Name: Geautomatiseerde Gel Size Selectie om de kwaliteit van next-generation sequencing bibliotheken Bereid uit Environmental watermonsters Verbeteren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 26 s
Description: Leer een geautomatiseerde gelgrootte-selectiemethode voor DNA-zuivering uit milieuwatermonsters. Deze techniek verbetert de kwaliteit en doorvoer van next-generation sequencing bibliotheken aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door Genome BC, Genome Canada en Coastal Genomics. De auteurs danken Kirby Cronin en Michael Chan voor hun hulp bij het verzamelen en verwerken van monsters. We willen ook Thea Van Rossum en Dr. Fiona Brinkman bedanken voor hun hulp bij bioinformatica.

1. Water Collection en Filtration <ol><li> Verzamel zoetwater monsters uit verschillende plaatsen (Figuur 1). Ga monsters door een reeks filters: 1 um filter, 0,2 urn filter, en 30 kDa cutoff tangentiële filter systematisch afzonderlijke eukaryote, bacteriële en virale deeltjes, respectievelijk. Opmerking: Alleen de zuivering en analyse van de teruggewonnen op de filters 0,2 urn (vrijlevende bacteriën) wordt beschreven in dit rapport, maar soortgelijke aanpak kan worden gebruikt voor andere deeltjes teruggewonnen uit de filters. </li></ol> 2. Bacteriële Concentratie, DNA-extractie en zuivering <ol><li> Verwijder de 0,2 pm membraanfilter (s) vanaf het waterfiltratie (schematisch diagram, figuur 2). Vouw de 0,2 um disc filter in de helft en plaats deze in een 50 ml buis met de open kant naar boven. Voeg 5 ml van 1x fosfaat gebufferde oplossing (PBS) en 0,01% Tween, pH 7.4 inde buis. Indien meer dan één filter gebruikt tijdens het proces gebruiken een verschillende buis per filter. Store tube (s) met filter bij 4 ° C totdat verwerkt. Anders, ga verder met stap 2.2. </li><li> Verwijder de 0,2 pm membraan filter van de 50 ml buis met een steriel pincet. Plaats op een petrischaal filter (s) (laat de PBS-buffer in de buis). <ol><li> Met een steriel pincet en een steriele schaar, knip de filter in kleine stroken (1 cm x 1 cm). Ontsmet tang en schaar door het weken in 70% isopropanol, vegen met een DNA-oppervlak ontsmettend en spoelen met ultrapuur water van type 1 tussen de verschillende monsters. </li></ol></li><li> Plaats het filter in reepjes gesneden terug in dezelfde buis van 50 ml. Voeg 10 ml 1x PBS en 0,01% Tween, pH 7,4 om het filter zodat er in totaal 15 ml buffer in de 50 ml buis. </li><li> Voeg 6 schoon wolfraam kralen (3 mm diameter) aan elke 50 ml tube, hebben betrekking op de buis met Parafilm, en vortex krachtig gedurende 20 min (gebruik 50 ml buisjes vortex adapter). Als multIPLE filters zijn uit één monster, de overdracht en het zwembad alle homogenisaat verwerkt in een schone 50 ml buis. Centrifugeer de buizen bij 3300 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer de pellet en monster bacteriële cellen (~ 1 ml hoeveelheden) in 1,7 ml microcentrifuge buizen. Merk op dat er 5 reactievaatjes per monster. </li><li> Spin down de microcentrifugebuizen bij 10.000 xg gedurende 10 min, en verwijder het grootste deel van de bovenstaande vloeistof naar beneden tot ~ 200 ul merk. </li><li> Bewaar de monsters bij -80 ° C, of ​​naar het bacterieel DNA extraheren met behulp van een commercieel verkrijgbare DNA isolatie kit volgens de instructies van de fabrikant. Tijdens bacterieel DNA-extractie gebruik ofwel PBS of water als een negatieve extractie controle, en E. coli als een positieve controle extractie. </li><li> Omdat DNA van meerdere buizen worden uitgepakt, bundelen parallelle sub-monsters uit hetzelfde monster in een 2 ml buis. Vervolgens een O / N precipitatie met een oplossing bestaande uit 0,1volume van 3 M natriumacetaat, 2 volumes 100% ethanol en 5 ui 5 ug / ul lineaire acrylamide. Meng goed en bewaar monsters bij -80 ° C. </li><li> Centrifugeer bij maximale snelheid (17000 xg) gedurende 30 min bij 4 ° C. Was