Driedimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Het algemene doel van deze procedure is het bieden van een in vitro, semi-geautomatiseerde, driedimensionale microplate-assay voor tumorcelinvasie. Dit wordt bereikt door eerst tumor-sferoïden van reproduceerbare grootte te genereren in suspensie in 96-wells platen met een ronde bodem en ultralage hechting, met één sferoïde per well. De tweede stap is het verwijderen van delen van het medium en het direct toevoegen van basement membrane-achtige matrix of BMM aan elke well om een semi-solide matrix te verkrijgen waarin tumorcellen vanuit het sferoïde lichaam kunnen invaderen.

Vervolgens wordt de invasie van het tumorsferoïde op intervallen gemonitord over een periode van 72 tot 96 uur, waarbij de beeldacquisitie ofwel automatisch op een cytometer of handmatig via een microscoop wordt uitgevoerd. De laatste stap is het analyseren van de tumorcelinvasie met behulp van een geautomatiseerde cytometer of imaging-software. Uiteindelijk wordt de 3D tumorsferoïde-invasieassay gebruikt om kankerinvasie in vitro te modelleren in een formaat dat fysiologisch relevanter is en geschikter voor targetvalidatie en drugscreening-studies.

Wij geloven dat deze techniek complementair is aan de eenvoudige tweedimensionale celproliferatie-assays die gewoonlijk worden gebruikt voor targetvalidatie en drugscreening in kankeronderzoek, omdat het ons ook in staat stelt om invasie te onderzoeken, wat een cruciaal aspect is van kankerprogressie in een fysiologisch relevant driedimensionaal formaat. Ik kreeg voor het eerst het idee voor deze methode toen ik de 3D-tumorfenotype-groei op microplaten optimaliseerde. Ik dacht dat het goed zou zijn om dezelfde opstelling te gebruiken en ook naar de invasie te kijken; het resultaat was eenvoudig: slechts een deel van het medium uit elke put verwijderen en vervangen door een matrix die lijkt op het basaalmembraan.

Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien het in het begin lastig kan zijn om de steroïden in een centrale positie van elke put te houden na overdracht van de BMM. Dit kan leiden tot een suboptimale beeldanalyse doordat de steroïden zich in verschillende brandvlakken bevinden. Met ervaring.

Dit komt zelden voor, maar indien nodig kan het proces worden vergemakkelijkt door de plaat voorzichtig te centrifugeren. Om alle BMM overnacht op ijs te starten, bewaar een set steriele filtertips voor P 10 E 200 en P 1000 pipetten en steriele buisjes bij minus 20 °C. Plaats daarnaast de ultra low attachment 96-well platen met vier dagen oude steroïden op ijs.

Verwijder met een meerkanaalpipet voorzichtig 100 µL groeimedium per putje uit de sparrow-platen. Richt de tip bij deze stap naar de binnenwand van de U-bodem. Vermijd hierbij contact met de bodem van het putje en de locatie van de sfeer.

Om verstoring van de steroïden te minimaliseren, wordt het BMM met ijskoude tips overgebracht naar ijskoude buisjes. Voor cytokine-geïnduceerde invasie of voor evaluatiestudies naar geneesmiddelen worden reagentia aan het BMM toegevoegd met behulp van ijskoude tips. Gebruik bijvoorbeeld epidermale groeifactor of EGF om de invasie van Cal S- en cal r-plaveiselcelcarcinoomcellen te stimuleren.

Dispenseer vervolgens voorzichtig 100 µL van het BMM in de ubo-well, waarbij de tip naar de binnenwand van de well wordt gericht. Deze stap is het meest kritisch.

Wat betreft de optische beeldanalyse moeten de steroïden in het midden van de well blijven. Herhaal deze stap voor alle benodigde wells, waarbij vijf tot zes replica's per conditie worden gebruikt. Indien nodig, vervang de tip door een vers gekoelde tip met behulp van een steriele naald.

Verwijder eventuele luchtbellen. Controleer met een microscoop visueel of de steroiden centraal gepositioneerd zijn; indien dit niet het geval is, centrifugeer de plaat dan 3 minuten bij 300 ×g en 4 °C. Dit zorgt ervoor dat de steroiden zich centraal in elke well bevinden.

Plaats de plaat vervolgens in een incubator bij 37 °C en laat het BMM na één uur stollen. Gebruik een multikanalspipet om voorzichtig 100 µL compleet groeimedium per well toe te voegen voor studies naar cytokine-geïnduceerde invasie of evaluaties van geneesmiddelen.

Voeg cytokines of remmers toe aan het medium voor geautomatiseerde beeldacquisitie. Scan de platen op de cytometer met regelmatige tussenpozen. Selecteer, beginnend vanaf tijd nul, de applicatie voor confluentie.

Controleer vervolgens of het sterioscoopbeeld scherp is. Pas indien nodig de focus handmatig aan en stel de focusoffset in onder de bemonsteringsinstellingen.

Scan met de selector één centraal gezichtsveld. Na toevoeging van BMM zouden de tumorsteroïden in een centrale positie moeten zijn gebleven. Er is daarom geen noodzaak om de volledige put in de software te scannen.

Definieer de te scannen wells door deze op de plaatkaart te markeren. Klik vervolgens op 'start scan'. Selecteer voor geautomatiseerde beeldanalyse de applicatie voor confluentie.

