Name: Oprichting van een Human Multiple Myeloma Xenograft Model in de Chicken tumorgroei, invasie en Angiogenese Studie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Leer een kippenembryo-xenograftmodel met menselijke multipel myeloma- en mesenchymale cellen voor onderzoek naar tumorgroei, invasie en angiogenese. Deze methode maakt grootschalige screening van anti-kankermedicijnen in een complexe 3D-omgeving mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen mevrouw Cornelia Heis bedanken voor haar uitstekende technische assistentie bij immunohistochemie en de voorbereiding van kippenembryo's. Dit werk werd ondersteund door de Oostenrijkse Wetenschapsraad (FWF Grant Nr. P19552) en de Europese Unie (EU FP7 project Optatio Nr: 278570).

Volgens de Oostenrijkse wet, en het Bureau van Laboratory Animal Welfare van de Amerikaanse publieke gezondheidszorg aviaire embryo&#39;s worden niet beschouwd als levende gewervelde dieren tot hatching.The NIH Bureau van Laboratory Animal Welfare schriftelijke begeleiding is in dit gebied (http: // www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm en NIH publicatie nr .: 06-4515). 1. Cel Cultuur en Lentivirale transfectie <ol><li> Culture MM cellijnen OPM-2, RPMI-8226 en menselijke mesenchymale stamcellen uit beenmerg in RPMI 1640 medium, gesupplementeerd met 10% foetaal kalfsserum en 100 IU / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 2 mM glutamine in aanwezigheid van 5% CO2 bij 37 ° C. </li><li> Transfecteren 5 x 10 6 293FT HEK cellen met virale verpakkingsmix (9 ug) DNA en 3 ug pLenti6 / V5 dest eGFP vector met behulp van 30 pl liposomaal transfectiereagens en transfectie medium (10 ml). Verwijder transfectie medium na 12 uur enVoeg 10 ml DMEM-medium met 10% bovien kalfsserum en 1% niet-essentiële aminozuren (NEAA). </li><li> Na 5 dagen, verzamel supernatanten van HEK293FT cellen na centrifugeren van het zwemmen cellen (1.000 x g, 5 min). Bepaal virale titer door real time PCR zoals elders 28 beschreven. </li><li> Transfecteren 1 x 10 6 MM cellen met eGFP lentivirale deeltjes (1 x 10 5 deeltjes) in een plaat met 24 putjes in compleet groeimedium. Na 3 dagen, te beginnen selectieproces door toevoeging van 2 ug / ml blasticidine aan het kweekmedium. Voor de commercieel verkrijgbare eGFP lentivirus, gebruikt 500 ug / ml neomycine. </li><li> Na 2 weken van de selectie, zal clusters van eGFP uiten MM cellen blijken; cellen te verzamelen door centrifugeren (1000 x g, 5 min) en uit te breiden hen als OPM-2 eGFP en RPMI-8226 eGFP sublijnen voor experimenten (hoofdstuk 2 en 3). </li></ol> 2. 3D-Multiple Myeloma Spheroid Model <ol><li> Type I Chill collageen-oplossing en 10 x DMEM on ijs. </li><li> Meng 1/10 volume van 10 x DMEM medium in collageen matrix; voeg NaOH (0,2 N) met zure collageenoplossing een pH waarde van 7,4 te neutraliseren; store collageen / medium oplossing op het ijs. </li><li> Meng transgene MM cellijnen (OPM-2 eGFP of RPMI-8226 eGFP; 250.000 per sferoïde,) met menselijke mesenchymale cellen (50.000 cellen / sferoïde, dat wil zeggen 30 ul druppel). </li><li> Centrifuge celmengsel in 15 ml buizen (1000 x g, 5 min), voeg koud bereide collageen mengsel (1 ml) naar de cel pellet en meng goed (met 1000 ul tip). </li><li> Onmiddellijk Pipetteer 30 ul van de collageen / celmengsel (met 100 ul tip) in een 24 wells plaat op steriele paraffine film en laat cellen / collageen mengsel polymeriseren gedurende 30 minuten bij 37 ° C (zie figuur 1A). </li><li> Overlay MM sferoïden met 1 ml kweekmedium dat 1, 10 en 100 nM bortezomib (zie figuur 1B). </li><li> Na 72 uur incubatie bij 37 ° C, document sferoïden doorfluorescentie stereomicroscopie (zie figuur 1C). </li><li> Breng elke sferoïde met behulp van forceps met brede platte bekken in een reageerbuis voor het meten van GFP (zie figuur 1D). </li></ol> 3. 