Name: Kwantificering van Neurovasculaire Protection Na Repetitive Hypoxische Voorconditionering en Transient midden cerebrale slagader Occlusie in Muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Leer hoe repetitieve hypoxische voorconditionering neurovasculaire bescherming biedt bij beroerte in muizen. Deze methode kwantificeert simultaan infarctvolumen en bloed-hersenbarrière-integriteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Speciale dank aan het Gidday lab voor hun werk in het ontwikkelen van het RHP-protocol, evenals de Neuro-Models Facility (UTSW) voor hun assistentie bij de tMCAo-operaties. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de American Heart Association (AMS), The Haggerty Center for Brain Injury and Repair (UTSW; AMS) en de Spastic Paralysis Research Foundation van de Illinois-Eastern Iowa District van Kiwanis International (JMG).

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een enkele blootstelling aan systemische hypoxie (dat wil zeggen, 2 uur van 11% O 2) bij muizen &quot;tijdelijk&quot; beschermt de hersenen tegen tMCAo, 29 betekent dat de epigenetische antwoord op de hypoxische preconditionering uitdaging is de korte levensduur, en de basislijn fenotype wordt hersteld binnen dagen. Repetitieve presentaties van de hypoxische preconditionering stimulus dramatisch verlengen van de duur van de neuroprotectieve fenotype. 6 Vele studies hebben aanget...

