Name: Electroretinogram Analyse van de Visual Response in zebravis Larven (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Leer elektroretinografie-analyse van visuele responsen in zebravislarven met behulp van micromanipulatietechnieken. Deze methode stelt onderzoekers in staat om visuele functie in vivo te beoordelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken de leden van de UNC Zebrafish Aquaculture-faciliteit voor het onderhoud van de zebravis. We willen ook Diagnosys, LLC bedanken voor hun hulp bij de installatie van het ERG-apparaat. Bijzondere dank gaat uit naar Dr. Portia McCoy en het laboratorium van Dr. Ben Philpot voor hun hulp bij elektrofysiologische methoden. We willen ook Lizzy Griffiths bedanken voor haar illustratie van een larvale zebravis. Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health-awards F32 EY022279 (aan J.D.C) en R21 EY019758 (aan E.R.W).

Dierlijke onderhoud en experimentele protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comités van de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill, en voldoen aan alle eisen van de NIH Bureau van Laboratory Animal Welfare en de Vereniging voor evaluatie en accreditatie van Laboratory Animal Care International. OPMERKING: Om larven voor ERG analyse te verkrijgen, gepubliceerde protocollen voor standaard zebravis veeteelt en onderhoud in dienst waren 18. Larven worden verkregen door middel van natuurlijke fokken en gehuisvest onder een 14 uur licht / 10 uur donker cyclus. Dit protocol is geoptimaliseerd voor larven aan 5-7 dagen na de bevruchting (dpf), maar zouden idealiter uitgevoerd op oudere vis met kleine aanpassingen aan de procedure. Hier, gebruik maken van de TL stam van wild-type zebravis larven op 5 DPF. 1. Micropipet Production <ol><li> Trek een aantal micropipetten behulp 1,5 x 0,86 mm (buitendiameter door binnendiameter) brand gepolijst borosilicaatglas haarvaten metfilament (smelttemperatuur, 821 ° C) en een P-97 Flaming / Brown Micropipet Puller uitgerust met doos warmte gloeidraad. Met het programma kneden micropipetten in tabel 1 beschreven. </li><li> Controleer elke micropipet onder een microscoop met een passende rasterplaat liniaal om ervoor te zorgen dat de tips zijn 10-15 micrometer in doorsnede en heeft een gladde tip opening (dat wil zeggen, zonder gekartelde randen). </li><li> Zorgvuldig te slaan micropipetten te tip schade en blootstelling aan stof te voorkomen. Opslag opties omvatten petrischaaltjes met lab tape, schuim gevoerde dozen, of in de handel verkrijgbare micropipette opslagcontainers. OPMERKING: Andere micropipet trekkers en glas capillairen zolang de juiste diameter van de micropipet en een hoge kwaliteit tip bereikt worden. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Druk </td><td> Hitte </td><td> Trek </td><td> Snelheid </td&gt; <td> Tijd </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 560 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 450 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 410 </td><td> 55 </td><td> 40 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Programma voor de productie van micropipetten met een P-97 Flaming / bruin Micropipet Trekker voorzien van een vat verwarmd filament Micropipetten worden gemaakt onder toepassing van 1,5 x 1,0 mm2 (buitendiameter door binnendiameter) vuur gepolijst borosilicaatglas capillairen met gloeidraad. (smelttemperatuur, 821 ° C). 2. Buffer Voorbereiding <ol><li> Gebruik gefiltreerd geoxygeneerde goudvis Ringer buffer 19 in de micro-elektrode capillair en de polyvinylalcohol (PVA) spons waarop de larven worden geplaatst experimenten verzadigen. U kunt ook gebruik maken van de E3<html> embryomedium of Hank&#39;s Balanced Salt Solution. </li><li> Pesticide 10x goudvis Ringer zoals beschreven in Tabel 2. Stel de pH 7,8 en gesteriliseerd met een 0,22 urn filter en bewaar de 10x voorraad bij 4 ° C. </li><li> Maak een werkoplossing op de dag van het experiment door verdunning van de 10x Ringer&#39;s oplossing tot 1x met gedeïoniseerd, gedestilleerd water. Filteren met een 0,22 pm filter systeem. Oxygenate door borrelen met 95% O 2/5% CO 2 gas voor 10 minuten. Cap strak daarna dat de oplossing is zuurstof. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> NaCl </td><td> 1.25 M </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 26 mM </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 25 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> glucose </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 100 mM </td></tr></tbody></table>jove_content &quot;&gt; Tabel 2: Voorbereiding van de oplossing 10x goudvis Ringer&#39;s. 3. electroretinogram Platform <ol><li> Voer ERG experimenten op antivibratietafel in een Faraday kooi de signaal-ruisverhouding te verbeteren. Bevestig een aangepaste stalen platform om de anti-vibratie tafel met behulp zeskantmoeren. Plaats een beweegbaar kunststof platform met een visco-elastische urethaan polymeer schokabsorberende bodem op de tafel onder de lichtbron. </li><li> Plaats de camera met een gemagnetiseerde stand, naar beneden gericht op de beweegbare kunststof platform. Plaats de micromanipulator met een tweede gemagnetiseerde stand rechts van het beweegbare kunststof platform (die de opname micro-elektrode houdt). Zorg ervoor dat de camera en micromanipulator niet gestoord worden door de beweging van andere apparatuur en dat zij geen verlichting van de lichtbron hoeft te blokkeren. </li><li> Sluit de camera aan op een video-monitor en de positie van het aan het oog van de te bekijkenlarve voor het plaatsen van de elektrode in de juiste positie. </li><li> Zorg ervoor dat de installatie goed geaard is met koperdraad. Om het geluid te controleren, plaatst u de referentie-elektrode en de punt van de opname micro-elektrode in een 35 mm petrischaal gevuld met Ringer-oplossing. Controleer de elektrische geluidsniveaus van de setup met een oscilloscoop of een ingebouwde functie van de ERG apparaat. Geluidsniveau mag niet meer dan ± 10 mV ten opzichte van baseline zijn. </li></ol> 4. Spons Voorbereiding <ol><li> Snijd een kleine rechthoek van droge PVA spons die goed past in een 35 mm petrischaal. De dikte van de spons niet groter dan de diepte van de schotel. Gebruik een mes met een schone scheermesje voor het snijden. </li><li> Een aanvullend gesneden in de spons met de referentie-elektrode geschikt (een ondiepe snede lengterichting op de bodem van de spons of een vlinder die verticaal door een