Name: Methoden voor het kweken van menselijke dijbeen weefselexplantaten naar Breast Cancer Cell Kolonisatie van het gemetastaseerde Niche Bestudeer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Leer hoe je menselijke dijbeenweefselexplanten kweekt om borstkankercelkolonisatie in het gemetastaseerde niche te bestuderen. Deze methode maakt bioluminescentiebeeldvorming en fluorescentiemicroscopie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studies werden gefinancierd, gedeeltelijk, door subsidies van de Alternatieve Research and Development Foundation (107.588), het National Institute of Health (1U54CA136465-04S1), en de California Breast Cancer Research Program (201B-0141). Wij danken Drs. Andrew Wilber en R. Scott McIvor voor de gulle donatie van hun <pkt2 lubig=""> transponson en PK / hUbiC-SB11 transposasegen plasmiden. Wij dankbaar erkennen John Tamaresis, Ph.D. voor advies over statistische methoden, Timothy Brown voor het uitvoeren van flowcytometrie, Georgette Henrich voor advies over migraties testen, en Nancy Bellagamba voor de inzameling van THR exemplaren vergemakkelijken. </pkt2>

Femurkoppen werden verzameld van patiënten die een electieve THR chirurgie in de afdeling orthopedische chirurgie aan de Stanford University School of Medicine. Alle weefsels werden verzameld als-de aangewezen exemplaren in overeenstemming met de voorschriften van de Stanford University Research Compliance Office. 1. Het selecteren van een cel Borstkanker Line (s) <ol><li> Verkrijgen of transfecteren de gewenste borstkanker cellijn (s) met een luciferase-GFP reporterconstruct. De volgende experimenten werden uitgevoerd met behulp van MDA-MB-231 en MCF-7 borstkanker cellijnen gemanipuleerd voor de stabiele expressie van vuurvlieg luciferase (Fluc) en versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP) door transfectie met Doornroosje transposon plasmide pKT2 / Lubig en de transposase plasmide pK / hUbiC-SB11 45,46. OPMERKING: De getransfecteerde cellijnen worden aangeduid als MDA-MB-231-fluctuaties-EGFP en MCF-7-fluctuaties-EGFP. </li></ol> 2. Isoleren Tissue Fragments uit femurkoppen <ol><li> Volgende THR chirurgie, het verzamelen van de afgedankte heupkop in een steriele container gevuld met fysiologische zoutoplossing. Het analysemonster overbrengen in het laboratorium en verwerken binnen 1-3 uur van de operatie. Opmerking: als er een vertraging in de verwerking, plaatst het monster bij 4 ° C. </li><li> Bereid een werkgebied door het plaatsen van de volgende items op een absorberende mat in een laminaire stroming weefselkweek kap: steriele handschoenen, chirurgische rongeur, forceps, bekerglas met 70% isopropanol instrumenten en weefselkweekvaten spoel zoals hieronder aangegeven voor elk type experiment . </li><li> Het dragen van een steriele chirurgische handschoen de ronde femurkop in één hand, gebruik rongeur in de andere hand trabeculair bot fragmenten van gewenste grootte (~ 2,5 mm) vanaf het blootgestelde bovenste schacht van de femur extraheren. Overdracht botfragmenten in het kweekvat (bijvoorbeeld 6-, 12- of 24-well weefselkweek plaat of migratie kamer), afhankelijk van het type van proliferatie, colonization of migratie-experiment, zoals beschreven in stappen 3, 4 of 5. OPMERKING: Botweefsel fragmenten moeten worden geoogst zoals hierboven beschreven na het voltooien van de eerste stappen voor elke specifieke proliferatie, kolonisatie of migratie assay. Fragmenten variëren in grootte zoals weergegeven in figuur 2. Fragmenten kunnen worden gewogen vóór of na experimenten met het oog op standaardisatie. </li></ol> 3. Co-kweken van borstkankercellen Aangrenzend aan botfragmenten te Breast celproliferatie te meten met behulp van BLI <ol><li> Voorafgaand aan het experiment bereiden van een suspensie met 2 x 10 5 borstkankercellen / 50 ul en pluggen been wax bereiden immobiliseren botfragmenten in kweek. Snijd een P200 micropipet tip in 3 stukken en gebruik het smalle uiteinde van het grootste stuk in een &quot;cookie cutter&quot; manier om kleine (~ 35 mg) stukjes bot was te snijden. Met het brede uiteinde van de kleinste naar de bot was uitgeworpen pluggen in een petrischaalvoor opslag. </li><li> Leg een stukje bot was op de 12 uur positie van elk putje en druk voorzichtig naar beneden met een steriel-gehandschoende wijsvinger. </li><li> Pipetteer 50 ul celsuspensie met 1 x 10 5 borstkankercellen in DMEM-10% FBS + Pen-Strep in het midden van elk putje van een 6-wells plaat. (Als alternatief zaad cellen in een verspreide patroon indien gewenst.) Plaats de plaat in een 37 ° C weefselkweek incubator voor 45 min naar cel gehechtheid te bevorderen. </li><li> Leg 1 stukje bot op 1 stukje bot wax voor elke experimentele