Geautomatiseerde Gel Size Selectie om de kwaliteit van next-generation sequencing bibliotheken Bereid uit Environmental watermonsters Verbeteren

Deze video demonstreert het gebruik van een geautomatiseerd instrument voor gel-grootteselectie om verbeterde reads te verkrijgen in next generation sequencing-platformen. Eerst worden watermonsters uit het milieu verzameld en door een reeks filters geleid om eukaryote, bacteriële en virale partikels systematisch te scheiden. De vastgehouden bacteriën worden vervolgens verder geconcentreerd door middel van centrifugatie.

Vervolgens wordt het bacteriële DNA geëxtraheerd. Het geëxtraheerde DNA wordt gebruikt voor het maken van bibliotheken waarin adapters en indexen in het gefragmenteerde DNA worden geïncorporeerd. Het DNA wordt daarna via PCR geamplificeerd, waarna de monsters in het elektroforese-werkstation worden geladen.

DNA-fragmenten binnen een specifiek bereik worden vervolgens automatisch geselecteerd. Analyse van sporen uit chip-gebaseerde capillaire elektroforese en aanvullende bio-informatica tonen aan dat deze methode geschikte hoeveelheden DNA-fragmenten oplevert voor downstream-analyse, met minimale clustering van ongewenste fragmenten onder de 200 base pairs. Het belangrijkste voordeel van het geautomatiseerde Electrophoresis square station of paramagnetische beads en andere commerciële systemen is dat het een nauwer selectiebereik mogelijk maakt, waarbij tot 96 monsters in één run kunnen worden verwerkt.

Hoewel deze methode inzicht kan bieden in microbiële gemeenschappen in zoetwatermonsters, kan deze worden toegepast op andere systemen zoals zeewater, afvalwaterzuivering, plantmonsters, sedimentbodem of microbiële matten; in essentie elk DNA-monster waarvoor we een nauwe selectie van groottes wensen. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we korte fragmenten zagen in sequenties van het MySEQ-platform. We hebben verschillende benaderingen voor grootte-selectie geprobeerd, waaronder verschillende typen para-beads en ratio's, evenals een handmatige methode voor grootte-selectie via gel.

Vervolgens zijn we gaan samenwerken met Coastal Genomics, een particuliere onderneming uit British Columbia die de Ranger-technologie aanbiedt voor het demonstreren van de procedure. Vandaag zijn aanwezig Michael Chan, research technician uit mijn laboratorium, Miguel Yi, postdoctoral fellow uit mijn laboratorium, en Jared Sloan, een engineer van Coastal Genomics. In deze video beschrijven we uitsluitend de zuivering en analyse van het materiaal dat op de 0,2 micron filters is teruggewonnen, primair vrijlevende bacteriën, maar houd er rekening mee dat soortgelijke benaderingen kunnen worden gebruikt voor de andere deeltjes die van de filters zijn teruggewonnen.

Begin deze procedure door 40 liter zoetwatermonsters te verzamelen van verschillende omgevingslocaties in gesaneerde carboys van 20 liter. Prefiltreer de monsters in situ met een polypropylene spectrum mesh filter van 105 micrometer. In dit geval worden de monsters verzameld uit stroomgebieden met stedelijke en landbouwkundige invloeden.

Plaats de monsters na afname in koelboxen en transporteer ze terug naar het laboratorium. Bewaar de monsters bij vier graden Celsius. De volgende dag.

Stel een filtratiesysteem samen dat bestaat uit een carboy voor monsterneming, die via een peristaltische pomp is verbonden met een EnviroCheck één micron bemonsteringscapsule. Verbind de bemonsteringscapsule met een 0,2 micron schijffilter en verbind dit via een tweede peristaltische pomp met een 30 kilodalton tangential flow filter. Zet de peristaltische pompen aan om de monsters door een reeks filters te leiden; de eukaryote cellen worden geïsoleerd wanneer ze door de bemonsteringscapsule passeren.