3D Multiple Myeloma Xenograft Model in de CAM <ol><li> Incubeer kippeneieren in een bijzondere incubator vogeleieren bij 37 ° C en 70% luchtvochtigheid gedurende drie dagen. </li><li> Daarna geopend eieren en overdracht embryo gesteriliseerd met ethanol, vierkant, 10 cm plastic weegschuitjes met celkweekplaat deksel en incubeer &quot;ex ovo&quot; gedurende zes dagen, waardoor de CAM kan ontwikkelen (zie figuur 2A). </li><li> Type-I Chill collageenoplossing en 10 x DMEM op ijs, meng 1/10 volume van 10 x DMEM medium in collageen matrix, Opslaan NaOH (0,2 N) met zure collageenoplossing een pH waarde van 7,4 te neutraliseren; store collageen / medium oplossing op het ijs. </li><li> Meng transgene MM cellijnen (OPM-2 eGFP ofRPMI-8226 eGFP; 250.000 per sferoïde,) met menselijke mesenchymale cellen (50.000 cellen / sferoïde). </li><li> Centrifuge cellen in 15 ml buizen (1000 xg, 5min, want elke test verbinding 1 flacon), voeg 1 ml koud bereid collageen mengsel met geneesmiddel (op de gewenste werken concentratie) naar de cel pellet en meng goed (met 1000 ul tip). </li><li> Plaats collageen druppels (30 pi elk) op parafilm in een 6 goed pate gedurende 30 minuten om polymerisatie van de extracellulaire matrix toe bij 37 ° C. </li><li> Transfer &quot;onplants&quot; uit stap 3.6 met behulp van een tang om het onbehandelde oppervlak van de CAM (2 cm van embryo) van 9 dagen oude kippenembryo&#39;s (4 onplants per kippenembryo, zie figuur 2B) </li><li> Na 5 dagen in vivo in een ei-incubator bij 37 ° C en 70% vochtigheid, document xenotransplantaten door fluorescentie stereomicroscopie (zie figuur 2C). Euthanaseren kippenembryo&#39;s van hypothermie bij 4 ° C in de koelkast gedurende 5 uur. </li><li> Verwijder xenotransplantaten met onderliggende CAM weefsel door een oogheelkundige schaar en tang met brede platte kaken. Gebruik ze voor het meten van GFP (hoofdstuk 4, zie figuur 2D) of voor immunohistochemische analyse van de bloedvaten en / of binnendringende tumorcellen (hoofdstuk 5). </li></ol> 4. Kwantificering van eGFP eiwit met ELISA <ol><li> Breng elke MM bolvormige of uitgeschakelde xenograft in 0,5 ml RIPA buffer bevattende 200 ug / ml proteaseremmers. </li><li> Homogeniseren sferoïde / xenograft met een tissue homogenisator op ijs. </li><li> Voer drie invriezen / ontdooien cycli in vloeibare stikstof en 37 ° C waterbad. </li><li> Centrifugeer homogenaat bij 4 ° C gedurende 20 min (12.000 g) en opslaan supernatanten. </li><li> Verdun monsters 1:20 in assaybuffer (200 ul) van de ELISA-kit. Meet GFP-niveaus door een commerciële ELISA kit GFP via gebiotinyleerd anti-GFP antilichamen volgens het protocol van de fabrikant. </li></ol> 5. Immunohistochemical Analyse van de bloedvaten en het binnenvallen van tumorcellen <ol><li> Bevestig uitgesneden xenotransplantaten met CAM gebied 4% paraformaldehyde O / N bij 4 ° C. </li><li> Vastgezet xenotransplantaten in inbedden cassettes en overbrengen in een weefsel inbedding station bij toenemende gegradeerde alcohol series (50%, 70%, 80%, 95% ethanol, xyleen en paraffine; iedere stap 60 min). </li><li> Sectie xenotransplantaten (5 urn) door middel van een benchtop rotatiemicrotoom. Bak paraffinecoupes op glasplaatjes O / N bij 56 ° C. </li><li> Deparaffinize secties door een afnemende gegradeerde alcohol serie dubbel gedestilleerd water (xylol, 95%, 80%, 70%, 50% ethanol, tweemaal gedestilleerd water; iedere stap 10 min). </li><li> Voer antigen retrieval in een waterbad (95 ° C, 20 min) met een antigen retrieval oplossing (citrate- buffer, pH 7,0, volume 100 ui). </li><li> Blokkeer endogene peroxidase-activiteit met 100 ui 3% H 2 O 2 / methanol gedurende 30 minuten. </li><li> Blokdelen in PBS bevattende10% foetaal kalfserum voor 45 min (volume 100 ui). </li><li> Stain gedurende 1 uur met 100 pi primair antilichaam (1 pg / ml) verdund in PBS dat 1% foetaal kalfsserum bij KT. </li><li> Na 3 maal wassen in PBS, geïncubeerd gedurende 1 uur met gebiotinyleerd secundair antilichaam (0,1 ug / ml) in PBS met 1% foetaal kalfsserum bij KT. </li><li> Na 3 maal wassen in PBS uitgevoerd kleurreactie door avidine / biotine-complex (ABC) en diaminobenzidine (DAB) substraatoplossing volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> 5.11. Stop de reactie door de overdracht van secties dubbel gedestilleerd water, tegenkleuring met hematoxyline en monteer secties met een synthetisch montage medium. </li></ol>