pellet met 1 ml ijskoude 70% ethanol, drogen in een bio kast niet meer dan 5 minuten en resuspendeer DNA pellet in 34 ui 10 mM Tris-Cl, pH 8,5. Opmerking: lineaire acrylamide helpt DNA pellet visualiseren na de O / N precipitatie. </li><li> Bepaal DNA kwantiteit en kwaliteit met een hoge gevoeligheid fluorescerende nucleïnezuur kwantificatie assay en een microvolume spectrofotometer respectievelijk de instructies van de fabrikant (zie Tabel Materials). Opmerking: Indien meerdere monsters worden bereid in de tijd kan een ultragevoelige fluorescerende nucleïnezuur assay voor het kwantificeren dsDNA en plaat-gebaseerde fluorometer / spectrofotometer worden gebruikt. </li></ol> 3. DNA Bibliotheek Voorbereiding <ol><li&gt; Normaliseren bacterieel genomisch DNA geëxtraheerd uit watermonsters tot een concentratie van ongeveer 0,2 ng / ul. </li><li> Enzymatisch fragment één nanogram van bacterieel DNA met een transposon-gebaseerde werkwijze (tagmentation). Voeg adapter en index sequenties op gefragmenteerd DNA volgens de instructies van de fabrikant. Onder tagmented monsters 12 cycli van PCR zoals is aangegeven in de instructies van de fabrikant, waarna de sequentie indexen zijn opgenomen. </li></ol> 4. Geautomatiseerde Gel Grootte Selectie <ol><li> Skip standaard post-PCR clean-up stap in de instructies van de fabrikant beschreven (zie tabel van Materialen). Maat selecteren post-PCR monsters direct behulp van een geautomatiseerd gel gebaseerde grootte selectie platform. <ol><li> Voeg 3,5 gl laadbuffer aan elk monster. </li><li> Volgens het protocol van de fabrikant, laadt de monsters op de elektroforese werkstation, het opgeven van een grootte-selectie doelstelling van 500-800 bp, in een 300 ul extractionenvolume, met behulp van een pre-cast 1,5% agarose cassette. </li><li> Concentreer de ruwe uitvoer materiaal (300 ul) tot 25 pi via ethanolprecipitatie. Opmerking: U kunt ook gebruik maken van de elektroforese werkstation om de concentratie te automatiseren voor grotere aantallen monsters via filter plaat en vacuümspruitstuk. <ol><li> Neerslag ruwe elutievolume toepassing van 0,1 volumina van 3 M natriumacetaat, 2 volumes 100% ethanol en 5 ui 5 ug / ul lineaire acrylamide. Meng goed, plaats monsters bij -80 ° CO / N. Centrifugeer de monsters bij 17.000 xg gedurende 30 min. </li><li> Gooi supernatanten en ga verder met DNA pellet te wassen met 1 ml ijskoude 70% ethanol. </li><li> Centrifugeer monsters weer bij 17.000 xg gedurende 30 min, gooi supernatant, drogen en tenslotte resuspendeer DNA pellet in 25 ui 10 mM Tris-Cl, pH 8,5. </li></ol></li></ol></li><li> (Optioneel) Gebruik 1 ui van DNA-bibliotheken grootte geselecteerd met de geautomatiseerde gel grootte selectie platform om een ​​vijf makenvoudige verdunning met Tris-EDTA-buffer, pH 8,0. Analyseer bibliotheken met een chip gebaseerde capillaire elektroforese instrument dsDNA kwaliteit analyse volgens instructies van de fabrikant. </li></ol> 5. Bibliotheek Normalisatie en Sequencing <ol><li> Ga verder met monsters met behulp van de bibliotheek normalisering kralen (inbegrepen in de transposon-gebaseerde voorbereiding bibliotheek kit) zoals beschreven in het klaarmaken van de fabrikant te normaliseren. <ol><li> U kunt ook meten dsDNA bibliotheken met een hoge gevoeligheid fluorescerende nucleïnezuur kwantificatie test, gevolgd door het poolen bij equimolaire verhoudingen tot een uiteindelijke dsDNA concentratie van 2 nM bereiken. Ga naar bibliotheken met 10 ui gepoolde bibliotheken en 10 pl 0,2 N NaOH denatureren, incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verdun gedenatureerd bibliotheken met hybridisatie buffer (geleverd bij de transposon gebaseerde preparaat kit) tot een eindvolume van 1 ml en de concentratie van 11:05. </li></ol></li><li> Load monsters in een next-generation sequencing platform door het volgen van standaard sequencing protocollen van de fabrikant. </li></ol>

