Name: Driedimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Leer een semi-geautomatiseerde 3D tumor spheroid invasie-assay voor kankeronderzoek met behulp van een basementmembraan-achtige matrix. Deze methode maakt tijdsafhankelijke monitoring van kankercelinvasie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door The National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (G1000121 ID no.94513) en de Oracle Cancer Trust. SE wordt ondersteund door The Institute of Cancer Research en Cancer Research UK (subsidienummer C309/A8274). Wij danken het NHS voor de financiering aan het NIHR Biomedical Research Centre.

1. Generatie van reproduceerbaar Sized Tumor Sferoïden <ol><li> Wash tumorcel monolagen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, 5 ml van een 25 cm 2 of 8-10 ml voor een 75 cm2 kolf), voeg celdissociatie enzyme (1 ml voor een 25 cm 2 of 2 ml van een 75 cm 2 kolf) en incubeer cellen bij 37 ° C gedurende 2-5 min. </li><li> Controleer cel onthechting onder een microscoop en neutraliseren celdissociatie enzym met compleet groeimedium (5 ml voor een 25 cm 2 of 8 ml voor een 75 cm2 kolf). </li><li> Centrifugeer celsuspensie bij 500 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder supernatant, tik op de buis en resuspendeer celpellet in 1 ml compleet groeimedium met een P1000 pipet. Dit zou een enkele celsuspensie verkregen zonder celgroepen. </li><li> Tellen cellen met een hemocytometer en verdun de celsuspensie te verkrijgen 0,5-2 x 10 4 cellen / ml (optimale celdichtheid moet worden bepaald voor elke cellijn order om bolvormige tumoren van 300 te verkrijgen - 500 pm diameter 4 dagen na cel zaaien 12,13). </li><li> Breng de celsuspensie om een steriele reservoir en, met behulp van een multichannel pipet, afzien van 200 ul / putje in ultra-low attachment (ULA) 96-well round bodemplaten 12. </li><li> Breng de platen een incubator (37 ° C, 5% CO2, 95% vochtigheid). Vier dagen later, visueel bevestigen tumor sferoïde formatie en ga verder met de 3D-invasie assay. </li></ol> 2. 3D Tumor Spheroid Invasion Assay <ol><li> Dooi BMM op ijs. </li><li> Houd een set van steriele filter tips voor P10, P200 en P1000 pipetten en steriele buizen (1,5 ml volume of meer, afhankelijk van het totale volume nodig) bij -20 ° C. </li><li> Plaats de ULA 96-well platen bevattende 4 dagen oude sferoïden op ijs. </li><li> Met behulp van een multichannel pipet, verwijder voorzichtig 100 ul / putje van groeimedium uit de bolvormige platen. Hiervoor staphoek de tips naar het inside wand van het U-bodem wells, het vermijden van contact met de bodem van de put en de locatie van de sferoïden; minimaliseren van verstoring van de sferoïden. </li><li> Met behulp van ijskoude tips, transfer BMM om ijskoude buizen. Voor cytokine-geïnduceerde invasie of voor drug evaluatiestudies, voeg reagentia (bij 2x de uiteindelijke concentratie) naar de BMM met ijskoude tips. Gebruik bijvoorbeeld epidermale groeifactor (EGF) aan de invasie van CAL CAL S en R squameuze carcinoomcellen stimuleren. Meng goed door voorzichtig te zwenken, het vermijden van de vorming van bellen. </li><li> Voorzichtig afzien 100 ul van BMM in de U-bodem vormt, de punt gericht naar de binnenwand van de put. Deze stap is de meest kritische als voor optimale beeldanalyse moet sferoïden in het midden van de put 12 blijven. </li><li> Herhaal stap 2.6 voor alle vereiste putten, waardoor 5-6 herhalingen / conditie. Indien nodig, te wijzigen om een ​​vers-gekoelde tip. OPMERKING: Wanneer meer ervaren, dispense BMM met behulp van een multichannel pipet. </li><li> Met behulp van een steriele naald, verwijder luchtbellen, indien aanwezig. <ol><li> Met behulp van een microscoop, visueel te controleren of sferoïden zijn in een centrale positie. Zo niet, gecentrifugeerd plaat bij 300 xg gedurende 3 min bij 4 ° C. Dit garandeert dat sferoïden centraal gelegen zijn in elk putje. </li></ol></li><li> Breng de plaat een incubator bij 37 ° C en laat de BMM stollen. </li><li> 1 uur later, met een multichannel pipet zachtjes voeg 100 ul / putje volledig groeimedium. Voor cytokine-geïnduceerde invasie of drug evaluatie studies, onder meer cytokines of remmers in het medium (1x uiteindelijke concentratie). Als alternatief, als reagens niet werd toegevoegd aan de BMM in stap 2,5, toevoegen aan het medium op dit punt (3x de gewenste eindconcentratie). </li></ol> 3. Automated Image Acquisition <ol><li> Scan platen op de cytometer (voor specificaties zie tabel van Equipment and Materials) met tussenpozen starting van tijd nul (t0 = dag van de invasie assay ingesteld, onmiddellijk na stap 2.10 tot 72 uur of 96 uur voor langzamere invasie tumorcellijnen. </li><li> Selecteer de &#39;Confluence&#39; applicatie. </li><li> Controleer of de bolvormige is scherpgesteld en, indien