Aangezien de voornaamste oorzaak van volwassen gehandicapten en de vierde doodsoorzaak, beroerte is één van de meest slopende ziekten tegenover de volwassen bevolking van de Verenigde Staten. 1 Diermodellen van een beroerte zorgen voor experimenteel onderzoek van nieuwe methoden ter vermindering van ischemische schade en het verbeteren van post-stroke herstel. Een roman avenue voor dergelijke translationeel onderzoek is preconditionering. Voorbehandeling het opzettelijk gebruik van een niet schadelijk stimulus om de schade op een volgende, en ernstiger letsel. 2 hypoxische preconditionering is aangetoond pleiotrope veranderingen in de hersenen die bescherming bieden tegen beroerte in zowel in vivo als in vitro studies produceren . 3 echter eenmalige blootstelling aan hypoxia biedt slechts kortdurende neuroprotectie, induceren minder dan 72 uur van tolerantie tegen ischemie bij volwassen muizen. 4 zelfs na vier weken van 14 uur dagelijkse blootstelling aan hypoxie hypobaric, Lin et al. found dat neuroprotectie werd volgehouden slechts één week. 5 Repetitive hypoxische preconditionering (RHP) wordt gekenmerkt door stochastische variaties in frequentie, duur en intensiteit van hypoxische blootstelling. In tegenstelling tot een voorbehandeling uitdaging RHP induceert een cerebroprotective fenotype die blijft tot acht weken bij muizen. 6 RHP verminderd infarct volumes bloed-hersen barrière (BBB) ​​verstoring, vasculaire inflammatie, en leukocyt diapedesis weken na de laatste hypoxische blootstelling . RHP bijzonder verminderde ontsteking in de ischemische hersenen door verlaging van T-cel, monocyt en macrofaag populaties, met behoud van B-celpopulaties in de ischemische hemisfeer. 7 In feite, RHP induceerde een immunosuppressief fenotype bij muizen vóór elke CNS letsel, waaronder beroerte. RHP-behandelde B-cellen geïsoleerd uit RHP behandelde gezonde muizen vertoonden een unieke anti-inflammatoir fenotype, met een neerwaartse regulatie van zowel antigeenpresentatie en antilichaamproductie. Dealgehele vermindering van pro-inflammatoire antigeen-specifieke afweermechanismen maakt RHP een uitstekende methode om endogene immunosuppressie te induceren niet alleen CNS-specifieke ontstekingsziekten, maar ook systemische verwondingen of ziekte modellen met een pro-inflammatoire pathologie omvatten. RHP vermindert zowel infarct volume en BBB verstoring na een voorbijgaande midden cerebrale slagader occlusie (tMCAo). Diermodellen van beroerte, zoals de algemeen gebruikte tMCAo, drastisch verbeteren van het begrip van de pathofysiologie van beroerte, alsook het ontwerpen van effectievere Neurotherapeutics. Eerst ontwikkeld door Koizumi et al., In 1986, 8 de tMCAo procedure is een veel gebruikte werkwijze voor het induceren van een beroerte bij knaagdieren en één van de voorkeurswerkwijzen voor het onderzoeken van ontsteking na reperfusie. Als werkwijzen voor tMCAo evolueren, de meer recente gebruik van met silicone beklede filamenten verder het risico van subarachnoïdale bloeding te verminderen in vergelijking met andere modellen 9,10 &lt;/ Sup&gt; en het verbeteren van de betrouwbaarheid, maar helaas tMCAo levert vaak een grote variatie in infarct volumes. 11-13 De meeste van deze studies af te bakenen infarct gebieden in coronale hersenen secties door kleuring met 2,3,5- trifenyltetrazoliumchloride (TTC), beschouwd als een gouden standaard voor kwantificatie infarct omdat het een eenvoudige en goedkope manier om levendige, reproduceerbare resultaten. TTC dient als een substraat van dehydrogenasen aanwezig in mitochondria. Wanneer hersenplakjes worden blootgesteld aan het TTC-oplossing wordt TTC selectief in levende cellen genomen als de niet-oplosbare reductieproduct, formazan, precipiteert een dieprode kleur in levensvatbare mitochondria. Omwille van mitochondriale dysfunctie in de ischemisch weefsel, dit weefsel blijft wit, waardoor voor differentiatie van beschadigde en gezond weefsel. 14 RHP vermindert ook BBB verstoring in de ischemische hemisfeer. 6 Daarom is de dubbele kwantificering van BBB integriteit binnen dezelfde Bregens als TTC-gebaseerde infarct volumebepalingen 15 nuttige informatie opleveren over de volledige werking van endogene bescherming en mogelijke causale verbanden tussen BBB verstoring en infarct bij onbehandelde en behandelde dieren te verschaffen. De instroom van perifeer bloed door een verstoorde BBB, secundaire beroerte, neemt leukocyt populaties, pro-inflammatoire cytokines, oxidatieve stress, vasogeen oedeem, en hemorragische transformatie in de ischemische hemisfeer uiteindelijk uitgebreid aantal besmettingen en mortaliteit bij patiënten met ischemische beroerte . 16,17 Een gebruikelijke meetmethode BBB verstoring in diermodellen met kwantificering van Evans blue (EB) kleurstof lekken in de hersenen. 15,18-21 EB selectief bindt aan albumine, een globulair eiwit serum (MW = 65 kDa) dat maakt de BBB niet oversteken ongedeerd dieren. 22 Naar aanleiding van ischemische beroerte, EB infiltreert de hersenen, en fluoresceert bij 620 nm, waardoor voor het meten van de optische dichtheid within geperfundeerde gewonden parenchym. 22 De extinctie is recht evenredig met de permeabiliteit van de BBB bij EB van transcardiale perfusie verricht van de post-mortem corticale vasculatuur gewassen. Met de onmiddellijke verwerking van TTC-gekleurd hersenen bij dieren met EB toediening kan zowel het infarct volume en BBB verstoring effectief worden gekwantificeerd. Opgemerkt zij echter dat neuronaal letsel en BBB verstoring niet gelijktijdige processen in de hersenen na een beroerte, 23,24 zodat de selectie van de tijd van offeren is een belangrijke overweging. Het protocol dat volgt geeft de RHP werkwijze de tMCAo werkwijze voor het induceren van een tijdelijke arteriële occlusie die modellen middelste cerebrale arterie occlusie bij menselijke patiënten, en de dubbele histologische methoden om neurale en vasculaire beroerte letsel eindpunten. TTC meet celdood en cumulatief weefselschade, waardoor de kwantificering van de totale infarct volume, terwijl EB voorziet in de hemisferische kwantificering van BBB schade.