<ol><li>Siuda, W., Chrost, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+and+susceptibility+of+dissolved+DNA+for+enzyme+degradation+in+lake+water+-+some+methodological+remarks%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Concentration and susceptibility of dissolved DNA for enzyme degradation in lake water - some methodological remarks.</a> Aquatic Microbial Ecology. 21, 195-201 (2000).</li>
<li>Butler, J. M., Hill, C. R. Scientific Issues with Analysis of Low Amounts of DNA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.promega.ca/resources/profiles-in-dna/2010/scientific-issues-with-analysis-of-low-amounts-of-dna">http://www.promega.ca/resources/profiles-in-dna/2010/scientific-issues-with-analysis-of-low-amounts-of-dna</a> (2010).</li>
<li>Ficetola, G. F., Miaud, C., Pompanon, F., Taberlet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+detection+using+environmental+DNA+from+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+letters%22%5BJournal%5D)">Species detection using environmental DNA from water samples.</a> Biology letters. 4, 423-425 (2008).</li>
<li>Liles, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery%2C+purification%2C+and+cloning+of+high-molecular-weight+DNA+from+soil+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Recovery, purification, and cloning of high-molecular-weight DNA from soil microorganisms.</a> Applied and environmental microbiology. 74, 3302-3305 (2008).</li>
<li>Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+high+molecular+weight+DNA+from+microbial+mats%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Extraction of high molecular weight DNA from microbial mats.</a> BioTechniques. 49, 631-640 (2010).</li>
<li>Tebbe, C. C., Vahjen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interference+of+humic+acids+and+DNA+extracted+directly+from+soil+in+detection+and+transformation+of+recombinant+DNA+from+bacteria+and+a+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and a yeast.</a> Applied and environmental microbiology. 59, 2657-2665 (1993).</li>
<li>Solonenko, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+platform+and+library+preparation+choices+impact+viral+metagenomes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Sequencing platform and library preparation choices impact viral metagenomes.</a> BMC genomics. 14, 320(2013).</li>
<li>Aird, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+and+minimizing+PCR+amplification+bias+in+Illumina+sequencing+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries.</a> Genome biology. 12, R18(2011).</li>
<li>Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J., et al. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aQuail%2C+MA+%22Current+protocols+in+human+genetics+%2F+editorial+board%2C+Jonathan+L.+Haines+..+%5Bet+al.%5D%22">Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines .. [et al.]</a>. 18, 18(2009).</li>
<li>Head, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+construction+for+next-generation+sequencing%3A+overviews+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges.</a> BioTechniques. 56, 61-64, 66, 68 (2014).</li>
<li>Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+preparation+methods+for+next-generation+sequencing%3A+tone+down+the+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias.</a> Experimental cell research. 322, 12-20 (2014).</li>
<li>Grunenwald, H., Baas, B., Caruccio, N., Syed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+high-throughput+library+preparation+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid, high-throughput library preparation for next-generation sequencing.</a> Nature Methods. 7, (2010).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2001).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of visualized experiments. , (2012).</li>
<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+genome+center%27s+improvements+to+the+Illumina+sequencing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.</a> Nature methods. 5, 1005-1010 (2008).</li>
<li>Marine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+transposase+protocol+for+rapid+generation+of+shotgun+high-throughput+sequencing+libraries+from+nanogram+quantities+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a transposase protocol for rapid generation of shotgun high-throughput sequencing libraries from nanogram quantities of DNA.</a> Applied and environmental microbiology. 77, 8071-8079 (2011).</li>
<li>Rohland, N., Reich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective+high-throughput+DNA+sequencing+libraries+for+multiplexed+target+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Cost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture.</a> Genome research. 22, 939-946 (2012).</li>
<li>Lamble, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+workflows+for+high+throughput+library+preparation+using+the+transposome-based+nextera+system%5BTitle%5D)+AND+%22Bmc+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based nextera system.</a> Bmc Biotechnology. 13, (2013).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn5+transposase+and+tagmentation+procedures+for+massively+scaled+sequencing+projects%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects.</a> Genome research. , (2014).</li>
<li>Rhodes, J., Beale, M. A., Fisher, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+Choices+for+Library+Prep%3A+A+Comparison+of+Library+Preparation+Methods+for+Whole+Genome+Sequencing+of+Cryptococcus+neoformans+Using+Illumina+HiSeq%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Illuminating Choices for Library Prep: A Comparison of Library Preparation Methods for Whole Genome Sequencing of Cryptococcus neoformans Using Illumina HiSeq.</a> PloS One. 9, e113501(2014).</li>
</ol>