goed en zachte druk uit te oefenen met de rongeur om het te beveiligen. Voeren experimenten in drievoud zodanig dat 3 botfragmenten uit een gegeven THR monster worden in de top drie putten geplaatst, terwijl de onderste drie putjes bevatten bot was alleen als controles. </li><li> Pipetteer 5 ml, voorzichtig en langzaam afleveren 5 ml DMEM-10% FBS aan de zijkant van elk putje te vermijden loskomen de borstcellen of botfragmenten. Plaats de plaat in een 3776; C weefselkweek incubator gedurende 20-24 uur. </li><li> Om bioluminescentie beeldvorming te voeren (BLI) verwijder de plaat uit de incubator en voeg luciferin substraat (tot een concentratie van 300 ug / ml te bereiken) aan elk putje. De plaat onmiddellijk op een IVIS Imaging Platform met de volgende parameters: f-stop van 1, kleine binning, belichtingstijd van 1 sec, niveau D. Meet het signaal intensiteit van elke evenals de gemiddelde straling (fotonen / seconde / vierkante centimeter / steradiaal). </li><li> Gebruik imaging software om Regions of Interest (ROI) te definiëren aan de gemiddelde straling te kwantificeren voor alle experimentele en controle putten. Export gemiddelde uitstraling waarden naar een Excel sheet om statistieken uit te voeren en het genereren van grafieken. </li></ol> 4. Co-kweken van borstkankercellen Direct gezaaid op botfragmenten te studeren Kolonisatie en Cell Aantal <ol><li> Gebruik een tang om botfragmenten direct te plaatsen in de lege putjes van een 24-well weefselkweek plaat (1 fragment / putje). </li><li> PipEtte 50 pi celsuspensie druppel DMEM-10% FBS bevattende 1 x 3-06 oktober borstkankercellen direct op elkaar botfragmenten. Plaats de plaat in een 37 ° C weefselkweek incubator gedurende 45 minuten om celhechting bevorderen. Voeg voorzichtig 1-2 ml DMEM-10% FBS in de zijkant van elk putje zodat het fragment volledig wordt ondergedompeld in medium. Incubeer de plaat in een 37 ° C weefselkweek incubator gedurende 20-24 uur. </li><li> Na incubatie tang om elk botweefsel fragment naar een verse plaat met 24 putjes bevattende 1 ml DMEM-10% FBS aan elk putje. Om BLI voeren, volgt u de stappen 3.6-3.7 hierboven. Bovendien kunnen fragmenten worden bekeken met een fluorescentiemicroscoop of weggespoeld het merg populatie analyses van borstkanker celaantallen en eigenschappen te verkrijgen zoals beschreven in stap 6. </li><li> Om de intacte fragmenten voor kwalitatieve evaluatie voor te bereiden met behulp van fluorescentie microscopie volgende BLI, pipet 5 ul van fluorescerende bisfosfonaat labelingoplossing (prevergeleken volgens de instructies van de fabrikant) in elk putje om de gemineraliseerde spicules van de botfragmenten label. Incubeer de plaat in de weefselkweek incubator eens 24 uur. </li><li> Na 24 uur van de cultuur in fluorescerende bisfosfonaat etikettering oplossing, een tang om de fragmenten te dragen aan weefselkweek platen met fenol rood-vrij medium en bekijken met behulp van een fluorescentie microscoop geconfigureerd om het GFP (485 nm) en bisfosfonaat label (680 nm). </li></ol> 5. Het meten van Migratie van borstkankercellen te botweefsel Fragmenten en Gekweekte Bone Fragment Supematanten <ol><li> Migratie naar botweefsel kweeksupernatans. Opmerking: Voer experimenten in drievoud zodat 3 fragmenten uit een bepaalde THR monster worden gebruikt om 3 supernatanten genereren. Voor elk experiment wordt migratie vergeleken in drie putjes bevattende supernatanten bot versus drie putjes die slechts medium controle. <ol><li> Genereren bot tissue supernatanten door het plaatsen botfragmenten in de putjes van een 12-wells plaat met 2,2 ml DMEM-10% FBS per putje. Cultuur in een 37 ° C weefselkweek incubator gedurende 24 uur. Trek het medium bij 24 uur en te vervangen door 2,2 ml vers DMEM-10% FBS. Behandel controleputjes DMEM-10% FBS dezelfde manier. OPMERKING: Het medium wordt veranderd 24 uur factoren afgescheiden in respons op weefseltrauma gevolg van een operatie verwijderen. Omdat botweefsel supernatanten worden gegenereerd in FBS-bevattend medium, wells die FBS-bevattend medium uitsluitend zijn opgenomen om te controleren voor de bijdragen van FBS borstkanker celmigratie. </li><li> Na 48 uur, verzamel 0,9 ml van elk supernatant / stuurmedium en pipet in de putjes van een plaat ontvanger. De inserts zullen later in deze putten worden geplaatst. Incubeer de ontvanger plaat in de weefselcultuurincubator terwijl zaaien de inserts. Opmerking: De resterende supernatant (~ 1 ml na verdamping) kunnen worden voor analyse van secretoom factors desgewenst 44. </li><li> Om de Transwell inserts zaad, plaats ze in een standaard, lege 24-well weefselkweek plaat. Pipetteer 350 ul celsuspensie met 1 x 10 5 borstkankercellen in DMEM-10% FBS