Name: Een test voor het meten van de effecten van ethanol de voortbeweging Snelheid Caenorhabditis elegans /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Leer een gedragsassay om de effecten van ethanol op de voortbewegingssnelheid van Caenorhabditis elegans te meten. Deze methode kwantificeert gevoeligheid en tolerantieontwikkeling voor alcohol.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studies werden ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health, Nationaal Instituut voor Alcoholisme en alcoholmisbruik: R01AA016837 (JCB) en P20AA017828 (AGD en JCB).

1. Stappen om te presteren op de Dag voor de Assay <ol><li> Pick L4 stadium wormen in de frisse nematode groeimedium (NGM) platen gezaaid met een gazon van OP50 E. coli, en cultuur ze op 20 CO / N. Elke test conditie vereist 10 wormen; pick een overmaat van wormen om voor O / N verlies van wormen. <ol><li> Alleen assay dieren die de eerste dag volwassenen zijn; vele mutanten groeien in een langzamer tempo dan wild-type. Pas de timing van plukken voor stammen die ontwikkelingsstoornissen vertragingen hebben, zodat alle dieren getest zijn eerste dag volwassenen. </li></ol></li></ol> 2. Stappen om te presteren op de Dag van de Assay <ol><li> Voorbereiding voor de test: <ol><li> Voeren tests op standaard ongeplaatste 60 x 15 mm NGM platen. Droog alle platen te gebruiken bij 37 ° C gedurende 2 uur, met deksels. Voor elke experimentele studie, gebruiken vier gedroogde NGM platen; zullen dit de 0 en 400 mm en ethanol assayplaten en hun begeleidende acclimatisatie platen. OPMERKING:Het gebruik van NGM platen is hier belangrijk; verschillen in de samenstelling van de platen, met name de osmolariteit, sterk kan de dosering respons ethanol op gedrag, dit is te wijten, althans gedeeltelijk, van veranderingen in de hoeveelheid ethanol geaccumuleerd door de dieren 20. NGM agar is 160 mOsm. </li><li> Na drogen wegen elk van de unseeded NGM platen voor gebruik in de assay en noteer het gewicht. Bepaal het volume van media in de platen op basis van het gewicht van een lege plaat. Om de conversie van gewicht van de agar volume benaderen veronderstellen dat de media weegt hetzelfde als een gelijk volume water. LET OP: Onze meest consistente resultaten gevonden met NGM media die voldoende is uitgedroogd dat een originele 10 ml volume heeft een post-drogende volume tussen 8,3-8,9 ml. Een alternatief voor de 2 uur droogtijd te drogen tot de bakplaten op dit volumebereik te verantwoorden verschillen in incubators. </li><li> Smelt 4 koperen ringen (inwendige diameter 1.6 cm) in het oppervlak van elk van de platen als kralen van de verschillende genotypen of behandelingsgroepen van worms.Grasp elke ring met een pincet en warmte in een vlam (een sterke vlam van een Bunsen brander werkt goed) ongeveer 3 seconde Onmiddellijk de ring op een plaat terwijl de ring met de tang houden om te voorkomen dat &quot;overslaan&quot;. <ol><li> Zorg ervoor dat de ring rust plat tegen het oppervlak van de agar door te drukken naar beneden voorzichtig met de tang op verschillende punten op de ring. Bij het plaatsen van de ring, wees voorzichtig om ruimte te laten voor een extra drie ringen. </li><li> Smelt de drie extra koperen ringen in het oppervlak van de plaat, zorg om ze zo dicht mogelijk bij elkaar te plaatsen zodat alle vier zullen in het gezichtsveld van de camera. OPMERKING: Een goede afdichting met de agar is essentieel om de wormen in de ringen tijdens de assay te houden. Ringen die overslaan rond op de plaat zullen waarschijnlijk niet de juiste afdichting met de agar te maken enkan agar, waardoor wormen te graven en verstoort visualiseren wormen litteken. </li><li> Voor elke testplaat bereiden een begeleidende &quot;acclimatisatie&quot; plaat, die moeten worden gedroogd en ongeplaatste en zal geen ethanol ontvangen. Plaats vier koperen ringen op deze platen. </li></ol></li><li> Label de onderkant van de platen naast elke ring met de worm stam voor gebruik in de ring, waarbij zorg niet schrijven in het gezichtsveld van de ring zelf. Overeenkomen met de labels op de testplaat met de bijbehorende acclimatisering plaat. </li><li> Bereken de hoeveelheid van 100% ethanol aan elke testplaat zodat de eindconcentratie 0 mM of 400 mM ethanol (gewicht tot volume). Voor elk experiment (n = 1), zal er een 0 mM en een 400 mM ethanol plaat; acclimatisatie platen niet ethanol ontvangen. Voeg de ethanol, pipetteren rond het oppervlak van de plaat. Gebruik laboratorium folie verzegeld, en laat equilibreren op het werkblad 2 uur. </li><li> Wanneer 1,5 uur verstreken, begint de acclimatisering stap van de assay, stap 2.2. </li></ol></li><li> Locomotie assay: assayplaten <ol><li> Zorgvuldig overdracht 10 wormen van elke experimentele groep het midden van een koperen ring op de acclimatisering plaat. Verwijder alle voedsel dat zichtbaar is op de agar op dit punt door schrapen zachtjes met de worm pick is. Variëren de volgorde waarin de experimentele groepen worden op de platen in experimentele studies zodat dezelfde stammen niet worden op de platen in dezelfde volgorde in de onderzoeken. Opmerking: Het doel is om de dieren te dragen aan de plaat met minimale hoeveelheden voedsel, want als voedsel op de acclimatisering plaat overgebracht naar de testplaat de wormen aggregeren rond het eten en het effect van het geneesmiddel op voortbeweging worden verduisterd. </li><li> Wees voorzichtig niet om het oppervlak van de agar met de pick te breken, omdat dit zal toestaan ​​dat de wormen te graven en zal de test verstoren. Incubeer de wormen bij RT gedurende 30 min. </li><li> Zorg ervoor dat er een geschikt interval tussen de initiaties van elke plaat. Een ervaren experimentator kan 40 dieren, 10 / ring voor 4 ringen in &lt;1,5 min te verplaatsen, maar elke interval tot 2 min aanvaardbaar is. De standaard test heeft films opnemen op 10-12 min en 30-32 min van de blootstelling voor zowel de 0 en 400 mm ethanol. </li><li> Inleiding van de acclimatisatie plaat voor de 0 mm belichting en de acclimatisering plaat voor de 400 mm belichting ongeveer 2 min en 30 sec uit elkaar te zorgen voor besparing van de eerste film bestand voordat de tweede film moet beginnen. </li><li> Nadat de 30-min acclimatiseringsperiode, overdracht van de wormen uit de acclimatisering platen om de assay platen. Breng de wormen de testplaten (0 mM of 400 mM ethanol) in dezelfde volgorde waarin ze werden toegevoegd aan de acclimatisering plaat, het bijhouden van de tijd tussen de aanvullingen van elke plaat. Sluit de plaat met laboratorium film verlies van ethanol verdamping te minimaliseren. </li><li> Use een scheppende beweging met een dunne randen afgevlakt worm pick om wormen te verzamelen op de top van de afgeplatte pick. Voer de overdracht van wormen uit de unseeded acclimatisering plaat om de testplaat zonder het gebruik van bacteriën, die gewoonlijk wordt gebruikt bij het overbrengen van wormen als het helpt om de worm lijm aan de oogst. OPMERKING: De snelheid waarmee dieren worden overgedragen in deze stap is belangrijk omdat de eerste wormen op de plaat wordt blootgesteld aan meer dan de laatste wormen toegevoegd aan de plaat ethanol en eerdere tijdstippen kan enige tijd-afhankelijke effecten vertonen. Dit is de belangrijkste reden voor het roteren van die stammen worden op een bord als eerste over experimentele replica geplaatst. </li></ol></li><li> Voeren Locomotion Assay: Filmen <ol><li> Gebruik een microscoop / camera combinatie die zorgt voor gelijktijdige weergave van alle vier ringen in het gezichtsveld (circa 42x42 mm2 vierkant), zoals een microscoop objectief 0,5x, 0,8x vergroting en een camera met een 2048x2048 7.481; m pixel CCD. </li><li> Gebruik een gelijkmatige verlichting van het gezichtsveld, wat helpt bij het herkennen van objecten op de intensiteit drempel stap (zie hieronder). Een 3 &quot;x3&quot; backlight werkt goed. </li><li> Afbeelding van de wormen op een bord geplaatst media-kant naar boven (deksel dicht), die contrasteren die verloren gaat wanneer u de verlichting in vergelijking met een traditionele microscoop overgedragen lichtbron genereert. </li><li> Bereid de beeldanalyse software om time-lapse filmpjes van de bewegende wormen vangen. Stel de software voor het vastleggen 12-bit grijswaarden