Name: Een goedkope, Scalable Behavioral Test voor het meten Ethanol Sedatie Gevoeligheid en Rapid Tolerantie in Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Leer een eenvoudige gedragstest om ethanolgevoeligheid en snelle tolerantie te meten in Drosophila. Deze schaalbare methode helpt onderzoekers verslavingsmechanismen te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze onderzoeken werden ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health, National Institute for Alcoholism and Alcohol Abuse aan M.G. (P20AA017828, R01AA020634, P50 AA022537). De auteurs danken Jill Bettinger voor nuttige discussies en Jacqueline DeLoyht voor technische assistentie.

1. Day Before Assay <ol><li> Verzamel ongedierte in vers voedsel flesjes in groepen van 11 (van hetzelfde geslacht) onder kort (1-5 min) CO 2. </li><li> Laat vliegen om te herstellen O / N in voeding flesjes op een milieuvriendelijke gecontroleerde ruimte (meestal 25 ° C, 60% relatieve vochtigheid, 12 uur licht / donker-cyclus). </li><li> Bereid ethanoloplossing (en) door verdunnen zuivere (100%) in ethanol gezuiverd (≥18 MQ) water tot eindconcentratie (s) voor de geplande experiment. Laat de oplossing (en) terugkeren naar kamertemperatuur O / N. Opmerking: Verdunning ethanol is exotherm. </li></ol> 2. Dag van Assay <ol><li> Voor elke injectieflacon vliegen te testen, bereid (i) een schone, lege voedsel vial; wil zeggen een controle flesje, (ii) een nieuwe celluloseacetaat plug, (iii) een siliconen stop en (iv) 1 ml ethanol oplossing (zie tabel 3). </li><li> Bereid testkamer door aanpassing temperatuur tot 20-25 ° C en relatieve vochtigheid van 55-65%. </li><li> Hebben een andere werknemertoewijzen van een unieke code voor elke groep flesjes en noteer de code voor later. Plaats gecodeerd flesjes met vliegen in de testkamer te acclimatiseren voor een paar minuten. </li><li> Label lege testen flesjes om codes op vlieg flesjes passen van 2,3. </li><li> De bouw van een hard copy testen logboek door in een spreadsheet vergelijkbaar met tabel 1 het invoeren van de codes in kolommen (één kolom / flacon). </li><li> Met behulp van de testen log als een gids, regelen gecodeerd voedsel flesjes met vliegen en lege testen flesjes in bijpassende arrays in de testkamer. Opmerking: Een redelijk maximum aantal flesjes om te testen is 24 (dwz, 6 sets van 4 flesjes per stuk). </li><li> Transfer vliegt van voedsel flacons in geëvenaard / label leeg testen flesjes en steek onmiddellijk celluloseacetaat stekkers in het testen van flesjes tot celluloseacetaat stekkers zijn 2 cm onder de flacon toppen. </li><li> Hierna behandelen elke rij van vier flesjes als een set bij gespreide 1 min intervallen. </li><li> Voor de tijd 0 beoordeling, pakt elk flesje individueel wet duim en wijsvinger, tik zachtjes