De bacteriële fractie wordt geïsoleerd op het membraanschijffilter en de virusdeeltjes worden geïsoleerd op het tangential flow-filter. Verwijder het 0,2 micrometer membraanfilter of de filters uit het waterfiltratiesysteem. Vouw het filter vervolgens dubbel en plaats het in een buis van 50 milliliter.

Met de open zijde naar boven. Voeg vijf milliliter PBS met tween toe aan de buis. Als er tijdens de filtratie meer dan één filter is gebruikt, gebruik dan voor elk filter een aparte buis.

De filters kunnen vervolgens worden bewaard bij 4 °C of direct als volgt worden verwerkt. Verwijder daarna met een steriele pincet het membraanfilter uit de buis van 50 ml en plaats dit met een steriele pincet en een steriele schaar op een Petrischaal. Knip het filter tussen de monsters door in stukjes van 1 cm bij 1 cm.

Desinfecteer de instrumenten door ze te weken in 70% isopropanol, af te nemen met een DNA-oppervlakte-decontaminatiemiddel en vervolgens te spoelen met ultrapuur water type 1. Plaats de filterstukken terug in dezelfde buis van 50 milliliter. Voeg met een steriele pincet 10 milliliter PBS met tween toe om het totale buffervolume op 15 milliliter te brengen.

Voeg zes schone wolfraamkraaltjes met een diameter van 3 mm toe aan elke buis van 50 ml. Sluit de buis af met parafilm en vortex deze krachtig gedurende 20 minuten.

Voeg na het vortexen alle suspensies voor elk monster samen in één schone buis van 50 milliliter. Centrifugeer de buizen 15 minuten bij 3.300 ×g bij vier graden Celsius. Verwijder na het centrifugeren het supernatant en resuspendeer het pellet.

Verdeel de bacteriële cellen in vijf milliliter PBS-oplossing in aliquots van één milliliter in 1,7 milliliter microcentrifugebuisjes en centrifugeer deze in een microcentrifuge bij 10,000 ×g gedurende 10 minuten. Verwijder na het centrifugeren met een pipet al het supernatant, behalve 200 µL. Bewaar de monsters bij -80 °C of ga verder met het extraheren van bacterieel DNA met behulp van een commercieel verkrijgbare DNA-isolatiekit.

Gebruik bij de extractie van bacterieel DNA ofwel PBS of water als negatieve extractiecontrole en E. coli als positieve extractiecontrole. Voeg na de DNA-extractieprocedure de aliquoten van hetzelfde monster samen in één buis van 2 ml met 10 mM Tris-buffer. Voer vervolgens een precipitatie overnacht uit door een oplossing toe te voegen bestaande uit 10% 3 M natriumacetaat, twee volumes 100% ethanol en 5 µL lineair acrylamide. Bewaar de monsters bij -80 °C.

Centrifuge de monsters de volgende dag gedurende 30 minuten bij 17.000 GS bij vier graden Celsius. Was na het centrifugeren het pellet met één milliliter ijskoud 70% ethanol en laat het pellet maximaal vijf minuten aan de lucht drogen in een veiligheidskast.

Resuspendeer vervolgens het DNA-pellet in 10 millimolar tris-CL. Bepaal tot slot de DNA-kwantiteit en -kwaliteit door een fluorescentie-assay voor nucleïnezuren met hoge gevoeligheid uit te voeren, gevolgd door microvolumespectrometrie. Voeg, na het bepalen van de DNA-hoeveelheid in elk monster, de juiste hoeveelheid water aan elke buis toe om de concentratie op ongeveer 0,2 nanogram per microliter te brengen.

Bereid met behulp van een commercieel verkrijgbare kit een DNA-bibliotheek voor van geïndexeerde fragmenten uit één nanogram bacterieel DNA. Hierbij wordt een methode op basis van transposase, bekend als mentatie, toegepast om het DNA gelijktijdig te fragmenteren en adaptersequenties in te bouwen. Vervolgens wordt er PCR uitgevoerd om de DNA-monsters gelijktijdig te amplificeren en te indexeren, waardoor specifieke barcodes op elk fragment komen en de sequenties die nodig zijn voor clusterformatie, die door het sequencingplatform kunnen worden uitgelezen.