beelden elke 1 sec, als een 2-min (120 kader) film. Om de grootte van de output bestand te verminderen, met behoud van voldoende beeldresolutie, gebruik dan een 2x2 binning mode tot 1024x1024 pixel beelden vast te leggen. </li><li> Noteer de films. Beginnen met het opnemen van een 120-kader filmpje van de eerste plaat (0 mm ethanol) 10 min na de laatste wormen werden op die plaat geplaatst. Sla het filmbestand. </li><li> Noteer de tweede plaat (400 mm ethanol). Herhaal dit proces voorbeide platen beginnend 30 minuten na de laatste wormen werden geplaatst op de eerste plaat (0 mM ethanol) om de 30-32 min tijdstippen voor elke opname vangen. OPMERKING: Zorg voor voldoende tijd om de beeldbestanden op te slaan na elke opnamesessie voor het begin van de opname van de volgende plaat te analyseren. </li><li> Voor toekomstbestendigheid van gearchiveerde films en om deze films te worden geopend en door andere publieke domein open source imaging software programma&#39;s, zoals ImageJ 28 geanalyseerd, zetten een kopie van elke film tot 8-bit 256 grijswaarden TIFF-bestanden. OPMERKING: De software voor beeldanalyse hier beschreven maakt gebruik van een eigen bestandsindeling. </li></ol></li><li> Analyse van films met behulp ImagePro software. <ol><li> Eenmaal gevangen, het analyseren van de films met behulp van Image-Pro Plus software of het equivalent daarvan. OPMERKING: Een verscheidenheid van andere object tracking software beschikbaar is die is gebruikt om succesvol volgen meerdere C. elegans in een keer 29 en dergelijkesoftware redelijkerwijs kon de plaats van die hier beschreven als de object identificatie stappen zijn gebaseerd op dezelfde principes. De beschreven methode heeft betrekking op Image-Pro Plus softwareversies 6,0-6,3 en 7,0, nieuwere versies van Image-Pro Plus software kunnen kleine verschillen hebben. </li><li> Analyseer films in 2-min (120 kader) segmenten. Breng eerst een filter om de beelden naar de achtergrond plat en het contrast vergroten van de worm objecten. Selecteer het filter als volgt: Menu&gt; Proces&gt; Filters&gt; Toebehoren&gt; Eén: Parameters: Achtergrond = Dark; Feature Breedte = 20 Pix. </li><li> Re-sla de films na de filtering stap, maar altijd aan de originele film in de ongefilterde vorm. <ol><li> Analyseer de voortbeweging van dieren in elke ring afzonderlijk een cirkelvormig gebied van belang (ROI) die geplaatst en bemeten om overlapping met de koperen ring. Identificeren en volgen de wormen met de Menu&gt; Meten&gt; Track Objects ... commando; Dit brengt voor de tracking-Data Tabel venster. De knop Tracking Opties kunt specifieke nummers uit te sluiten en om eventuele experimentele artefacten te beperken. </li></ol></li><li> Onder het tabblad Auto Tracking, gebruikt u de volgende parameters: Track Parameters: Velocity limiet (zoekradius) = 400 pm / frame, Versnelling limiet = Auto, Minimale totale spoor lengte = 400 pm, Overheersend soort beweging = chaotisch; Objecten in tracks parameters: Sta gedeeltelijke tracks = ja, Min lengte = 21 frames, Tracking voorspelling diepte = 1 frame. </li><li> Om het volgen proces te starten, klikt u op het zoeken Alle nummers automatisch functioneren knop aan de graaf / Size opties dialoogvenster en het Volgen dialoogvenster te openen. Selecteer de handmatige optie voor de Intensity Range Selectie in het dialoogvenster Graaf / Maat doos, die de belangrijke drempel stap die de grijs-schaal intensiteit van de worm pixels gebruikt om een ​​worm object voor analyse te benadrukken en om te negeren de lichtere achtergrond pixels biedt. <ol><li> Pas de intensiteit drempel sliders (een tot de bovengrens te stellen, een om de ondergrens te stellen) om een ​​inclusieve reeks die alle donkere objecten hoogtepunten te creëren. Een reeks van 0-1,500 op een schaal van 0-4,095 is een goed uitgangspunt voor veel fijner afstellen. </li><li> Breng een maat filter om objecten die groter en kleiner dan een worm voorwerp zoals de koperen ring eventueel vuil op de platen te sluiten. Stel twee grootte parameters aan toe dat maten voor individuele wormen te dekken in een verscheidenheid van houdingen met de Measure doen&gt; Selecteer Metingen menu-item in het dialoogvenster Graaf / Size opties doos. (Ruimte range: 28,000-120,000 um 2 en Perimeter range: 600-2,500 pm). </li><li> Als een mutante stam significant kleiner of groter dan andere dieren op de plaat te analyseren, verbreden het bereik van de filter instellingen voor objectherkenning de verschillende afmetingen van de stammen geschikt voordat dierenvolgsystemen zodat instellingen niet te worden gewijzigd mid-analyse. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Voltooi het volgen proces door op Doorgaan in het dialoogvenster Volgen klikken. Visueel vergelijken de uitgang tracks met de voortgang van elke worm in de film om ervoor te zorgen dat elke worm is vertegenwoordigd, tenzij er een geldige reden om het uit te sluiten op basis van de automatische filter instellingen. Tracks die werden geproduceerd door de aanwezigheid van niet-bevestigde worm objecten die de omvang filter criteria voldaan handmatig verwijderen. </li><li> Gebruik de software om de snelheid van elke worm tussen elk frame te berekenen (afgelegde afstand voor het zwaartepunt van een object per 1 sec tussen frames) en toont de gemiddelde snelheid voor elk spoor en de gemiddelde snelheid over alle tracks voor de bevolking van wormen in de koperen ring. Beschouw dit laatste gemiddelde tot n = 1 zijn in termen van experimentele studies. De gegevens te exporteren naar een spreadsheet programma voor statistische analyses en data-archivering. </li><li> Zodra de gegevens zijn opgenomen voor de eerste ring op de plaat, verplaats de ROI naar de volgende ring enherhaal het volgen proces, zonder dat een van de parameters. </li><li> Bereken relatieve snelheid van voortbeweging door: </li><li> Relatieve snelheid (%) = behandeld (400 mm) snelheid / onbehandeld (0 mm) snelheid x 100. OPMERKING: Verschillende genetische manipulaties veranderen vaak het basale motoriek tarief van dieren. Om het effect van ethanol op de voortbeweging snelheid dieren vast en kunnen deze effecten in verschillende genotypen of voorwaarden vergelijken, berekenen relatieve snelheid. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Prescott, C. A., Kendler, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+environmental+contributions+to+alcohol+abuse+and+dependence+in+a+population-based+sample+of+male+twins%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins.</a> Am. J. Psychiatry. 156, 34-40 (1999).</li>
<li>Schuckit, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+the+risk+for+alcoholism%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Addict.+Article+Review%22%5BJournal%5D)">Genetics of the risk for alcoholism.</a> Am. J. Addict. Article Review. 9, 103-112 (2000).</li>
<li>Heath, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+differences+in+alcohol+sensitivity+and+the+inheritance+of+alcoholism+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol.+Med%22%5BJournal%5D)">Genetic differences in alcohol sensitivity and the inheritance of alcoholism risk.</a> Psychol. Med. 29, 1069-1081 (1999).</li>
<li>Rodriguez, L. A., Wilson, J. R., Nagoshi, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+psychomotor+sensitivity+to+alcohol+predict+subsequent+alcohol+use%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol.+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Does psychomotor sensitivity to alcohol predict subsequent alcohol use.</a> Alcohol. Clin. Exp. Res. 17, 155-161 (1993).</li>
<li>Schuckit, M. A., Smith, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+8-year+follow-up+of+450+sons+of+alcoholic+and+control+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Gen.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects.</a> Arch. Gen. Psychiatry. 53, 202-210 (1996).</li>
<li>Kalu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritability+of+level+of+response+and+association+with+recent+drinking+history+in+nonalcohol-dependent+drinkers%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol.+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Heritability of level of response and association with recent drinking history in nonalcohol-dependent drinkers.</a> Alcohol. Clin. Exp. Res. 36, 522-529 (2012).</li>