op de tafel drie keer om vliegen te kloppen op de bodem van de flacon, wacht 30 seconden en dan tellen het aantal vliegen die immobiel / dood zijn. Noteer het aantal immobiele / dode vliegen voor elk flesje op tijdstip 0 min in de hardcopy testen log. </li><li> Start timer tellen voortdurend op tijdstip 0 en onmiddellijk beginnen met het toevoegen van 1 ml ethanol aan celluloseacetaat pluggen in de flesjes voor de eerste rij / set van 4 flesjes. Voeg 1 ml ethanol aan het celluloseacetaat pluggen in de flesjes bij 5 sec intervallen in de volgorde waarin ze worden getest. Ethanol Aan het celluloseacetaat pluggen in een cirkelvormige beweging, zodat de ethanol gelijkmatig geabsorbeerd gehele celluloseacetaat pluggen. Wanneer ethanol is toegevoegd aan alle 4 testen flesjes in de set, plaatst u een siliconen plug in elk flesje om het te verzegelen. </li><li> Soms 1, 2, 3, 4 en 5 min, voeg 1 ml ethanol aan de tweede, derde, vierde, vijfde en zesde sets van 4 flesjes resp. Doorgaan invoegen van siliconen stoppers nahet toevoegen van ethanol aan elke set van 4 flesjes. </li><li> Op het moment 6 min, test de eerste set van 4 flesjes door grijpen iedere flacon met duim en wijsvinger, tikken zachtjes op de tafel drie keer om vliegen te kloppen op de bodem van de flacon, wacht 30 seconden en dan tellen en registreren van het totale aantal vliegen die worden verdoofd. Score vliegt als verdoofd als ze (i) op ​​de bodem van de flacon staan, maar niet lopen of (ii) liggen op hun rug, met of zonder klapperen met hun vleugels. </li><li> Behandel elk flesje in de set op 5 sec intervallen met behulp van het schema in tabel 2. </li><li> Soms 7, 8, 9, 10 en 11 min, test de tweede, derde, vierde, vijfde en zesde sets flacons, respectievelijk, zoals voor de eerste set. </li><li> Op tijdstip 12 min, test de eerste set van 4 flesjes opnieuw zoals beschreven in 2.12 en verder testen van de tweede, derde, vierde, vijfde en zesde sets flacons 13, 14, 15, 16 en 17 min, respectievelijk. </li><li> Verder testen vliegen zoals beschreven in 2.12 tot alle vliegen zijn sedated. </li><li> Voer het totale aantal vliegen in elk flesje in de hard copy testen log. Censureren immobiel / dode vliegen op tijdstip 0 van het totale aantal vliegen. </li><li> Bereken het percentage actieve vliegt bij elke meting tijdpunt en plot gegevens% actief vliegen (y-as) versus tijd (x-as). Kwantificeren ethanol sedatie door interpolatie Sedatie Time 50 waarden (ST50, tijd tot 50% sedatie) vanaf derdegraads polynoom of sigmoïdale curve fits of geraamd gebied onder de curve. </li><li> Gegevens verzamelen van gedecodeerd flacons en statistische analyses uit te voeren (bijvoorbeeld, one-way ANOVA met Bonferroni meervoudige vergelijkingstest) in voorkomend geval voor de experimentele opzet. </li></ol>

