Een

Het algemene doel van het volgende experiment is om dit in vitro-dormantie-model toe te passen voor het bestuderen van moleculaire en cellulaire mechanismen en om hypotheses te genereren voor testen in biologisch complexere in vivo-modellen. Dit wordt bereikt door oestrogeenpositieve borstkankercellen te kweken in weefselkweekplaten met fibrinenecken bij een congenische dichtheid, waarbij hun interacties primair met het substraat zijn en niet met elkaar. In een tweede stap wordt in sommige van de oestrogeenpositieve cellen een dormante staat geactiveerd, die wordt ondersteund en in stand gehouden door FGF two en fibronectine, representatief voor borstkankercellen in het beenmerg.

Vervolgens wordt het systeem verstoord door de toevoeging van antilichamen, inhibitoren, peptiden of nucleïnezuren om verschillende fenotypische en moleculaire aspecten van de dormante cellen te doorbreken en hun rol bij het behoud van de dormante staat te bepalen. De resultaten tonen het aantal en het uiterlijk van groeiende en dormante kolonies die het resultaat zijn van de behandeling van geïncubeerde cellen met FGF2 op met fibronectine gecoate platen. Deze methode kan helpen bepalen welke signaleringspaden, adhesiemoleculen of andere specifieke moleculaire mechanismen verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling en het behoud van dormantie in oestrogeenafhankelijke borstkankercellen in de micro-omgeving van het beenmerg.

Begin met het aspireren van het kweekmedium uit platen die ongeveer 50% confluent zijn met CF seven-cellijnen en spoel deze vervolgens met voorverwarmde PBS. Voeg daarna één milliliter van een 0,25 trypsin EDTA-oplossing toe, opgelost in DMEM, high glucose-medium zonder foetaal kalfsserum. Incubeer de platen gedurende één tot vier minuten bij 37 °C terwijl de cellen beginnen los te laten.

Zodra de cellen loskomen van de plaat en een enkelcellsuspensie beginnen te vormen, worden eventuele resterende celklonten opgebroken door meerdere keren op en neer te pipetteren met een pipet van twee milliliter. Als er na vier minuten trypsinisering nog steeds celklonten aanwezig zijn, worden de cellen weggegooid en worden er nieuwe kweekcellen voorbereid; cellen die na vier minuten nog steeds aan elkaar kleven, zullen waarschijnlijk fouten introduceren bij het tellen van het aantal kolonies. Pelleteer de getrypsiniseerde cellen en resuspendeer deze in kweekmedium op 1.500 cellen per milliliter. Gebruik een pipet van vijf milliliter om de celsuspensie te mengen door voorzichtig op en neer te pipetteren, tel de cellen en verifieer met een automatische celteller dat de suspensie voornamelijk uit enkelcellen bestaat.

Dit kan ook handmatig worden gedaan met een telkamer onder een fasecontrastmicroscoop. Pipetteer vervolgens drie milliliter van de celsuspensie op en verdeel telkens één milliliter over twee van de wells van een met fibronectine gecoate 24-wells plaat. Om de ruimtelijke verdeling van de cellen te optimaliseren, dient de suspensie in het midden van de well te worden gepipetteerd; zorg ervoor dat de plaat niet verder wordt bewogen voordat de cellen zijn neergedaald en gehecht.

Voeg de resterende celsuspensie toe aan het hoofdcelmengsel en meng de cellen opnieuw voordat er weer drie milliliters wordt opgezogen. Deze procedure vermindert de variabiliteit in het aantal cellen, aangezien de cellen in de buis continu bezinken en het pipetteren snel gebeurt om de grote volumes cellen te distribueren; het laten staan van cellen in suspensie bij kamertemperatuur en de huidige CO2-concentratie zou namelijk hun congene potentieel beïnvloeden. Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2. Dit wordt beschouwd als dag min één.