<li>Davis, S. J., Scott, L. L., Hu, K., Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+single+residue+in+the+BK+potassium+channel+required+for+activation+by+alcohol+and+intoxication+in%5BTitle%5D)+AND+%22C.+elegans.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Conserved single residue in the BK potassium channel required for activation by alcohol and intoxication in.</a> C. elegans. J. Neurosci. 34, 9562-9573 (2014).</li>
<li>Raabe, R. C., Mathies, L. D., Davies, A. G., Bettinger, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Omega-3+Fatty+Acid+Eicosapentaenoic+Acid+Is+Required+for+Normal+Alcohol+Response+Behaviors+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The Omega-3 Fatty Acid Eicosapentaenoic Acid Is Required for Normal Alcohol Response Behaviors in C. elegans.</a> PLoS ONE. 9, e105999(2014).</li>
<li>Topper, S. M., Aguilar, S. C., Topper, V. Y., Elbel, E., Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+disinhibition+of+behaviors+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Alcohol disinhibition of behaviors in C. elegans.</a> PLoS ONE. 9, e92965(2014).</li>
<li>Bhandari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+intracellular+channels+modulate+acute+ethanol+behaviors+Drosophila%2CCaenorhabditis+elegans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+Behav%22%5BJournal%5D)">Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors Drosophila,Caenorhabditis elegans and mice.</a> Genes Brain Behav. 11, 387-397 (2012).</li>
<li>Davies, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+central+role+of+the+BK+potassium+channel+in+behavioral+responses+to+ethanol+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A central role of the BK potassium channel in behavioral responses to ethanol in C. elegans.</a> Cell. 115, 655-666 (2003).</li>
<li>Davies, A. G., Bettinger, J. C., Thiele, T. R., Judy, M. E., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+variation+in+the+npr-1+gene+modifies+ethanol+responses+of+wild+strains+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Natural variation in the npr-1 gene modifies ethanol responses of wild strains of C. elegans.</a> Neuron. 42, 731-743 (2004).</li>
<li>Kapfhamer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+RAB-3%2FA+in+Caenorhabditis+elegans+and+the+mouse+affects+behavioral+response+to+ethanol%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+Behav%22%5BJournal%5D)">Loss of RAB-3/A in Caenorhabditis elegans and the mouse affects behavioral response to ethanol.</a> Genes Brain Behav. 7, 669-676 (2008).</li>
<li>Speca, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+role+of+unc-79+in+ethanol+responses+in+lightweight+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Conserved role of unc-79 in ethanol responses in lightweight mutant mice.</a> PLoS Genet. 6, e1001057(2010).</li>
<li>Thiele, T. E., Badia-Elder, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+neuropeptide+Y+in+alcohol+intake+control%3A+evidence+from+human+and+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">A role for neuropeptide Y in alcohol intake control: evidence from human and animal research.</a> Physiol. Behav. 79, 95-101 (2003).</li>
<li>Treistman, S. N., Martin, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BK+Channels%3A+mediators+and+models+for+alcohol+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">BK Channels: mediators and models for alcohol tolerance.</a> Trends Neurosci. 32, 629-637 (2009).</li>
<li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+GWASs+and+human+protein+interaction+networks+identifies+a+gene+subnetwork+underlying+alcohol+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence.</a> Am. J. Hum. Genet. 93, 1027-1034 (2013).</li>
<li>Kendler, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomewide+association+analysis+of+symptoms+of+alcohol+dependence+in+the+molecular+genetics+of+schizophrenia+%28MGS2%29+control+sample%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol.+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Genomewide association analysis of symptoms of alcohol dependence in the molecular genetics of schizophrenia (MGS2) control sample.</a> Alcohol. Clin. Exp. Res. 35, 963-975 (2011).</li>
<li>Schuckit, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autosomal+linkage+analysis+for+the+level+of+response+to+alcohol%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol.+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Autosomal linkage analysis for the level of response to alcohol.</a> Alcohol. Clin. Exp. Res. 29, 1976-1982 (2005).</li>
<li>Alaimo, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+metabolism+and+osmolarity+modify+behavioral+responses+to+ethanol+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol.+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Ethanol metabolism and osmolarity modify behavioral responses to ethanol in C. elegans.</a> Alcohol. Clin. Exp. Res. 36, 1840-1850 (2012).</li>
<li>Morgan, P. G., Sedensky, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+sensitivity+to+ethanol+in+the+nematode%2C+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol.+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting sensitivity to ethanol in the nematode, Caenorhabditis elegans.</a> Alcohol. Clin. Exp. Res. 19, 1423-1429 (1995).</li>
<li>Mitchell, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+concentration-dependent+effects+of+ethanol+on+Caenorhabditis+elegans+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics+J%22%5BJournal%5D)">The concentration-dependent effects of ethanol on Caenorhabditis elegans behaviour.</a> Pharmacogenomics J. 7, 411-417 (2007).</li>
<li>Vidal-Gadea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+selects+distinct+crawling+and+swimming+gaits+via+dopamine+and+serotonin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans selects distinct crawling and swimming gaits via dopamine and serotonin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, 17504-17509 (2011).</li>
<li>Bettinger, J. C., Leung, K., Bolling, M. H., Goldsmith, A. D., Davies, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+environment+modulates+the+development+of+acute+tolerance+to+ethanol+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Lipid environment modulates the development of acute tolerance to ethanol in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. 7, e35129(2012).</li>
<li>Davies, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+genes+influence+toluene-+and+ethanol-induced+locomotor+impairment+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Alcohol+Depend%22%5BJournal%5D)">Different genes influence toluene- and ethanol-induced locomotor impairment in C. elegans.</a> Drug Alcohol Depend. 122, 47-54 (2012).</li>
<li>Newlin, D., Thomson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+challenge+with+sons+of+alcoholics%3A+a+critical+review+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Alcohol challenge with sons of alcoholics: a critical review and analysis.</a> Psychol. Bull. 108, 383-402 (1990).</li>
<li>Ponomarev, I., Crabbe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+assess+initial+sensitivity+and+acute+functional+tolerance+to+hypnotic+effects+of+ethanol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">A novel method to assess initial sensitivity and acute functional tolerance to hypnotic effects of ethanol.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 257-263 (2002).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHusson%2C+SJ+%22WormBook%22">WormBook</a>. , The C. elegans Research Community. (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De eenvoudige neurobiologie en genetische hulpmiddelen die beschikbaar zijn in C. elegans maken de worm een uitstekend model om de moleculaire basis van de effecten van ethanol op gedrag te bestuderen. Hier beschrijven we een test die is gebruikt om verschillende moleculaire en milieu mediatoren van acute gedragsreactie tot ethanol 8,10,20,24,25 identificeren. Deze methode maakt de differentiatie en gelijktijdig onderzoek van twee verschillende ethanol responsgedrag fenotypes, aanvankelijk gevoelighe...