nodig, handmatig aanpassen en bevestig de &#39;Focus off-set&#39;. </li><li> Onder &#39;Sampling instellingen&#39;, selecteert u om een centrale gezichtsveld (FOV) te scannen. Na BMM Bovendien moeten bolvormige tumoren bleven in een centrale positie, is derhalve niet nodig de hele scan ook. </li><li> In de software bepalen de putten worden gescand door ze te markeren op het bord kaart. Klik op &#39;Start scan&#39;. LET OP: De scan wordt automatisch opgeslagen en kan later off-line te worden beoordeeld. </li></ol> 4. Automated Image Analysis <ol><li> Selecteer de toepassing &#39;Confluence&#39;. </li><li> In het tabblad &#39;Analysis&#39;, passen applictie-instellingen (bijvoorbeeld &quot;precisie&quot;: laag, normaal, hoog, &quot;intensiteitsdrempel&quot;: 1 - 15) om een precieze verdeling rond de sferoïde inbegrip celprocessen en invadopodia zich in de BMM (zie figuur 1) te produceren. Pas de instellingen voor elke tumor cellijn en / of op verschillende tijdstippen. De &#39;Confluence&#39; toepassing van de maatregelen% van de put gebied dat onder de binnenvallende cellen, in de geselecteerde FOV. </li><li> Controleer dat de analyse instellingen geschikt zijn (dat wil zeggen, segmentatie accuraat is) voor andere sferoïden in de plaat door te klikken op een paar verschillende putten. Als de segmentatie niet nauwkeurig schetsen een sferoïde, verder aan te passen aan de applicatie-instellingen. </li><li> Klik op &#39;Start analyse&#39;. </li><li> Op het tabblad &#39;Results&#39;, check meerdere putten analyse kwaliteit te controleren. Export &#39;Nou level data&#39; naar een spreadsheet programma. </li><li> REPEAt-analyse van alle tijdspunten. Bereken het gemiddelde% samenvloeiing voor repliceren putten en plot invasie (% samenvloeiing) tegen de tijd in een staafdiagram, met behulp van wetenschappelijke grafieken en statistische software keuze. </li></ol> 5. Manual Image Acquisition <ol><li> Opnemen van een beeld voor elke tumor sferoïde met tussenpozen vanaf t = 0 tot 72-96 uur, afhankelijk van de snelheid van inval van de cellijn in kwestie met behulp van een omgekeerde microscoop (bij een 96-putjesplaat dit duurt ongeveer 20 - 30 min). Gebruik een 10X objectief. Gebruik een 4x objectief wanneer een binnengedrongen gebied te groot is om volledig te worden meegenomen in het gebied 10X gezien. </li><li> Sla elke individuele afbeelding verworven. </li><li> Voor de kalibratie, neem foto&#39;s van een podium raster (1 mm) met behulp van zowel 10X en 4X doelstellingen (en afbeeldingen opslaan). </li></ol> 6. Manual Image Analysis <ol><li> Open het podium raster afbeeldingen in de beeldanalyse software van keuze. </li><li> Voer de graticule metingen, de eenheden (micrometer), de doelstellingen gebruikt (10X of 4X) en voer de kalibratie. Deze stap is slechts eenmaal vereist. Voor de daaropvolgende beeldanalyse, gewoon opnieuw de vereiste kalibratie-instellingen. </li><li> Open de invasie assay beelden en selecteer de kalibratie-instellingen, afhankelijk van de microscoop doelstelling (10X of 4X) gebruikt om de beelden te verkrijgen. <ol><li> Alternatief invoer verkregen beelden op een beeldvormend cytometer (stap 3) en handmatig analyseren, zoals beschreven voor afbeeldingen verkregen onder toepassing van een omgekeerde microscoop (zie figuur 3 en figuur 4 de resultaten). </li></ol></li><li> Meet het gebied dat door de bolletjes. <ol><li> In de software wordt gebruikt voor de Representatieve resultaten (voor specificaties zie tabel van Equipment and Materials), ga naar &#39;Measure&#39; en selecteer &#39;Count / size&#39;. Koos voor &#39;Bestand&#39; dan &#39;Load settings&#39; en selecteer vooraf vastgestelde ASSAy instellingen. Vervolgens kiest u &#39;Count&#39;. De sferoïde moet dan nauwkeurig worden gesegmenteerd. </li><li> Als alternatief ga naar &#39;Bewerken&#39; dan &#39;Teken / Objects Merge&#39; om het venster &#39;Magic Wand / Trace&#39; te openen. Gebruik de staf cursor te klikken op het bolvormige en het verkrijgen van segmentatie. Selecteer &#39;Trace&#39; (in het venster &#39;Magic Wand&#39;) naar de bolvormige handmatig schetsen met behulp van een muis. </li></ol></li><li> Metingen van verschillende parameters (oppervlakte, diameter, omtrek etc.) naar een spreadsheet exporteren. Record op de spreadsheet de relevante beeldinformatie (bijvoorbeeld, goed nummer, relatieve tijdstip). </li><li> Plot van de gemiddelde oppervlakte van repliceren sferoïden (inval) versus tijd met behulp van wetenschappelijke grafieken en statistische software. Alternatief Bereken de verandering in bolvormige gebied op elk tijdstip ten opzichte van het gebied op t = 0. Vervolgens plot invasie (t0%) versus tijd als een lineaire graph. </li></ol>