van de kleinere uiteinden). </li><li> Gebruik een chemisch resistente markereen kleine stip op de spons (waar de larven worden geplaatst) die kunnen worden gebruikt voor het positioneren van de camera te markeren. </li><li> Week de PVA spons in Ringer-oplossing tot verzadiging. Verwijderen en dep snel op een papieren handdoek 2-3 keer. Plaats de spons in een schone 35 mm petrischaal. </li><li> Plaats de petrischaal met de spons op de plastic platform zodanig dat het merkteken kan worden gevisualiseerd door de camera. </li></ol> 5. Elektrode Voorbereiding OPMERKING: De zebravis opstelling bestaat uit een referentie-elektrode in contact met Ringer-oplossing verzadigd PVA spons en een registratie-elektrode in contact met de cornea. De referentie-elektrode bestaat uit een Ag / AgCl pellet. De registratie-elektrode is een getrokken glas micropipet gevuld met Ringer-oplossing en in het bezit van een micro-elektrode houder met daarin een Ag draad. <ol><li> Chloride de elektroden door weken in 6-9% natriumhypochloriet (bleek) gedurende 5 min (de opname microelectrode draad) of 15 min (de referentie-elektrode). Lucht drogen op een Kimwipe voor 5 min. <ol><li> Afhankelijk van het soort snede gemaakt in stap 4.2, plaatst de Ag / AgCl pellet van de referentie-elektrode in (voor verticale vlinder cut) of onder (de ondiepe snede lengte onderaan) de spons. Bevestig de referentie-elektrode leiden tot de opname-systeem. </li><li> Als alternatief, als de ERG setup heeft beperkte ruimte of zijn er bijzonder sterk fotovoltaïsche artefacten uit de Ag / AgCl elektrode, sluit de referentie-elektrode naar de spons via een agar zout brug naar de elektrode uit het lichtpad te verplaatsen. </li></ol></li><li> Hechten ~ 40 cm van de juiste maat slang aan op een 5 ml lock niet-Luer spuit. Vul de spuit met Ringer-oplossing. Micro-elektrode houders bezitten druk poorten worden doorgaans geleverd met adapters om slangen met een binnendiameter van 1/16 tegemoet &quot;, 3/32&quot;, 1/8 &quot;en 5/32&quot;. </li><li> Vul een 1 ml niet-Luer lock spuitRinger-oplossing en, met behulp van een Micro-fil, aandachtig en vullen de micro-elektrode houder. Voorkomen de vorming van bellen. </li><li> Maak de spuit 5 ml de drukpoort van de micro-elektrode houder buizen en gebruiken zodat de micro-elektrode houder vol Ringer&#39;s oplossing. Met behulp van de Micro-fil en 1-ml injectiespuit gevuld met Ringer-oplossing, vul het micropipet glas uit de tip en zorgen dat er geen luchtbellen aanwezig zijn. </li><li> Bevestig de glazen micropipet om de micro-elektrode houder, let daarbij goed op de elektrode draad recht te houden. Eenmaal bevestigd, gebruikt de spuit 5 ml Ringer&#39;s oplossing door de micro-elektrode voorzichtig dwingen tot een kleine hoeveelheid oplossing is zichtbaar op de tip. Incidenteel toepassing van druk op de spuit (indien niet toegepast op cornea) zal de vorming van luchtbellen, en occlusies vanwege stof of zout ophoping voorkomen in de micropipet tip. <ol><li> Als de oplossing naar buiten komt als een stroom, vervang dan de glass micropipet, de punt opening te groot of beschadigd. </li></ol></li><li> Plaats voorzichtig de opname micro-elektrode in de micromanipulator en bevestig de kabel aan op de opname-systeem. </li></ol> 6. electroretinogram Analyse LET OP: Door de kegel dominantie van de larvale netvlies, kan een hoge kwaliteit ERG resultaten worden verkregen wanneer de voorbereidingen voor de opname worden uitgevoerd onder lage niveaus van indirecte wit licht (&lt;1 lux) of met korte periodes (&lt;1 min) van hogere intensiteit ( ≤250 lux) werkverlichting. Een korte periode van aanpassing aan het donker is nog steeds nodig voorafgaand aan de opname (zie stap 6.7). Echter, experimenten bij weinig rood of infrarood licht worden uitgevoerd met een infrarood gevoelige camera. Alle experimenten werden in steriel gefiltreerd (0,22 pm) systeem water uit de UNC zebravis aquacultuurvoorziening maar alternatieve embryo media kunnen worden gebruikt. <ol><li> Snijd papieren handdoek vierkanten van ongeveer 1cm2. </li><li> Als het meten van geïsoleerde kegel massa receptor potential, incubeer 3-5 larven in het systeem water met 500 uM (±) -2-amino-4-phosphonobutyric zuur (APB) gedurende 5 minuten. Opmerking: hoewel APB is een racemisch mengsel van de actieve (L) en inactieve (R) vormen van AP4, is even effectief als L-VA4 en goedkoper. </li><li> Verdoven 3-5 larven in het systeem water met 0,02% (w / v) tricaïne totdat reageert, ongeveer 1-2 minuten. </li><li> Gebruik een Pasteur pipet en pipetpomp individuele larven zorgvuldig overbrengen op papier handdoek pleinen onder een dissectie stereoscoop met minimale verlichting (≤250 lux voor &lt;1 min). Controleer de positie van elke larve en kiezen voor een kandidaat die is dorsale zijde omhoog met een unoccluded oog. <ol><li> Voor langere opnames (&gt; 30 min), houden de larve vochtig door verglazing van het lichaam tot aan, maar niet met inbegrip van het hoofd met 3% methylcellulose met een fijn kameelharen borstel. </li></ol></li><li> Met behulp van een tang, overdracht van de papieren handdoek square met de larve van de vochtige PVA spons. <ol><li> Voor langere opnames (&gt; 30 min), toepassen van een continue stroom van waterverzadigde 100% O2 gas over de larve door doorleiden het gas door een uitstroomsteen in een zijarm kolf met gedestilleerd water. Plaats de slang de kolf zijarm dat de bevochtigde zuurstof in de buurt van het hoofd van de larve straalt verlaten. OPMERKING: Stap 6.4.1 en 6.5.1 stap zal de levensduur verlengen van de vis 16. </li></ol></li><li> Onder minimale verlichting, gebruik dan de micromanipulator en camera aan de micro-elektrode tip positioneren in het midden tussen de neus en de caudale uiteinden van het oog en druk voorzichtig op de dorsale grens van het hoornvlies. OPMERKING: verkeerd gerichte van de elektrode naar het verre distale gebieden van het hoornvlies kan resulteren in ERG golfvormen van omgekeerde polariteit. </li><li> Laat larve tot donker-passen voor 5-10 min. </li><li> Recordtestwinnaar flash reacties op licht voorzien van een LED-lichtbron of optische stimulator met behulp van de beschiketiket stimulatie en opnameapparatuur. Pas protocol parameters zoals flitsintensiteit, flash lengte, flash kleur, achtergrond intensiteit en kleur en filter instellingen om het experiment te passen. </li><li> Wanneer u klaar bent met het experiment, euthanaseren larven volgens AVMA / IACUC richtlijnen. </li></ol>