Stoornissen in alcoholgebruik (AUD) zijn wijdverbreid en veroorzaken ernstige gezondheids-, sociale en economische problemen. Bij mensen wordt de vatbaarheid om een AUD te ontwikkelen sterk beïnvloed door zowel genetica als de omgeving1,2. Een sterke fysiologische voorspeller van misbruiksgevoeligheid is het initiële responsniveau (LR) op alcohol (ethanol) dat wordt getoond door naïeve drinkers3-5. Dit LR-fenotype wordt beïnvloed door genetica en niet-genetische componenten6. Het bepalen van de moleculaire mechanismen die de LR naar ethanol beïnvloeden, is een belangrijk doel van de studie naar ethanolresponsgedrag.
De rondworm, Caenorhabditis elegans, wordt steeds vaker gebruikt als model voor het bestuderen van de effecten van ethanol op gedrag7-9. Er is sterke moleculaire conservering in de werking van het zenuwstelsel tussen wormen en zoogdieren, en verschillende genen waarvan is aangetoond dat ze de LR naar ethanol bij wormen beïnvloeden, hebben ook invloed op de LR naar ethanol bij zoogdieren10-16, en zijn betrokken bij misbruiksgevoeligheid bij mensen17-19.
Ethanol beïnvloedt wormen, wat tot uiting komt in een afname van hun bewegingssnelheid. Verschillende laboratoria hebben gedragstests ontwikkeld die op verschillende manieren van elkaar verschillen, bijvoorbeeld in het onderzochte bewegingsgedrag (kruipen versus zwemmen11,12,14,20,21) of in de samenstelling van de oplossingen waarin de tests worden uitgevoerd (nematode groeimedium versus Dent's zoutoplossing20,22). Interessant genoeg hebben deze uiteenlopende tests iets verschillende dosisresponsprofielen opgeleverd voor de effecten van ethanol. Deze resultaten hebben gewezen op belangrijke verschillen in de onderliggende gedragingen van kruipen en zwemmen9,23, evenals op een rol voor de omgevingsvariabele osmolariteit in ethanolreacties20, en hebben de belangrijkheid benadrukt van het beschrijven van experimentele details van de verschillende tests.
Een test om de acute effecten van ethanol op het kruipgedrag te meten wordt hier gepresenteerd. Deze test is uitgebreid gebruikt om de genetische en omgevingsinvloeden op de LR naar ethanol te bestuderen8,10,20,24,25. Het zoogdier LR-fenotype is een samenstelling van ten minste twee componenten, initiële gevoeligheid voor ethanol en acute functionele tolerantie voor ethanol26,27. Bij wormen is aangetoond dat het LR-fenotype scheidbaar is in deze twee componenten door gebruik te maken van deze gedragstest. De invloeden van genetische en omgevingsmanipulaties op beide fenotypes kunnen worden onderzocht met behulp van deze enkele test. Belangrijk is dat deze twee fenotypes genetisch scheidbaar zijn.

