Kwantificering van Neurovasculaire Protection Na Repetitive Hypoxische Voorconditionering en Transient midden cerebrale slagader Occlusie in Muizen

Het algemene doel van het volgende experiment is het kwantificeren van neuroprotectie na repetitieve hypoxie-preconditionering (RHP) door gelijktijdig het infarctvolume en de integriteit van de bloed-hersenbarrière te meten. Dit wordt bereikt door muizen bloot te stellen aan negen stochastische hypoxie-blootstellingen die variëren in zowel duur als intensiteit om neurovasculaire bescherming tegen een beroerte te bieden. Vervolgens wordt er een beroerte bij de muis geïnduceerd, gevolgd door een injectie met Evans blue.

Evan's blue bindt selectief aan albumine, wat kwantificatie van de verstoring van de bloed-hersenbarrière mogelijk maakt na het opofferen van het dier na injectie. De hersenen worden verwijderd en gekleurd met TTC om het infarctvolume te kwantificeren. De resultaten tonen neuroprotectieve voordelen van herhaalde hypoxie-preconditionering bij muizen na een ischemische beroerte.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals hypoxische preconditionering met een enkele blootstelling, is dat RHP neuroprotectie biedt voor ten minste acht weken bij muizen. Deze dubbele kwantificatiemethode kan cruciale vragen in het beroertestonderzoek beantwoorden, zoals de vraag hoe infarctvolumes en verstoringen van de bloed-hersenbarrière gelijktijdig gemeten kunnen worden. Hoewel deze methode kan worden gebruikt om inzicht te krijgen in ischemische beroertes, kan RHP ook worden toegepast op andere pro-inflammatoire ziektebeelden in het centrale zenuwstelsel en systemische aandoeningen. Verdeel de muizen eerst in twee groepen.

De RHP-groep, die blootgesteld wordt aan 8% en 11% zuurstof, en de controlegroep, die gelijktijdig blootgesteld wordt aan 21% zuurstof, verwijderen het bovenste filterdeksel van elke kooi en plaatsen de kooi, met de voedsel- en waterflessen intact, in de kamers die verbonden zijn met hun respectievelijke zuurstoftanks. Sluit het deksel van de kamer en zet dit vast. Open de hoofdgaskraan van de tanks en stel de initiële flow voor elke inductiekamer in op twee liter per minuut of LPM.

Na vijf minuten blootstelling wordt het debiet verlaagd naar 1 LPM voor de rest van de blootstellingsperiode. Aan het einde van de blootstelling wordt de flow teruggebracht naar 0 LPM en wordt het gasventiel gesloten. Voor de tanks.

Open de kleppen van de kamer en plaats het filterdeksel terug op elke kooi. Plaats de kooien in standaard huisvesting tot de volgende hypoxische blootstelling. Bespuit elke inductiekamer na elk gebruik met een desinfectiemiddel en een geurverwijderaar.

Stel zowel de RHP- als de controlemuizen op hetzelfde tijdstip van de dag bloot gedurende de twee weken van het protocol. Voer vervolgens een tijdelijke occlusie van de middelste cerebrale arterie of A-T-M-C-A-O uit zoals beschreven in de tekst. De EB-injectie dient 22 uur na reperfusie te worden uitgevoerd en moet twee uur voor de sacrifice NTTC-kleuring in de bloedbaan circuleren.

Bereid de hoeveelheid EB voor die nodig is voor de injectie. Trek vervolgens de gewenste hoeveelheid op kamertemperatuur op in een insulinespuit van 0,3 cc. Fixeer de muis met behulp van een fixatieapparaat met een platte bodem en gebruik een naald van 29 gauge.

Houd de staart vast zodat de laterale vene naar boven is gericht. Laterale venen bevinden zich aan weerszijden van de middellijn van de staart. Houd de punt van de staart vast om de muis stabiel te houden voor de injectie.

Voer de naald ongeveer drie tot vijf millimeter in de ader in. Injecteer alle kleurstof gedurende één minuut, waarbij u er zorg voor draagt dat de ader niet wordt geperforeerd. Als de oplossing in de ader stroomt, moet er minimale weerstand zijn bij het uitoefenen van druk op de spuit.

Bevestig de succesvolle systemische veneuze toediening van EB door een onmiddellijke kleurverandering in de staartextremiteiten en de ogen van de muis. Verwijder de naald uit de staart en oefen voorzichtig druk uit met schoon gaas om de bloeding te stoppen. Start de tijdmeting.

Wanneer de huid van de muis blauw wordt, laat het EB gedurende twee uur circuleren om de verzwakte bloed-hersenbarrière te penetreren. Perfusie en TTC-kleuring dienen plaats te vinden 24 uur na reperfusie, wat 24 uur na T-M-C-A-O en twee uur na toediening van EB is; offer het dier vervolgens op met een overdosis isofluraan in een kleine inductiekamer. De perfusie moet onmiddellijk na de opoffering beginnen om autolyse te minimaliseren, welke begint bij zuurstofgebrek na de dood.