Jared R. Slobodan en Matthew J. Nesbitt zowel aandelen houden van Coastal Genomics, een particulier British Columbia corporatie het aanbieden van de Ranger Technology.

De aanwezigheid van de adapter dimeren en clustering van kleine insert maten voorkeur worden gesequenced in de huidige platforms vertegenwoordigen een afname van de bruikbare opbrengst en onderbenutting van de apparatuur capaciteit 15. Het gebruik van kralen slaan methoden gekoppeld met een transposon gebaseerde benadering bibliotheken te bereiden, kan leiden tot DNA afschuiving in vergelijking met andere werkwijzen voor extractie 4,5. Niettemin zijn alle extractie- en bibliotheek bereiding mogelij...

Metagenomica omvat de sequentiebepaling van al het genetisch materiaal in een monster om de aanwezige microbiële gemeenschappen te karakteriseren. Het is een complex en duur proces waarbij geëxtraheerde nucleïnezuren worden omgezet in DNA-bibliotheken, gevolgd door volgende generatie sequencing. Hoogwaardige bibliotheken zijn essentieel voor maximale data-output en nauwkeurige metagenomische analyse. Milieumonsters, zoals watermonsters, vormen vaak aanzienlijke uitdagingen voor het genereren van hoogwaardige bibliotheken, vanwege lage hoeveelheden DNA die mogelijk ook gedegradeerd zijn1-3 en de aanwezigheid van remmers van PCR4-6. 
Hoogwaardige bibliotheken bestaan idealiter uit langere segmenten DNA binnen een nauwkeurig bepaald bereik van lengtes. Om de hoeveelheid nuttige data per sequencing-run te maximaliseren, moet de lengte van het DNA in de bibliotheek minstens zo lang zijn als de maximale leeslengte van de gebruikte sequencing-methode. Bij gebruik van een sequencing-by-synthesis technologie zoals de Illumina MiSeq, beïnvloedt de grootte van de DNA-fragmenten de efficiëntie waarmee clusters worden gegenereerd op de flowcel. Wanneer een bibliotheek bijvoorbeeld zowel kortere als langere DNA-fragmenten bevat, zullen de kortere fragmenten oververtegenwoordigd zijn in de sequencing-data7,8. Daarentegen zal een bibliotheek met DNA-fragmenten van vergelijkbare grootte evenredig vertegenwoordigd zijn in de sequencing-data. Veel bibliotheekvoorbereidingskits gebruiken ligatie-gebaseerde methoden om adapters aan de DNA-fragmenten toe te voegen en maatselectie is noodzakelijk om adapter-dimers die geen insert bevatten te verwijderen9,10. Er zijn talrijke methoden11,12 om dit te bereiken, maar de techniek die de meest consistente resultaten geeft is de elektroforetische scheiding van DNA gevolgd door de terugwinning van de gewenste lengtes DNA13,14. Dit proces kan handmatig worden uitgevoerd voor een klein aantal monsters, maar wanneer honderden monsters moeten worden verwerkt, zijn geautomatiseerde oplossingen vereist. De momenteel beschikbare platforms voor geautomatiseerde gelmaatselectie hebben een lage doorvoer en er zijn nieuwe platforms nodig om grote aantallen monsters voor sequencing te verwerken. De Ranger Technology kan worden geïntegreerd met bestaande liquid handling werkstations om het gebruik van agarose gelelektroforese voor maatselectie en analytische doeleinden mogelijk te maken op een schaal die voldoet aan de huidige high-throughput omgeving.

<table><tbody><tr><td>Peristaltic pump Masterflex P/S 1400 Series</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>1400-1620</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &micro;m Supor Membrane</td><td>VWR</td><td>CA28143-969</td><td>Pall Corporation, Ann Harbor, MI</td></tr><tr><td>Tungsten carbide beads 3 mm (200)</td><td>Qiagen</td><td>69997</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol 70%</td><td>Jedmon Products</td><td>825751</td><td>Healthcare Plus</td></tr><tr><td>DNA away</td><td>VWR</td><td>7010</td><td>Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA</td></tr><tr><td>Milli-Q water purification system</td><td>Fisher Scientific</td><td>ZMQS6VF0Y</td><td>Merck Millipore. Dit systeem is stopgezet.</td></tr><tr><td>20x PBS pH 7.5</td><td>VWR</td><td>E703-1L</td><td>Amresco, Inc., Solon, OH</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td>Fisher chemicals</td></tr><tr><td>Vortex adapter for 2 (50&nbsp;ml) tubes</td><td>VWR</td><td>13000-V1-50</td><td>MoBio, Carlsbad, CA</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2, 120&nbsp;V (Model G560)</td><td>VWR</td><td>SI-0236</td><td>Scientific Industries, Inc.</td></tr><tr><td>Beckman Centrifuge</td><td>Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd</td><td>Model J-6B</td><td></td></tr><tr><td>PowerLyzer Powersoil DNA isolation kit</td><td>VWR</td><td>12855-100</td><td>MoBio, Carlsbad, CA</td></tr><tr><td>Vortex adapter for 24 (1.5-2 ml) tubes</td><td>VWR</td><td>13000-V1-24</td><td>MoBio, Carlsbad, CA</td></tr><tr><td>Microfuge 18 centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td>Nimbus Select workstation met Ranger Technology</td><td>Hamilton Robotics</td><td>92720-01</td><td>Inclusief de liquid handling werkstation en geïntegreerde Ranger Tech (elektroforese hardware)</td></tr><tr><td>Ranger reagent kit</td><td>Coastal Genomics</td><td>CG-10600-150-12-21</td><td>Inclusief laadbuffer en cassettes</td></tr><tr><td>Ethyl alcohol (anhydrous)</td><td>Commercial Alcohols</td><td>P016EAAN</td><td>Greenfield Ethanol</td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889-250G</td><td></td></tr><tr><td>Linear acrylamide (5&nbsp;mg/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9520</td><td>Ambion</td></tr><tr><td>Eppendorf gekoelde centrifuge</td><td>Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd.</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Buffer EB (250 ml)</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Qubit fluorometer</td><td>Life Technologies</td><td>Q32857</td><td>Invitrogen. Dit product is stopgezet.</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS assay kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>Invitrogen</td></tr><tr><td>High sensitivity DNA reagent</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>High sensitivity DNA chips</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2011 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2938B</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA sample preparation kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT index kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq reagent kit v2 (500-cycles)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>Miseq systeem</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr></tbody></table>

geautomatiseerde gel size selectie om de kwaliteit van next-generation sequencing bibliotheken bereid uit environmental watermonsters verbeteren