<table><tbody><tr><td>C. elegans stammen</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 x 15 mm Petri-schotels, drievoudig geventileerd</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628161</td><td>Andere merken platen zijn voldoende.</td></tr><tr><td>NGM-agar</td><td>Verschillende</td><td></td><td>NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), pepton (2,5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O</td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Verschillende</td><td></td><td>bijv., Fisher Scientific #10300</td></tr><tr><td>37 &deg;C Incubator</td><td>Verschillende</td><td></td><td>Voor het drogen van agar</td></tr><tr><td>Digitale balans</td><td>Verschillende</td><td></td><td>Voor het bepalen van plaatgewichten en agarvolume</td></tr><tr><td>Koperen ringen</td><td>Plumbmaster</td><td>STK#35583 (48 cap draad gasket)</td><td>1,6 cm binnendiameter, 1,8 cm buitendiameter koperringen</td></tr><tr><td>100% ethanol</td><td>Verschillende</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>CCD-camera</td><td>QImaging</td><td>RET-4000R-F-M-12</td><td>Deze camera heeft een groot gezichtsveld.</td></tr><tr><td>Stereomicroscoop met C-mount en 0,5X objectief</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>Uit productie genomen model, M60 is het huidige equivalent.</td></tr><tr><td>Lichtbron</td><td>Schott</td><td>A08923</td><td>3&rdquo;x3&rdquo;&nbsp; achtergrondverlichting voor een gelijkmatige verlichting over het gezichtsveld</td></tr><tr><td>Beeldvormings- en trackingsoftware</td><td>Media Cybernetics</td><td>ImagePro-Plus v6.0-6.3</td><td>Nieuwere versies van de software hebben trackingfuncties.</td></tr></tbody></table>