<ol><li>Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+evaluation+of+in+vitro+cell+culture+models+for+high-throughput+drug+screening+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+therapeutics%22%5BJournal%5D)">A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity.</a> Pharmacology & therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).</li>
<li>Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Dimensional+vs.+Three-Dimensional+In+Vitro+Tumor+Migration+and+Invasion+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Two-Dimensional vs. Three-Dimensional In Vitro Tumor Migration and Invasion Assays.</a> Methods and Protocols. 986, 227-252 (2013).</li>
<li>Hwang, Y. S., Park, K. K., Chung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invadopodia+formation+in+oral+squamous+cell+carcinoma%3A+the+role+of+epidermal+growth+factor+receptor+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Oral.+Biol%22%5BJournal%5D)">Invadopodia formation in oral squamous cell carcinoma: the role of epidermal growth factor receptor signalling.</a> Arch. Oral. Biol. 57 (4), 335-343 (2012).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+on+invadopodia+formation+for+lung+carcinoma+invasion+with+a+microfluidic+3D+culture+device%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Study on invadopodia formation for lung carcinoma invasion with a microfluidic 3D culture device.</a> PLoS One. 8 (2), e56448(2013).</li>
<li>Friedl, P., Alexander, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+invasion+and+the+microenvironment%3A+plasticity+and+reciprocity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity.</a> Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).</li>
<li>Brekhman, V., Neufeld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+asymmetric+3D+in-vitro+assay+for+the+study+of+tumor+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion.</a> BMC Cancer. 9, 415(2009).</li>
<li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+basement+membrane+matrix+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Semin. Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Nystrom, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> The Journal of pathology. 205 (4), 468-475 (2005).</li>
<li>Deisboeck, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+self-organization+in+tumour+systems%3A+complex+growth+dynamics+in+a+novel+brain+tumour+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Pattern of self-organization in tumour systems: complex growth dynamics in a novel brain tumour spheroid model.</a> Cell Prolif. 34 (2), 115-134 (2001).</li>
<li>Harma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+panel+of+three-dimensional+models+for+studies+of+prostate+cancer+growth%2C+invasion+and+drug+responses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses.</a> PLoS One. 5 (5), e10431(2010).</li>
<li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biol. 10, 29(2012).</li>
<li>Vinci, M., Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+spheroid-based+migration+assays+for+evaluation+of+therapeutic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents.</a> Methods and Protocols. , 253-266 (2013).</li>
<li>Box, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+serum+protein+signature+associated+with+resistance+to+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+inhibitors+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">A novel serum protein signature associated with resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Eur. J. Cancer. 49 (11), 2512-2521 (2013).</li>
<li>Khajah, M. A., Al Saleh, S., Mathew, S., M, P., Luqmani, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effect+of+growth+factors+on+invasion+and+proliferation+of+endocrine+resistant+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differential effect of growth factors on invasion and proliferation of endocrine resistant breast cancer cells.</a> PLoS One. 7 (7), e41847(2012).</li>
<li>Brosicke, N., van Landeghem, F. K., Scheffler, B., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tenascin-C+is+expressed+by+human+glioma+in+vivo+and+shows+a+strong+association+with+tumor+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+tissue+research%22%5BJournal%5D)">Tenascin-C is expressed by human glioma in vivo and shows a strong association with tumor blood vessels.</a> Cell and tissue research. 354 (2), 409-430 (2013).</li>
<li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li>
<li>Molina, J. R., Hayashi, Y., Stephens, C., Georgescu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+glioblastoma+cells+acquire+stemness+and+increased+Akt+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Invasive glioblastoma cells acquire stemness and increased Akt activation.</a> Neoplasia. 12 (6), 453-463 (2010).</li>
</ol>

Alle auteurs verklaren geen concurrerende belangenverstrengeling.