op de bovenste, binnenste membraan oppervlak van elk inzetstuk zoals weergegeven in figuur 1A. Plaats de 24-wells plaat met de geënte inserts in de 37 ° C weefselkweek incubator gedurende 45 min hechting bevorderen. </li><li> Zodra de cellen inzetstukken hebben gehecht, een tang om de inserts dragen aan de ontvanger plaat volgens de instructies van de fabrikant. Hoek elke insert bij het plaatsen van het in de ontvanger goed op de vorming van luchtbellen tussen de insert membraan en de ontvanger goed supernatant te voorkomen. Incubeer de ontvanger plaat met inzetstukken 20 uur in een 37 ° C weefselkweek incubator. OPMERKING: Controleer de onderkant van de ontvanger plaat voor luchtbellen tussen de insert membraan en de ontvanger goed supernatant. Als er bellen zichtbaar zijn, verwijder de specifieke inserts en plaats ze opnieuw in de ontvanger goed totdat er geen luchtbellen aanwezig zijn. </li><li> Na 20 uur gebruik een tang om de inserts van de ontvanger plaat te verwijderen. De procedures in stappen 3.6-3.7 voeren BLI beeld cellen die zijn gemigreerd naar en aan de onderzijde van de ontvanger putjes. </li></ol></li><li> Migratie naar botweefsel fragmenten. OPMERKING: Voer experimenten in drievoud zodanig dat 3 fragmenten uit een bepaalde THR monster worden geplaatst in 3 afzonderlijke inserts, en 3 glazen kralen worden in 3 aparte inserts als controle geplaatst. <ol><li> Bereid de ontvanger plaat door pipetteren 0,9 ml DMEM-10% FBS in elk putje. Plaats deze in de weefselkweek incubator, terwijl de voorbereiding van de inserts. </li><li> Om de inzetstukken zaad, keer ze op het oppervlak van een kunststof microcentrifugebuis doos die een deksel heeft. Pipetteer 50 ul celsuspensie druppel DMEM-10% FBS bevattende 1 x 10 5 borstkankercellen directly op het buitenste ondervlak van elke insert membraan (die naar boven in de omgekeerde inserts). Bedek de microcentrifugebuis doos met deksel opengebroken en overgebracht naar de 37 ° C incubator weefsel gedurende 45 min celhechting bevorderen. </li><li> Breng de doos microfugebuis aan de weefselkweek kap, en een tang om de geplaatste inserts rechtsaf omhoog en zet ze in de putjes van de ontvanger plaat. Pipet 0,450 ml DMEM-10% FBS in elk inzetkom. Met behulp van een tang, transfer één botweefsel fragment (~ 3 mm) in elk bereid inzetkom. Eventueel gebruikt glasparels als negatieve controles extra putjes. Plaats de plaat in een weefselkweek incubator voor 20 uur. </li><li> Om migratie te meten, bereiden een standaard 24-well weefselkweek plaat met 1 ml DMEM-10% FBS per putje. Verwijder de ontvanger plaat uit de incubator tang om de botfragmenten en kralen overdracht van elkaar voegen in afzonderlijke putjes van de standaardplaat. Luciferin toevoegensubstraat elk (tot een eindconcentratie van 300 ug / ml te bereiken) en goed presteren BLI volgens de procedures in stappen 3.6-3.7. </li></ol></li></ol> 6. Extra pre- en post-experimentele Analyses <ol><li> Analyse van gespoeld merg. <ol><li> Breng een botfragment in een 70 um cel zeef bovenaan een 50 ml conische buis. Gebruik een 10 ml spuit met een 25 G naald krachtig spoelen fragment met 10 ml PBS aan een suspensie van mergcellen verkrijgen in de conische buis. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 3 minuten bij 300 g en 21 ° C, zuig de supernatant en resuspendeer de gepelleteerde cellen in PBS of andere gewenste oplossing voor flowcytometrie. OPMERKING: resuspenderende hoeveelheden afhankelijk van de grootte van de cel pellet na centrifugatie, en toepassing. </li><li> Voor levensvatbaarheid testen ~ 75-300 ul volumes PBS geschikt zijn, en deze suspensies kunnen worden geanalyseerd met behulp van in de handel verkrijgbare fluorescence gebaseerde levensvatbaarheid assays volgens de instructies van de fabrikant, gepipetteerd in een conventionele hemocytometer en geteld met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. </li><li> Voor flowcytometrische analyse en sortering op basis van detectie van GFP-positieve borstkankercellen, resuspendeer de celpellet in 1 ml PBS met 2% FBS, 2 mM EDTA en 10 mM HEPES zodat de concentratie 1 x 10 6 cellen / ml. </li></ol></li><li> H &amp; E kleuring en immunohistochemie. <ol><li> Om de fragmenten voor hematoxyline &amp; eosine (H &amp; E) kleuring en / of immunohistochemie verwerken, plaatst u de fragmenten in plastic cassettes gelabeld met een nummer 2 potlood en onderdompelen in een container gevuld met 10% gebufferde formaline gedurende 24 uur. </li><li> Proces weefsels voor inbedden in paraffine, snijden en kleuring met behulp van routine protocollen die een ontkalking stap om rekening te houden met de gemineraliseerde spicules binnen elk fragment bevatten. </li></ol></li></ol>

