Methoden voor het kweken van menselijke dijbeen weefselexplantaten naar Breast Cancer Cell Kolonisatie van het gemetastaseerde Niche Bestudeer

Het doel van deze procedure is om de proliferatie, kolonisatie en migratie van borstkankercellen te bestuderen in een explantaat-modelsysteem van menselijk botweefsel. Dit wordt bereikt door fragmenten van trabeculair botweefsel te isoleren uit chirurgische specimens van de femurkop en deze te kweken met borstkankercellen die luciferase en groen fluorescerend proteïne tot expressie brengen. Bioluminescentie-imaging wordt gebruikt om de proliferatie van cellen te meten en de kolonisatie van borstkankercellen in de botweefselfragmenten te verifiëren.

Patronen van kolonisatie door borstkankercellen worden in beeld gebracht met fluorescentiemicroscopie. Het mergcompartiment kan uit de fragmenten worden gespoeld voor analyse via flowcytometrie, luminescentie- en kleuringsassays. De migratie van borstkankercellen naar weefselkweeksupernatanten en botweefselfragmenten wordt gemeten in Transwell-migratiekamers met bioluminescentie-imaging. Bot is de meest voorkomende locatie voor borstkankermetastasen, en uiteindelijk biedt dit model een nieuw venster voor het bestuderen van borstkankercellen binnen de botmetastatische niche.

Een groot voordeel van dit model is dat het directe toegang biedt tot de micro-omgeving van fragmenten van menselijk botweefsel, waardoor we het gedrag van borstkankercellen tijdens kortstondige co-cultuurexperimenten eenvoudig kunnen observeren en analyseren. Deze methode kan worden gebruikt om kernvragen te bestuderen over de mechanismen die ten grond liggen aan borstkankermetastasen naar het bot, met als doel therapeutische strategieën te identificeren om dit proces effectief te voorkomen en te behandelen. Hoewel dit model inzicht kan verschaffen in borstkankermetastasen, kan het ook worden gebruikt om andere botzoekende maligniteiten te bestuderen, zoals prostaatkanker.

Fragmenten van botweefsel moeten op verschillende momenten in elke assay worden geoogst. Dit begint met het verzamelen en transporteren van een femurspecimen in zoutoplossing en het voorbereiden van het werkstation in een biosafety cabinet onder het dragen van een chirurgische handschoen. Pak de femurkop met één hand vast en gebruik een chirurgische zaag om trabeculair bot te extraheren.

De fragmenten hebben een grootte van ongeveer twee tot vijf millimeter. Pincetten zijn voor deze stap niet geschikt. U heeft een chirurgische zaag van goede kwaliteit nodig.

Bereid voor dit experiment een suspensie van borstkankercellen voor met 100.000 cellen per 50 µL DMEM plus 10% FBS. Bereid daarnaast pluggen van botwas voor om de botfragmenten te mobiliseren door gebruik te maken van de afgesneden uiteinden van een micropipetpunt en bewaar de pluggen in een Petrischaal. Breng de pluggen vervolgens met een pincet over naar een zes-wells plaat en druk de pluggen met een steriele handschoen op de 12-uurspositie.

Pipette vervolgens 50 µL van de celsuspensie in het midden van elke put. Plaats de plaat gedurende 45 minuten in een weefselkweekincubator om de celhechting te bevorderen. Terwijl de plaat incubeert, worden de botfragmenten met de aangehechte cellen uitgesloten. Plaats in drie putten een botweefselfragment op de botwas en druk deze aan met de GER. De drie putten zonder fragmenten dienen als controles.

Voeg vervolgens langzaam vijf milliliter DMEM plus 10% FBS toe aan de wand van elke well. De botwas en botfragmenten mogen niet worden verschoven. Incubeer de cultuur daarna gedurende 20 tot 24 uur.

Maak de volgende dag eerst beelden van de cellen. Voeg 300 micrograms per milliliter Lucifer toe aan elke well en maak direct daarna beelden van de plaat met een Ivis imaging platform. Voor dit experiment is een borstkankercelsuspensie nodig, vergelijkbaar met de vorige.

Nadat de botfragmenten zijn geëxtraheerd, gebruikt u een pincet om elk fragment over te brengen naar een lege well van een 24-wells plaat. Pipetteer vervolgens 50 µL cel-suspensie direct op elk botfragment en plaats de plaat gedurende 45 minuten in een incubator om de celadhesie te bevorderen. Wanneer de cellen zijn gehecht, voegt u voorzichtig één tot twee mL medium toe aan elke well, voldoende om het botfragment volledig te onderdompelen. Plaats de plaat vervolgens gedurende 20 tot 24 uur in de weefselkweekincubator.

Ter voorbereiding op Ivis-imaging, fluorescentie-imaging of het verzamelen van beenmergcellen voor analyse voor Ivis-imaging, worden de botfragmenten overgebracht naar een 24-wells plaat met één milliliter vers medium per well. Voeg 300 µg/mL Lucifer toe aan elke well en ga verder zoals eerder beschreven voor fluorescentiemicroscopie. Pipetteer vijf µL fluorescente bisfosfaat-labelingsoplossing in elke well om de botspicula van het botfragment te labelen en incubeer de plaat nog eens 24 uur.