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Next-generation sequencing van omgevingsmonsters kan een uitdaging zijn vanwege de variabele DNA-hoeveelheid en -kwaliteit in deze monsters. Hoge kwaliteit DNA-bibliotheken zijn nodig voor optimale resultaten van next-generation sequencing. Milieumonsters zoals water kunnen een lage kwaliteit en hoeveelheden DNA hebben, evenals contaminanten die meeprecipiteren met DNA. De mechanische en enzymatische processen die betrokken zijn bij extractie en voorbereiding van de bibliotheek kunnen het DNA verder beschadigen. Gelgrootteselectie maakt zuivering en herstel van DNA-fragmenten van een gedefinieerde grootte mogelijk voor sequencing-toepassingen. Desondanks is deze taak een van de meest tijdrovende stappen in het workflow voor DNA-bibliotheekvoorbereiding. Het hier beschreven protocol maakt volledige automatisering van agarose gel laden, elektroforeseanalyse en herstel van gerichte DNA-fragmenten mogelijk.
In deze studie beschrijven we een high-throughput aanpak om hoogwaardige DNA-bibliotheken voor te bereiden uit zoetwatermonsters die ook kunnen worden toegepast op andere omgevingsmonsters. We gebruikten een indirecte aanpak om bacteriecellen uit omgevingszoetwatermonsters te concentreren; DNA werd geëxtraheerd met behulp van een commercieel verkrijgbaar DNA-extractiekit en DNA-bibliotheken werden voorbereid met behulp van een commercieel transposon-gebaseerd protocol. DNA-fragmenten van 500 tot 800 bp werden geselecteerd op grootte in een gel met behulp van Ranger Technology, een geautomatiseerde elektroforese werkstation. Sequencing van de groottegeselecteerde DNA-bibliotheken toonde significante verbeteringen in de lengte en kwaliteit van de sequencing-reads.

DNA-concentratie, en Quality Assessment Bacterieel DNA-concentraties varieerden 0,01-0,11 ng ​​/ ml per watermonster van de verschillende waterscheiding sites (Tabel 1). DNA geïsoleerd uit bacteriële fractie had A 260/280 en 260/230 A verhoudingen van 1,4-1,8 en 0,3-1,6, respectievelijk. Hoewel sommige van de A 260/230 ratio relatief laag werd geen duidelijke inhibitie waargenomen in de bereide bibliotheek en andere afgeleide...

Dit manuscript beschrijft een geautomatiseerde aanpak voor gelgrootteselectie voor het zuiveren van DNA-fragmenten voor next-generation sequencing. De Ranger-technologie biedt volledige automatisering van het gehele proces van agarose gel laden, elektroforetische analyse en herstel van gerichte DNA-fragmenten, waardoor high-throughput en hoge kwaliteit next-generation sequencing bibliotheken mogelijk zijn.

Geautomatiseerde Gel Size Selectie om de kwaliteit van next-generation sequencing bibliotheken Bereid uit Environmental watermonsters Verbeteren