Geen onthullingen om te rapporteren.

Mehra et al. Hebben eerder beschreven postmortem verzameling en analyse van bot specimens van uitgezaaide prostaatkanker patiënten geoogst bij de autopsie, waaruit hoogwaardige weefsels en valideren het gebruik van menselijke botsamples het metastatische proces 47 bestuderen. Hier hebben we protocollen beschreven voor het verzamelen, verwerken menselijk botweefsel verkregen fragmenten uit afgedankte femurkoppen na THR chirurgie in een korte co-kweeksysteem borst- celmigratie, kolonisatie en prolifera...

De tumor micro-omgeving wordt algemeen erkend als een kritische determinant van kankercel gedrag tijdens borstkanker progressie en metastatische verspreiden 1-3. Het doel van de hier voorgestelde methode is het bestuderen van borstkankercellen in het micromilieu van menselijk botweefsel, de meest voorkomende plaats van borstkankermetastasen 4-6 vergemakkelijken. Bot bestaat uit gemineraliseerd en merg compartimenten 7-9, beide haven cellen en uitgescheiden factoren betrokken bij metastatische progressie 10,11. Hoewel veel gebruikt in vivo muismodellen te vergemakkelijken systemische studies van het metastatische proces 12-15, cel interacties binnen het skelet zijn niet gemakkelijk toegankelijk voor observatie en directe verstoring. Modelsystemen voor het bestuderen van en het kweken van de muis bot weefsels en muis beenmerg cellen zorgen voor een betere toegang en hebben veel inzichten met betrekking tot overspraak en mechanismen die ten grondslag liggen aan borstkanker cel m opgeleverdetastasis van de muizen skelet 16-22. Studies hebben echter gesuggereerd dat er mogelijk species-specifieke patronen van osteotropism voor botweefsel 23,24. Deze patronen kunnen inherent species-specifieke verschillen in botweefsel eigenschappen, die voortvloeien uit veranderde beenmerg populaties in immuun-deficiënte muizen 11 en / of de relatief jonge leeftijd van muizen die voor experimenten, die waarschijnlijk determinanten van het bot weergeeft micro-omgeving. In vitro technieken voor het bestuderen van borstkankercellen in menselijk bot coculturen zijn doorgaans gericht op specifieke been celtypes zoals beenmerg afgeleide osteoblasten en stromale cellen gekweekt als monolagen of binnen gemanipuleerde 3-dimensionaal modelsystemen 25-35. Hoewel 2-dimensionele celkweekmodellen de steunpilaar van in vitro gevormd benaderingen voor kankeronderzoek is het al lang erkend dat celgedrag fundamenteel veranderd in monolayer kweeksystemen 18,36,37. Dit heeft geleid tot de ontwikkeling van gemanipuleerde micro-omgevingen die de complexiteit van 3-dimensionale levende weefsels, zoals matrix- en steiger gebaseerde modellen uit natuurlijke materialen zoals collageen nabootsen, of synthetische polymeren geënt met specifieke celtypen te weefselachtige microenvironments creëren 36-41. Gemanipuleerde benaderingen hebben ook het gebruik van de bioreactor platforms te controleren en de studie van de hormonale milieu van de micro-omgeving 18,19,41-43. Hoewel biomimetische modellen en bioreactoren bieden veel elementen van een complex weefsel micro-omgeving in een gecontroleerde omgeving, en zijn met succes toegepast op de studie van de uitzaaiing van borstkanker aan het bot 18,19,35,42,43 vooruit, denk engineered modelsystemen in het algemeen niet op te nemen het volledige spectrum van celtypen en extracellulaire matrix componenten aanwezig in het natuurlijk bot milieu. Tot voor kort, borstkankercellen werden niet bestudeerd in het natieve, intacte, 3-dimensionale micromilieu van menselijke botweefsel. We hebben onlangs meldde de ontwikkeling van een co-cultuur model met behulp van menselijk bot weefselfragmenten geïsoleerd van de totale heupprothese (THR) chirurgie exemplaren 44. Deze exemplaren haven zowel de gemineraliseerde en merg compartimenten die nodig zijn om mechanismen die ten grondslag liggen micro-uitzaaiingen in korte termijn cultuur te bestuderen. In eerdere werk gevestigde we proof-of-principle voor het gebruik van bioluminescentie beeldvorming (BLI) om de proliferatie van luciferase uiten borstkankercellen (MDA-MB-231-Fluc) samen gekweekt met botfragmenten 44 monitoren. Hier presenteren we gedetailleerde experimentele protocollen voor het bestuderen borstcel kanker proliferatie, kolonisatie en migratie binnen het kader van de natieve micro met menselijk bot weefsel explantaten. Eerst presenteren we een protocol voor co-kweken borstkankercellen grenzend aan botfragmenten om borstvoeding te metencelproliferatie behulp van BLI. In dit hoofdstuk worden borst celsuspensies geënt cel- spots in 6-well platen naast botfragmenten, die worden geïmmobiliseerd door botstukken was. Controle putjes bevatten bot was, maar geen bot fragment. Zodra cel spots te bevestigen, wordt medium toegevoegd en de plaat gekweekt gedurende 24 uur, waarna bioluminescente signaalintensiteit (geassocieerd met het aantal cellen) wordt gemeten BLI. In de volgende stap stellen we methode voor co kweken borstkankercellen direct gezaaid op botfragmenten kolonisatie en proliferatie bestuderen. Hier de borst celsuspensies worden direct gepipetteerd op het botweefsel fragmenten die in kweek worden bewaakt door BLI en fluorescentiemicroscopie tijd kolonisatie en aantal cellen te volgen. In deze werkwijze kan het beenmerg compartiment gespoeld uit de botfragmenten op elk tijdstip voor analyse gekoloniseerde borstkankercellen door flowcytometrie of merg levensvatbaarheid assays. Daarnaast hebben we Dèschriftgeleerde twee verschillende benaderingen voor het meten van borstkanker cel migratie. In de eerste werkwijze stappen beschreven voor het meten migratie naar botweefsel kweeksupernatanten. In dit protocol borstkanker cellen worden gezaaid op de binnenste bovenvlakken van Transwell voegen membranen met 8 urn poriegrootte (zie figuur 1A). De inserts worden vervolgens geplaatst in een ontvanger plaat met putjes die botweefsel supernatant of controle medium. In de loop van 20 uur incubatieperiode kleine aantallen borstkankercellen migreren door het inzetstuk membranen naar het onderste weefsel kweekputjes wanneer zij hechten voor detectie door BLI. In de tweede migratiemethode borstkanker cellen worden gezaaid op de onderste buitenoppervlakken van Transwell insert membranen. Botweefsel fragmenten worden in de inzetkommen geplaatst en borstkankercellen migreren door de membranen om de botfragmenten koloniseren (zie figuur 1B), dieVervolgens worden afgebeeld met behulp BLI.