Sla na voltooiing van de PCR de standaard stap voor post-PCR-zuivering over en voeg 3,5 µL laadbuffer toe aan elk monster voor een totaalvolume van 28,5 µL. Draag de monsters vervolgens over naar een 96-wellplaat. Plaats de 96-wellplaat in een elektroforesewerkstation met een gegoten 1,5% agarose cassette via de gebruikersinterface van de Ranger-software.

Specificeer een doel voor de selectie van de grootte van 500 tot 800 basenparen. Stel het extractievolume in op 300 microliters. Start de run.

Het elektroforese-werkstation laadt de monsters automatisch in de aros-cassettes. Vervolgens wordt er spanning op de cassettes gezet en wordt een op een portaal gemonteerd imaging-systeem gebruikt om de locatie van het monster-DNA in de aros te bepalen gedurende de gehele run.

De Ranger-software legt beelden vast en schat met behulp van interne standaarden de positie van het op grootte geselecteerde doelwit in elk monster in. Nadat de doelwitten zijn geïdentificeerd, varieert de Ranger-software het voltage dat op elk monster wordt aangelegd om de aankomst van de doelwitten bij de extractieputjes van de cassette te synchroniseren.

Ten slotte zuigt het elektroforeseworkstation de targets in TBE uit de extractieputjes en doseert deze in een nieuwe 96-well plaat om het ruwe outputmateriaal te concentreren; precipiteer het ruwe elutievolume met natriumacetaat en ethanol met lineair acrylamide gedurende de nacht bij -80 °C. Centrifugeer de monsters opnieuw bij 17.000 ×g gedurende 30 minuten. Gooi na het centrifugeren de supernatanten weg en spoel het DNA-pallet vervolgens met 1 mL ijskoud, 70% ethanol en centrifugeer dit.

Centrifugeer de monsters op 17.000 GS gedurende 30 minuten, verwijder het supernatant, droog ze en resuspendeer tenslotte de DNA-pellet in 10 millimolair tris CL. Normaliseer vervolgens de monsters met behulp van library-normalisatiekralen, die zijn inbegrepen in de transpose on base library preparation kit. Voer tenslotte DNA-sequencing uit met een next generation sequencing-platform om informatievere reads te verkrijgen in next generation sequencing-platforms door de kwaliteit van de sequencing-libraries te verbeteren.

Watermonsters werden genomen op acht verschillende locaties binnen het stroomgebied en index-DNA-bibliotheken werden klaargemaakt van de geïsoleerde bacteriële fractie, zoals weergegeven in dit elektroferogram. DNA-bibliotheken gegenereerd uit zoetwatermonsters na PCR, maar vóór geautomatiseerde selectie op grootte, bestonden uit fragmenten met een grootte variërend van 50 basenparen tot 3000 basenparen. Na selectie op grootte met behulp van het geautomatiseerde high-throughput platform, vertoonden de monsters een nauw bereik van DNA-fragmenten tussen 500 en 800 basenparen. Bijgevolg leidde het gebruik van dit geautomatiseerde platform voor gel-selectie op grootte tot geschikte opbrengsten en werd de clustering van ongewenste fragmenten onder 200 basenparen geminimaliseerd.

DNA-sequencing van deze library op de aluminium MiSeq genereerde een clusterdichtheid van 1198 K per vierkante millimeter. Het percentage clusters dat de filters passeerde was 84,2% met een geschatte opbrengst van 9,2 gigabytes. Bovendien hadden 7,4 gigabytes, of 82,8% van de reads een kwaliteitsscore van groter dan of gelijk aan 30.

Dit betekent dat ongeveer 83% van de basen die met dit aangepaste protocol zijn gesequenced en toegepast op watermonsters uit het milieu, een base call-nauwkeurigheid van ten minste 99,9% hadden. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u meer informatieve resultaten uit sequencing-libraries kunt genereren. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om rekening te houden met de microbiële fractie die u nastreeft, de keuze van de library-preparatie, de doellengte van het fragment en de sequencing-platforms.