<ol><li>Rehm, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+disease+and+injury+and+economic+cost+attributable+to+alcohol+use+and+alcohol-use+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global burden of disease and injury and economic cost attributable to alcohol use and alcohol-use disorders.</a> Lancet. 373, 2223-2233 (2009).</li>
<li>Prescott, C. A., Kendler, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+environmental+contributions+to+alcohol+abuse+and+dependence+in+a+population-based+sample+of+male+twins%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+psychiatry%22%5BJournal%5D)">Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins.</a> The American journal of psychiatry. 156, 34-40 (1999).</li>
<li>Devineni, A. V., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+Drosophila+melanogaster+as+a+model+for+alcohol+research%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research.</a> Annual review of neuroscience. 36, 121-138 (2013).</li>
<li>Scholz, H., Mustard, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invertebrate+Models+of+Alcoholism%5BTitle%5D)+AND+%22Current+topics+in+behavioral+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Invertebrate Models of Alcoholism.</a> Current topics in behavioral neurosciences. 13, 433-457 (2011).</li>
<li>Rodan, A. R., Rothenfluh, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRodan%2C+AR+%22Functional+Plasticity+and+Genetic+Variation%3A+Insights+into+the+Neurobiology+of+Alcoholism%22">Functional Plasticity and Genetic Variation: Insights into the Neurobiology of Alcoholism</a>. Reilly, M. T., Lovinger, D. M. 91, Elsevier. (2010).</li>
<li>Schumann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+and+genetic+functional+studies+identify+autism+susceptibility+candidate+2+gene+%28AUTS2%29+in+the+regulation+of+alcohol+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association and genetic functional studies identify autism susceptibility candidate 2 gene (AUTS2) in the regulation of alcohol consumption.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7119-7124 (2011).</li>
<li>Corl, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Happyhour%2C+a+Ste20+family+kinase%2C+implicates+EGFR+signaling+in+ethanol-induced+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Happyhour, a Ste20 family kinase, implicates EGFR signaling in ethanol-induced behaviors.</a> Cell. 137, 949-960 (2009).</li>
<li>Moore, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+intoxication+in+Drosophila%3A+Genetic+and+pharmacological+evidence+for+regulation+by+the+cAMP+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway.</a> Cell. 93, 997-1007 (1998).</li>
<li>Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hangover+gene+defines+a+stress+pathway+required+for+ethanol+tolerance+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development.</a> Nature. 436, 845-847 (2005).</li>
<li>Riley, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+dependence+is+associated+with+the+ZNF699+gene%2C+a+human+locus+related+to+Drosophila+hangover%2C+in+the+Irish+affected+sib+pair+study+of+alcohol+dependence+%28IASPSAD%29+sample%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+psychiatry%22%5BJournal%5D)">Alcohol dependence is associated with the ZNF699 gene, a human locus related to Drosophila hangover, in the Irish affected sib pair study of alcohol dependence (IASPSAD) sample.</a> Molecular psychiatry. 11, 1025-1031 (2006).</li>
<li>Morozova, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+sensitivity+in+Drosophila%3A+translational+potential+of+systems+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Alcohol sensitivity in Drosophila: translational potential of systems genetics.</a> Genetics. 183, 733-745 (2009).</li>
<li>Ogueta, M., Cibik, O., Eltrop, R., Schneider, A., Scholz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+Adh+function+on+ethanol+preference+and+tolerance+in+adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+senses%22%5BJournal%5D)">The influence of Adh function on ethanol preference and tolerance in adult Drosophila melanogaster.</a> Chemical senses. 35, 813-822 (2010).</li>
<li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+GWASs+and+human+protein+interaction+networks+identifies+a+gene+subnetwork+underlying+alcohol+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+human+genetics%22%5BJournal%5D)">Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence.</a> American journal of human genetics. 93, 1027-1034 (2013).</li>
<li>Lind, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomewide+association+study+of+nicotine+and+alcohol+dependence+in+Australian+and+Dutch+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Twin+Res+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">A genomewide association study of nicotine and alcohol dependence in Australian and Dutch populations.</a> Twin Res Hum Genet. 13, 10-29 (2010).</li>
<li>Schuckit, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+level+of+response+to+alcohol+as+a+predictor+of+future+alcoholism%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+psychiatry%22%5BJournal%5D)">Low level of response to alcohol as a predictor of future alcoholism.</a> The American journal of psychiatry. 151, 184-189 (1994).</li>
