senseitouch #7823</td><td></td></tr><tr><td>Avertin or other anesthetic</td><td>see recipe citation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen or other analgesic</td><td>see veternarian&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tracking software</td><td>Noldus</td><td>Ethovision XT</td><td></td></tr><tr><td>Tracking Camera</td><td>Noldus</td><td>Media Recorder</td><td></td></tr></tbody></table>

het toepassen van stereotactische injectie techniek om genetische effecten op animal gedrag studie

Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors

Stereotactische injectie is een nuttige techniek om hoge titer lentivirussen leveren aan gerichte hersengebieden bij muizen. Lentivirussen kunnen hetzij overexpressie of knockdown genexpressie in een relatief geconcentreerde gebied zonder significante schade aan het hersenweefsel. Na het herstel, kan de geïnjecteerde muis worden getest op verschillende behavioral taken, zoals het open veld Test (OFT) en de Gedwongen Swim Test (FST). De OFT is ontworpen om de voortbeweging en de angstige fenotype bij muizen beoordelen door het meten van de hoeveelheid tijd die een muis doorbrengt in het midden van een nieuw open veld. Een angstig muis aanzienlijk minder tijd in het midden van het nieuwe veld in vergelijking met controles. De FST beoordeelt de anti-depressieve fenotype door het kwantificeren van de hoeveelheid tijd die de muizen onbeweeglijk doorbrengen indien opgelost in een emmer water. Een muis met een anti-depressieve fenotype zal aanzienlijk minder tijd immobiel vergelijking met controledieren brengen. Het doel van dit protocol is om de ster te gebruikeneotactic injectie van een lentivirus in combinatie met gedrags-tests om te beoordelen hoe genetische factoren moduleren dierlijk gedrag.

<html> Accurate stereotactische injectie leunt zwaar op het instellen van de juiste coördinaten. De punt van de naald gebruikt om het virus te injecteren moeten rechtstreeks worden ingesteld op de kruising van bregma en de interaurale lijn (figuur 1). Het is nuttig om een ​​stereomicroscoop gebruiken om na te gaan of de naald correct is geplaatst. Bij het zoeken door de microscoop moet de naald worden geplaatst dat wanneer het virus werden geïnjecteerd, zou direct landen op de kruising van bregma en de i...

Stereotactische injectie van lentivirussen uiten cDNAs of shRNAs kan genexpressie moduleren in specifieke hersengebieden van muizen. Hier presenteren we een protocol om stereotactische injecties te combineren met gedragsproblemen taken, zoals het open veld Test (OFT) en de Gedwongen Swim Test (FST).

Het toepassen van stereotactische injectie techniek om genetische effecten op Animal Gedrag Studie

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or ...

Het algemene doel van deze procedure is om vast te stellen hoe het moduleren van de expressie van een gen in een doelgebied het gedrag van een dier beïnvloedt. Dit wordt bereikt door eerst een lentivirus te creëren om de expressie van het doelgen te moduleren. De tweede stap is het gebruik van stereotactische injectie om het lentivirus in een specifiek hersengebied van een ER-knaagdier te injecteren.Vervolggedragingen, zoals angst en depressie, kunnen kwantitatief worden gemeten met behulp van gevestigde gedragsparadigma's. De laatste stap is het uitvoeren van histologie om de correcte injectieplaats te bevestigen. Uiteindelijk kan stereotactische injectie in combinatie met gedragsbeoordeling aantonen hoe een specifiek gen in een doelgebied het gedrag van muizen kan beïnvloeden.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat wetenschappers de expressie van een enkel gen in een klein, gericht gebied kunnen wijzigen en vervolgens gedragsveranderingen bij muizen kunnen evalueren. Om deze procedure te starten, plaatst u een geanestheseerde muis in het stereotactische apparaat, bevestigt u de voortanden aan de voorste klem en fixeert u de kaak. Vo

applying-stereotactic-injection-technique-to-study-genetic-effects-on

Research

JoVE Journal

Behavior

Gedrag

Source: Porlan, E., et al. Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates stable genetic modification of neural stem cells (NSCs) in the ventricular-subventricular zone (V-SVZ) through stereotaxic injection of a virus-carrying therapeutic gene in a mouse model. The virus enters NSCs, undergoes reverse transcription, integrates into the genome, and...