<ol><li>Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDowling%2C+JE+%22The+retina%3A+an+approachable+part+of+the+brain%22">The retina: an approachable part of the brain</a>. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1987).</li>
<li>Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inexpensive+device+for+non-invasive+electroretinography+in+small+aquatic+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates.</a> J Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).</li>
<li>Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-evoked+responses+of+the+mouse+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium.</a> J Neurophysiol. 91, 1134-1142 (2004).</li>
<li>Heckenlively, J. R., Arden, G. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeckenlively%2C+JR+%22Principles+and+Practice+of+Clinical+Electrophysiology+of+Vision%22">Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision</a>. , 2nd edn, The MIT Press. Cambridge, MA. (2006).</li>
<li>Perlman, I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPerlman%2C+I+%22Webvision%3A+The+Organization+of+the+Retina+and+Visual+System%22">Webvision: The Organization of the Retina and Visual System</a>. Kolb, H., Nelson, R., Fernandez, E., Jones, B. , (1995).</li>
<li>Fadool, J. M., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+system+for+the+study+of+eye+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22ProgRetin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model system for the study of eye genetics.</a> ProgRetin. Eye Res. 27, 89-110 (2008).</li>
<li>Doerre, G., Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+photoreceptor+cell+development+in+the+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of photoreceptor cell development in the zebrafish retina.</a> Mech. Dev. 110, 125-138 (2002).</li>
<li>Brockerhoff, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+stimulates+a+transducin-independent+increase+of+cytoplasmic+Ca2%2B+and+suppression+of+current+in+cones+from+the+zebrafish+mutant+nof%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Light stimulates a transducin-independent increase of cytoplasmic Ca2+ and suppression of current in cones from the zebrafish mutant nof.</a> J Neurosci. 23, 470-480 (2003).</li>
<li>Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+cone-specific+kinase+GRK7+in+larval+zebrafish+leads+to+impaired+cone+response+recovery+and+delayed+dark+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knockdown of cone-specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone response recovery and delayed dark adaptation.</a> Neuron. 47, 231-242 (2005).</li>
<li>Harada, T., Harada, C., Parada, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+visual+system+development%3A+more+than+meets+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of visual system development: more than meets the eye.</a> Genes Dev. 21, 367-378 (2007).</li>
<li>Branchek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+photoreceptors+in+the+zebrafish%2C+brachydaniorerio.+II.+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The development of photoreceptors in the zebrafish, brachydaniorerio. II. Function.</a> J Comp Neurol. 224, 116-122 (1984).</li>
<li>Schmitt, E. A., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+retinal+development+in+the+zebrafish%2C+Daniorerio%3A+light+and+electron+microscopic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Early retinal development in the zebrafish, Daniorerio: light and electron microscopic analyses.</a> J Comp Neurol. 404, 515-536 (1999).</li>
<li>Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod+contributions+to+the+electroretinogram+of+the+dark-adapted+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish.</a> Dev Dyn. 222, 564-570 (2001).</li>
<li>Wong, K. Y., Adolph, A. R., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+bipolar+cell+input+mechanisms+in+giant+danio%5BTitle%5D)+AND+%22I.+Electroretinographic+analysis.+J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Retinal bipolar cell input mechanisms in giant danio.</a> I. Electroretinographic analysis. J Neurophysiol. 93, 84-93 (2005).</li>
<li>Nelson, R. F., Singla, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spectral+model+for+signal+elements+isolated+from+zebrafish+photopicelectroretinogram%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A spectral model for signal elements isolated from zebrafish photopicelectroretinogram.</a> Vis Neurosci. 26, 349-363 (2009).</li>
<li>Korenbrot, J. I., Mehta, M., Tserentsoodol, N., Postlethwait, J. H., Rebrik, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EML1+%28CNG-modulin%29+controls+light+sensitivity+in+darkness+and+under+continuous+illumination+in+zebrafish+retinal+cone+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">EML1 (CNG-modulin) controls light sensitivity in darkness and under continuous illumination in zebrafish retinal cone photoreceptors.</a> J Neurosci. 33, 17763-17776 (2013).</li>
<li>Gurevich, L., Slaughter, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+waveforms+of+the+ON+bipolar+neuron+and+the+b-wave+of+the+electroretinogram%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of the waveforms of the ON bipolar neuron and the b-wave of the electroretinogram.</a> Vision Res. 33, 2431-2435 (1993).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Daniorerio%29%22">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Daniorerio)</a>. , 5th edn, University of Oregon Press. Portland, OR. (2007).</li>
<li>Kim, D. Y., Jung, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction+contributions+to+the+goldfish+electroretinogram+at+the+photopic+illumination+level%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+J+PhysiolPharmacol%22%5BJournal%5D)">Gap junction contributions to the goldfish electroretinogram at the photopic illumination level.</a> Korean J PhysiolPharmacol. 16, 219-224 (2012).</li>
<li>Brockerhoff, S. E., Dowling, J. E., Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+retinal+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish retinal mutants.</a> Vision Res. 38, 1335-1339 (1998).</li>
<li>Naka, K. I., Rushton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-potentials+from+colour+units+in+the+retina+of+fish+%28Cyprinidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">S-potentials from colour units in the retina of fish (Cyprinidae).</a> J Physiol. 185, 536-555 (1966).</li>
<li>Naka, K. I., Rushton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-potentials+from+luminosity+units+in+the+retina+of+fish+%28Cyprinidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae).</a> J Physiol. 185, 587-599 (1966).</li>
<li>Shao, X. M., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-agar+salt+bridge+in+patch-clamp+electrode+holder+stabilizes+electrode+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials.</a> J Neurosci. Methods. 159, 108-115 (2007).</li>
<li>Brockerhoff, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+behavioral+screen+for+isolating+zebrafish+mutants+with+visual+system+defects%5BTitle%5D)+AND+%22ProcNatlAcadSci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects.</a> ProcNatlAcadSci. U S A. 92, 10545-10549 (1995).</li>
<li>Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroretinogram+%28ERG%29+Measurements+in+Larval+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish.</a> CSH protocols. , (2008).</li>
<li>Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganzfeld+ERG+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Doc+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Ganzfeld ERG in zebrafish larvae.</a> Doc Ophthalmol. 104, 57-68 (2002).</li>
<li>Kainz, P. M., Adolph, A. R., Wong, K. Y., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lazy+eyes+zebrafish+mutation+affects+M%C3%BCller+glial+cells%2C+compromising+photoreceptor+function+and+causing+partial+blindness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Lazy eyes zebrafish mutation affects Müller glial cells, compromising photoreceptor function and causing partial blindness.</a> J Comp Neurol. 463, 265-280 (2003).</li>
<li>Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celsr3+is+required+for+normal+development+of+GABA+circuits+in+the+inner+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+genetics%22%5BJournal%5D)">Celsr3 is required for normal development of GABA circuits in the inner retina.</a> PLoS. genetics. 7, e1002239(2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