In de tijdlijn van het experiment. Op dag nul van de assay wordt het medium vervangen door 1 mL vers medium, of vers medium met 10 ng/mL fibroblast groeifactor 2. Het kleine aantal cellen in een putje na zes dagen zal de nutriënten- of cytokinensamenstelling en de pH van het oorspronkelijke medium niet significant beïnvloeden.

Voeg op dag drie 100 µL van een oplossing toe die 10 x de uiteindelijke beoogde concentratie van een perturberend agens bevat, zoals een PI3K-remmer, LY 2 9 4 0 0 2, negatieve controle LY 3 0 3 5 1 1 of mediumcontrole, aan de ene milliliter medium die al in de putjes zit, en laat de oplossingen door diffusie mengen. Plaats de plaat voor nog eens drie dagen terug in de incubator. Los op dag zes 0,1% kristalviolet op in een oplossing van 2% ethanol en 10 mM natriumboraat.

Bij pH 9 wordt het medium uit de wells geaspireerd, waarna één milliliter van de kristalvioletoplossing gedurende 20 minuten aan elke well wordt toegevoegd. Richt een spoelstation in door een ijsemmer in de gootsteen te plaatsen en er continu water in te laten lopen; was de platen door ze in het water te dompelen, waarbij de wellopeningen onder een scherpe hoek naar beneden in de emmer zijn gericht. Kantel de plaat zodra deze onder water is naar een horizontale positie, zodat de wellopeningen naar beneden wijzen.

Kantel de plaat vervolgens weer naar een acute hoek en verwijder deze in één rustige, vloeiende beweging. Herhaal de onderdompeling twee of drie keer totdat het water onderin de wells niet langer blauw kleurt. Plaats de platen vervolgens ondersteboven op handdoeken op het werkblad om een nacht te drogen.

Zodra de plaat droog is, wordt deze onder een omgekeerde fasecontrastmicroscoop geplaatst om het aantal groeiende en dormante kolonies in elke put te tellen. Bij een 40 x vergroting worden kolonies van meer dan 30 cellen als groeiend geteld en kolonies van 12 of minder cellen als dormant. Getoond. Hier is het typische uiterlijk van een groeiende en een dormante kolonie.

Groeiende kolonies bevatten meer dan 30 cellen en dormante kolonies bevatten 12 of minder cellen; deze laatste zijn vele malen groter dan groeiende cellen, met grote cytoplasma-kernverhoudingen zonder toevoeging van FGF two aan de cultuur. De kolonies worden voornamelijk vertegenwoordigd door groeiende klonen. Hoewel de overgrote meerderheid van de klonen dormant is in aanwezigheid van FGF two, kan het effect van additionele agentia ook met dit systeem worden geëvalueerd. Hierbij werden twee perturberende agentia in vooraf bepaalde concentraties op dag drie van de Congenic assay aan de wells toegevoegd.

De figuur toont een preferentiële inhibitie van dormante klonen door de PI drie kinase-inhibitor LY 2 9 4 0 2, maar een gebrek aan effect door de negatieve controle LY 3 0 3 511. Deze experimenten kunnen worden gebruikt om bij te dragen aan het begrip van de elementen die dormantie en therapieresistentie bepalen. Hier verloren de overlevende dormante cellen die waren behandeld met de PI i drie kinase-inhibitor hun gespreide uiterlijk, werden ze klein dendritisch en vertoonden ze tekenen van stress.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u deze congene assay opzet voor het kweken van dormante cellen, hoe u de cellen perturbeert door specifieke inhibitoren of perturberende agentia toe te voegen na het vestigen van dormantie en hoe u het effect van de perturberende agentia kwantificeert; deze assay kan worden gebruikt om zowel kwantitatieve als kwalitatieve resultaten te beoordelen door dormante kolonies te tellen of door een willekeurig aantal ultrastructurele, immunofenotypische of moleculaire gebeurtenissen in de dormante en geperturbeerde cellen te meten. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.