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Deze video demonstreert het gebruik van een geautomatiseerd instrument voor gel-grootteselectie om verbeterde reads te verkrijgen in next generation sequencing-platformen. Eerst worden watermonsters uit het milieu verzameld en door een reeks filters geleid om eukaryote, bacteriële en virale partikels systematisch te scheiden. De vastgehouden bacteriën worden vervolgens verder geconcentreerd door middel van centrifugatie.Vervolgens wordt het bacteriële DNA geëxtraheerd. Het geëxtraheerde DNA wordt gebruikt voor het maken van bibliotheken waarin adapters en indexen in het gefragmenteerde DNA worden geïncorporeerd. Het DNA wordt daarna via PCR geamplificeerd, waarna de monsters in het elektroforese-werkstation worden geladen.DNA-fragmenten binnen een specifiek bereik worden vervolgens automatisch geselecteerd. Analyse van sporen uit chip-gebaseerde capillaire elektroforese en aanvullende bio-informatica tonen aan dat deze methode geschikte hoeveelheden DNA-fragmenten oplevert voor downstream-analyse, met minimale clustering van ongewenste fragmenten onder de 200 base pairs. Het belangrijkste voordeel van het geautomatiseerde Electrophoresis square station of paramagnetische beads en andere commerciële systemen is dat het een nauwer selectiebereik mogelijk maakt, waarbij tot 96 monsters in één run kunnen worden verwerkt.Hoewel deze methode inzicht kan bieden in microbiële gemeenschappen in zoetwatermonsters, kan deze worden toegepast op andere systemen zoals zeewater, afvalwaterzuivering, plantmonsters, sedimentbodem of microbiële matten; in essentie elk DNA-monster waarvoor we een nauwe selectie van groottes wensen. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we korte fragmenten zagen in sequenties van het MySEQ-platform. We hebben verschillende benaderingen voor grootte-selectie geprobeerd, waaronder verschillende typen para-beads en ratio's, evenals een handmatige methode voor grootte-selectie via gel.Vervolgens zijn we gaan samenwerken met Coastal Genomics, een particuliere onderneming uit British Columbia die de Ranger-technologie aanbiedt voor het demonstreren van de procedure. Vandaag zijn aanwezig Michael Chan, research technician uit mijn laboratorium, Miguel Yi, postdoctoral fellow uit mijn laboratorium, en Jared Sloan, een engineer van Coastal Genomics. In deze video beschrijven we uitsluitend de zuivering en analyse van het materiaal dat op de 0,2 micron filters is teruggewonnen, primair vrijlevende bacteriën, maar houd er rekening mee dat soortgelijke benaderingen kunnen worden gebruikt voor de andere deeltjes die van de filters zijn teruggewonnen.Begin deze procedure door 40 liter zoetwatermonsters te verzamelen van verschillende omgevingslocaties in gesaneerde carboys van 20 liter. Prefiltreer de monsters in situ met een polypropylene spectrum mesh filter van 105 micrometer. In dit geval worden de monsters verzameld uit stroomgebieden met stedelijke en landbouwkundige invloeden.Plaats de monsters na afname in koelboxen en transporteer ze terug naar het laboratorium. Bewaar de monsters bij vier graden Celsius. De volgende dag.Stel een filtratiesysteem samen dat bestaat uit een carboy voor monsterneming, die via een peristaltische pomp is verbonden met een EnviroCheck één micron bemonsteringscapsule. Verbind de bemonsteringscapsule met een 0,2 micron schijffilter en verbind dit via een tweede peristaltische pomp met een 30 kilodalton tangential flow filter. Zet de peristaltische pompen aan om de monsters door een reeks filters te leiden; de eukaryote cellen worden geïsoleerd wanneer ze door de bemonsteringscapsule passeren.De bacteriële fractie wordt geïsoleerd op het membraanschijffilter en de virusdeeltjes worden geïsoleerd op het tangential flow-filter. Verwijder het 0,2 micrometer membraanfilter of de filters uit het waterfiltratiesysteem. Vouw het filter vervolgens dubbel en plaats het in een buis van 50 milliliter.Met de open zijde naar boven. Voeg vijf milliliter PBS met tween toe aan de buis. Als er tijdens de filtratie meer dan één filter is gebruikt, gebruik dan voor elk filter een aparte buis.De filters kunnen vervolgens worden bewaard bij 4 °C of direct als volgt worden verwerkt. Verwijder daarna met een steriele pincet het membraanfilter uit de buis van 50 ml en plaats dit met een steriele pincet en een steriele schaar op een Petrischaal. Knip het filter tussen de monsters door in stukjes van 1 cm bij 1 cm.Desinfecteer de instrumenten door ze te weken in 70% isopropanol, af te nemen met een DNA-oppervlakte-decontaminatiemiddel en vervolgens te spoelen met ultrapuur water type 1. Plaats de filterstukken terug in dezelfde buis van 50 milliliter. Voeg met een steriele pincet 10 milliliter PBS met tween toe om het totale buffervolume op 15 milliliter te brengen.Voeg zes schone wolfraamkraaltjes met een diameter van 3 mm toe aan elke buis van 50 ml. Sluit de buis af met parafilm en vortex deze krachtig gedurende 20 minuten.Voeg na het vortexen alle suspensies voor elk monster samen in één schone buis van 50 milliliter. Centrifugeer de buizen 15 minuten bij 3.300 ×g bij vier graden Celsius. Verwijder na het centrifugeren het supernatant en resuspendeer het pellet.Verdeel de bacteriële cellen in vijf milliliter PBS-oplossing in aliquots van één milliliter in 1,7 milliliter microcentrifugebuisjes en centrifugeer deze in een microcentrifuge bij 10,000 ×g gedurende 10 minuten. Verwijder na het centrifugeren met een pipet al het supernatant, behalve 200 µL. Bewaar de monsters bij -80 °C of ga verder met het