<ol><li>Kuehl, W. M., Bergsagel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+myeloma%3A+evolving+genetic+events+and+host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Cancer%22%5BJournal%5D)">Multiple myeloma: evolving genetic events and host interactions.</a> Nat.Rev.Cancer. 2 (3), 175-187 (2002).</li>
<li>Kumar, S. K., Gertz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+adapted+therapy+for+multiple+myeloma%3A+back+to+basics%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk.Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Risk adapted therapy for multiple myeloma: back to basics.</a> Leuk.Lymphoma. , (2014).</li>
<li>Prideaux, S. M., Conway, O. E., Chevassut, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+architecture+of+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.Hematol%22%5BJournal%5D)">The genetic architecture of multiple myeloma.</a> Adv.Hematol. 2014, 864058(2014).</li>
<li>Chauhan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+orally+active+proteasome+inhibitor+ONX+0912+triggers+in+vitro+and+in+vivo+cytotoxicity+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A novel orally active proteasome inhibitor ONX 0912 triggers in vitro and in vivo cytotoxicity in multiple myeloma.</a> Blood. 116 (23), 4906-4915 (2010).</li>
<li>Kuehl, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+can+predict+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mouse models can predict cancer therapy.</a> Blood. 120 (2), 238-240 (2012).</li>
<li>Nefedova, Y., Gabrilovich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+clinical+prospects+of+Notch+inhibitors+in+the+therapy+of+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Resist.Updat%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and clinical prospects of Notch inhibitors in the therapy of hematological malignancies.</a> Drug Resist.Updat. 11 (6), 210-218 (2008).</li>
<li>Yaccoby, S., Barlogie, B., Epstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+myeloma+cells+growing+in+SCID-hu+mice%3A+a+model+for+studying+the+biology+and+treatment+of+myeloma+and+its+manifestations%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Primary myeloma cells growing in SCID-hu mice: a model for studying the biology and treatment of myeloma and its manifestations.</a> Blood. 92 (8), 2908-2913 (1998).</li>
<li>Dazzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+chronic+phase+CML+hematopoietic+cells+repopulate+NOD%2FSCID+bone+marrow+with+different+kinetics+and+cell+lineage+representation%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol.J%22%5BJournal%5D)">Normal and chronic phase CML hematopoietic cells repopulate NOD/SCID bone marrow with different kinetics and cell lineage representation.</a> Hematol.J. 1 (5), 307-315 (2000).</li>
<li>Lock, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nonobese+diabetic%2Fsevere+combined+immunodeficient+%28NOD%2FSCID%29+mouse+model+of+childhood+acute+lymphoblastic+leukemia+reveals+intrinsic+differences+in+biologic+characteristics+at+diagnosis+and+relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mouse model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis and relapse.</a> Blood. 99 (11), 4100-4108 (2002).</li>
<li>Feuring-Buske, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+engraftment+of+human+acute+myeloid+leukemia+progenitor+cells+in+beta+2-microglobulin-deficient+NOD%2FSCID+mice+and+in+NOD%2FSCID+mice+transgenic+for+human+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Improved engraftment of human acute myeloid leukemia progenitor cells in beta 2-microglobulin-deficient NOD/SCID mice and in NOD/SCID mice transgenic for human growth factors.</a> Leukemia. 17 (4), 760-763 (2003).</li>
<li>Pearce, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AML+engraftment+in+the+NOD%2FSCID+assay+reflects+the+outcome+of+AML%3A+implications+for+our+understanding+of+the+heterogeneity+of+AML%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">AML engraftment in the NOD/SCID assay reflects the outcome of AML: implications for our understanding of the heterogeneity of AML.</a> Blood. 107 (3), 1166-1173 (2006).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+inhibition+of+Notch+signaling+and+Bcl-2%2FBcl-xL+results+in+synergistic+antimyeloma+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Combined inhibition of Notch signaling and Bcl-2/Bcl-xL results in synergistic antimyeloma effect.</a> Mol.Cancer Ther. 9 (12), 3200-3209 (2010).</li>
<li>Tassone, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinically+relevant+SCID-hu+in+vivo+model+of+human+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A clinically relevant SCID-hu in vivo model of human multiple myeloma.</a> Blood. 106 (2), 713-716 (2005).</li>
<li>Ranga, A., Gjorevski, N., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+discovery+through+stem+cell-based+organoid+models%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.Drug+Deliv.Rev%22%5BJournal%5D)">Drug discovery through stem cell-based organoid models.</a> Adv.Drug Deliv.Rev. 69-70, 19-28 (2014).</li>
<li>Pereira, R. F., Barrias, C. C., Granja, P. L., Bartolo, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+biofabrication+strategies+for+skin+regeneration+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine.%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Advanced biofabrication strategies for skin regeneration and repair.</a> Nanomedicine.(Lond). 8 (4), 603-621 (2013).</li>
<li>Fischbach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+tumors+with+3D+scaffolds%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering tumors with 3D scaffolds).</a> Nat.Methods. 4 (10), 855-860 (2007).</li>
<li>Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenotransplantation+of+human+stem+cells+into+the+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Xenotransplantation of human stem cells into the chicken embryo.</a> J.Vis.Exp. (41), (2010).</li>