De beide tumormodellen beschreven (glioblastoma en SCCHN) werden specifiek geselecteerd om onze assay 3D illustreren zoals ze klinisch relevant lokaal invasieve kankers met een onvervulde behoefte aan effectieve therapieën 12. Na behandeling met geneesmiddelen, evaluatie van in vitro farmacodynamische (PD) biomarker veranderingen kunnen eenvoudig worden uitgevoerd door Western blot of immunoassays van lysaten na het gebruik van specifieke in de handel verkrijgbare reagentia naar cel herstel van BMM en / of immunofluorescente analyse van invasie bolvormige tumoren in hele toestaan mount vlekken. Dit invasie assay is een nuttige techniek voor snelle en reproduceerbare beoordeling van tumorcel invasie in een halfvast medium en daarom bijzonder geschikt voor latere in vitro screenen van geneesmiddelen. Kankercellen binnenvallen matrix in een 3D manier als ze verspreid een &quot;micro-tumor&quot;, vertegenwoordigd door de tumor sferoïde, en strekken zich in een extracellular matrix-achtige omgeving. De ware driedimensionaliteit van de assay is zichtbaar in de celmorfologie, die verschilt van de vlakke, hechtende cellen morfologie aannemen tijdens het verplaatsen op een vast substraat. De mate van invasie gemakkelijk gekwantificeerd met behulp van een beeldvormende cytometer, waardoor een automatische uitlezing, of met een gewone microscoop in combinatie met beeldverwerkingssoftware. Bovendien is deze methode geschikt voor het fluorescent imaging 13 (bijvoorbeeld bij cellijnen die fluorescerende eiwitten of vooraf gemerkt met fluorescente kleurstoffen). De werkwijze is eenvoudig uit te voeren met het enige kritische stap voorgesteld door de toevoeging van de BMM, wanneer er een risico van verstoring van de middenstand van de sferoïde in de put U-vormig. Dit kan leiden tot suboptimale beeldanalyse met bolletjes in verschillende beeldvlakken. Het is derhalve kritisch voor de BMM voorzichtig en langzaam goed aan elke. Na BMM Daarnaast is het raadzaam om de plaat te controlerenonder een microscoop en als de lokalisatie onacceptabel wordt beschouwd, kan dit worden verholpen door zacht centrifugeren. Met ervaring is dit zelden nodig. Hoewel deze werkwijze is robuust en zeer reproduceerbaar, kunnen inter-experimentele variatie optreden met verschillende batches van BMM. Om dit te vermijden, is het raadzaam om voldoende BMM kopen van een enkele partij aan een reeks studies voltooien. Een beperking van de werkwijze (zoals voor dergelijke assays) is het moeilijk om onderscheid te maken tussen invasie en proliferatie, waarbij de tumorcellen waarschijnlijke ondergaan gedurende de test periode. Hoewel de verdubbelingstijd van de cellen in aanmerking kan worden genomen of celcyclus remmers zoals cytochalasine D ingevoerd, is het niet gemakkelijk te controleren of een duidelijk onderscheid tussen deze twee aspecten van tumorprogressie, in het bijzonder voor snel groeiende tumorcellen en voor die die een meer &quot;uitgebreide&quot; dan infiltratieve, invasie patroon. Om deze redenwordt voorgesteld dat een parallelle 3D growth assay wordt uitgevoerd om specifieke effecten van remmende of stimulerende middelen te evalueren. Bij zorgvuldige dosis respons studies worden uitgevoerd, kan het mogelijk zijn om concentraties die gevolgen proliferatie minimaliseren selecteren. Zo hebben we aangetoond dat het HSP90 remmer 17-AAG remt U-87 MG 3D tumor sferoïde invasie al op 24 uur en bij concentraties beneden de concentratie die 3D-groei met 50% (GI 50) 12. Anderzijds, de betekenis van deze assay in vergelijking met andere standaard invasie assays (bijv filter gebaseerde bepalingen of invasie van enkele cellen in 3D-matrices 1), dat tumorcellen binnendringen in het omgevende matrix in het sferoïde, dat lijkt op een &quot; micro-tumor &quot;of&quot; micro-metastase &quot;, waardoor rekening gehouden met belangrijke aspecten van de pathofysiologie van een tumormassa. De methode die we presenteren geeft informatie