<table><tbody><tr><td>Flowmeters, regulators</td><td>VetEquip, Inc</td><td>Specialty order</td><td>Vier flowmeters zijn bevestigd aan 6,0 mm flexibele PVC-buis die met een vrouwelijke kunststof connector op de inlaatpoort van elke inductiekamer wordt aangesloten. Deze flowmeters zijn aan een metalen balk van 6,5" x 1" x 1" vastgeschroefd. Deze metalen balk is vastgeschroefd aan een MI-246-P drukmeter met een DISS-uitgang. Deze drukmeter en flowmeterapparatuur kunnen met een sleutel aan elke nieuwe gascilinder worden bevestigd.</td></tr><tr><td>21% O2 tank</td><td>AirGas</td><td>OX USP200</td><td></td></tr><tr><td>11% O2 tank</td><td>AirGas</td><td>Specialty order</td><td></td></tr><tr><td>8% O2 tank&nbsp;</td><td>AirGas</td><td>Specialty order</td><td></td></tr><tr><td>15 L inductiekamers</td><td>VetEquip</td><td>941454</td><td></td></tr><tr><td>Moor Laber Dopper Flow&nbsp;</td><td>Moor Instruments&nbsp;</td><td>moorVMS-LDF1-HP</td><td>0,8 mm diameter sonde&nbsp;</td></tr><tr><td>High Intensity Illuminator&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>NI-150</td><td></td></tr><tr><td>Zoom Stereo Microscope&nbsp;</td><td>NIkon</td><td>SMZ800</td><td>Andere chirurgische microscopen kunnen worden gebruikt.&nbsp;</td></tr><tr><td>Kent Scientific Right Temperature CODA</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>Discontinued</td><td>Aanbevolen vervanging is PhysioSuite met RightTemp Temperatuurbewaking en Homeothermische Controle (Kent Scientific, #PS-RT).</td></tr><tr><td>Hovabator Incubator</td><td>Stromberg's</td><td>2362-E</td><td>Ons model is de 2362N. 2362E is een later model en bevat een elektronische thermostaat.&nbsp;</td></tr><tr><td>V010 Anesthesie systeem&nbsp;</td><td>VetEquip</td><td>901807</td><td>Inclusief: tien voet hogedruk zuurstofslang, frame, flowmeter, zuurstof flush-assemblage, verdamper, ademhalingscircuit, kamer, neuskoningen, afvoerbuis voor afvalgas en twee VapoGuard-filters</td></tr><tr><td>250 ml isofluraand&nbsp;</td><td>Butler Schein</td><td>NDC-11695</td><td></td></tr><tr><td>D-6 Vet Trim Animal Cordless Trimmer&nbsp;</td><td>Andis&nbsp;</td><td>#23905</td><td>Vervangende messen zijn verkrijgbaar bij Andis (#23995)</td></tr><tr><td>Betadine&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-898-867&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Q-tips</td><td>Meerdere verkopers&nbsp;</td><td>Catalogusnummer niet beschikbaar&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gauze Pads</td><td>Fisher Scientific</td><td>67622</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische draperie</td><td>Fisher Scientific</td><td>GM300&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zijde Sutures&nbsp;</td><td>Look/Div Surgical Specialties</td><td>SP115</td><td></td></tr><tr><td>Nylon Sutures</td><td>Look/Div Surgical Specialties</td><td>SP185</td><td></td></tr><tr><td>Durmont #5 forceps (2)&nbsp;</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>11251-35</td><td>Verticaal 45&deg;</td></tr><tr><td>Chirurgische schaar</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>3 mm Vannas</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>INS600177</td><td>Rechte kling</td></tr><tr><td>Hartman Hemostatis&nbsp;</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>13002-10</td><td></td></tr><tr><td>Occluderende filamenten</td><td>Washington University</td><td>Specialty order</td><td>Filamenten zijn siliconen gecoat bij Washington University en worden voor een vergoeding aan UTSW-faciliteiten verstrekt.&nbsp;</td></tr><tr><td>Evans Blue</td><td>Sigma Aldritch</td><td>E2129-10G</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier&nbsp;</td><td>Sigma Aldritch</td><td>WHA1001150</td><td>150 mm, cirkels, Grade 1&nbsp;</td></tr><tr><td>Weigh Boats</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202-101</td><td>2,5" diameter</td></tr><tr><td>0,9% Natriumchloride-injectie USP&nbsp;</td><td>Baxter Pharmaceutics&nbsp;</td><td>2B1321</td><td></td></tr><tr><td>0,3 cc insulinesyringe met 29 gauge naald</td><td>Becton Dickinson Labware</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>Flat bottom restrainer&nbsp;</td><td>Braintree Scientific&nbsp;</td><td>FB&nbsp;M</td><td>2,0" diameter</td></tr><tr><td>TTC</td><td>Sigma</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, pH 7.4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-20</td><td></td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>Meerdere verkopers&nbsp;</td><td>Catalogusnummer niet beschikbaar&nbsp;</td><td>Scintillatiebuisjes met TTC kunnen handmatig onder stromend warm water worden gehouden als alternatief voor het waterbad.</td></tr><tr><td>Styrofoam bord</td><td>Meerdere verkopers&nbsp;</td><td>Catalogusnummer niet beschikbaar&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Grote spuitenset</td><td>PumpSystems Inc</td><td>P-SYRKIT-LG</td><td></td></tr><tr><td>Perfusiepomp</td><td>PumpSystems Inc</td><td>NE-300&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>60 cc spuit</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9203256</td><td></td></tr><tr><td>27 gauge gevleugelde infuusset</td><td>Kawasumi Laboratories, Inc</td><td>D3K1-25G 1</td><td></td></tr><tr><td>20 ml scintillatieglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-367-126</td><td></td></tr><tr><td>Roestvrijstalen spatel</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-25A</td><td></td></tr><tr><td>Alto acryl 1,0 mm muisbrein, coronaal</td><td>CellPoint Scientific&nbsp;</td><td>Catalogusnummer niet beschikbaar&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>0,21 mm roestvrijstalen messen, 25 pk</td><td>CellPoint Scientific&nbsp;</td><td>Catalogusnummer niet beschikbaar&nbsp;</td><td>Herbruikbare cryostat-messen zijn een goedkope alternatief.</td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>Santa Cruz Biotechnology&nbsp;</td><td>SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost microscoopglazen&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>HP Scanjet G4050</td><td>Meerdere verkopers&nbsp;</td><td>Catalogusnummer niet beschikbaar&nbsp;</td><td>Andere commerciële scanners zijn geschikt voor deze stap in het protocol.</td></tr><tr><td>ImageJ&nbsp;</td><td>National Institute of Health</td><td>Catalogusnummer niet beschikbaar&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Analytische weegschaal</td><td>Mettler Toledo&nbsp;</td><td>XSE 205U</td><td></td></tr><tr><td>Precision Compact Oven&nbsp;&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>PR305225M</td><td></td></tr><tr><td>1,7 ml microcentrifugebuisjes (Eppendorfs)</td><td>Denville Scientific&nbsp;</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP228-100</td><td></td></tr><tr><td>96-well platen</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-9</td><td></td></tr><tr>