<table><tbody><tr><td>DMEM (1X) + GlutaMAX-l</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td>Supplementeer al DMEM met 10% foetaal runderserum en 1% Pen/Strep</td></tr><tr><td>McCoy's 5A Medium (1X)</td><td>Life Technologies</td><td>16600-082</td><td>Supplementeer al McCoy's&nbsp; met 10% foetaal runderserum en 1% Pen/Strep</td></tr><tr><td>Foetaal runderserum</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline Streptomycine</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin (10 mgl/ml)</td><td>InvivoGen&nbsp;</td><td>ant-bl</td><td>Supplementeer media gebruikt voor getransfecteerde cellijnen.</td></tr><tr><td>Falcon&reg; Cell Culture Inserts voor 24 Well Plate met Transparante PET Membraan (8,0 &mu;m poriegrootte)</td><td>Corning Incorporated</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>Falcon&reg; 24 Well TC-Behandelde Polystyreen Cell Culture Insert Companion Plate</td><td>Corning Incorporated</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *voor zoogdiercellen*</td><td>Invitrogen Detection Technologies</td><td>L-3224</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>A18967-01</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferine vuurvlieg, kaliumzout 5 g (30 mg/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>L-8220</td><td></td></tr><tr><td>Steriele Cell Strainer 70 &mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>6 Well TC-Behandelde Cell Culture Cluster</td><td>Corning Incorporated</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>12 Well TC-Behandelde Cell Culture Cluster</td><td>Corning Incorporated</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>24 Well TC-Behandelde Cell Culture Cluster</td><td>Corning Incorporated</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td></td></tr><tr><td>Boterwas</td><td>Surgical Specialties Corporation</td><td>903</td><td></td></tr><tr><td>IVIS 50 Imaging Platform</td><td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Image Software Program&nbsp;</td><td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td><td>133026</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL Imaging System</td><td>Life Technologies</td><td>Versie 4.2</td><td></td></tr><tr><td>OsteoSense 680 EX</td><td>PerkinElmer</td><td>NEV10020EX</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7 borstkankercellen</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 borstkankercellen</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonaal muis anti-menselijk cytokeratine antilichaam</td><td>DAKO Cytomation</td><td>Clone (AE1/AE3)</td><td></td></tr></tbody></table>

methoden voor het kweken van menselijke dijbeen weefselexplantaten naar breast cancer cell kolonisatie van het gemetastaseerde niche bestudeer

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Bot is de meest voorkomende plaats van borstkankermetastasen. Hoewel het algemeen aanvaard dat de micro-invloeden kankercel gedrag, is er weinig bekend over borstkanker cel eigenschappen en gedragingen binnen de inheemse micro-omgeving van de menselijke botweefsel. We hebben benaderingen op te sporen, te kwantificeren en te moduleren menselijke borstkankercellen in de micro-omgeving van de ontwikkelde gekweekte menselijke botweefsel fragmenten geïsoleerd uit afgedankte femurkoppen na een totale heupprothese chirurgie. Met borstkankercellen ontworpen voor luciferase en versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP) expressie, kunnen wij reproduceerbaar kwantificeren migratie en proliferatie patronen met bioluminescentie (BLI), spoor cel interacties binnen de botfragmenten middels fluorescentiemicroscopie en evalueren borstcellen na kolonisatie met flowcytometrie. De belangrijkste voordelen van dit model zijn: 1) een native, architectonisch intact weefsel microenvironment dat relevante menselijke celtypes omvat, en 2) een directe toegang tot de micro-omgeving, die een snelle kwantitatieve en kwalitatieve monitoring en verstoring van de borst en been cel eigenschappen, gedragingen en interacties vergemakkelijkt. Een belangrijkste beperking op dit moment is de eindige levensvatbaarheid van het weefsel fragmenten, die het raam van onderzoek op korte termijn cultuur beperkt. Toepassingen van het modelsysteem omvatten bestuderen de fundamentele biologie van borstkanker en andere bot-zoekende maligniteiten in de metastatische niche en ontwikkeling van therapeutische strategieën om gerichter borstkankercellen in botweefsel.