een test voor het meten van de effecten van ethanol de voortbeweging snelheid<em&gt; caenorhabditis elegans</em

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcoholgebruiksstoornissen zijn een belangrijke publieke gezondheidsproblematiek, waarvoor er weinig effectieve behandelingsstrategieën zijn. Een moeilijkheid die de ontwikkeling van effectievere behandelingen heeft vertraagd, is het relatieve gebrek aan begrip van de moleculaire grondslagen van de effecten van ethanol op het gedrag. De rondworm, Caenorhabditis elegans (C. elegans), biedt een nuttig model om hypothesen te genereren en te testen over de moleculaire effecten van ethanol. Hier beschrijven we een test die is ontwikkeld en gebruikt om de rollen van bepaalde genen en omgevingsfactoren in gedragsreacties op ethanol te onderzoeken, waarbij voortbeweging het gedragsuiterlijk is. Ethanol veroorzaakt dosisafhankelijk een acute depressie van het kruipen op een agaroppervlak. De effecten zijn dynamisch; dieren die aan een hoge concentratie worden blootgesteld, vertonen een initiële sterke depressie van het kruipen, hier verwezen als initiële gevoeligheid, en herstellen vervolgens gedeeltelijk de voortbewegingssnelheid ondanks de aanhoudende aanwezigheid van het medicijn. Deze door ethanol geïnduceerde gedragsplasticiteit wordt hier de ontwikkeling van acute functionele tolerantie genoemd. Deze test is gebruikt om aan te tonen dat deze twee fenotypes onderling verschillend en genetisch te scheiden zijn. De eenvoudige voortbewegingstest die hier wordt beschreven, is geschikt voor het onderzoeken van de effecten van zowel genetische als omgevingsmanipulaties op deze acute gedragsreacties op ethanol in C. elegans.

Representatieve gegevens (figuur 1) van verschillende genotypen en hun gepaarde controles worden gepresenteerd 8,24; gegevens werden specifiek gekozen die highlight verschillen in de geteste dieren. De mate van het effect bij 10 minuten blootstelling wordt beschouwd als de oorspronkelijke gevoeligheid van een stam, die wordt weergegeven aan de linkerkant assen in Figuur 1B-G. Mutante stammen met een relatieve snelheid groter dan de controle 10 min worden geacht resistent etha...

C. elegans is een nuttig model voor het bestuderen van de effecten van ethanol op het gedrag. We presenteren een gedragstest die de effecten van ethanol op de bewegingssnelheid van kruipende wormen kwantificeert; zowel de initiële gevoeligheid als de ontwikkeling van acute functionele tolerantie voor ethanol kunnen met deze test worden gemeten.