kwantificering van neurovasculaire protection na repetitive hypoxische voorconditionering en transient midden cerebrale slagader occlusie in muizen

Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Experimentele diermodellen van een beroerte zijn van onschatbare waarde tools voor het begrijpen van een beroerte pathologie en het ontwikkelen van meer effectieve behandeling strategieën. Een 2 week protocol voor repetitieve hypoxische preconditionering (RHP) induceert langdurige bescherming tegen het centrale zenuwstelsel (CNS) letsel in een muismodel van focale ischemische beroerte. RHP bestaat uit 9 stochastische blootstelling aan hypoxie die variëren in zowel duur (2 of 4 uur) en de intensiteit (8% en 11% O2). RHP vermindert infarct volumes bloed-hersen barrière (BBB) ​​verstoring, en de post-stroke ontstekingsreactie weken na de laatste blootstelling aan hypoxie suggereert een langdurige inductie van een endogene CNS-beschermende fenotype. De methode voor de dubbele kwantificering van infarct volume BBB verstoring is doeltreffend worden geëvalueerd neurovasculaire bescherming bij muizen met RHP of andere putatieve neuroprotectieve. Volwassen mannelijke Swiss Webster muizen werden geconditioneerd door RHP of duur equivalent blootstelling aan 21% O <sub&gt; 2 (dwz kamer lucht). Een 60 min voorbijgaande midden cerebrale slagader occlusie (tMCAo) werd geïnduceerd 2 weken na de laatste hypoxische blootstelling. Zowel de occlusie en reperfusie werden bevestigd door transcraniële laser Doppler flowmetry. Tweeëntwintig uur na reperfusie, Evans Blue (EB) werd intraveneus toegediend via een injectie in de staartader. 2 uur later werden de dieren opgeofferd door een overdosis isofluraan en hersencoupes werden gekleurd met 2,3,5- trifenyltetrazoliumchloride (TTC). Infarcten volumes werden vervolgens gekwantificeerd. Vervolgens EB geëxtraheerd uit het weefsel dan 48 uur om BBB storing te bepalen na tMCAo. Samengevat, RHP is een eenvoudig protocol dat kan worden gerepliceerd, met minimale kosten, langdurige bescherming tegen endogeen neurovasculaire beroerte letsel bij de muis, de translationele potentieel voor andere CNS-gebaseerde en systemische pro-inflammatoire ziektetoestanden.