In dit protocol een eenvoudige procedure voor ERG opnames van larvale zebravis is gedetailleerd. Deze procedure zorgt voor een snelle en uitgebreide analyse van de visuele function.There zijn verschillende kritische stappen tijdens de hele procedure die moet in gedachten worden gehouden. De zebravis larven moeten gezond zijn voor het experiment te overlijden tijdens potentiële behandelingen met medicijnen te voorkomen en te zorgen voor langdurige levensonderhoud tijdens de ERG opnames. Bovendien is het belangrijk dat de...

De elektroretinogram (ERG) is een niet-invasieve elektrofysiologische werkwijze die uitgebreid is gebruikt in de kliniek voor de bepaling van de functie van de retina bij de mens. De elektrische activiteit in reactie op een stimulus licht wordt gemeten door opname elektroden op het buitenoppervlak van de cornea. De kenmerken van de stimulus paradigma en de respons golfvorm hier de retinale neuronen bijdragen aan de respons. Deze werkwijze is aangepast voor gebruik met een aantal diermodellen zoals muizen en zebravissen. De typische gewervelde ERG response vier hoofdcomponenten: de a-golf, een cornea-negatieve potentiaal afkomstig van fotoreceptorcellen celactiviteit; de b-golf, een hoornvlies-positieve potentiële afgeleid van de ON bipolaire cellen; de d-golf, een cornea-positieve potentiaal geïnterpreteerd als de activiteit van de UIT bipolaire cellen; en de C-golf, die enkele seconden plaatsvindt na de B-golf weerspiegelt activiteit Müller glia en retinal pigment epitheel 1-4. Extra referenties voor het begrijpen van de geschiedenis en beginselen van ERG analyse bij de mens en het model dieren zijn de online leerboek, WebVision, van de Universiteit van Utah en teksten zoals de Principles and Practice of Clinical Electrofysiologie van Vision 4, 5. Danio rerio (zebravis) is al lang favoriet als een model voor gewervelde ontwikkeling, vanwege de snelle rijping en transparantie, die het mogelijk maakt voor niet-invasieve morfologische analyse van orgaansystemen, gedrags-assays en zowel vooruit als achteruit genetische screens (voor een overzicht, zie Fadool en Dowling 6). Zebravis larven zijn zeer vatbaar voor genetische en farmacologische manipulatie, die, in combinatie met hun hoge vruchtbaarheid, maken ze een uitstekend diermodel voor high-throughput biologische analyses. De hogere verhouding kegels te staven larvale zebravis - ongeveer 1: 1 in vergelijking met muizen (~ 3% cones) - hen bijzonder bruikbaar voor de studie van conus functie 7-9. In de gewervelde netvlies, kegeltjes ontwikkelen voordat staven 10. Interessant, zebravis kegels zijn werkzaam zo vroeg als 4 dpf, waardoor voor selectieve elektrofysiologische analyse van kegels in die fase 6, 11,12. Daarentegen ERG reacties in staven staan ​​tussen 11 en 21 dpf 13. Daarom zebravis larven op 4-7 dpf dienen functioneel als een all-conus netvlies. Echter, de inheemse photopic ERG reactie van 4-7 DPF larven gedomineerd door de b-golf. Toepassing van farmacologische middelen, zoals L - (+) - 2-amino-4-fosfono-boterzuur (L-AP4), een agonist voor de metabotrope glutamaat (mGluR6) receptor door expressie ON bipolaire cellen blokkeert effectief de generatie van de b-golf en onthult de geïsoleerde kegel massa receptor potential, (de &quot;a-wave&quot;) 14-17. Hier beschrijven we een eenvoudige en reliable werkwijze voor ERG analyse met behulp van commercieel verkrijgbaar ERG materiaal bestemd voor gebruik met muizen die zijn aangepast voor gebruik met zebravis larven. Dit systeem kan worden gebruikt op zebravis larven van verschillende genetische achtergronden, evenals die behandeld met farmacologische middelen, onderzoekers helpen bij de identificatie van signaalroutes die bijdragen aan de visuele gevoeligheid en lichte aanpassing 16. De experimentele procedures die in dit protocol onderzoekers begeleiden bij het gebruik van ERG analyse van verschillende biologische vragen over visie beantwoorden, en tonen de constructie van een flexibele ERG setup.