Stereotaxic Injection of Viruses for Stable Genetic Modification in a Mouse Model

Source: Fricano-Kugler, C. J., et al. Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates stereotaxic viral injection for precise neuronal gene editing in the mouse brain. The protocol ensures accurate virus delivery to the dentate gyrus, enabling fluorescent labeling and CRISPR-mediated gene knockout to study neural circuits, gene function, and disease mechanisms in vivo.

Stereotaxic Viral Injection for Targeted Neuronal Gene Editing in the Mouse Brain

In dit artikel wordt beschreven hoe u virale vectoren microinject in de hersenen van muizen en vervolgens te testen in een geconditioneerde voorkeur paradigma plaats die een overname, uitsterven en herstel fase omvat.

Stereotactische Micro-injectie van virale vectoren uitdrukken Cre Recombinase om de rol van Target Genen in Cocaine Geconditioneerd Place Voorkeur Studie

Hier beschrijven we een procedure gebaseerd op het gebruik van lentivirale deeltjes voor de langetermijn genetische modificatie van neurale stamcellen en/of hun aangrenzende ependymale cellen in de volwassen ventriculair-subventriculaire neurogene niche, wat de aparte analyse mogelijk maakt van cel-autonome en niet-autonome, niche-afhankelijke effecten op neurale stamcellen.

Stabiele en efficiënte genetische modificatie van cellen in de Adult Mouse V-SVZ voor de Analyse van de neurale stamcel autonome en niet-autonome Effects

In dit artikel wordt beschreven hoe u virale vectoren te injecteren in de muis frontale cortex gedragsproblemen assays die GPCR heteromere vorming nodig te testen.

HSV-Mediated Transgene Expressie van Chimere constructen tot Behavioral functie van GPCR heteromeren in Muizen Studie

We beschrijven een protocol van stereotaxic chirurgie met een zelfgemaakte hoofd-fixed device voor microinjecting reagentia in het striatum van neonatale muis hersenen. Deze techniek maakt het mogelijk specifieke genmanipulatie in neuronale cellen van bepaalde regio's van neonatale muis hersenen.

Stereotaxic chirurgie voor genetische manipulatie van striatale cellen van neonatale muis hersenen

Dit protocol beschrijft een reeks methoden voor het identificeren van de cel-type specifieke functionele connectiviteit van lange-bereik ingangen van verre hersengebieden met behulp van optogenetische stimulaties in ex vivo hersenen segmenten.

In vivo intracerebrale Stereotaxic injecties voor Optogenetische stimulatie van lange-afstand ingangen in muis hersenen segmenten

De rol van recent ontdekte ziekte-geassocieerde genen in de pathogenese van neuropsychiatrische aandoeningen blijft onduidelijk. Een gemodificeerde bilaterale in utero elektroporatie techniek maakt de genoverdracht in grote populaties neuronen en onderzoek van de veroorzakers van genexpressie veranderingen op sociaal gedrag mogelijk.

Een pijpleiding die bilaterale in Utero-elektroporatie gebruikt om genetische invloeden op knaagdiergedrag te ondervragen

Het huidige protocol beschrijft een praktische strategie om de verificatiestap van stereotaxische injectiecoördinaten te versnellen voordat virale tracering wordt uitgevoerd met behulp van kleurstoffen en bevroren secties.

Voorlopige validatie van stereotaxische injectiecoördinaten via cryosectie

MicroRNA een belangrijke rol spelen in hersenstructuur en functie. Hier beschrijven we een methode om hippocampus miRNA dwingen over-expressie met behulp van stereotactische injectie van een aangelegde miRNA-expressie lentivirus. Deze benadering kan dienen als een relatief snelle manier om te...

Stereotactische injectie van MicroRNA expressie Lentivirussen om de muis Hippocampus CA1 regio en Evaluatie van de Behavioral Outcome

Leer stereotactische injectietechnieken om genexpressie in muizenhersenen te moduleren en gedragsveranderingen te meten. Deze methode combineert lentivirale injecties met gedragstests voor neurowetenschappelijk onderzoek.

Het toepassen van stereotactische injectie techniek om genetische effecten op Animal Gedrag Studie

Meer video's verkennen