<li>Schuckit, M. A., Smith, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+8-year+follow-up+of+450+sons+of+alcoholic+and+control+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+general+psychiatry%22%5BJournal%5D)">An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects.</a> Archives of general psychiatry. 53, 202-210 (1996).</li>
<li>Tabakoff, B., Cornell, N., Hoffman, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Emerg+Med%22%5BJournal%5D)">Alcohol tolerance.</a> Ann Emerg Med. 15, 1005-1012 (1986).</li>
<li>Chan, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+Influences+of+Drosophila+white%2Fmini-white+on+Ethanol+Sensitivity+in+Two+Different+Behavioral+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">Contrasting Influences of Drosophila white/mini-white on Ethanol Sensitivity in Two Different Behavioral Assays.</a> Alcohol Clin Exp Res. 38, 1582-1593 (2014).</li>
<li>Eddison, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((arouser+reveals+a+role+for+synapse+number+in+the+regulation+of+ethanol+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">arouser reveals a role for synapse number in the regulation of ethanol sensitivity.</a> Neuron. 70, 979-990 (2011).</li>
<li>Wen, T., Parrish, C. A., Xu, D., Wu, Q., Shen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuropeptide+F+and+its+receptor%2C+NPFR1%2C+define+a+signaling+pathway+that+acutely+modulates+alcohol+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuropeptide F and its receptor, NPFR1, define a signaling pathway that acutely modulates alcohol sensitivity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2141-2146 (2005).</li>
<li>Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assay+for+evoked+locomotor+behavior+in+Drosophila+reveals+a+role+for+integrins+in+ethanol+sensitivity+and+rapid+ethanol+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance.</a> Alcohol Clin Exp Res. 33, 1794-1805 (2009).</li>
<li>Bhandari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+intracellular+channels+modulate+acute+ethanol+behaviors+in+Drosophila%2C+Caenorhabditis+elegans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+brain%2C+and+behavior%22%5BJournal%5D)">Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors in Drosophila, Caenorhabditis elegans and mice.</a> Genes, brain, and behavior. 11, 387-397 (2012).</li>
<li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+iterative+negative+geotaxis+%28RING%29%3A+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+gerontology%22%5BJournal%5D)">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).</li>
<li>Chen, J., Wang, Y., Zhang, Y., Shen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Bacchus+reveal+a+tyramine-dependent+nuclear+regulator+for+acute+ethanol+sensitivity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Mutations in Bacchus reveal a tyramine-dependent nuclear regulator for acute ethanol sensitivity in Drosophila.</a> Neuropharmacology. 67, 25-31 (2013).</li>
<li>Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lmo+genes+regulate+behavioral+responses+to+ethanol+in+Drosophila+melanogaster+and+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse.</a> Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).</li>
<li>Maples, T., Rothenfluh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+way+to+measure+ethanol+sensitivity+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple way to measure ethanol sensitivity in flies.</a> J Vis Exp. , e2541(2011).</li>
<li>Rothenfluh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+behavioral+responses+to+ethanol+are+regulated+by+alternate+RhoGAP18B+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms.</a> Cell. 127, 199-211 (2006).</li>
<li>Nohronha, A. Ch. 23. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRothenfluh%2C+A+%22Neurobiology+of+Alcohol+Dependence%22">Neurobiology of Alcohol Dependence</a>. 23, Elsevier. 467-495 (2014).</li>
<li>Jones, M. A., Grotewiel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+age-related+impairment+in+locomotor+and+other+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+gerontology%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors.</a> Experimental gerontology. 46, 320-325 (2010).</li>
<li>Martin, I., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+damage+and+age-related+functional+declines%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+ageing+and+development%22%5BJournal%5D)">Oxidative damage and age-related functional declines.</a> Mechanisms of ageing and development. 127, 411-413 (2006).</li>
<li>Devineni, A. V., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+ethanol+responses+in+Drosophila+are+sexually+dimorphic%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Acute ethanol responses in Drosophila are sexually dimorphic.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 21087-21092 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Ongecompliceerde testen die reproduceerbaar kwantificeren zinvolle fenotypes zijn van grote waarde voor de analyse van het gedrag. De hier beschreven werkzaamheden hebben betrekking op een aantal praktische aspecten van een test voor het meten van ethanol sedatie gevoeligheid en snelle tolerantie in Drosophila. Hoewel het niet een focus van dit werk, zijn gedragsanalyses bevorderd door het handhaven van het milieu en de genetische achtergrond constante voor proefpersonen in een studie. Bovendien moet vergelijki...