<table><tbody><tr><td>Faraday kooi</td><td>80/20 Inc</td><td>aangepast</td><td>Op maat gemaakt aluminium "Industrial Erector Set" voor kooi frame</td></tr><tr><td>PVA-spons</td><td>Amazon</td><td>B000ZOWG1C</td><td>Biedt een zachte, vochtige platform voor het plaatsen van zebravislarven</td></tr><tr><td>150 ml steriele filtersystemen</td><td>Corning</td><td>431154</td><td>Filteroplossingen om te voorkomen dat kleine artikelen micropipetten blokkeren</td></tr><tr><td>Espion E2</td><td>Diagnosys, LLC</td><td>contact</td><td>Modulaire elektrofysiologie systeem dat in staat is om visuele stimuli voor elke stimulator te genereren en digitale opname en analyse van reacties met behulp van propriëtaire software, meer informatie op http://www.diagnosysllc.com</td></tr><tr><td>Colordome</td><td>Diagnosys, LLC</td><td>contact</td><td>Lichtstimulator met RGB LED en Xenon lichtbronnen voor Ganzfeld ERG, meer informatie op http://www.diagnosysllc.com</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Drummond</td><td>3-000-024-R</td><td>Het vasthouden en positioneren van de opname microelektrode</td></tr><tr><td>Magneetring standaard</td><td>Drummond</td><td>3-000-025-MB</td><td>Het vasthouden en positioneren van de camera en referentie elektrode</td></tr><tr><td>Leidingverlengstukken</td><td>Grass Technologies</td><td>F-LX</td><td>Reserve vrouwelijke naar mannelijke 1.5 mm leidingkabels voor het aansluiten van elektroden</td></tr><tr><td>Mannelijke Pin naar Vrouwelijke SAFELEAD Adaptor</td><td>Grass Technologies</td><td>DF-215/10</td><td>Verbinden van 2 mm pinnen naar 1.5 hoofdbord pinnen</td></tr><tr><td>Venster scherm frame (metaal) en spleet</td><td>Lowes of Home Depot</td><td>diverse</td><td>Voor het bevestigen van koperen gaas aan het Faraday kooi frame</td></tr><tr><td>Steriflip 50 ml filters</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>Filteroplossingen om te voorkomen dat kleine artikelen micropipetten blokkeren</td></tr><tr><td>BNC adapter</td><td>Monoprice</td><td>4127</td><td>Camera aansluiten op BNC kabel</td></tr><tr><td>BNC kabel</td><td>Monoprice</td><td>626</td><td>Camera aansluiten op video adapter</td></tr><tr><td>Camera lens</td><td>Navitar</td><td>1582232</td><td>Visualiseren van de positie van de opname microelektrode op de larvale cornea</td></tr><tr><td>Camera koppeling</td><td>Navitar</td><td>1501149</td><td>Visualiseren van de positie van de opname microelektrode op de larvale cornea</td></tr><tr><td>Luna BNC naar VGA + HDMI Converter</td><td>Sewell</td><td>SW-29297-PRO</td><td>BNC naar VGA adapter waardoor de camera afbeelding op computer monitor kan worden geprojecteerd</td></tr><tr><td>APB</td><td>Sigma</td><td>A1910</td><td>mGluR6 agonist, blokkeert b-golf waardoor analyse van het geïsoleerde kegel massa receptor potentieel mogelijk is</td></tr><tr><td>Borosilicaatglas</td><td>Sutter</td><td>BF-150-86-10</td><td>Met vlam gepolijst borosilicaat glas (smelttemperatuur = 821&deg;C) met gloeidraad en afmetingen van 1.5mm x 0.86 mm (buitendiameter door binnendiameter)&nbsp;</td></tr><tr><td>P97 Flaming/Brown puller</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td>Voor het trekken van glazen micropipetten</td></tr><tr><td>Sorbothane plaat</td><td>Thorlabs</td><td>SB12A</td><td>Synthetisch viscoelastisch urethaan polymeer, geplaatst onder Passieve Isolatie Mounts en ERG platform om schokken te absorberen en glijden te voorkomen, kan op maat worden gesneden</td></tr><tr><td>Breadboard</td><td>Thorlabs</td><td>B2436F</td><td>Vibratie isolatie platform voor ERG stimulator en zebravis specimen</td></tr><tr><td>Passieve Isolatie Mounts</td><td>Thorlabs</td><td>PWA074</td><td>Zorgt voor vibratie isolatie voor breadboard</td></tr><tr><td>Koper gaas</td><td>TWP</td><td>022X022C0150W36T</td><td>Om Faraday kooi te bekleden</td></tr><tr><td>Pipetpompe</td><td>VWR</td><td>53502-233</td><td>Gebruikt met Pasteur pipetten om voorzichtig zebravislarven over te brengen</td></tr><tr><td>Pasteur pipetten</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td>Gebruikt met Pipetpompe om voorzichtig zebravislarven over te brengen</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Watec</td><td>WAT-902B</td><td>Visualiseren van de positie van de opname microelektrode op de larvale cornea</td></tr><tr><td>Tricaine (MS-222)</td><td>Western Chemical</td><td>Tricaine-S</td><td>Farmaceutische kwaliteit anestheticum,</td></tr><tr><td>Micro-fil</td><td>WPI</td><td>MF28G-5</td><td>Microelektrode houder en microelektrode glas vullen</td></tr><tr><td>Microelektrode houder</td><td>WPI</td><td>MEH2SW15</td><td>Houdt glazen microelektrode, aansluiten op ERG apparatuur</td></tr><tr><td>Referentie Elektrode</td><td>WPI</td><td>DRIREF-5SH</td><td>Zorgvuldig de laatste centimeter van de behuizing afbreken om de elektrolyt af te tappen en de gesinterde Ag/AgCl pellet elektrode bloot te leggen</td></tr><tr><td>Referentie Elektrode (alternatief)</td><td>WPI</td><td>EP1</td><td>Alternatief voor DRIREF-5SH. Ag/AgCl elektrode die moet worden bedrad/gelijmd aan de verbindingsdraad</td></tr><tr><td>Laag-ruis kabel voor Microelektrode houder</td><td>WPI</td><td>13620</td><td>Aansluiten van opname microelektrode houder op adapter/hoofdbord</td></tr></tbody></table>