extraheren van bacterieel DNA met behulp van een commercieel verkrijgbare DNA-isolatiekit.Gebruik bij de extractie van bacterieel DNA ofwel PBS of water als negatieve extractiecontrole en E. coli als positieve extractiecontrole. Voeg na de DNA-extractieprocedure de aliquoten van hetzelfde monster samen in één buis van 2 ml met 10 mM Tris-buffer. Voer vervolgens een precipitatie overnacht uit door een oplossing toe te voegen bestaande uit 10% 3 M natriumacetaat, twee volumes 100% ethanol en 5 µL lineair acrylamide. Bewaar de monsters bij -80 °C.Centrifuge de monsters de volgende dag gedurende 30 minuten bij 17.000 GS bij vier graden Celsius. Was na het centrifugeren het pellet met één milliliter ijskoud 70% ethanol en laat het pellet maximaal vijf minuten aan de lucht drogen in een veiligheidskast.Resuspendeer vervolgens het DNA-pellet in 10 millimolar tris-CL. Bepaal tot slot de DNA-kwantiteit en -kwaliteit door een fluorescentie-assay voor nucleïnezuren met hoge gevoeligheid uit te voeren, gevolgd door microvolumespectrometrie. Voeg, na het bepalen van de DNA-hoeveelheid in elk monster, de juiste hoeveelheid water aan elke buis toe om de concentratie op ongeveer 0,2 nanogram per microliter te brengen.Bereid met behulp van een commercieel verkrijgbare kit een DNA-bibliotheek voor van geïndexeerde fragmenten uit één nanogram bacterieel DNA. Hierbij wordt een methode op basis van transposase, bekend als mentatie, toegepast om het DNA gelijktijdig te fragmenteren en adaptersequenties in te bouwen. Vervolgens wordt er PCR uitgevoerd om de DNA-monsters gelijktijdig te amplificeren en te indexeren, waardoor specifieke barcodes op elk fragment komen en de sequenties die nodig zijn voor clusterformatie, die door het sequencingplatform kunnen worden uitgelezen.Sla na voltooiing van de PCR de standaard stap voor post-PCR-zuivering over en voeg 3,5 µL laadbuffer toe aan elk monster voor een totaalvolume van 28,5 µL. Draag de monsters vervolgens over naar een 96-wellplaat. Plaats de 96-wellplaat in een elektroforesewerkstation met een gegoten 1,5% agarose cassette via de gebruikersinterface van de Ranger-software.Specificeer een doel voor de selectie van de grootte van 500 tot 800 basenparen. Stel het extractievolume in op 300 microliters. Start de run.Het elektroforese-werkstation laadt de monsters automatisch in de aros-cassettes. Vervolgens wordt er spanning op de cassettes gezet en wordt een op een portaal gemonteerd imaging-systeem gebruikt om de locatie van het monster-DNA in de aros te bepalen gedurende de gehele run.De Ranger-software legt beelden vast en schat met behulp van interne standaarden de positie van het op grootte geselecteerde doelwit in elk monster in. Nadat de doelwitten zijn geïdentificeerd, varieert de Ranger-software het voltage dat op elk monster wordt aangelegd om de aankomst van de doelwitten bij de extractieputjes van de cassette te synchroniseren.Ten slotte zuigt het elektroforeseworkstation de targets in TBE uit de extractieputjes en doseert deze in een nieuwe 96-well plaat om het ruwe outputmateriaal te concentreren; precipiteer het ruwe elutievolume met natriumacetaat en ethanol met lineair acrylamide gedurende de nacht bij -80 °C. Centrifugeer de monsters opnieuw bij 17.000 ×g gedurende 30 minuten. Gooi na het centrifugeren de supernatanten weg en spoel het DNA-pallet vervolgens met 1 mL ijskoud, 70% ethanol en centrifugeer dit.Centrifugeer de monsters op 17.000 GS gedurende 30 minuten, verwijder het supernatant, droog ze en resuspendeer tenslotte de DNA-pellet in 10 millimolair tris CL. Normaliseer vervolgens de monsters met behulp van library-normalisatiekralen, die zijn inbegrepen in de transpose on base library preparation kit. Voer tenslotte DNA-sequencing uit met een next generation sequencing-platform om informatievere reads te verkrijgen in next generation sequencing-platforms door de kwaliteit van de sequencing-libraries te verbeteren.Watermonsters werden genomen op acht verschillende locaties binnen het stroomgebied en index-DNA-bibliotheken werden klaargemaakt van de geïsoleerde bacteriële fractie, zoals weergegeven in dit elektroferogram. DNA-bibliotheken gegenereerd uit zoetwatermonsters na PCR, maar vóór geautomatiseerde selectie op grootte, bestonden uit fragmenten met een grootte variërend van 50 basenparen tot 3000 basenparen. Na selectie op grootte met behulp van het geautomatiseerde high-throughput platform, vertoonden de monsters een nauw bereik van DNA-fragmenten tussen 500 en 800 basenparen. Bijgevolg leidde het gebruik van dit geautomatiseerde platform voor gel-selectie op grootte tot geschikte opbrengsten en werd de clustering van ongewenste fragmenten onder 200 basenparen geminimaliseerd.DNA-sequencing van deze library op de aluminium MiSeq genereerde een clusterdichtheid van 1198 K per vierkante millimeter. Het percentage clusters dat de filters passeerde was 84,2% met een geschatte opbrengst van 9,2 gigabytes. Bovendien hadden 7,4 gigabytes, of 82,8% van de reads een kwaliteitsscore van groter dan of gelijk aan 30.Dit betekent dat ongeveer 83% van de basen die met dit aangepaste protocol zijn gesequenced en toegepast op watermonsters uit het milieu, een base call-nauwkeurigheid van ten minste 99,9% hadden. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u meer informatieve resultaten uit sequencing-libraries kunt genereren. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om rekening te houden met de microbiële fractie die u nastreeft, de keuze van de library-preparatie, de doellengte van het fragment en de sequencing-platforms.