Alcoholgebruik stoornis (AUD) is een enorm gezondheidsprobleem wereldwijd (beoordeeld in 1). Hoewel de mechanismen die de ontwikkeling van AUD complex, deze aandoeningen hebben een belangrijke genetische component (bijvoorbeeld 2). De grote erfelijkheid van AUD en de geconserveerde gedragsreacties naar ethanol in heel veel soorten (beoordeeld in 3,4) sterke interesse in het gebruik van genetisch model organismen om de betrokkenheid van specifieke genen in-ethanol gerelateerd gedrag in de richting van een beter inzicht in de moleculaire basis van onderzoeken hebben gegenereerd AUD. De fruitvlieg Drosophila melanogaster, heeft ontpopt als een toonaangevende modelorganisme voor het verkennen van moleculair-genetische mechanismen van-ethanol gerelateerd gedrag (beoordeeld in 3,4). Studies in vliegt hebt gemarkeerd rollen voor verschillende signaalwegen in gedragsreacties om ethanol (beoordeeld in 5). Intrigerend sommige genen en pathways die gedragsmatige respons beïnvloedenes ethanol in vliegen zijn ook betrokken knaagdieren ethanol gerelateerd gedrag en / of menselijke AUD (bijvoorbeeld 6-14). Het behoud van mechanismen achter-ethanol gerelateerd gedrag alle species, in combinatie met de reeks genetische gereedschap in het Drosophila modelsysteem onderstrepen het nut van de fruitvlieg model voor onderzoek naar de genetica van gedragsreacties ethanol. Gevoeligheid 15,16 en tolerantie (besproken in 17) tot ethanol bij de mens is verbonden met de ontwikkeling van AUD. Beide gedragsreacties ethanol kan worden gemodelleerd in vliegen via diverse laboratorium testen (besproken in 3,4). Alle van de vlieg assays die tot op heden zijn gebaseerd op ofwel tijdsafhankelijke-ethanol geïnduceerde sedatie / coördinatiestoornissen of tijdsafhankelijke herstel van ethanol sedatie. In een vorig artikel uit onze groep op de genetica van ethanol gevoeligheid en rAPID tolerantie in Drosophila, een gedrags-test op basis van ethanol-damp geïnduceerde sedatie van vliegen werd gebruikt 18. Testen in deze test is geïnitieerd door het overdragen van live adult vliegt zonder verdoving om voedsel flesjes leeg, het vangen van de vliegen in de injectieflacons met een celluloseacetaat stekker, het toevoegen van ethanol naar de top (dat wil zeggen, niet-fly kant) van de cellulose-acetaat stekker, en het afdichten van de flacon met vliegen, celluloseacetaat plug en ethanol met een siliconen stopper (zie schema in figuur S3, referentie 18). Meerdere flacons die verschillende groepen vliegen werden beoordeeld in parallel, waardoor doorvoer van deze assay. Flesjes kregen een anonieme code en onderzoekers waren blind voor de behandeling groep om onbedoelde bias in de beoordeling van de sedatie te voorkomen. In een standaard experiment, vliegen in flesjes werden voorzichtig aangetikt 6 min intervallen en, na 30 seconden herstel, het aantal verdoofd vliegen in elk flesje werd geteld en Converted om procent actief vliegen. Vliegen geabsorbeerd ethanol damp uit het celluloseacetaat sluit een tijdsafhankelijke wijze, waardoor toenemende verhoging van interne ethanol 18 en sedatie (zie verwijzing 18 en figuur 1A en 1B in dit verslag). Sedatie in deze test werd operationeel gedefinieerd als vliegen (i) staan ​​in de afwezigheid van wandelen of (ii) liggend op hun rug, met of zonder klapperen met hun vleugels. Hier wordt deze ethanol sedatie assay beschreven, verder operationele optimalisering te gebruiken relevant verstrekt, en de test wordt gebruikt om de bijdrage van voedingssupplement opties aan fly sedatie gevoeligheid pakken.