electroretinogram analyse van de visual response in zebravis larven

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

De electroretinogram (ERG) is een niet-invasieve elektrofysiologische methode voor het bepalen van retinale functie. Door het plaatsen van een elektrode op het oppervlak van de cornea, elektrische activiteit gegenereerd in reactie op licht kan worden gemeten en gebruikt om de activiteit van retinale cellen in vivo te evalueren. Dit manuscript beschrijft het gebruik van de ERG om de visuele functie te meten in de zebravis. Zebravis zijn al lange tijd gebruikt als een model voor gewervelde ontwikkeling als gevolg van het gemak van het gen onderdrukking door morfolino- oligonucleotiden en farmacologische manipulatie. 5-10 dpf, alleen kegels zijn functioneel in de larvale retina. Daarom is de zebravis, in tegenstelling tot andere dieren, is een krachtig model voor de studie van kegel visuele functie in vivo. Dit protocol maakt gebruik van standaard anesthesie, micromanipulatie en stereomicroscopie protocollen die gangbaar zijn in de laboratoria die de zebravis onderzoek uit te voeren. De geschetste methoden maken gebruik van standaard elektrofysiologie equipment en een weinig licht camera om de plaatsing van de opname micro-elektrode te begeleiden op de larvale hoornvlies. Tenslotte tonen we hoe een commercieel verkrijgbaar ERG stimulator / recorder oorspronkelijk ontworpen voor gebruik met muizen gemakkelijk worden aangepast voor gebruik bij zebravis. ERG van larvale zebravis biedt een uitstekende methode voor het bepalen van kegel visuele functie bij dieren die zijn gewijzigd door morfolino- oligonucleotide injectie, alsook nieuwere genoom engineering-technieken zoals Zinc Finger Nucleasen (ZFNs), transcriptie Activator-Like Effectorcellen Nucleasen (Talens), en Regelmatig Gegroepeerde afgewisseld met korte Palindromic Repeats (CRISPR) / Cas9, die allemaal sterk verhoogde de efficiëntie en effectiviteit van gen targeting in zebravis. Bovendien benutten we het vermogen van farmacologische middelen aan zebravis larven de moleculaire componenten die bijdragen aan de photoresponse evalueren dringen. Dit protocol beschrijft een opstelling die kan worden gemodificeerd en gebruikt door onderzoekersmet diverse experimentele doelen.

Gewoonlijk ERG worden geregistreerd van zebravis larven 5 dpf, aangezien een aantal studies ERG opnames gepubliceerd in dit stadium 9, 16,20. Larvale reacties werden gemeten onder donker aangepaste voorwaarden zonder achtergrond verlichting met behulp van een 20 msec stimulans van wit LED licht. We gebruik gemaakt van een in de handel verkrijgbaar ERG systeem dat bestaat uit een Ganzfeld licht stimulator en computer controller / recorder. De stimulator gebruikt een strak eigen pulsbreedtemodulatie (PWM) syste...

We presenteren een methode voor de elektroretinografische (ERG) analyse van zebravislarven met behulp van micromanipulatie en elektroretinografietechnieken. Dit is een eenvoudige en duidelijke methode voor het testen van de visuele functie van zebravislarven in vivo.