Breng 24 uur later met een pincet de fragmenten over naar platen met fenolroodvrij medium. Bekijk de platen vervolgens met een fluorescentiemicroscoop die is ingesteld op 485 nanometers om GFP-expresserende borstkankercellen te lokaliseren en op 680 nanometers om met bisfosfaat gelabelde botspicula te identificeren. Spoel het beenmergcompartiment leeg voor analyse van het aantal cellen of de celkenmerken.

Breng een fragment over naar een zeef van 70 micron boven een chronicle-buis van 50 milliliter. Gebruik vervolgens een spuit van 10 milliliter met een naald van 25 gauge om het fragment krachtig door te spoelen met 10 milliliter PBS. Centrifugeer de suspensie bij 300 G gedurende drie minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelletteren; aspireer en verwijder het supernatant.

Resuspendeer het pellet mergcellen in PBS of andere gewenste oplossingen voor flowcytometrie of levensvatbaarheidsassays. Begin met het genereren van botweefsel-suspensies. Plaats botfragmenten in de wells van een 12-wells plaat.

Vul de wellplaat met 2,2 milliliters DMEM 10%FBS per well en laat enkele controlewells zonder botfragmenten. Kweek de plaat gedurende 24 uur. Aspireer vervolgens het medium, vervang dit en zet de kweek voort voor nog eens 24 uur; na 48 uur kweektijd wordt 0,9 milliliters supernatant overgebracht naar een opvangplaat, terwijl de opvangplaat tijdelijk wordt geïncubeerd.

Plaats transwell-inserts in een lege 24-wellplaat. Pipetteer vervolgens 100 000 borstkankercellen in 350 µL op elk insert. Cultiveer de platen daarna gedurende 45 minuten om de celhechting te bevorderen. Gebruik na 45 minuten een pincet om de inserts over te brengen naar een opvangplaat.

Zorg ervoor dat de inserts schuin worden geplaatst wanneer u ze in de houder zet. Supineer grondig zodat er geen luchtbellen ontstaan. Incubeer de plaat met inserts vervolgens gedurende 20 uur bij 37 °C tot de volgende dag.

Gebruik een pincet om de inserts te verwijderen en voeg aan elk 300 micrograms per milliliter Lucifer toe. Voer bioluminescentie-imaging uit op de opvangplaat om borstkankercellen te detecteren die door de membranen zijn gemigreerd en zich hebben gehecht aan de bodem van de wells van de opvangplaat. Vul eerst een opvangplaat met medium en plaats deze in de weefselkweekincubator.

Om de inserts te zaaien: plaats deze omgekeerd in een lege microfugebuisjesdoos met deksel. Voeg vervolgens 100.000 cellen in 50 µL toe aan het buitenste bottomoppervlak van elk insertmembraan.

Dek de doos af maar laat het deksel op een kier staan en incubeer de inzetten gedurende 45 minuten in de weefselkweekincubator. Gebruik vervolgens een pincet om de inzetten om te keren en over te brengen naar de wells van een opvangplaat met elk 0,45 milliliters DMEM met 10% FBS. Voeg daarna een botfragment van drie millimeter of een glazen kraal toe aan elke inzet en zet de plaat gedurende 20 uur in de incubator.

Gebruik de volgende dag een pincet om de fragmenten en beads over te brengen naar een plaat met wells die een milliliter vers medium bevatten. Voeg 300 µg/mL Lucifer per well toe en ga verder met bioluminescentie-imaging. MDA MB 2 31 F.Luke EGFP.

Borstkankercellen werden gecocultiveerd naast geïmmobiliseerde botfragmenten om de proliferatie van borstcellen te meten. Bioluminescentie-imaging na 24 uur cultuur toonde een verhoogde proliferatie van borstkankercellen aan in de aanwezigheid van botfragmenten in de bovenste drie wells, vergeleken met de afwezigheid van botfragmenten in de onderste drie wells. De resultaten van experimenten met fragmenten van drie afzonderlijke chirurgische specimens toonden een verhoogde proliferatie aan in de aanwezigheid versus de afwezigheid van bot.

In alle drie de gevallen werd met bioluminescentie-imaging na 24 uur kolonisatie waargenomen van MCF seven F Luke EGFP-cellen die direct onder botweefselfragmenten waren geplaatst. Een afnemend signaal was geassocieerd met een dalende zaaidichtheid na 48 uur. Direct gezaaide fragmenten die waren gelabeld met een bisfosfonaatreagens onthulden kolonisatie van de GFP-positieve borstkankercellen binnen de gemineraliseerde compartimenten en het beenmerg.

De migratie van de borstkankercellen door het poreuze migratiemembraan naar botweefselculturen, zichtbaar in de bovenste drie putjes, was robuust in vergelijking met de migratie in de controle. Medium is zichtbaar in de onderste drie putjes. Er werd ook migratie waargenomen in drie botfragmenten van een bepaald THR-specimen, terwijl er geen migratie op de beads werd waargenomen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe menselijke botweefselfragmenten uit een femurhoofd-specimen kunnen worden geëxtraheerd en hoe deze kunnen worden ingezet in co-cultuurassays om het gedrag van borstkankercellen te meten, waaronder migratie, kolonisatie en proliferatie.