<table><tbody><tr><td>food vials</td><td>VWR</td><td>89092-772</td><td>smal</td></tr><tr><td>Flugs</td><td>Genesee/flystuff.com</td><td>49-102</td><td>smal</td></tr><tr><td>silicone stopper</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-704-1l</td><td>#4</td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Pharmaco-Aaper</td><td>111000200</td><td>200 proof</td></tr></tbody></table>

een goedkope, scalable behavioral test voor het meten ethanol sedatie gevoeligheid en rapid tolerantie in<em&gt; drosophila</em

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

Alcoholgebruik stoornis (AUD) is een ernstig gezondheidsprobleem uitdaging. Ondanks een grote erfelijke component AUD, zijn weinig genen eenduidig ​​betrokken bij hun etiologie. De fruitvlieg Drosophila melanogaster, is een krachtig model voor het verkennen van moleculair genetische mechanismen die ten grondslag liggen aan alcohol gerelateerde gedrag en daarom bezit is van een grote belofte voor het identificeren en begrijpen van de functie van genen die AUD beïnvloeden. Het gebruik van het Drosophila model voor deze soorten onderzoeken afhankelijk van de beschikbaarheid van testen die gedragsreacties ethanol betrouwbaar te meten. Dit rapport beschrijft een test geschikt is voor de beoordeling van ethanol gevoeligheid en snelle tolerantie in vliegen. Ethanol gevoeligheid gemeten in deze assay wordt beïnvloed door het volume en de concentratie van ethanol gebruikt, verschillende eerder beschreven genetische manipulaties, en ook hoe lang het vliegen worden ondergebracht zonder voedsel ogenblik van de proef. Daarentegen ethanol sensitivity gemeten in deze test wordt niet beïnvloed door de kracht van vlieg behandeling, geslacht van de vliegen en suppletie kweekmedium met antibiotica of levende gist. Drie verschillende methoden voor het kwantificeren ethanol gevoeligheid beschreven uiteindelijk toe leidt kenmerken ononderscheidbaar ethanol gevoeligheid resultaten. De schaalbare karakter van deze test, in combinatie met de algehele eenvoud aan de set-up en de relatief lage kosten, maken het geschikt voor kleine en grote schaal genetische analyse van ethanol gevoeligheid en snelle tolerantie in Drosophila.

De ruwe gegevens van het ethanol sedatie assay het aantal vliegen die gesedeerd als functie van ethanoldamp belichtingstijd. Ruwe gegevens worden omgezet naar het percentage actieve vliegen als functie van de tijd (primaire gegevens Figuren 1A, B, D - F). Gevoeligheid voor ethanol sedatie van de primaire gegevens kunnen worden gekwantificeerd zoals sedatie Time 50 (ST50), de tijd die nodig is voor 50% van vliegen tot verdoofd of aea onder de curve (AUC) worden via interpolatie van curve...

Eenvoudige tests voor het meten van ethanolgevoeligheid en snelle tolerantie bij Drosophila vergemakkelijken het gebruik van dit modelorganisme voor het onderzoeken van deze belangrijke ethanol-gerelateerde gedragingen. Hier wordt een relatief eenvoudige, schaalbare test beschreven voor het meten van ethanolgevoeligheid en snelle tolerantie bij vliegen.

Een goedkope, Scalable Behavioral Test voor het meten Ethanol Sedatie Gevoeligheid en Rapid Tolerantie in<em&gt; Drosophila</em