<li>Deryugina, E. I., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+2.+Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+models+to+quantify+angiogenesis+induced+by+inflammatory+and+tumor+cells+or+purified+effector+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Chapter 2. Chick embryo chorioallantoic membrane models to quantify angiogenesis induced by inflammatory and tumor cells or purified effector molecules.</a> Methods Enzymol. 444, 21-41 (2008).</li>
<li>Deryugina, E. I., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+model+systems+to+study+and+visualize+human+tumor+cell+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis.</a> Histochem.Cell Biol. 130 (6), 1119-1130 (2008).</li>
<li>Kern, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GRP-78+secreted+by+tumor+cells+blocks+the+antiangiogenic+activity+of+bortezomib%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">GRP-78 secreted by tumor cells blocks the antiangiogenic activity of bortezomib.</a> Blood. 114 (18), 3960-3967 (2009).</li>
<li>Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Presta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gelatin+sponge-chorioallantoic+membrane+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Protoc%22%5BJournal%5D)">The gelatin sponge-chorioallantoic membrane assay.</a> Nat.Protoc. 1 (1), 85-91 (2006).</li>
<li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chick+embryo+chorioallantoic+membrane+as+a+model+for+tumor+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology.</a> Exp.Cell Res. , (2014).</li>
<li>Dohle, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+ex+ovo+culture+and+ex+ovo+CAM+assay%3A+how+it+really+works%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works.</a> J.Vis.Exp. (33), (2009).</li>
<li>Kobayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chick+embryo+model+for+metastatic+human+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.Urol%22%5BJournal%5D)">A chick embryo model for metastatic human prostate cancer.</a> Eur.Urol. 34 (2), 154-160 (1998).</li>
<li>Koop, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+melanoma+cells+entering+the+microcirculation%3A+over+80%25+survive+and+extravasate%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fate of melanoma cells entering the microcirculation: over 80% survive and extravasate.</a> Cancer Res. 55 (12), 2520-2523 (1995).</li>
<li>Martowicz, A., Spizzo, G., Gastl, G., Untergasser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype-dependent+effects+of+EpCAM+expression+on+growth+and+invasion+of+human+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.Cancer%22%5BJournal%5D)">Phenotype-dependent effects of EpCAM expression on growth and invasion of human breast cancer cell lines.</a> BMC.Cancer. 12, 501(2012).</li>
<li>Martowicz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpCAM+overexpression+prolongs+proliferative+capacity+of+primary+human+breast+epithelial+cells+and+supports+hyperplastic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cancer%22%5BJournal%5D)">EpCAM overexpression prolongs proliferative capacity of primary human breast epithelial cells and supports hyperplastic growth.</a> Mol.Cancer. 12, 56(2013).</li>
<li>Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+lentiviral+vector+titration+methods%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Comparison of lentiviral vector titration methods.</a> 6, 34(2006).</li>
<li>Farnoushi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vivo+testing+of+drug+response+in+multiple+myeloma+made+possible+by+xenograft+to+turkey+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Br.J.Cancer%22%5BJournal%5D)">Rapid in vivo testing of drug response in multiple myeloma made possible by xenograft to turkey embryos.</a> Br.J.Cancer. 105 (11), 1708-1718 (2011).</li>
<li>Wunderlich, M., Krejci, O., Wei, J., Mulloy, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD34%2B+cells+expressing+the+inv%2816%29+fusion+protein+exhibit+a+myelomonocytic+phenotype+with+greatly+enhanced+proliferative+ability%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human CD34+ cells expressing the inv(16) fusion protein exhibit a myelomonocytic phenotype with greatly enhanced proliferative ability.</a> Blood. 108 (5), 1690-1697 (2006).</li>
<li>Hideshima, T., Mitsiades, C., Tonon, G., Richardson, P. G., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+multiple+myeloma+pathogenesis+in+the+bone+marrow+to+identify+new+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Cancer%22%5BJournal%5D)">Understanding multiple myeloma pathogenesis in the bone marrow to identify new therapeutic targets.</a> Nat.Rev.Cancer. 7 (8), 585-598 (2007).</li>
<li>Parikh, M. R., Belch, A. R., Pilarski, L. M., Kirshner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+tissue+culture+model+to+study+primary+human+bone+marrow+and+its+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional tissue culture model to study primary human bone marrow and its malignancies.</a> J.Vis.Exp. (85), (2014).</li>
<li>Schuler, J., Ewerth, D., Waldschmidt, J., Wasch, R., Engelhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+of+multiple+myeloma%3A+a+critical+appraisal%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.Opin.Biol.Ther%22%5BJournal%5D)">Preclinical models of multiple myeloma: a critical appraisal.</a> Expert.Opin.Biol.Ther. 13, Suppl 1. S111-S123 (2013).</li>
<li>Kirshner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+three-dimensional+model+for+evaluating+the+impact+of+therapy+on+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma.</a> Blood. 112 (7), 2935-2945 (2008).</li>
<li>Jilani, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+binding+of+lectins+to+embryonic+chicken+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22J.Histochem.Cytochem%22%5BJournal%5D)">Selective binding of lectins to embryonic chicken vasculature.</a> J.Histochem.Cytochem. 51 (5), 597-604 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen

De ontwikkeling van nieuwe therapeutische middelen voor vuurvaste MM vereist minder tijdrovend en duur in vivo systemen om gevoeligheid van humane cellen naar drugs evalueren. Tot nu toe slechts weinig in vivo systemen zijn beschikbaar voor de preklinische evaluatie van nieuwe anti-myeloma therapieën. Allemaal hebben ze hun beperkingen voor grootschalige screening van compound libraries 29. De beste huidige modellen voor menselijke MM cellen zijn zeer immuun-deficiënte muizen 7,13,30 e...

Multipel myeloom (MM) wordt gekenmerkt door proliferatie van kwaadaardige plasmacellen in het beenmerg, botlaesies en immunodeficiëntie 1. Hoewel nieuwe behandelingsopties zoals proteasoomremmers (bortezomib) en immuunmodulerende geneesmiddelen (pomalidomide en lenalidomide) beschikbaar zijn, blijft MM nog steeds een ongeneeslijke maligniteit met een grimmige prognose 2. De slechte prognose kan worden verklaard door de buitengewone heterogeniteit van MM-celklonen die bijdraagt aan variabele reacties op therapie, in het bijzonder onder langdurige behandeling en selectiedruk van MM-klonen 3.
Preklinisch testen van nieuwe geneesmiddelen en hun combinaties in vitro en in vivo is een kritieke en tijdrovende stap voor toekomstige geneesmiddelontwikkeling. Daarom zijn nuttige in-vivo-modellen van MM nodig om een beter begrip van de biologie van de ziekte te krijgen en om de ontdekking van nieuwe geneesmiddelen mogelijk te maken. Eigenlijk zijn de beste xenotransplantatiemodellen voor hematologische maligniteiten en therapeutischa immuundeficiënte muizen, zoals de ernstig gecombineerde immuundeficiënte (SCID) muizen 4-7, de niet-obese diabetische/SCID (NOD/SCID) muizen 8,9 of de β-microglobuline-knockout NOD/SCID muizen 10,11.
Hoewel muizenmodellen van menselijk MM in sommige aspecten kunnen lijken op het fenotype van de menselijke ziekte, zijn immuundeficiënte muizen ingefokt, daarom simuleren ze slechts één individuele reactie op een geneesmiddel en zijn de kosten zeer hoog. Vanwege immunosuppressie vereisen dieren speciale onderhoudscondities en het aanplanten van menselijk MM in muizen duurt 6 weken tot 2 maanden 9,12, tenzij cellen direct in het beenmerg worden getransplanteerd met behulp van een technisch veeleisende procedure met lagere overlevingspercentages bij dieren 7,13. Daarom zijn nieuwe methoden die gebruikmaken van op stamcellen gebaseerde organoïd-modellen 14, weefselengineering 15 of geavanceerde 3D-celcultuurmodellen 16 ontwikkeld. Ze zullen in de nabije toekomst concurreren met klassieke dierproeven voor preklinische geneesmiddeltesten, maar kunnen geen systeemtoxiciteitstests in levende organismen vervangen.
Het kippenembryo is eerder aangetoond een geschikt organisme te zijn voor xenotransplantatie van menselijke cellen en weefsels vanwege het ontbreken van een adaptieve immuunrespons tot het uitkomen 17-19. Bovendien weerspiegelt elk kippenembryo een individuele reactie op toegepaste geneesmiddelen of tumorcellen vanwege genetische diversiteit binnen de kippenpopulatie. De chorioallantoïsche membraan (CAM) is een goed gevestigd systeem om tumorafhankelijke angiogenesis te bestuderen 20-22. Wanneer vaste tumoren op de CAM worden getransplanteerd, vertonen ze veel kenmerken van kanker in vivo, inclusief proliferatie, invasie, angiogenesis en metastase 23-27.
Op basis van de eerdere ervaring van onze groep met CAM-xenograftmodellen20,26,27, werd een menselijk MM-model opgezet dat het voordeel van een menselijke 3D-kweekmethode combineert met het model van ex ovo ontwikkelende kippenembryo's. Dit MM-modelsysteem maakt real-time monitoring van MM-groeiprogressie, kwantificering van celmassa en preklinische geneesmiddeltesten mogelijk.