Electroretinogram Analyse van de Visual Response in zebravis Larven

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

Het algemene doel van deze procedure is om de stappen te illustreren die nodig zijn voor het uitvoeren van een electrografische analyse bij zebravislarven. Dit wordt bereikt door eerst glazen micropipetten te vervaardigen met de juiste vorm en afmetingen. De tweede stap is het zorgvuldig opstellen van apparatuur die essentieel is voor het experiment, zoals referentie- en registratie-elektroden.Vervolgens wordt de zebravislarve geanestheseerd en correct georiënteerd ten opzichte van de stimulerings- en registratieapparatuur. De laatste stap is de juiste plaatsing van de glazen micro-elektrode op het hoornvlies van de zebravislarve. Uiteindelijk de zebravislarven.ERG-analyse is nuttig voor het onderzoeken van de visuele functie van kegeltjes in de retina van vertebraten met uitsluitend kegeltjes in vivo. Deze methode is zeer waardevol voor het beantwoorden van kernvragen binnen de visuele wetenschappen, zoals de identificatie van signaleringspaden die bijdragen aan de visuele gevoeligheid en lichtadaptatie in kegeltjes. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de juiste positionering van de registratie-micro-elektrode op het specimen moeilijk te leren is vanwege de geringe omvang van het oog van de zebravislarve.Om deze procedure te starten, worden meerdere micropipetten getrokken met behulp van vuurgepolijste borosilicaatglaskapillairen met een filament. Controleer elke micropipet onder een microscoop met een geschikte maatschaal om te bevestigen dat de diameter van de tips 10 tot 15 micrometers is en dat deze er gelijkmatig uitzien. Maak op de dag van het experiment een werkoplossing door een 10 x Ringer-oplossing te verdunnen tot één x.Steriliseer de oplossing met een gedeïoniseerd gedestilleerd waterfilter om te voorkomen dat partikels de tip van de micropipet blokkeren. Zuurstof vervolgens gedurende 10 minuten met 95% zuurstof en 5% kooldioxide. Sluit de oplossing daarna stevig af om te garanderen dat de oplossing zuurstofrijk blijft.Plaats nu een beweegbaar plastic platform met een schokabsorberende bodem van visco-elastisch urethaanpolymeer op de trillingsvrije tafel onder de lichtbron. Positioneer vervolgens de camera met een magnetische standaard en richt deze op het beweegbare plastic platform. Plaats daarna de micromanipulator van de registratie-micro-elektrode op een tweede magnetische standaard.Zorg ervoor dat de camera en de micromanipulator niet worden verstoord door de beweging van andere apparatuur en dat de verlichting van de lichtbron niet wordt geblokkeerd. Sluit daarna de camera aan op een videomonitor en richt deze op het platform. Zorg ervoor dat de opstelling correct is geaard met koperdraad.Snijd in deze stap met een schoon scheermesje een kleine rechthoek van droge PVA-spons die precies in een Petri-schaal van 35 millimeter past. Maak een extra inkeping in de spons om de referentie-elektrode te accommoderen. Gebruik vervolgens een chemisch bestendige marker om een klein stipje op de spons te markeren waar de larve geplaatst zal worden.Week daarna de PVA-spons in ringersoplossing tot deze verzadigd is. Haal de spons eruit en dep deze twee tot drie keer snel af met een papieren handdoek voordat u deze in een schone Petri-schaal van 35 millimeter plaatst. Plaats vervolgens de Petri-schaal met de spons op een plastic platform, zodat de markering door de camera kan worden gevisualiseerd.Chloride vervolgens de elektroden door ze in een oplossing van 6 tot 9% natriumchloride te weken. Laat ze daarna vijf minuten aan de lucht drogen op een Kim wipe. Plaats de zilver/zilverchloride-pellet van de referentie-elektrode in of onder de spons, afhankelijk van de wijze waarop de incisie is gemaakt, en sluit de kabel van de referentie-elektrode aan op het registratiesysteem.Bevestig vervolgens ongeveer 40 centimeter slang aan een vijf milliliter niet-luer-lock spuit en vul de spuit met Ringer-oplossing. Vul daarna een één milliliter niet-luer-lock spuit met Ringer-oplossing. Vul de micro-elektrodehouder voorzichtig met een microfill en voorkom de vorming van luchtbellen.Bevestig vervolgens de spuit van vijf milliliter met behulp van slang en de microfill en een spuit van één milliliter gevuld met Ringer-oplossing aan de drukpoort van de houder voor de microelektrode. Vul de glazen micropipet vanaf de punt en zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn. Bevestig daarna de glazen micropipet aan de houder voor de microelektrode en zorg ervoor dat de elektrode-draad recht blijft.Zodra deze is vastgezet, gebruikt u de spuit van vijf milliliter om de ringer-oplossing voorzichtig door de micro-elektrode te drukken totdat er een kleine hoeveelheid oplossing op de punt zichtbaar is. Plaats nu de registratie-micro-elektrode voorzichtig in de micromanipulator en sluit de kabel aan op het registratiesysteem om het systeemgeluid te controleren. Plaats de referentie-elektrode en de punt van de registratie-micro-elektrode in een Petri-schaal van 35 millimeter gevuld met ringer-oplossing.Controleer de elektrische ruisniveaus van de opstelling met een oscilloscoop of een ingebouwde functie van het ERG-apparaat. De ruisniveaus mogen niet meer dan plus of minus 10 µV vanaf de basislijn bedragen. Snijd bij deze procedure verschillende vierkante centimeters keukenpapier en anesthetiseer drie tot vijf larven in een Petri-schaal van 35 mm door trica toe te voegen tot een uiteindelijke concentratie van 0,02% en één tot twee minuten te wachten.Kort daarna wordt een individuele larve zorgvuldig overgebracht naar een vierkant stukje keukenpapier onder een dissectiestereoscope met minimale verlichting. Controleer de positie van de larven en kies een kandidaat die met de rugzijde naar boven ligt en een afgesloten oog heeft voor opnamesessies die langer dan 30 minuten duren. Houd de larve vochtig door het lichaam te bestrijken met 3% methylcellulose met behulp van een fijne penseel van kameelhaar.Verplaats vervolgens het vierkantje keukenpapier met de larve naar de vochtige PVA-spons. Pas daarna een continue stroom van waterverzadigde 100% oxygen toe over de larven door het gas via een luchtsteen in een zijarmkolf met gedestilleerd water te borrelen. Positioneer de bevochtigde oxygen uit de zijarm van de kolf met behulp van slangjes nabij de kop van de larve onder minimale verlichting.Gebruik de micromanipulator en de camera om de tip van de microelektrode te positioneren in het middenpunt tussen de nasale en caudale uiteinden van het oog en druk voorzichtig op de dorsale grens van het hoornvlies. Laat de larven vijf tot 10 minuten wennen aan het donker. Registreer vervolgens de testflash-responsen op het licht dat wordt geleverd door een LED-lichtbron of optische stimulator.Deze figuur toont een typische ERG-registratie in een zebravislarve van vijf DPF. De donkergeadapteerde vissen werden gedurende 20 milliseconden blootgesteld aan wit LED-licht met intensiteiten variërend van 1 tot 5.000 canula per vierkante meter, waarbij de lichtstimulus begon bij nul seconden. De negatieve potentiaal a-golf is moeilijk te onderscheiden, terwijl de positieve potentiaal b-golf de dominante piek van de golfvorm is.Dit inzetstuk toont de gemiddelde B-golf responsamplitudes die zijn gefit met behulp van de Naka-Rushton-vergelijking. Deze figuur toont een typische ERG-registratie in een donker-geadapteerde zebravislarve van vijf DPF die behandeld is met een PB. De vissen worden gedurende 20 milliseconden blootgesteld aan wit LED-licht met intensiteiten variërend van 1 tot 5.000 candela per vierkante meter, waarbij het geïsoleerde receptorpotentiaal van de kegelcellen het dominante element van de golfvorm is. Dit inzetstuk toont de gemiddelde responsamplitudes van een met PB behandelde zebravislarve die zijn gefit met behulp van de Naka-Rushton-vergelijking.Deze figuur toont een typische ERG-opname van een zebravislarve behandeld met vijf D-P-F-A-P-B. Er is gebruikgemaakt van een dual-flash paradigma. De in het donker geadapteerde vissen worden blootgesteld aan opeenvolgende witte lichtflitsen van 20 milliseconden.LED-flitsen hebben een intensiteit van 1000 canula per vierkante meter, en het ISI tussen de flitsen is twee seconden. Het begin van elke lichtstimulus wordt hier aangegeven. Deze figuur toont de verhouding van de maximale geïsoleerde receptorpotentiaal-respons van de kegelmassasnelheid van de tweede stimulus ten opzichte van die van de initiële stimulus bij een toenemend ISI, wat wijst op het progressieve herstel van de gevoeligheid van de fotoreceptoren.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de kwaliteit van de opnames wordt bepaald door de integriteit van de verbinding tussen de elektrode en het hoornvlies en de gezondheid van de larven. De ontwikkeling van deze techniek heeft het vermogen van onderzoekers in de visiewetenschappen aanzienlijk vergroot om cone-adaptatie en -herstel in de retina van gewervelden in vivo te onderzoeken.