Alcohol use disorder (AUD) is a serious health challenge. Despite a large hereditary component to AUD, few genes have been unambiguously implicated in ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de gevoeligheid voor ethanol-sedatie bij fruitvliegen te beoordelen. Dit wordt bereikt door vliegen in vials te plaatsen en ze bloot te stellen aan ethanol-damp. De tweede stap is het bepalen van het aantal gesedeerde vliegen in elke vial op terugkerende tijdstippen, totdat alle vliegen gesedeerd zijn.Vervolgens wordt het tijdstip geïnterpoleerd. Wanneer 50% van de vliegen in elk flacon is gesedateerd, tonen de resultaten een index van de tijd die nodig is om fruitvliegen met ethanol te sedateren; deze procedure zal vandaag worden gedemonstreerd door Simran Sindu, een student in mijn laboratorium. Om het experiment te starten, verzamel vliegen in flacons met vers voedsel in groepen van 11 van één enkel geslacht gedurende maximaal vijf minuten met CO2, en laat de vliegen gedurende de nacht herstellen in voedingsflacons in een omgevinggecontroleerde ruimte.Bereid een ethanoloplossing door zuivere 100% ethanol te verdunnen in gezuiverd water tot een uiteindelijke concentratie van 85%. Laat de oplossing gedurende de nacht terugkeren naar kamertemperatuur. Bereid vóór de assay een schoon, leeg voedingsflesje voor, dat als testflesje zal dienen. Zorg voor een nieuwe plug van celluloseacetaat, een siliconen stop en één milliliter ethanoloplossing voor elk flesje vliegen dat getest moet worden. Stel de kamertemperatuur in op 20 tot 25 °C en de relatieve luchtvochtigheid op 55 tot 65%. Wijs een andere medewerker aan om een unieke code toe te kennen aan elke groep flesjes en noteer deze code voor later. Plaats de gecodeerde flesjes met vliegen enkele minuten in de testruimte om te acclimatiseren. Label vervolgens de lege testflesjes zodat deze overeenkomen met de codes op de vliegflesjes.Maak een fysiek testlogboek door de codes in kolommen in een spreadsheet in te voeren, met één kolom per flacon. Gebruik het testlogboek als leidraad. Plaats de gecodeerde voedingsflacons met vliegen en de lege testflacons in overeenkomstige arrays in de testruimte en breng de vliegen één voor één over van de voedingsflacons naar de bijbehorende en gelabelde testflacons.Plaats vervolgens onmiddellijk celluloseacetaatpluggen in de testbuisjes totdat de celluloseacetaatpluggen twee centimeter onder de bovenkant van de buisjes zitten. Voor de bepaling op tijdstip nul: houd elk buisje individueel vast met de duim en wijsvinger.Tik drie keer zachtjes op de tafel om de vliegen naar de bodem van het buisje te schudden. Wacht 30 seconden en tel het aantal vliegen dat immobiel is en/of dood is. Noteer het aantal immobiele of dode vliegen voor elk buisje op dat tijdstip.Noteer nul minuten in het papieren testlogboek. Start de timer bij tijd nul en voeg onmiddellijk één milliliter ethanol toe aan de celluloseacetaat. Meng in een cirkelvormige beweging met intervallen van vijf seconden voor de eerste set van vier vials in de volgorde.Ze worden getest wanneer de ethanol aan alle vier de testbuisjes in de set is toegevoegd. Plaats in elk buisje een siliconen stop om deze af te sluiten na 1, 2, 3, 4 en vijf minuten. Voeg één milliliter ethanol toe aan de tweede, derde, vierde, vijfde en zesde sets van vier buisjes respectievelijk.Ga door met het plaatsen van siliconen stoppen nadat ethanol aan elke set van vier vials LS is toegevoegd bij zes minuten. Test de eerste set van vier vials door elke vial met duim en wijsvinger vast te pakken en drie keer zachtjes op de tafel te tikken om de vliegen naar de bodem van de vial te doen vallen. Wacht 30 seconden, tel vervolgens het totale aantal gesedateerde vliegen en noteer dit.Spoor vliegen als gesedeerd als ze óf op de bodem van het buisje staan maar niet lopen, óf op hun rug liggen met of zonder vleugelslaan. Behandel elk buisje binnen de set met intervallen van vijf seconden volgens dit schema op 7, 8, 9, 10 en 11 minuten.Test de tweede, derde, vierde, vijfde en zesde set flacons respectievelijk op dezelfde wijze als voor de eerste set bij 12 minuten. Test de eerste set van vier flacons opnieuw en ga verder met het testen van de tweede, derde, vierde, vijfde en zesde set flacons bij respectievelijk 13, 14, 15, 16 en 17 minuten. Ga door met het testen van de vliegen totdat ze allemaal gesedeerd zijn.Voer het totale aantal vliegen in elke vial in bij de test op papier. Registreer immobiele of dode vliegen op tijdstip nul als aftrek van het totale aantal vliegen. Ruwe gegevens uit de ethanol-sedatie-assay werden omgezet naar het percentage actieve vliegen als functie van de tijd.De gevoeligheid voor ethanol-sedatie uit de primaire gegevens werd gekwantificeerd als sedatietijd 50 of ST 50. Dit is de tijd die nodig is voordat 50% van de vliegen gesedeerd raakt, of de oppervlakte onder de curve (AUC). De assay detecteert de effecten van RNAi tegen calnexin 14 D in het zenuwstelsel, wat de ethanolgevoeligheid verminderde ten opzichte van de controles; mutaties van scab en rouser verhoogden de gevoeligheid voor ethanol-sedatie, en mutaties van happy hour verminderden de gevoeligheid voor ethanol-sedatie in vergelijking met de controles zodra deze gewend waren.Deze techniek kan in anderhalf uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd.

an-inexpensive-scalable-behavioral-assay-for-measuring-ethanol

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een eenvoudige test om de sederende effecten van ethanol te meten...