Deze studie omvatte 25 mannelijke Swiss Webster muizen die 10 weken oud waren bij aanvang van randomisatie tot RHP (n = 10) of 21% O 2 (n = 15) groepen. Twee weken na de laatste RHP blootstelling werden chirurgische procedures uitgevoerd met groepen blind en vorkheftruck tussen dag. Na tMCAo, 1 muis stierf tijdens postoperatieve herstel en 1 muis werd uit het onderzoek uitgesloten omdat het niet voldeed aan de reperfusie CBF criterium. Beide uitgesloten muizen werden van de 21% O 2-groep. Overeenko...

Dit protocol beschrijft repetitieve hypoxische preconditie, of korte blootstellingen aan systemische hypoxie die infarctvolumes en bloed-hersenbarrière-storingen verminderen na een voorbijgaande occlusie van de middelste hersenslagader bij muizen. Het beschrijft ook dubbele kwantificering van infarctvolume en bloed-hersenbarrière-storing na een beroerte om de werkzaamheid van neurovasculaire bescherming te beoordelen.

Kwantificering van Neurovasculaire Protection Na Repetitive Hypoxische Voorconditionering en Transient midden cerebrale slagader Occlusie in Muizen

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het kwantificeren van neuroprotectie na repetitieve hypoxie-preconditionering (RHP) door gelijktijdig het infarctvolume en de integriteit van de bloed-hersenbarrière te meten. Dit wordt bereikt door muizen bloot te stellen aan negen stochastische hypoxie-blootstellingen die variëren in zowel duur als intensiteit om neurovasculaire bescherming tegen een beroerte te bieden. Vervolgens wordt er een beroerte bij de muis geïnduceerd, gevolgd door een injectie met Evans blue.Evan's blue bindt selectief aan albumine, wat kwantificatie van de verstoring van de bloed-hersenbarrière mogelijk maakt na het opofferen van het dier na injectie. De hersenen worden verwijderd en gekleurd met TTC om het infarctvolume te kwantificeren. De resultaten tonen neuroprotectieve voordelen van herhaalde hypoxie-preconditionering bij muizen na een ischemische beroerte.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals hypoxische preconditionering met een enkele blootstelling, is dat RHP neuroprotectie biedt voor ten minste acht weken bij muizen. Deze dubbele kwantificatiemethode kan cruciale vragen in het beroertestonderzoek beantwoorden, zoals de vraag hoe infarctvolumes en verstoringen van de bloed-hersenbarrière gelijktijdig gemeten kunnen worden. Hoewel deze methode kan worden gebruikt om inzicht te krijgen in ischemische beroertes, kan RHP ook worden toegepast op andere pro-inflammatoire ziektebeelden in het centrale zenuwstelsel en systemische aandoeningen. Verdeel de muizen eerst in twee groepen.De RHP-groep, die blootgesteld wordt aan 8% en 11% zuurstof, en de controlegroep, die gelijktijdig blootgesteld wordt aan 21% zuurstof, verwijderen het bovenste filterdeksel van elke kooi en plaatsen de kooi, met de voedsel- en waterflessen intact, in de kamers die verbonden zijn met hun respectievelijke zuurstoftanks. Sluit het deksel van de kamer en zet dit vast. Open de hoofdgaskraan van de tanks en stel de initiële flow voor elke inductiekamer in op twee liter per minuut of LPM.Na vijf minuten blootstelling wordt het debiet verlaagd naar 1 LPM voor de rest van de blootstellingsperiode. Aan het einde van de blootstelling wordt de flow teruggebracht naar 0 LPM en wordt het gasventiel gesloten. Voor de tanks.Open de kleppen van de kamer en plaats het filterdeksel terug op elke kooi. Plaats de kooien in standaard huisvesting tot de volgende hypoxische blootstelling. Bespuit elke inductiekamer na elk gebruik met een desinfectiemiddel en een geurverwijderaar.Stel zowel de RHP- als de controlemuizen op hetzelfde tijdstip van de dag bloot gedurende de twee weken van het protocol. Voer vervolgens een tijdelijke occlusie van de middelste cerebrale arterie of A-T-M-C-A-O uit zoals beschreven in de tekst. De EB-injectie dient 22 uur na reperfusie te worden uitgevoerd en moet twee uur voor de sacrifice NTTC-kleuring in de bloedbaan circuleren.Bereid de hoeveelheid EB voor die nodig is voor de injectie. Trek vervolgens de gewenste hoeveelheid op kamertemperatuur op in een insulinespuit van 0,3 cc. Fixeer de muis met behulp van een fixatieapparaat met een platte bodem en gebruik een naald van 29 gauge.Houd de staart vast zodat de laterale vene naar boven is gericht. Laterale venen bevinden zich aan weerszijden van de middellijn van de staart. Houd de punt van de staart vast om de muis stabiel te houden voor de injectie.Voer de naald ongeveer drie tot vijf millimeter in de ader in. Injecteer alle kleurstof gedurende één minuut, waarbij u er zorg voor draagt dat de ader niet wordt geperforeerd. Als de oplossing in de ader stroomt, moet er minimale weerstand zijn bij het uitoefenen van druk op de spuit.Bevestig de succesvolle systemische veneuze toediening van EB door een onmiddellijke kleurverandering in de staartextremiteiten en de ogen van de muis. Verwijder de naald uit de staart en oefen voorzichtig druk uit met schoon gaas om de bloeding te