Isoleren Tissue Fragmenten uit femurkoppen Femurkoppen werden verzameld uit een gelijk aantal mannelijke en vrouwelijke patiënten (44-90 jaar) die een electieve totale heupprothese chirurgie in de afdeling orthopedische chirurgie aan de Stanford University School of Medicine. Elke weggegooid femurkop bevat een klein gedeelte van het bovenste dijbeen, die trabeculair botweefsel uit gemineraliseerde spicules en merg herbergt. Dit weefsel is toegankelijk via het chirurgisch blootgestelde dwarsd...

Protocollen worden beschreven voor het bestuderen van borstkanker celmigratie, proliferatie en kolonisatie in een menselijk botweefsel explantaatmodel systeem.

Methoden voor het kweken van menselijke dijbeen weefselexplantaten naar Breast Cancer Cell Kolonisatie van het gemetastaseerde Niche Bestudeer

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

Het doel van deze procedure is om de proliferatie, kolonisatie en migratie van borstkankercellen te bestuderen in een explantaat-modelsysteem van menselijk botweefsel. Dit wordt bereikt door fragmenten van trabeculair botweefsel te isoleren uit chirurgische specimens van de femurkop en deze te kweken met borstkankercellen die luciferase en groen fluorescerend proteïne tot expressie brengen. Bioluminescentie-imaging wordt gebruikt om de proliferatie van cellen te meten en de kolonisatie van borstkankercellen in de botweefselfragmenten te verifiëren. Patronen van kolonisatie door borstkankercellen worden in beeld gebracht met fluorescentiemicroscopie. Het mergcompartiment kan uit de fragmenten worden gespoeld voor analyse via flowcytometrie, luminescentie- en kleuringsassays. De migratie van borstkankercellen naar weefselkweeksupernatanten en botweefselfragmenten wordt gemeten in Transwell-migratiekamers met bioluminescentie-imaging. Bot is de meest voorkomende locatie voor borstkankermetastasen, en uiteindelijk biedt dit model een nieuw venster voor het bestuderen van borstkankercellen binnen de botmetastatische niche.Een groot voordeel van dit model is dat het directe toegang biedt tot de micro-omgeving van fragmenten van menselijk botweefsel, waardoor we het gedrag van borstkankercellen tijdens kortstondige co-cultuurexperimenten eenvoudig kunnen observeren en analyseren. Deze methode kan worden gebruikt om kernvragen te bestuderen over de mechanismen die ten grond liggen aan borstkankermetastasen naar het bot, met als doel therapeutische strategieën te identificeren om dit proces effectief te voorkomen en te behandelen. Hoewel dit model inzicht kan verschaffen in borstkankermetastasen, kan het ook worden gebruikt om andere botzoekende maligniteiten te bestuderen, zoals prostaatkanker.Fragmenten van botweefsel moeten op verschillende momenten in elke assay worden geoogst. Dit begint met het verzamelen en transporteren van een femurspecimen in zoutoplossing en het voorbereiden van het werkstation in een biosafety cabinet onder het dragen van een chirurgische handschoen. Pak de femurkop met één hand vast en gebruik een chirurgische zaag om trabeculair bot te extraheren.De fragmenten hebben een grootte van ongeveer twee tot vijf millimeter. Pincetten zijn voor deze stap niet geschikt. U heeft een chirurgische zaag van goede kwaliteit nodig.Bereid voor dit experiment een suspensie van borstkankercellen voor met 100.000 cellen per 50 µL DMEM plus 10% FBS. Bereid daarnaast pluggen van botwas voor om de botfragmenten te mobiliseren door gebruik te maken van de afgesneden uiteinden van een micropipetpunt en bewaar de pluggen in een Petrischaal. Breng de pluggen vervolgens met een pincet over naar een zes-wells plaat en druk de pluggen met een steriele handschoen op de 12-uurspositie.Pipette vervolgens 50 µL van de celsuspensie in het midden van elke put. Plaats de plaat gedurende 45 minuten in een weefselkweekincubator om de celhechting te bevorderen. Terwijl de plaat incubeert, worden de botfragmenten met de aangehechte cellen uitgesloten. Plaats in drie putten een botweefselfragment op de botwas en druk deze aan met de GER. De drie putten zonder fragmenten dienen als controles.Voeg vervolgens langzaam vijf milliliter DMEM plus 10% FBS toe aan de wand van elke well. De botwas en botfragmenten mogen niet worden verschoven. Incubeer de cultuur daarna gedurende 20 tot 24 uur.Maak de volgende dag eerst beelden van de cellen. Voeg 300 micrograms per milliliter Lucifer toe aan elke well en maak direct daarna beelden van de plaat met een Ivis imaging platform. Voor dit experiment is een borstkankercelsuspensie nodig, vergelijkbaar met de vorige.Nadat de botfragmenten zijn geëxtraheerd, gebruikt u een pincet om elk fragment over te brengen naar een lege well van een 24-wells plaat. Pipetteer vervolgens 50 µL cel-suspensie direct op elk botfragment en plaats de plaat gedurende 45 minuten in een incubator om de celadhesie te bevorderen. Wanneer de cellen zijn gehecht, voegt u voorzichtig één tot twee mL medium toe aan elke well, voldoende om het botfragment volledig te onderdompelen. Plaats de plaat vervolgens gedurende 20 tot 24 uur in de weefselkweekincubator.Ter voorbereiding op Ivis-imaging, fluorescentie-imaging of het verzamelen van beenmergcellen voor analyse voor Ivis-imaging, worden de botfragmenten overgebracht naar een 24-wells plaat met één milliliter vers medium per well. Voeg 300 µg/mL Lucifer toe aan elke well en ga verder zoals eerder beschreven voor fluorescentiemicroscopie. Pipetteer