<table><tbody><tr><td>RPMI-8226 cellen</td><td>DSMZ</td><td>ACC 9</td><td>STR geprofileerd</td></tr><tr><td>OPM-2 cellen</td><td>DSMZ</td><td>ACC 50</td><td>STR geprofileerd</td></tr><tr><td>Menselijke mesenchymale stamcellen&nbsp;</td><td>PromoCell</td><td>PC-C-12974</td><td></td></tr><tr><td>HEK293FT cellen&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>R700-07</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum&nbsp; HyClone</td><td>ThermoScientific</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>L-Glut- Pen- Strep oplossing</td><td>Sigma</td><td>G6784</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>Transfectie Medium/Opti-MEM&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>51985</td><td></td></tr><tr><td>eGFP lentivirale deeltjes</td><td>GeneCopoeia</td><td>LPP-EGFP-LV105</td><td>Klaar voor gebruik virale deeltjes</td></tr><tr><td>pLenti6/V5Dest6 eGFP vector</td><td>Invitrogen</td><td>PN 35-1271</td><td>van auteurs</td></tr><tr><td>ViralpowerTM verpakkingsmix&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P/N 35-1275</td><td></td></tr><tr><td>Transfectiereagens/ Lipofectamin 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Invitrogen</td><td>R210-01</td><td></td></tr><tr><td>Neomycin</td><td>Biochrom</td><td>A2912</td><td></td></tr><tr><td>Collageen-Type1&nbsp; Rat Staart</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>DMEM poeder</td><td>Life Technologies</td><td>Art.Nr. 10338582</td><td></td></tr><tr><td>plitidepsin</td><td>Pharmamar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bortezomib</td><td>LKT Lab., Inc.</td><td>B5871</td><td></td></tr><tr><td>SPF-witte heneneieren</td><td>Charles River</td><td></td><td>Bevrucht&nbsp; witte Leghorn&nbsp; kippeneieren</td></tr><tr><td>Kunststof weegschepen</td><td>neoLab</td><td>Art.Nr. 1-1125</td><td>voor ex-ovo cultuur</td></tr><tr><td>Petrischaal vierkant (Deksels)</td><td>Simport</td><td>D210-16</td><td>voor ex-ovo cultuur</td></tr><tr><td>RIPA Buffer (10x)</td><td>Cell Signaling</td><td>#9806</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Tabletten</td><td>Roche</td><td>11 836 170 001</td><td></td></tr><tr><td>Complete Mini EDTA-vrij</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP ELISA</td><td>Cell Biolabs, Inc.</td><td>AKR-121</td><td></td></tr><tr><td>Histocette II</td><td>Simport</td><td>M493-6</td><td></td></tr><tr><td>PFA&nbsp; 37%</td><td>Roth</td><td>7398.1</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolut</td><td>Normapur</td><td>20,821,321</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Histol</td><td>Roth</td><td>Art.Nr.6640.4</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast</td><td>Sigma</td><td>A6330</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Microscoopglaasjes</td><td>R. Langenbrinck&nbsp;</td><td>Art.-Nr.</td><td></td></tr><tr><td>Labor- u. Medizintechnik</td><td>03-0060</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DakoCytomation Wash Buffer 10x</td><td>DakoCytomation</td><td>Code-Nr.</td><td></td></tr><tr><td>S 3006</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Target Retrieval Solution (10x)&nbsp; pH 6,1</td><td>DAKO</td><td>Code-Nr.</td><td></td></tr><tr><td>S 1699</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu ASMA clone 1A4</td><td>DAKO</td><td>M0851</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu CD138 clone MI15</td><td>DAKO</td><td>M7228</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu Vimentin clone V9</td><td>DAKO</td><td>M0725</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu Desmin clone D33</td><td>DAKO</td><td>&nbsp;M0760</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu Ki67&nbsp; clone MIB-1&nbsp;&nbsp;</td><td>DAKO</td><td>&nbsp;M7240</td><td></td></tr><tr><td>biotinyleerde geit- anti-muis IgG</td><td>Vector Laboratories Inc.</td><td>BA-9200</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC Kit</td><td>Vector Laboratories Inc.</td><td># PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>FAST DAB Tablet Set.</td><td>Sigma Biochemicals</td><td># D4293</td><td></td></tr><tr><td>Mayer&rsquo;s hemalaun oplossing</td><td>Merck</td><td>1,092,490,500</td><td></td></tr><tr><td>Roti Histokitt</td><td>Roth</td><td>Art.Nr.6638.2</td><td></td></tr><tr><td>Bench top roterende microtoom</td><td>Thermo Electron, Shandon Finesse ME+</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weefsel inbedding station</td><td>Leica, TP1020</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ei-Incubator</td><td>Grumbach&nbsp;</td><td>BSS160</td><td></td></tr><tr><td>Stereo fluorescentiemicroscoop uitgerust met een verbonden met een digitale camera (Olympus E410) en flexibele koude licht&nbsp;</td><td>Olympus, SZX10</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra Turrax&nbsp;</td><td>IKA T10</td><td></td><td>Homogenisator</td></tr></tbody></table>

oprichting van een human multiple myeloma xenograft model in de chicken tumorgroei, invasie en angiogenese studie