Een test voor het meten van de effecten van ethanol de voortbeweging Snelheid<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Het algemene doel van deze procedure is om het effect van alcohol op CL-organen van verschillende genotypen op een consistente manier te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst een agarplaat te maken die alcohol bevat met koperen ringen ingebed in het oppervlak om de dieren te leiden. Vervolgens worden de verschillende genotypen afzonderlijk geleid en blootgesteld aan alcohol. Tijdens de blootstelling wordt videogegevens verzameld op vaste tijdstippen.De laatste stap is het meten van de snelheid van elk genotype met behulp van objectherkenningssoftware. Uiteindelijk wordt een vergelijking van snelheden op vroege en late tijdstippen gebruikt om abnormale gevoeligheid of tolerantieontwikkeling voor alcohol te onthullen. De specifieke genotypen.Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, die genotypen op verschillende platen vergelijken, is dat de omgevingsvariatie wordt verminderd. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben met het oppakken van wormen met een blote pick. Op de dag vóór de test. Neem L vierfasewormen op verse NGM-platen Geplaatst met een dekking van OP 50 E coli-kweek, de platen bij 20 graden Celsius door de nacht, de test vereist standaard ongezeten 60 bij 15 millimeter.NGM-platen drogen alle platen die moeten worden gebruikt bij 37 graden Celsius gedurende twee uur met hun deksels open. Elke proef vereist vier platen. Het gebruik van NGM-platen is hier belangrijk.Verschillen in de samenstelling van de platen. Met name hun osmolariteit kan de dosisresponsieve ethanol op gedrag sterk beïnvloeden. Dit is ten minste gedeeltelijk te wijten aan veranderingen in de hoeveelheid ethanol die door de dieren is opgehoopt. Eenmaal gedroogd, weeg elk van de ongezeten NGM-platen.Gebruik dit gewicht om het volume media op elke plaat te bepalen, ervan uitgaande dat het media evenveel weegt als water. Plan vervolgens om vier koperen ringen met een binnendiameter van 1,6 centimeter in elke plaat te smelten, zodat ze tegelijkertijd door de camera kunnen worden bekeken. Met behulp van een pincet.Eet elke ring in een vlam gedurende ongeveer drie seconden en leg de ring onmiddellijk op de plaat zonder hem te laten vallen. Druk vervolgens voorzichtig op een paar plaatsen om hem langs de rand te bevestigen. Label de platen met de stam die in elke ring zal zijn.Bereken nu de hoeveelheid 100% ethanol die nodig is om een 400 millimolair gewicht per volumeconcentratie op de plaat te krijgen. Laad vervolgens de helft van de platen met ethanol door de ethanol uit een pipetten te druppelen. Laat alle voorbereide platen twee uur gelijkwaardig worden voordat u met het experiment begint.Om te beginnen, neem twee minuten of minder om 10 wormen van elke experimentele groep over te brengen naar het midden van een koperen ring op een acclimatisatieplaat. Dit is een plaat zonder ethanol. Vermijd het overbrengen van voedsel met de wormen, omdat dit hun beweging zal verminderen.Vermijd ook het beschadigen van het agaroppervlak omdat de wormen zullen graven. Noteer de tijd van het laden op de plaat en zorg ervoor dat de overdracht van wormen naar elke plaat met meer dan twee minuten wordt gespreid, zodat elke plaat individueel kan worden gefilmd op het juiste tijdsinterval. Laat elke acclimatisatieplaat 30 minuten op kamertemperatuur incuberen.Breng vervolgens de wormen over naar de testplaat volgens de volgorde die is gebruikt om de wormen op de acclimatisatieplaat te plaatsen, met behulp van een dunne rand met een afgeplatte worm. Kies zonder bacteriën. Verzamel de wormen bovenop de afgeplatte pick.Gebruik een schepbeweging en verzegel vervolgens de platen met laboratoriumfolie om verlies van ethanol door verdamping te minimaliseren. De snelheid waarmee de dieren worden overgebracht in deze stap is erg belangrijk, omdat de overdracht naar dieren langer aan ethanol zal worden blootgesteld, dus het is een goed idee om te roteren welke stammen op de plaat worden geplaatst. Eerst over experimentele replica's.Een microscoop met hoge resolutie videocamera is vereist om de wormen te filmen. Nu, zelfs gelijkmatige verlichting, zoals van een drie inch vierkante teruglicht is essentieel voor de analyse. Bereid vervolgens de beeldanalysesoftware voor om 120 op te vangen.Frame 12 bit grijstinten tijd-lapse films in één frame per seconde. Om de grootte van het uitvoerbestand te verkleinen terwijl nog voldoende beeldresolutie wordt behouden, gebruik een twee bij twee buigingsmodus. Neem nu twee minuutfilmpjes op van elke plaat.10 minuten nadat de laatste wormen op die plaat zijn geplaatst. Maak vervolgens een tweede opname van twee minuten. 30 minuten nadat de wormen op de plaat zijn geplaatst voor dit demonstratiebeeld.Pro plus-software wordt gebruikt, maar een breed scala aan andere software kan worden aangepast aan de techniek. Analyseer de films als tweedelige segmenten. Pas eerst een filter toe op de afbeeldingen die de achtergrond plat maakt en de contrast van de wormobjecten verbetert.Onder het menu selecteer proces. Vervolgens filters, dan verbetering, en dan vlakke. Stel de parameter in voor een donkere achtergrond en een 20 picks kenmerkende breedte.Analyseer nu de voortbeweging van de dieren in elke ring afzonderlijk met een circulair interessegebied dat de koperen ring overlapt. Identificeer en volg de wormen met de opdrachten track objecten onder het meetsub-menu. In het venster met de trackinggegevenstabel, gebruik de knop trackingopties om specifieke tracks uit te sluiten en om eventuele experimentele artefacten te beperken.Onder het tabblad automatisch volgen, stel de volgparameters in op een snelheidslimiet van 400 micrometer per frame. Stel de versnellingslimiet in op automatisch, stel de minimale totale tracklengte in op 400 micrometer en stel het overheersende bewegingstype in op chaotisch. Stel vervolgens onder de volgparameter de objecten in om toe te staan dat gedeeltelijke tracks een minimale lengte van 21 frames hebben en een trackingvoorspellingsdiepte van één frame hebben.Klik nu om het volgproces te initiëren, eerst op de knop voor de functie alle tracks automatisch vinden. Dit brengt het dialoogvenster