stoppen. Start de tijdmeting.Wanneer de huid van de muis blauw wordt, laat het EB gedurende twee uur circuleren om de verzwakte bloed-hersenbarrière te penetreren. Perfusie en TTC-kleuring dienen plaats te vinden 24 uur na reperfusie, wat 24 uur na T-M-C-A-O en twee uur na toediening van EB is; offer het dier vervolgens op met een overdosis isofluraan in een kleine inductiekamer. De perfusie moet onmiddellijk na de opoffering beginnen om autolyse te minimaliseren, welke begint bij zuurstofgebrek na de dood.Zet het dier snel vast op een styrofoam platform door de voorpoten bij de poten te fixeren. Maak een laterale incisie door de buikwand vanaf de middenlijn, net onder de ribbenkast. Snijd voorzichtig door het diafragma om het hart bloot te leggen.Start de perfusiepomp bij een stroomsnelheid van 5 ml per minuut met een spuit van 60 cc gevuld met ijskoud 0,01 M fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), aangesloten op een vlinderinfuunaald van 27 gauge. Plaats de punt van de naald ongeveer 0,5 cm in de linker ventrikel van het hart en snijd het rechter atrium door. Tijdens de perfusie moet progressief verdund veneus bloed uit het atrium stromen totdat er kleurloos vocht verschijnt. Perfundeer 30 ml 0,01 M PBS transcardiaal door het hart.Voeg vervolgens vijf milliliter TTC-oplossing toe aan 20 transparante scintillatieflessen. Ontkop de dieren direct na de perfusie en dissekeer de hersenen uit met een klein schaartje en, indien nodig, een spatel. Controleer of het hemisfeer contralateraal aan de occlusie van de middelste cerebrale arterie bleek oogt, zonder merkbare EB-lekkage of oedeem.Giet vervolgens PBS in een acryl hersenmatrix die is ontworpen voor het maken van coronale coupes van 1,0 millimeter dik van een muizenbrein. Plaats het brein met de dorsale zijde naar boven in de matrix en giet onmiddellijk PBS over het brein. Houd het brein vochtig.Verwijder de bulbi olfactorii door een roestvrijstalen mesje met een dikte van 0,21 millimeter in de tweede gleuf vanaf de rostrale zijde van de matrix te steken. Verwijder vervolgens het cerebellum door een mesje in de vierde gleuf vanaf de caudale zijde van de matrix te steken. Steek een mesje in de middelste van de resterende gleuven in de matrix.Plaats vervolgens de resterende mesjes zodanig dat ze het overgebleven weefsel gelijkmatig bisecteren, om de meest evenredige verdeling van het weefsel tijdens het snijden te waarborgen. Wanneer alle mesjes zijn geplaatst, voegt u één tot twee druppels PBS toe aan de hersenen om deze te bevochtigen. Verwijder vervolgens de mesjes één voor één uit de matrix, beginnend bij de rostrale regio.Bewaar de eerste zeven coupes voor TTC-analyse. Na T-M-C-A-O gebruikt u een klein spatel om de coupes voorzichtig van het mes naar het met TTC gevulde vial over te brengen. Zodra alle coupes zich in het vial bevinden, sluit u dit af en plaatst u het in een warm waterbad totdat de coupes roze kleuren.Draai de fles indien nodig voorzichtig in het bad om overlap van de coupes te voorkomen, wat zou kunnen leiden tot een ongelijkmatige kleuring. Voer vervolgens de TTC af en giet een 4% paraformaldehydelopping in het vial om de hersencoupes te bedekken. Hiermee wordt de chemische reactie van de TTC beëindigd.Plaats de coupes onmiddellijk op een schoon glazen objectglas van één bij drie inch en oriënteer de coupes van rostraal naar caudaal wanneer ze op het objectglas worden gerangschikt. Scan het objectglas. Stel bij gebruik van een standaardscanner de resolutie in op minimaal 600 DPI voor beeldanalyse.Zorg ervoor dat de naam van het dier en een metrieke liniaal in de gescande afbeelding zijn opgenomen. Draai tot slot het objectglas om en scan de achterzijde om te garanderen dat alle gegevens zijn verzameld. RHP vermindert infarctvolumes met 46% vergeleken met controlemuizen, maar heeft geen effect op de hemisferische zwelling afgeleid van de TTC-gegevens in dezelfde dieren.RHP vermindert de verstoring van de bloed-hersenbarrière, gedefinieerd als het lekken van Evans Blue genormaliseerd naar het contralaterale hemisfeer, representatief voor TTC-kleuringen van zowel RHP-behandelde als aan 21% zuurstof blootgestelde controlegroepen. De muizen worden getoond met de bijbehorende infarctvolumes en het lekken van Evans Blue vermeld onder elk monster. Ipsilateraal is het ischemische hemisfeer van de hersenen en contralateraal is de niet-aangetaste zijde van de hersenen.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat Evan's blue 22 uur na de fusie moet worden geïnjecteerd en twee uur moet circuleren voordat het dier na de ontwikkeling wordt geofferd. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van preklinisch beroerteonderzoek om mechanismen van endogene bescherming tegen beroertes bij muizen te verkennen. Na het bekijken van deze video zou u een duidelijk beeld moeten hebben van hoe het neuroprotectieve effect van RHP kan worden gemeten via de dubbele kwantificatie van de integriteit van de bloed-hersenbarrière en het infarctvolume.