Zet het dier snel vast op een styrofoam platform door de voorpoten bij de poten te fixeren. Maak een laterale incisie door de buikwand vanaf de middenlijn, net onder de ribbenkast. Snijd voorzichtig door het diafragma om het hart bloot te leggen.

Start de perfusiepomp bij een stroomsnelheid van 5 ml per minuut met een spuit van 60 cc gevuld met ijskoud 0,01 M fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), aangesloten op een vlinderinfuunaald van 27 gauge. Plaats de punt van de naald ongeveer 0,5 cm in de linker ventrikel van het hart en snijd het rechter atrium door. Tijdens de perfusie moet progressief verdund veneus bloed uit het atrium stromen totdat er kleurloos vocht verschijnt. Perfundeer 30 ml 0,01 M PBS transcardiaal door het hart.

Voeg vervolgens vijf milliliter TTC-oplossing toe aan 20 transparante scintillatieflessen. Ontkop de dieren direct na de perfusie en dissekeer de hersenen uit met een klein schaartje en, indien nodig, een spatel. Controleer of het hemisfeer contralateraal aan de occlusie van de middelste cerebrale arterie bleek oogt, zonder merkbare EB-lekkage of oedeem.

Giet vervolgens PBS in een acryl hersenmatrix die is ontworpen voor het maken van coronale coupes van 1,0 millimeter dik van een muizenbrein. Plaats het brein met de dorsale zijde naar boven in de matrix en giet onmiddellijk PBS over het brein. Houd het brein vochtig.

Verwijder de bulbi olfactorii door een roestvrijstalen mesje met een dikte van 0,21 millimeter in de tweede gleuf vanaf de rostrale zijde van de matrix te steken. Verwijder vervolgens het cerebellum door een mesje in de vierde gleuf vanaf de caudale zijde van de matrix te steken. Steek een mesje in de middelste van de resterende gleuven in de matrix.

Plaats vervolgens de resterende mesjes zodanig dat ze het overgebleven weefsel gelijkmatig bisecteren, om de meest evenredige verdeling van het weefsel tijdens het snijden te waarborgen. Wanneer alle mesjes zijn geplaatst, voegt u één tot twee druppels PBS toe aan de hersenen om deze te bevochtigen. Verwijder vervolgens de mesjes één voor één uit de matrix, beginnend bij de rostrale regio.

Bewaar de eerste zeven coupes voor TTC-analyse. Na T-M-C-A-O gebruikt u een klein spatel om de coupes voorzichtig van het mes naar het met TTC gevulde vial over te brengen. Zodra alle coupes zich in het vial bevinden, sluit u dit af en plaatst u het in een warm waterbad totdat de coupes roze kleuren.

Draai de fles indien nodig voorzichtig in het bad om overlap van de coupes te voorkomen, wat zou kunnen leiden tot een ongelijkmatige kleuring. Voer vervolgens de TTC af en giet een 4% paraformaldehydelopping in het vial om de hersencoupes te bedekken. Hiermee wordt de chemische reactie van de TTC beëindigd.

Plaats de coupes onmiddellijk op een schoon glazen objectglas van één bij drie inch en oriënteer de coupes van rostraal naar caudaal wanneer ze op het objectglas worden gerangschikt. Scan het objectglas. Stel bij gebruik van een standaardscanner de resolutie in op minimaal 600 DPI voor beeldanalyse.

Zorg ervoor dat de naam van het dier en een metrieke liniaal in de gescande afbeelding zijn opgenomen. Draai tot slot het objectglas om en scan de achterzijde om te garanderen dat alle gegevens zijn verzameld. RHP vermindert infarctvolumes met 46% vergeleken met controlemuizen, maar heeft geen effect op de hemisferische zwelling afgeleid van de TTC-gegevens in dezelfde dieren.

RHP vermindert de verstoring van de bloed-hersenbarrière, gedefinieerd als het lekken van Evans Blue genormaliseerd naar het contralaterale hemisfeer, representatief voor TTC-kleuringen van zowel RHP-behandelde als aan 21% zuurstof blootgestelde controlegroepen. De muizen worden getoond met de bijbehorende infarctvolumes en het lekken van Evans Blue vermeld onder elk monster. Ipsilateraal is het ischemische hemisfeer van de hersenen en contralateraal is de niet-aangetaste zijde van de hersenen.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat Evan's blue 22 uur na de fusie moet worden geïnjecteerd en twee uur moet circuleren voordat het dier na de ontwikkeling wordt geofferd. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van preklinisch beroerteonderzoek om mechanismen van endogene bescherming tegen beroertes bij muizen te verkennen. Na het bekijken van deze video zou u een duidelijk beeld moeten hebben van hoe het neuroprotectieve effect van RHP kan worden gemeten via de dubbele kwantificatie van de integriteit van de bloed-hersenbarrière en het infarctvolume.