Gebruik makend van de Antigen Capsid-Incorporation strategie voor de ontwikkeling van adenovirus serotype 5-Vectored Vaccin Approaches

Het algemene doel van deze procedure is om de antigen caps-incorporatiestrategie te gebruiken voor de ontwikkeling van adenovirus serotype vijf vector-gebaseerde vaccinbenaderingen met behulp van een recombinant divalent adenoviraal vector als bewijs van principe door de antigen capsid-incorporatiestrategie te gebruiken, worden meerdere kloneringstappen gebruikt om het gemodificeerde plasmide te construeren, A D vijf R een K-W-S-H-V-R vijf hiss. Vervolgens de divalente adenyl virale vector. R een K was HVR vijf.

Hiss wordt gered, vermeerderd en gezuiverd. Daarna worden de virale titers en de antigene weergave van geïncorporeerde antigenen op de virale capsid gekenmerkt. Ten slotte wordt het potentieel van de Divalent Aden virale vector om neutralisatie door een D vijf positieve sera te omzeilen geëvalueerd door de antigen capsid-incorporatiestrategie te gebruiken.

Meerdere kloneringstappen worden gebruikt om het gemodificeerde plasmide te construeren, A D vijf R een K-W-A-S-H-V-R vijf hiss. Vandaag zullen we de antigen capsid-incorporatiestrategie demonstreren. Deze strategie is gunstig in vergelijking met andere strategieën zoals de transgen expressiemethode omdat het niet alleen het geïnteresseerde antigeen op het adenovirus als een eiwit weergeeft, maar het ook een robuuste humorale respons tegen dat antigeen toestaat.

Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat stappen met betrekking tot de generatie van de cap-modificerende adenovirus moeilijk te leren zijn omdat veel variabelen bijdragen aan de ontwikkeling van de aanbevolen virale vectoren, zoals de selectie van de restrictie-enzymen, de lens van de energie van interesse in anderen. Het demonstreren van de procedures. Vandaag zullen mijn twee postdocs, Dr. Lin Lin Gu en Dr. Nitra Farrow, zijn. Ook Alexandre Kren, de onderzoeksmedewerker in het laboratorium Om de shuttle-plasmide te construeren, voegt u zes eenheden toe van een GE een en een CCC een tot zes microgram van het HVR een KWA-fragment.

Incubeer de verteringsreactie gedurende drie uur bij 37 graden Celsius. Los het verteringsfragment op in een 2% agros-gel door elektroforese en gebruik een DNA-gel-extractiekit volgens het protocol van de fabrikant om het fragment te zuiveren. Lijmen vervolgens 12 nanogram van het gezuiverde fragment in de a G een en ACC een sites van de 100 nanogram van de eerder geconstrueerde shuttle-plasmide.

HVR vijf hiss zes pH vijf s en een 10 microliter reactievolume bij kamertemperatuur gedurende twee uur. Voeg vervolgens een microliter van de ligatiereactie toe aan 50 microliters van elektrocompetente DH vijf alfa-cellen, een elektro acht voordat u 950 microliters SOC-medium toevoegt. Incubeer de getransformeerde cellen gedurende een uur bij 37 graden Celsius en 200 RPM voordat u 100 tot 200 microliter van de cultuur op een LB CANY-plaat spreidt.

Incubeer overnacht bij 37 graden Celsius. Gebruik zes eenheden van Echo R een en PME een om zes microgram van het gezuiverde shuttle-plasmide bij 37 graden Celsius gedurende drie uur te verteren. Na het zuiveren van het fragment dat homologe recombinatie-armen en het dubbel gemodificeerde exon vijf-gen bevat, gebruikt u SUA een om het ruggengraatplasmide, PAD vijf, delta H vijf te lineariseren om homologe recombinatie uit te voeren.

Gebruik elektroporatie om 100 nanogram van elk van de gezuiverde shuttle-fragment en het ruggengraatplasmide co-te transformeren in 50 microliters van elektrocompetente BJ 5 180 3-cellen. Zoals eerder in deze video is aangetoond, pikt u de volgende dag ongeveer 10 kolonies in drie milliliter vloeibare LB met can mycine en laat u ze overnacht groeien voordat u ze volgens het tekstprotocol screent. Transformeer vervolgens 100 nanogram gezuiverd plasmide in DH vijf alfa-cellen zoals eerder is aangetoond om de add virale vector te redden.

Begin met het gebruik van PAC een om 15 microliters van de vector in een 100 microliter-volume te lineariseren. Incubeer gedurende drie uur bij 37 graden Celsius na de vertering. Om het gelinieerde plasmide onder een dampkap te extraheren.

Voeg een gelijk volume fenol chloroform, isoamylalcohol toe aan de reactie, centrifugeer gedurende één minuut bij 10.000 G en verzamel supernatant voordat u de extractie herhaalt en de spin naar het geëxtraheerde volume. Voeg 300 microliter 100% ethanol en 10 microliter acetaat toe, centrifugeer gedurende 10 minuten bij 10.000 G. Nadat u het supernatant hebt weggegooid, voegt u 700 microliter 70% ethanol toe voordat u opnieuw centrifugeert.

Zodra de pellet is geresuspendeerd en het DNA is gekwantificeerd, transfecteert u drie microgram van het gelinieerde plasmide samen met commercieel liposomaal transfectie reagens in een eerder bereide T 25 fles van 80% confluente HEK 2 93-cellen volgens de instructies van de fabrikant. Na zes uur incubatie, vervangt u het transfectiemedium door compleet medium voordat u de fles terugbrengt naar de incubator. Wanneer plaques een volledige cytopatogene effect of CPE onder een steriele kap ontwikkelen, schraap de resterende cellen van de fles en centrifugeer de cultuur gedurende 10 minuten bij 300 G en vier graden Celsius.

Gebruik vervolgens één milliliter medium met 2% FBS om het celpellet te resuspenderen. Breek vervolgens de cellen door vier rondes vries-ontdooiing uit te voeren en centrifugeer het lysaat vervolgens gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Verzamel de S-supernatant die het geredde virus bevat om de virale vector op een grootschalige cultuur te propageren.

Een derde tot alle virale lysaat van de T 25 fles in een T 75 fles met HEK 2 93-cellen. Nadat u de volledige CPE hebt laten ontwikkelen en de supinaat hebt geoogst zoals eerder is aangetoond, propageer u de helft van al het virus in een of meer. T 1 75 flessen van HK 2 93-cellen, vervolgens propageer u het virus geïsoleerd van de T 1 75 flessen in een dozijn of meer.

T 1 75 flessen cellen na het bereiden van één punt 33 gram per milliliter en 1,45 gram per milliliter. Cesium