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multipel myeloom (MM), een kwaadaardige plasmacel ziekte ongeneeslijk blijft en nieuwe medicijnen moeten de prognose voor patiënten te verbeteren. Door het ontbreken van het bot en micro auto / paracriene groeifactoren humane MM cellen zijn moeilijk te kweken. Daarom is er dringend behoefte aan vaststelling adequate in vitro en in vivo kweeksystemen de werking van nieuwe therapieën voor humane MM cellen te bestuderen. Hier presenteren we een model voor humane multiple myeloma cellen groeien in een complexe 3D omgeving in vitro en in vivo. MM cellijnen OPM-2 en RPMI-8226 werden getransfecteerd met het GFP-transgen tot expressie en werden in de aanwezigheid van menselijke mesenchymale cellen en collageen gekweekt type I matrix driedimensionale sferoïden. Daarnaast werden Steroiden geënt op het chorioallantoïsmembraan (CAM) van kippenembryo&#39;s en tumorgroei werd gevolgd met stereo fluorescentiemicroscopie. Beide modellen maken de studie van nieuwe therapeutische drugs in een complexe 3D-omgeving en de kwantificering van de tumorcel massa na homogenisering van grafts in een transgen-specifiek GFP-ELISA. Bovendien kan angiogene responsen van de gastheer en invasie van tumorcellen in de onderliggende gastheerweefsel dagelijks gemonitord door een stereomicroscoop en immunohistochemische kleuring tegen humane tumorcellen (Ki-67, CD138, Vimentin) of host mural cellen die bloedvaten geanalyseerd (desmine / ASMA). Concluderend, het onplant systeem kunnen bestuderen MM celgroei en angiogenese in een complexe 3D-omgeving en maakt screening op nieuwe therapeutische verbindingen gericht overleving en proliferatie van MM cellen.

In vitro analyse van doelverbindingen in 3D multiple myeloma spheroïde assays Door de beperking van het kweken van primaire humane MM cellen in vitro we werden nieuwe 3D cultuur in vitro modellen voor humane MM cellijnen gebruikmakend van een extracellulaire matrix groei en ondersteunende primaire humane mesenchymale cellen uit beenmerg (Figuur 1A, B). EGFP transgene MM cellijnen toelaten visualisatie en kwantificatie van MM tumor ...

Human multiple myeloma (MM) cellen vereisen ondersteunende micromilieu van mesenchymale cellen en extracellulaire matrix componenten voor overleving en proliferatie. Wij vestigden een in vivo model van kippenembryo engrafted humane myeloma en mesenchymale cellen effecten van kanker geneesmiddelen op tumorgroei, invasie en angiogenese.

Oprichting van een Human Multiple Myeloma Xenograft Model in de Chicken tumorgroei, invasie en Angiogenese Studie

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het vestigen van een in vivo kippenembryomodel met gegrafts humane myeloom- en mesenchymale cellen om de effecten van kankerbestrijdende medicijnen op tumorgroei, invasie en angiogenese te bestuderen. Dit wordt bereikt door transgene humane multiple myeloomcellen te genereren voor analyse in 3D in vitro en in vivo modellen. De cellen worden getransfecteerd met lentivirus dat GFP verschaft voor visualisatie en blastine-resistentie voor de selectie van getransfecteerde cellen.Als tweede stap worden 3D-viroïden gevormd. Met de getransfecteerde cellen worden mesenchymale cellen en extracellulaire matrix gegenereerd, wat grootschalige screening van antikankergeneesmiddelen in een complexe 3D in vitro-omgeving mogelijk maakt. Vervolgens volgt de 3D-tumor.PHE kan in vivo worden gekweekt in kiemembryo's om de effecten van nieuwe geneesmiddelen op tumorgroei, invasie en angiogenese te testen. Uiteindelijk kunnen de tumoromvang en angiogene responsen dagelijks en na euthanasie worden gedocumenteerd. De tumoren kunnen worden onderzocht via GFP, Eliza en immunohistochemie.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande me

establishment-human-multiple-myeloma-xenograft-model-chicken-to-study

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Met behulp van kwantitatieve PCR, we zien hoe de gevestigde chick CAM-model kan worden gebruikt om kwantitatief analyseren van de uitzaaiing van menselijke tumorcellen naar verre organen.