automated-gel-size-selection-to-improve-quality-next-generation

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Het karakteriseren van microbiële gemeenschappen is een al lang bestaand doel in de milieumicrobiologie. Methoden voor next-generation sequencing maken nu de karakterisering van microbiële gemeenschappen mogelijk op een ongekende diepte met minimale kosten en arbeid. We beschrijven hier onze aanpak om bacteriële 16S ribosomale RNA-genen te sequencen met behulp van een tafelsequencer.

Next-generation sequencing van het 16S ribosomaal RNA Gene Amplicons

Verbeterde Gereduceerde Representatie Bisulfiet Sequencing is een methode voor de voorbereiding van sequencingbibliotheken voor DNA-methylatieanalyse op basis van restrictie-enzymdigestie gecombineerd met cytosine bisulfietconversie. Dit protocol vereist 50 ng aan uitgangsmateriaal en levert data met base-paarresolutie op GC-rijke genomische regio's.

Verbeterde Verminderde Vertegenwoordiging bisulfietsequencing voor de Beoordeling van DNA-methylatie bij Base Pair Resolutie

Bisulfiet amplicon sequentiebepaling (BSAS) is een methode voor het kwantificeren van cytosinemethylatie in gerichte genomische regio's van belang. Deze methode maakt gebruik van bisulfietconversie in combinatie met PCR-amplificatie van doelregio's vóór next-generation sequencing om absolute kwantificering van DNA-methylatie op een basisspecifiek niveau te produceren.

Gerichte DNA methylatie analyse van next-generation sequencing

Er wordt een geïntegreerd systeem beschreven voor gerichte next-generation sequencing van oncologische monsters. Dit cross-platform systeem is geoptimaliseerd voor tumorbiopsies van lage kwaliteit en lage hoeveelheid, past zich aan lage DNA-inputs aan, omvat goed gekarakteriseerde multi-variant controles en beschikt over een nieuwe variant caller die wordt geïnformeerd door kwantitatieve pre-analytische kwaliteitscontrolemaatregelen.

Integratie van Nat en droog Bench Processen Optimaliseert Gerichte next-generation sequencing van lage kwaliteit en lage hoeveelheid tumorbiopten

We beschrijven een efficiente en rendabele methode voor het extraheren van nucleïnezuur uit uitstrijkjes ter karakterisering van bacteriële 16S rRNA gen gebruiken amplicon sequencing. De methode maakt het mogelijk voor een gemeenschappelijke aanpak voor de verwerking van meerdere soorten monster en herbergt een aantal downstream-analytische processen.

Efficiënte Nucleic Acid Extraction en 16S rRNA Gene Sequencing voor Bacteriële Gemeenschap karakterisering

Meest voorkomende analyses van de inhoud van de darm van macroinvertebrates zijn visueel. Waarbij intensieve kennis over morfologische diversiteit van organismen van de prooi, ze missen zachte lijf prooi en, als gevolg van de sterke trimventilatoren van de prooi, zijn bijna onmogelijk voor sommige organismen, met inbegrip van vlokreeftjes. Wij bieden gedetailleerde, roman genetische methoden voor macroinvertebrate ten prooi identificatie in het dieet van vlokreeftjes.

Laboratorium Protocol voor genetische Analyses van de inhoud van de Gut van aquatische Macroinvertebrates gebruiken groepsspecifieke rDNA Primers

Gel-seq kan onderzoekers gelijktijdig bereiden bibliotheken voor beide DNA - en RNA-seq op de te verwaarlozen extra kosten vanaf 100-1000 cellen met behulp van een eenvoudige hydrogel-apparaat. Dit document stelt een gedetailleerde aanpak voor de fabricage van zowel het apparaat als het biologische protocol voor het genereren van gepaarde bibliotheken.

Gel-seq: Een methode voor de voorbereiding van de bibliotheek van de gelijktijdige Sequencing van DNA en RNA met Hydrogel Matrices

Full-length individuele proviraal sequencing (FLIPS) een efficiënte en hoog-productie methode voorziet in de versterking en sequentiebepaling van één, in de buurt van full-length (intact en defecte) HIV-1 proviruses en zorgt voor de bepaling van hun potentieel replicatie-competentie. FLIPS overwint beperkingen van eerdere tests ontworpen om de volgorde van het latente reservoir van HIV-1.

Versterking van in de buurt van Full-length HIV-1 Proviruses voor Next-Generation Sequencing

De identificatie van de fysieke interacties tussen genen en regelgevende elementen is uitdagend maar heeft bevorderd door chromosoom conformatie opname methoden. Deze wijziging van het 4C-seq-protocol PCR bias vermindert door het minimaliseren van de over-amplificatie van PCR sjablonen en maximaliseert de mappability van leest door het opnemen van een toevoeging restrictie-enzym digest stap.

High-throughput identificatie van regelgevende gensequenties met behulp van Next-generation Sequencing van circulaire chromosoom conformatie Capture (4C-seq)

We bieden een protocol dat algemeen kan worden toegepast op het selecteren van aptameren die alleen binden aan infectieuze virussen en niet aan virussen die niet-infectieus zijn gemaakt door een desinfectiemethode of aan andere soortgelijke virussen. Dit opent de mogelijkheid om de infectiviteitsstatus te bepalen in draagbare en snelle tests.

In vitro selectie van aptameren om infectieuze van niet-infectieuze virussen te onderscheiden

Dit protocol biedt een eenvoudig te volgen workflow voor het uitvoeren van poly(A) RNA-zuivering, bisulfietconversie en bibliotheekvoorbereiding met behulp van gestandaardiseerde apparatuur voor een biologisch monster van belang.

Verrijking van mRNA en bisulfiet-mRNA-bibliotheekvoorbereiding voor sequencing van de volgende generatie

Leer een geautomatiseerde gelgrootte-selectiemethode voor DNA-zuivering uit milieuwatermonsters. Deze techniek verbetert de kwaliteit en doorvoer van next-generation sequencing bibliotheken aanzienlijk.

Geautomatiseerde Gel Size Selectie om de kwaliteit van next-generation sequencing bibliotheken Bereid uit Environmental watermonsters Verbeteren (Video) | JoVE Journal

Geautomatiseerde Gel Size Selectie om de kwaliteit van next-generation sequencing bibliotheken Bereid uit Environmental watermonsters Verbeteren

Meer video's verkennen