quantification-neurovascular-protection-following-repetitive-hypoxic

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Er is een groeiend aantal aanwijzingen, dat ischemische preconditionering (PC) - een niet-schadelijk ischemische uitdaging voor de hersenen - verleent een tijdelijke bescherming aan een volgende schadelijke ischemische schade. Wij opgericht bilaterale gemeenschappelijke occlusie van de halsslagader (BCCAO) als voorbehandeling stimulans voor vroege ischemische tolerantie (IT) in C57Bl6 / J muizen aanzetten tot voorbijgaande focale cerebrale ischemie (geïnduceerd door midden cerebrale slagader...

Bilaterale Gemeenschappelijke occlusie van de halsslagader als een adequate Voorconditionering Stimulus naar Early ischemische tolerantie te induceren bij focale ischemie

Source: Zheng, Y., et al. Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the application of acidic postconditioning (APC) to evaluate its neuroprotective effects against ischemic injury in a mouse model of middle cerebral artery occlusion (MCAO). It outlines the steps involved in reperfusion in the MCAO model and the application of APC during reperfusion to mitigate excitotoxicity, oxidative...

 Assessing the Neuroprotective Effects of Acidic Postconditioning in a Mouse Model of Cerebral Ischemia

Source: Poinsatte, K., et al., Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the method of repetitive hypoxic preconditioning (RHP) by exposing a mouse to controlled hypoxia cycles before inducing an ischemic stroke. The experiment evaluates its effects on blood-brain barrier stability, neuronal adaptation, and inflammation.