Kwantitatieve analyse van kanker metastase met behulp van een Avian Embryo Model

This video demonstrates the procedure of intravenously injecting cancer cells into the chicken chorioallantoic membrane vasculature to generate a CAM cancer metastasis model. The injected cells eventually form scattered single-cancer cell colonies, allowing for the study of cancer invasion and metastasis.

Intravenous Injection of Cancer Cells into Chicken Chorioallantoic Membrane Vasculature: A Procedure to Establish Chorioallantoic Membrane Cancer Model to Study Cancer Invasion and Metastasis

Menselijke tumorxenotransplantaten in immunodeficiënte muizen zijn waardevolle instrumenten om kanker biologie studeren. Specifieke protocollen voor subcutane en intrahepatische xenograften uit menselijke hepatocellulair carcinoom cellen of tumorfragmenten genereren worden beschreven. Leverregeneratie geïnduceerd door gedeeltelijke hepatectomie in ontvangende muizen wordt gepresenteerd als een strategie om intrahepatische engraftment vergemakkelijken.

Generatie van subcutane en Intrahepatic Human Hepatocellular carcinoom Xenografts in immunodeficiënte muizen

De gevestigde techniek om primaire invasieve orthotoop blaaskanker xenotransplantaten te enten vereist laparotomie en mobilisatie van de blaas. Deze procedure toebrengt significante morbiditeit op de muizen, technisch uitdagend en tijdrovend. Daarom hebben wij een hoge precisie, percutane benadering gebruik te maken van echografie begeleiding.

Minimaal Invasieve Oprichting van Muriene Orthotope Blaas Xenografts

Het dooierzakmembraan van het kuiken (CAM) is immuundeficiënt en sterk gevasculariseerd, waardoor het een natuurlijke in vivo model van tumorgroei en angiogenesis is. In dit protocol beschrijven we een betrouwbare methode om driedimensionale, gevasculariseerde hepatocellulair carcinoom (HCC) tumoren te laten groeien met behulp van de CAM-assay.

De<em&gt; In Ovo</em&gt; Chick chorioallantoïsmembraan (CAM) Assay als een efficiënte xenotransplantaatmodel van Hepatocellular Carcinoom

Prostaatkanker is de op een na meest voorkomende oorzaak van kankergerelateerde sterfgevallen in de Verenigde Staten. Een orthotopisch kankermodel biedt een nuttige benadering om de biologie van prostaatkanker te begrijpen en de werkzaamheid van therapeutische regimes te evalueren. Dit protocol beschrijft gedetailleerde stappen die nodig zijn om een orthotopisch muismodel voor prostaatkanker te vestigen.

Pre-klinische Orthotope muizenmodel van Human prostaatkanker

Uitgezaaid helder celnieraal celcarcinomis is een ziekte zonder een uitgebreid diermodel voor grondig preklinisch onderzoek. Dit protocol illustreert twee nieuwe diermodellen voor de ziekte: het orthotopicalisch geïmplanteerde muismodel en het kipchorioallantoïsche membraanmodel, die beide longmetastasen aantonen die lijken op klinische gevallen.

Vergelijking van uitgezaaide Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model opgericht in muisnier en op Kip Chorioallantoic Membraan

We presenteren het kipchorioallantoïsche membraanmodel als een alternatief, transplanteerbaar, in vivo model voor de engraftment van gynaecologische en urologische kankercellijnen en tumoren die door de patiënt zijn afgeleid.

Met behulp van de Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model om gynaecologische en urologische kankers studie

Dit is een effectieve methode om te screenen op suppressors of drivers van kankermetastase. Cellen, getransduceerd met een expressiebibliotheek, worden geïnjecteerd in het kippen chorioallantoïsche membraan vasculatuur om gemetastaseerde kolonies te vormen. Kolonies met verminderde of verhoogde invasiviteit worden verwijderd, uitgebreid, opnieuw geïnjecteerd om hun fenotype te bevestigen en ten slotte geanalyseerd met behulp van sequencing met hoge doorvoer.

Ontdekking van gemetastaseerde regulatoren met behulp van een snel en kwantitatief intravital chick chorioallantoic membraanmodel

Dit protocol beschrijft in ovo xenotransplantatie van van de patiënt afgeleide B- en T-acute lymfoblastische leukemie (ALL)-cellen, die 4 dagen na injectie plaatsvindt.

In Ovo Xenotransplantatie van van patiënten afgeleide acute lymfoblastische leukemie (ALL)-cellen (PDX-ALL)

Leer een kippenembryo-xenograftmodel met menselijke multipel myeloma- en mesenchymale cellen voor onderzoek naar tumorgroei, invasie en angiogenese. Deze methode maakt grootschalige screening van anti-kankermedicijnen in een complexe 3D-omgeving mogelijk.

Oprichting van een Human Multiple Myeloma Xenograft Model in de Chicken tumorgroei, invasie en Angiogenese Studie

Meer video's verkennen