an-assay-for-measuring-effects-ethanol-on-locomotion-speed

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een eenvoudige test om de sederende effecten van ethanol te meten...

Een eenvoudige manier om Ethanol Gevoeligheid meten in Flies

C. elegans eierleggedrag kan belangrijke informatie bieden in ontwikkelings-, reproductieve en anatomische studies.  Deze video introduceert de belangrijke stappen van een eierlegtest en toont een monsterexperiment waarbij een medicijn wordt getest op reproductietoxiciteit.

Egg Laying Assay: Een methode om het eierleggedrag van C. elegans te kwantificeren

Onderzoekers kunnen on-demand beweging in C. elegans activeren door een elektrisch veld toe te passen dat wormen voelen en erop reageren.  Deze video introduceert elektrotactisch gedrag en toont een voorbeeldprotocol dat wordt uitgevoerd in een microfluïdisch apparaat.

Electrotaxis Assay: een methode om voortbeweging te observeren in C. elegans

Deze video beschrijft het gebruik van video- en trackingsoftware om wormbewegingen in een arena op te nemen.  Het voorbeeldprotocol meet het effect van blootstelling aan ethanol op de voortbeweging van wormen.

C. elegans Bewegingstracking: een methode om voortbeweging in wormen te beoordelen

Werkwijze voor het kwantitatief beoordelen van de chemotactische respons...

C. elegans Chemotaxis Assay

Een semi-automatische micro-electro-fluidisch methode om on-demand motoriek induceren...

Microfluïdische-based Electrotaxis voor On-demand Kwantitatieve analyse van<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

Een ei-in-worm (EIW) test is een handige methode om eierleggende gedrag te kwantificeren. Veranderingen in eileg kan een gedragsmatige reactie van het modelorganisme...

Het meten van de effecten van bacteriën op<em&gt; C. Elegans</em&gt; Gedrag Met behulp van een Ei Retention Assay

Eenvoudige tests voor het meten van ethanolgevoeligheid en snelle tolerantie bij Drosophila vergemakkelijken het gebruik van dit modelorganisme voor het onderzoeken van deze belangrijke ethanol-gerelateerde gedragingen. Hier wordt een relatief eenvoudige, schaalbare test beschreven voor het meten van ethanolgevoeligheid en snelle tolerantie bij vliegen.

Een goedkope, Scalable Behavioral Test voor het meten Ethanol Sedatie Gevoeligheid en Rapid Tolerantie in<em&gt; Drosophila</em

De huidige methoden om de alcoholgevoeligheid in Drosophila te meten zijn ontworpen om groepen vliegen te testen. We presenteren een eenvoudige, goedkope, hoge doorvoer test voor de beoordeling van alcohol sedatie gevoeligheid in grote aantallen enkele vliegen. De methode vereist geen gespecialiseerde gereedschappen en kan worden uitgevoerd in elk laboratorium met behulp van gemeenschappelijke materialen.

High-Throughput Methode voor het meten van alcohol sedatie tijd van individuele Drosophila melanogaster

Deze studie presenteert protocollen voor twee semi-geautomatiseerde locomotorische activiteitsanalysebenaderingen in C. elegans complex I ziekte gas-1(fc21) wormen, namelijk ZebraLab (een medium-throughput assay) en WormScan (een high-throughput assay) en biedt vergelijkende analyse tussen een breed scala aan onderzoeksmethoden om het gedrag van nematoden en de geïntegreerde neuromusculaire functie te kwantificeren.

Vergelijkende analyse van experimentele methoden om dierlijke activiteit in Caenorhabditis elegans-modellen van mitochondriale ziekte te kwantificeren

Het huidige protocol beschrijft een test om de respons op levamisol te bepalen, een farmacologische agonist van één klasse caenorhabditis elegans acetylcholinereceptoren. In deze vloeibare levamisol-zwemtest observeren en kwantificeren onderzoekers visueel de tijdsafhankelijke verlamming van dieren die in 24-well-platen worden gekweekt.

Het meten van Caenorhabditis elegans Gevoeligheid voor de Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Leer een gedragsassay om de effecten van ethanol op de voortbewegingssnelheid van Caenorhabditis elegans te meten. Deze methode kwantificeert gevoeligheid en tolerantieontwikkeling voor alcohol.

Een test voor het meten van de effecten van ethanol de voortbeweging Snelheid

Meer video's verkennen