vijf µL fluorescente bisfosfaat-labelingsoplossing in elke well om de botspicula van het botfragment te labelen en incubeer de plaat nog eens 24 uur.Breng 24 uur later met een pincet de fragmenten over naar platen met fenolroodvrij medium. Bekijk de platen vervolgens met een fluorescentiemicroscoop die is ingesteld op 485 nanometers om GFP-expresserende borstkankercellen te lokaliseren en op 680 nanometers om met bisfosfaat gelabelde botspicula te identificeren. Spoel het beenmergcompartiment leeg voor analyse van het aantal cellen of de celkenmerken.Breng een fragment over naar een zeef van 70 micron boven een chronicle-buis van 50 milliliter. Gebruik vervolgens een spuit van 10 milliliter met een naald van 25 gauge om het fragment krachtig door te spoelen met 10 milliliter PBS. Centrifugeer de suspensie bij 300 G gedurende drie minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelletteren; aspireer en verwijder het supernatant.Resuspendeer het pellet mergcellen in PBS of andere gewenste oplossingen voor flowcytometrie of levensvatbaarheidsassays. Begin met het genereren van botweefsel-suspensies. Plaats botfragmenten in de wells van een 12-wells plaat.Vul de wellplaat met 2,2 milliliters DMEM 10%FBS per well en laat enkele controlewells zonder botfragmenten. Kweek de plaat gedurende 24 uur. Aspireer vervolgens het medium, vervang dit en zet de kweek voort voor nog eens 24 uur; na 48 uur kweektijd wordt 0,9 milliliters supernatant overgebracht naar een opvangplaat, terwijl de opvangplaat tijdelijk wordt geïncubeerd.Plaats transwell-inserts in een lege 24-wellplaat. Pipetteer vervolgens 100 000 borstkankercellen in 350 µL op elk insert. Cultiveer de platen daarna gedurende 45 minuten om de celhechting te bevorderen. Gebruik na 45 minuten een pincet om de inserts over te brengen naar een opvangplaat.Zorg ervoor dat de inserts schuin worden geplaatst wanneer u ze in de houder zet. Supineer grondig zodat er geen luchtbellen ontstaan. Incubeer de plaat met inserts vervolgens gedurende 20 uur bij 37 °C tot de volgende dag.Gebruik een pincet om de inserts te verwijderen en voeg aan elk 300 micrograms per milliliter Lucifer toe. Voer bioluminescentie-imaging uit op de opvangplaat om borstkankercellen te detecteren die door de membranen zijn gemigreerd en zich hebben gehecht aan de bodem van de wells van de opvangplaat. Vul eerst een opvangplaat met medium en plaats deze in de weefselkweekincubator.Om de inserts te zaaien: plaats deze omgekeerd in een lege microfugebuisjesdoos met deksel. Voeg vervolgens 100.000 cellen in 50 µL toe aan het buitenste bottomoppervlak van elk insertmembraan.Dek de doos af maar laat het deksel op een kier staan en incubeer de inzetten gedurende 45 minuten in de weefselkweekincubator. Gebruik vervolgens een pincet om de inzetten om te keren en over te brengen naar de wells van een opvangplaat met elk 0,45 milliliters DMEM met 10% FBS. Voeg daarna een botfragment van drie millimeter of een glazen kraal toe aan elke inzet en zet de plaat gedurende 20 uur in de incubator.Gebruik de volgende dag een pincet om de fragmenten en beads over te brengen naar een plaat met wells die een milliliter vers medium bevatten. Voeg 300 µg/mL Lucifer per well toe en ga verder met bioluminescentie-imaging. MDA MB 2 31 F.Luke EGFP.Borstkankercellen werden gecocultiveerd naast geïmmobiliseerde botfragmenten om de proliferatie van borstcellen te meten. Bioluminescentie-imaging na 24 uur cultuur toonde een verhoogde proliferatie van borstkankercellen aan in de aanwezigheid van botfragmenten in de bovenste drie wells, vergeleken met de afwezigheid van botfragmenten in de onderste drie wells. De resultaten van experimenten met fragmenten van drie afzonderlijke chirurgische specimens toonden een verhoogde proliferatie aan in de aanwezigheid versus de afwezigheid van bot.In alle drie de gevallen werd met bioluminescentie-imaging na 24 uur kolonisatie waargenomen van MCF seven F Luke EGFP-cellen die direct onder botweefselfragmenten waren geplaatst. Een afnemend signaal was geassocieerd met een dalende zaaidichtheid na 48 uur. Direct gezaaide fragmenten die waren gelabeld met een bisfosfonaatreagens onthulden kolonisatie van de GFP-positieve borstkankercellen binnen de gemineraliseerde compartimenten en het beenmerg.De migratie van de borstkankercellen door het poreuze migratiemembraan naar botweefselculturen, zichtbaar in de bovenste drie putjes, was robuust in vergelijking met de migratie in de controle. Medium is zichtbaar in de onderste drie putjes. Er werd ook migratie waargenomen in drie botfragmenten van een bepaald THR-specimen, terwijl er geen migratie op de beads werd waargenomen.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe menselijke botweefselfragmenten uit een femurhoofd-specimen kunnen worden geëxtraheerd en hoe deze kunnen worden ingezet in co-cultuurassays om het gedrag van borstkankercellen te meten, waaronder migratie, kolonisatie en proliferatie.

methods-for-culturing-human-femur-tissue-explants-to-study-breast

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Op lange termijn Cultuur van menselijke borstkankercellen Monsters en hun analyse met behulp van optische projectie Tomografie

Deze video beschrijft de cultivering van borstkankercellen naast dijbeen explants om de proliferatie en kolonisatie van kankercellen in een menselijk botweefsel explant modelsysteem te meten.