Een eenvoudige manier om Ethanol Gevoeligheid meten in Flies

Drosophila heeft zich ontpopt als een belangrijk modelsysteem voor het ontleden van de cellulaire en moleculaire onderbouwing van gedragsreacties op alcohol. Hier presenteren we een protocol voor het verzamelen van alcohol gevoelige gegevens in een circadiane context die gemakkelijk kan worden toegepast op andere experimenten en is goed geschikt voor gegradueerdenonderzoek.

De flybar: Toedienen Alcohol te Flies

In deze video artikel beschrijven we een geautomatiseerde test om het effect van honger of verzadiging op olfactorische afhankelijke voedsel zoekgedrag meten de volwassen fruitvlieg Drosophila melanogaster.

A Single-fly test voor foerageergedrag in Drosophila

Hier presenteren we een protocol om de vermijding van gestreste individuen te kwantificeren. Dit paradigma is krachtig maar gebruiksvriendelijk en kan worden gebruikt om de invloed van genen en omgeving op een soort sociale interactie bij Drosophila melanogaster te beoordelen.

Ongecompliceerd Assay voor de kwantificering van Sociale Avoidance in Drosophila melanogaster

C. elegans is een nuttig model voor het bestuderen van de effecten van ethanol op het gedrag. We presenteren een gedragstest die de effecten van ethanol op de bewegingssnelheid van kruipende wormen kwantificeert; zowel de initiële gevoeligheid als de ontwikkeling van acute functionele tolerantie voor ethanol kunnen met deze test worden gemeten.

Een test voor het meten van de effecten van ethanol de voortbeweging Snelheid<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

We beschrijven een protocol voor het induceren van belonen en nonrewarding ervaringen in fruitvliegjes (Drosophila melanogaster) met behulp van vrijwillige ethanol consumptie als maat voor veranderingen in de beloning staten.

Een eenvoudige manier om Veranderingen Meet in Reward-zoekend gedrag Met behulp<em&gt; Drosophila melanogaster</em

De huidige methoden om de alcoholgevoeligheid in Drosophila te meten zijn ontworpen om groepen vliegen te testen. We presenteren een eenvoudige, goedkope, hoge doorvoer test voor de beoordeling van alcohol sedatie gevoeligheid in grote aantallen enkele vliegen. De methode vereist geen gespecialiseerde gereedschappen en kan worden uitgevoerd in elk laboratorium met behulp van gemeenschappelijke materialen.

High-Throughput Methode voor het meten van alcohol sedatie tijd van individuele Drosophila melanogaster

De Flypub test meet het gedrag dat de fruitvlieg Drosophila melanogaster toont onder invloed van ethanol. De test kan gemakkelijk worden beheerst door onderzoekers op alle niveaus en toegepast op verschillende verdampte stimuli, het vergemakkelijken van drugsmisbruik en verslavingsstudies.

Flypub om ethanol geïnduceerde gedragsstoornissen en sensibilisatie te bestuderen

Het protocol presenteert een high-throughput, kosteneffectieve methode voor het beoordelen van neurotoxiciteit in de fruitvlieg door middel van de kwantificering van locomotorische disfunctie als alternatief voor traditionele zoogdiermodellen. Het heeft tot doel de neurotoxische effecten van farmaceutische verbindingen, milieuagentia of genetische modificaties te evalueren met behulp van een gevoelig, reproduceerbaar en ethisch gunstig model.

Gedragsanalyse van locomotorische disfunctie bij Drosophila melanogaster als uitlezing voor neurotoxiciteit

De procedure beschreven in dit protocol laat zien dat testosteron administratie en folk overtuigingen over testosteron kan gepaard gaan met direct tegenover sociaal gedrag.

De combinatie van Behavioral Endocrinologie en Experimentele Economie: Testosteron en Sociaal Decision Making

Leer een eenvoudige gedragstest om ethanolgevoeligheid en snelle tolerantie te meten in Drosophila. Deze schaalbare methode helpt onderzoekers verslavingsmechanismen te bestuderen.

Een goedkope, Scalable Behavioral Test voor het meten Ethanol Sedatie Gevoeligheid en Rapid Tolerantie in

Meer video's verkennen