Neuronal Adaptation to Repetitive Hypoxic Preconditioning in Mice

Source: Lee, S. E., et al. Assessing Neuroprotective Effects of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Extract Using a Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Mouse Model. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the procedure to assess the neuroprotective effect of a test compound in a middle cerebral artery occlusion mouse model. The compound enters the brain, prevents neuronal death, and reduces infarct volume, confirming its neuroprotective effect compared to an untreated mouse.

Assessing the Neuroprotective Effects of a Test Compound in a Middle Cerebral Artery Occlusion Mouse Model

Om de pathofysiologie van beroerte te begrijpen, is het belangrijk betrouwbare modellen. Dit document zal een van de meest gebruikte takt modellen beschrijven in muizen, genaamd de middelste cerebrale slagader occlusie (MCAo) model (ook aangeduid als de intraluminale filament of hechtdraad model) met reperfusie.

Chirurgische Aanpak voor midden cerebrale slagader occlusie en reperfusie Induced Stroke in Muizen

Chirurgische occlusie van een distale middelste cerebrale slagader tak (MCAo) is een veel gebruikte model in de experimentele beroerte onderzoek. Dit manuscript beschrijft de basistechniek vaste MCAo, gecombineerd met het inbrengen van een laterale craniale venster, dat de mogelijkheid voor longitudinaal intravitale microscopie bij muizen heeft.

Laterale Chronische Cranial Window Voorbereiding Maakt In Vivo Observatie Na distale midden cerebrale slagader Occlusie in Muizen

We beschrijven een muismodel van een beroerte veroorzaakt door de occlusie van de middelste hersenslagader met behulp van een met siliconen omhulde naald. Het protocol kan worden toegepast om een permanente occlusie of een tijdelijke ischemie te induceren, gevolgd door reperfusion.

Inductie van ischemische beroerte en ischemie-reperfusie in Muizen met behulp van het Midden-slagader occlusie Techniek en Visualisatie van Infarct Area

Zure postconditioning beschermt tegen cerebrale ischemie. Hier presenteren wij twee modellen om APC uit te voeren. Ze worden respectievelijk bereikt door corticostriatale plakjes over te brengen naar zure buffer na zuurstof-glucose-deprivatie in vitro en door inademing van 20% CO 2 na middelste cerebrale arterie-occlusie in vivo .

Experimentele modellen om de neuroprotectie van zure postconditioning te bestrijden tegen cerebrale ischemie

Een muismodel van cerebrale ischemie-reperfusie is gevestigd te onderzoeken de pathofysiologie van een beroerte. We distally de rechts midden cerebrale slagader en rechts gemeenschappelijke halsslagader afbinden en bloedstroom herstellen na 10 of 40 min van ischemie.

Muismodel van twee-schip occlusie van cerebrale ischemie-reperfusie

Dit protocol beschrijft het model van voorbijgaande focale cerebrale ischemie bij muizen door intraluminale occlusie van de middelste hersenslagader. Daarnaast worden voorbeelden van uitkomstbeoordeling getoond met behulp van magnetische resonantiebeeldvorming en gedragstests.

Voorbijgaand occlusiemodel van de middelste cerebrale slagader van een beroerte

Hier presenteren we een protocol om een distaal occlusiemodel van de middelste hersenslagader (dMCAO) op te stellen door middel van transcraniële elektrocoagulatie bij C57BL/6J-muizen en evalueren we het daaropvolgende neurologische gedrag en histopathologische kenmerken.

Inductie van acute ischemische beroerte bij muizen met behulp van de distale occlusietechniek van de middelste slagader

Leer hoe repetitieve hypoxische voorconditionering neurovasculaire bescherming biedt bij beroerte in muizen. Deze methode kwantificeert simultaan infarctvolumen en bloed-hersenbarrière-integriteit.

Kwantificering van Neurovasculaire Protection Na Repetitive Hypoxische Voorconditionering en Transient midden cerebrale slagader Occlusie in Muizen (Video) | JoVE Journal

Kwantificering van Neurovasculaire Protection Na Repetitive Hypoxische Voorconditionering en Transient midden cerebrale slagader Occlusie in Muizen

Meer video's verkennen