electroretinogram-analysis-of-the-visual-response-in-zebrafish-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We ontwikkelden de Visual-Motor Reactie op het motorvermogen van larvale zebravis kwantificeren in reactie op licht stappen en verlaagt. We hebben ook onderzocht zebravis visie mutanten, waaronder de no optokinetische reactie (NRC) mutanten, waarvan gedacht werd dat volledig blind wanneer het wordt getest door een andere visie assay, de optokinetische reflex.

Een Behavioral Assay aan responsiviteit van zebravis Maatregel om veranderingen in lichtintensiteit

Optokinetische reactie is op grote schaal gebruikt om de visuele functies van larvale zebravis te beoordelen. Toch is het standaard protocol voor larvale vis is nog niet goed toepasbaar bij...

Met behulp van de optokinetische reactie op de visuele functie van de zebravis studie

De VisioTracker is een geautomatiseerd systeem voor de kwantitatieve analyse van de visuele prestaties van larvale en kleine volwassen vissen op basis van de registratie van oogbewegingen. Het beschikt over volledige controle over visuele stimulus eigenschappen en real-time analyse, waardoor high-throughput onderzoek op gebieden zoals visuele systeem ontwikkeling en functie, farmacologie, neurale circuit studies en sensomotorische integratie.

VisioTracker, een innovatieve geautomatiseerde benadering van oculomotorische Analyse

Deze video beschrijft de fotomotorische responstest van zebravissen en dikkopminnowlarven met behulp van een geautomatiseerde trackingsoftware. Het protocol meet de gedragsrespons van de larvevis na een plotselinge verandering in de lichtomstandigheden.

Fotomotorische responstest: een methode om de gedragsrespons van larvale zebravissen op een plotselinge verandering in verlichtingsconditie te meten

Deze video beschrijft de optokinetische responstest bij zebravissen. De video meet de reflexieve oogbewegingen op basis van de visuele bewegende stimulus en bepaalt de gezichtsscherpte bij zebravissen.

Optokinetic Response Assay: een methode om gezichtsscherpte bij zebravissen te meten

This video demonstrates the method for studying visual prey detection in transgenic zebrafish larvae using calcium indicator-based fluoresce imaging with their neurons expressing fluorescent calcium indicator complexes.

Analyzing the Prey-Evoked Neuronal Activity in a Transgenic Zebrafish Larva

Zebravis hebben een waardevol instrument voor vele onderzoeksgebieden geweest. Hier laten we een methode om een ​​visuele respons opwekken en berekent een functionele gezichtsscherpte in het volwassen zebravissen.

Optokinetische Response als een kwantitatieve maat van de gezichtsscherpte in zebravis

We introduceren een efficiënte methode om retinale ganglioncellen (RGC's) bij volwassen zebravissen retrograad te labelen.

Retrograde Labeling van retinale ganglioncellen in Adult zebravis met fluorescente kleurstoffen

Hier presenteren we een protocol voor de ontwikkeling en de karakterisering van een zebravismodel van epilepsie als gevolg van de voorbijgaande remming van het DEPDC5-gen.

Gedrags- en fysiologische analyse in een zebravismodel van epilepsie

Hier presenteren we een protocol dat de meting van lichte evoked electroretinogram reacties van larvale zebrafish vereenvoudigt. Een roman kegelvormige spons-tip-elektrode kan helpen om de studie van visuele ontwikkeling in larvale zebrafish met behulp van de electroretinogram ERG gemakkelijker te bereiken met betrouwbare resultaten en lagere kosten.

Electroretinogram opname in larvale Zebrafish met behulp van A roman kegel-vormig spons-tip elektrode

Het artikel legt uit hoe de ogen chirurgisch kunnen worden verwijderd van levende zebravislarven als de eerste stap om te onderzoeken hoe retinale input de groei en ontwikkeling van het optische tectum beïnvloedt. Daarnaast biedt het artikel informatie over larvale anesthesie, fixatie en hersendissectie, gevolgd door immunohistochemie en confocale beeldvorming.

Oogverwijdering bij levende zebravislarven om innervatie-afhankelijke groei en ontwikkeling van het visuele systeem te onderzoeken

Leer elektroretinografie-analyse van visuele responsen in zebravislarven met behulp van micromanipulatietechnieken. Deze methode stelt onderzoekers in staat om visuele functie in vivo te beoordelen.

Electroretinogram Analyse van de Visual Response in zebravis Larven

Meer video's verkennen