Bc-cellen co-cultiveren: borstkankercellen cultiveren met botfragmenten om de proliferatie van kankercellen te bestuderen

Bij standaard kweekmethoden cellen uit hun fysiologische omgeving en gekweekt op het plastic oppervlak van een schotel. Om het gedrag van primaire humane beenmergcellen bestuderen we een 3-D kweeksysteem waarbij cellen worden gekweekt onder omstandigheden indient de natieve micro van het weefsel.

Een Drie-dimensionale Tissue Culture Model om te studeren Primary humaan beenmerg en zijn Malignancies

Primaire celcultuur met behulp van intact weefsel organoids biedt een modelsysteem dat de meercellige in vivo micro-omgeving nabootst. We ontwikkelden een serum-vrij primaire borst epitheel weefselkweek model dat gemengde celkweek geslachten en exposities gedifferentieerde morfologie bestendigt, zonder enzymatische weefsel verstoring. Borst organoids blijven nog gedurende&gt; 6 maanden.

Niet-enzymatische, Serum-vrije Tissue Culture van Pre-invasieve borstlaesies voor Spontane Generatie van Mammospheres

Hier presenteren we een protocol voor co-cultuur in drie dimensies, wat nuttig is voor het onderzoeken van interacties tussen meerdere cellen en het beïnvloeden van het gedrag van kankercellen door de extracellulaire matrix. In dit experimentele model worden kankercellen gekweekt op collageengels ingebed met humane kanker-geassocieerde fibroblasten.

Driedimensionale Co-cultuur Model voor Tumor-stromale Interactie

Dit manuscript beschrijft een ex vivo modelsysteem bestaande uit orgaan-geconditioneerde media, afgeleid van de lymfknoop, bot, long en hersenen van muizen. Dit modelsysteem kan worden gebruikt om op orgaan afgeleidde oplosbare factoren te identificeren en te bestuderen en hun effecten op de orgaantropisme en metastatisch gedrag van kankercellen.

Genereren van Organ-geconditioneerde media en toepassingen voor het bestuderen van Organ-specifieke invloeden op Borstkanker Gemetastaseerde Behavior

Kankercellen worden ingebed in een collageengel en vervolgens tussen een acellulair fibrinegel gedaan om een 3D-kweeksysteem te genereren waarin de invasiviteit en vorming van satelliettumoren kunnen worden gemonitord.

Driedimensionale Culture Assay te ontdekken Cancer Cell Invasiviteit en Satellite tumorvorming

Dit experimentele protocol beschrijft de isolatie van BCSC's uit borstkankercel- en weefselmonsters, evenals de in vitro en in vivo assays die kunnen worden gebruikt om bcsc-fenotype en -functie te beoordelen.

Isolatie en functionele beoordeling van menselijke borstkankerstamcellen uit cel- en weefselmonsters

Het manuscript beschrijft een methodologie voor het opzetten en longitudinaal monitoren van spontane longmetastasen van orthotopisch geïnjecteerde borsttumoren, die vatbaar is voor interventie in alle stadia van de metastatische cascade.

In vivo Beeldvorming om spontane longmetastasen van orthotopisch geïnjecteerde borsttumorcellen te meten

Er is een kritieke behoefte aan 3D-kankermodellen die heterocellulaire overspraak vastleggen om kankermetastasen te bestuderen. Onze studie presenteert de generatie van heteromulticellulair stromaal-epitheel in een steiger- en steigervrije omgeving die kan worden gebruikt om invasie en cellulaire ruimtelijke verdelingen te bestuderen.

Heteromulticellulaire stromale cellen in steigervrije 3D-culturen van epitheelkankercellen om invasie te stimuleren

Dit protocol schetst methoden voor het kweken, manipuleren en analyseren van muizen CAF's, inclusief in vitro/in vivo functionele assays, transcriptomics en computationele analyse. Bovendien beschrijft het een webgebaseerd platform dat is ontwikkeld om de openbaar beschikbare transcriptomen van laseropname van micro-ontlede stromale en epitheliale componenten uit een verzameling menselijke borstkankertumoren te analyseren.

Kanker-geassocieerde fibroblasten van borsttumoren bij muizen als hulpmiddelen voor moleculaire en computationele studies

Leer hoe je menselijke dijbeenweefselexplanten kweekt om borstkankercelkolonisatie in het gemetastaseerde niche te bestuderen. Deze methode maakt bioluminescentiebeeldvorming en fluorescentiemicroscopie mogelijk.

Methoden voor het kweken van menselijke dijbeen weefselexplantaten naar Breast Cancer Cell Kolonisatie van het gemetastaseerde Niche Bestudeer (Video) | JoVE Journal

Methoden voor het kweken van menselijke dijbeen weefselexplantaten naar Breast Cancer Cell Kolonisatie van het gemetastaseerde Niche Bestudeer

Meer video's verkennen