Pas in het analyse-tabblad de applicatie-instellingen aan om een nauwkeurige segmentatie rond het steroïd te verkrijgen, inclusief celuitlopers en invaderende podia die zich in de BMM uitstrekken. Pas de instellingen aan voor elke tumorcellijn en/of op verschillende tijdstippen. Controleer of de analyse-instellingen geschikt zijn voor andere steroïden in de plaat door op een paar verschillende putjes te klikken.

Als de segmentatie een steroïde niet nauwkeurig omlijnt, pas dan de applicatie-instellingen verder aan. Klik op 'start analysis' op het tabblad met resultaten. Controleer meerdere wells om de kwaliteit van de analyse te verifiëren voordat de data op well-niveau naar een spreadsheetprogramma worden geëxporteerd.

Herhaal de analyse voor alle tijdspunten en bereken vervolgens de gemiddelde procentuele confluentie voor de replica-putjes en zet de invasie tegenover de tijd uit in een staafdiagram. Gebruik de gewenste wetenschappelijke grafiek- en statistische software voor handmatige beeldacquisitie; gebruik een omgekeerde microscoop uitgerust met het 10 x objectief om op intervallen een afbeelding van elke tumorsteroïde vast te leggen. Begin bij T gelijk aan nul tot T tussen 72 en 96 uur.

Afhankelijk van de snelheid van de invasie van de betreffende cellijn, gebruikt u een Forex-objectief wanneer een geïnvadeerd gebied te groot is om volledig binnen het gezichtsveld van 10x te worden vastgelegd. Sla elke afzonderlijk verworven afbeelding op voor handmatige beeldanalyse. Open de afbeeldingen van de stage graphe in de beeldanalyse.

De gekozen software voor kalibratie is images of a stage graphe taking. Gebruik hiervoor zowel 10 x als vier x objectieven. Voer de grafische metingen, de eenheden en de gebruikte objectieven in en voer de kalibratie uit.

Deze stap is slechts één keer vereist voor de daaropvolgende beeldanalyse. Laad simpelweg de vereiste kalibratie-instellingen. Open vervolgens de afbeeldingen van de invasie-assay en selecteer de kalibratie-instellingen op basis van het microscoopobjectief dat is gebruikt om de afbeeldingen te verkrijgen.

Meet het oppervlak dat door de steroïden wordt beslagen in de gebruikte software. Ga naar 'measure' en selecteer 'count size'. Kies 'while', laad vervolgens de instellingen en selecteer de vooraf vastgestelde assay-instellingen.

Kies vervolgens voor tellen. Het steroïde moet dan nauwkeurig gesegmenteerd zijn. Exporteer de metingen als verschillende parameters naar een spreadsheet en noteer de relevante beeldinformatie in de spreadsheet.

Plot tot slot de gemiddelde oppervlakte van de herhaalde steroïden of invasie tegenover de tijd met behulp van wetenschappelijke grafische en statistische software. Hier getoond als een voorbeeld van kanker-celinvasie waargenomen in de U 87 MG glioblastoom-cellijn, die kan worden gebruikt om hersentumorinvasie te illustreren. Zodra ze in BMM-cellen zijn ingebed, verspreiden ze zich met een typisch sterburst-invasiepatroon; dit proces wordt gedurende een periode van 72 uur gevolgd.

Volledig geautomatiseerde beeldanalyse. Het gebruik van een beeldcytometer resulteert in een segmentatie rondom de celuitlopers en maakt een nauwkeurige kwantificering van de invasie van tumorcellen mogelijk. Let erop dat voor deze cellijn het steroïdenlichaam wordt uitgesloten van de meting van het geïnfiltreerde oppervlak.

Volledig geautomatiseerde beeldanalyse kan eenvoudig worden uitgevoerd en biedt kwantificering van tumorcelinvasie in de loop van de tijd. Een ander patroon van celinvasie wordt vertoond door humane isogene plaveiselcelcarcinoomcellen uit hoofd-halsregio. Kankercellijnen Cal S zijn gevoelig voor, en CAL R zijn resistent tegen EGFR tyrosinekinaseremmers.

In afwezigheid van EGF innudeerde geen van beide cellijnen de BMM; in aanwezigheid van EGF werden vingerachtige uitstulpingen uit het hoofdlichaam van Cal ars steroiden geëxtrudeerd. Hoewel Cal s cellen minder invasief waren na 72 uur, werden de afbeeldingen in dit geval snel verkregen met behulp van een beeldcytometer en, om een alternatieve methode te illustreren, werd de mate van invasie handmatig gekwantificeerd met behulp van zelfstandige beeldanalyse-software. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat elke cellijn geoptimaliseerd moet worden voor het vermogen om steroiden te vormen, de zaaidichtheid van de cellen, de samenstelling van de matrix en de beeld- en analyse-instellingen. Na deze procedure kan dezelfde methode ook worden aangepast om 3D-weefselinvasie te beoordelen met behulp van bijvoorbeeld tumoren in co-cultuur met embryo-lichamen om een complex weefsel na te bootsen, of andere organoïden zoals astrocyten voor glioom, cryptculturen voor gastro-intestinale kankers, of lever voor hepatocellulair carcinoom en colonkanker-metastasen.