over decollectief gedrag van tumorcellen, bij eerste verlaten van de sferoïden, alsmede afzonderlijk, als enkele cellen bereiken meer afgelegen gebieden van de BMM. Bovendien kunnen cellen in bolvormige tumoren hypoxie en voedingsstoffen ontbering ervaren die door veranderingen in genexpressie, kan bevorderen migratie en invasie; dergelijke functies ontbreken in 2D assays. Bovendien, dit alles in een high-throughput-formaat door het gebruik van specifieke 96-putjesplaten en de nieuwste beeldvormingstechnologie, waardoor een complexe 3D assay gemakkelijk gebruik in targetvalidatie en drug discovery. De werkwijze die we voorstellen is geschikt voor verdere verzoeken om aanvullende aspecten van tumorcel invasie pakken. In het bijzonder kunnen extra complexiteit door toevoeging van gastheercellen, zoals fibroblasten en / of endotheelcellen worden overwogen, in het bolvormige zelf of de omringende matrix. Dit kan ook worden gemodificeerd, niet alleen wat betreft de stijfheid (door het gebruik van verschillende concentrations van BMM), maar ook qua samenstelling (door toevoeging van andere componenten afhankelijk van de specifiek weefsel / orgaan van de vastgestelde tumormodel: bijvoorbeeld tenascine voor hersenkanker 16 en collageen voor borstcarcinoom 17). Een vergelijkbare opstelling (vorming van sferoïden en imaging) kunnen ook worden aangepast om weefsel invasie beoordelen 3D, waarbij bolvormige tumoren worden samen gekweekt met embryoid organen lijkt op een complex weefsel 12 of andere celspecifieke organoids (bijvoorbeeld astrocyten voor glioma 18 of crypte culturen voor gastro-intestinale kankers), maar verder werk is nodig om automatische beeldanalyse in te schakelen.

Klassieke ontwikkeling antikankergeneesmiddel is grotendeels gericht op het gebruik van in vitro op cellen gebaseerde assays voor het screenen op cytotoxische middelen die proliferatie van tumorcellen remmen en / of bevorderen geprogrammeerde celdood (apoptose). Recenter zijn pogingen bewogen naar gerichte therapieën bij de ontwikkeling van remmers van de onderliggende moleculaire oorzaak van kwaadaardige celproliferatie. Ondanks de spectaculaire resultaten zijn dergelijke middelen vaak geassocieerd met de snelle ontwikkeling van resistentie. Aangezien het invasieve en metastatische vermogen van tumorcellen die verantwoordelijk is voor de meerderheid van sterfgevallen door kanker, en recidief ziekte presenteert vaak agressiever fenotype, is het logisch ook complementair in vitro experimentele modellen 1,2 tot nieuwe identificatie te overwegen middelen die deze extra key &#39;kenmerken&#39; van kanker zal remmen. Tijdens kwaadaardige progressie, tumorcellen verwervende mogelijkheid om het omringende weefsel binnen te dringen en / of verspreid in afgelegen organen (metastase). Kankercellen doordringen in de basaal membraan door de vorming van invadopodia 3,4. Deze structuren zijn verrijkt met actine filamenten specifieke adhesie-eiwitten en proteasen en gezamenlijk verantwoordelijk voor tumor celbeweeglijkheid en afbraak van de extracellulaire matrix (ECM) 5. Invadopodia uit te breiden naar de ECM en worden verondersteld belangrijk voor tumorcel invasie te zijn en ook de extravasatie in vasculaire kanalen, hematogene (of lymfatische) verspreiding en metastase te vergemakkelijken. Voor standaardmethoden tumorcel invasie in vitro omvatten het volgende te evalueren. Transwell-gebaseerde of Boyden-kamer assays 2,6 waarin enkelvoudige celsuspensies worden geënt op een filter bekleed met een dikke laag ECM-afgeleide eiwitten. Cellen dringen en vervolgens verplaatsen naar de onderste kamer in reactie op een chemo-attractant. Veel gebruikte ECMeiwitten zijn type I collageen, of basaal membraan-achtige matrix (BMM bijvoorbeeld Matrigel, afgeleid van de EHS tumor 7) de natuurlijke samenstelling van basismembranen nabootst. Als alternatief voor de filter gebaseerde Type Boyden kamer 8 assays, kunnen cellen worden geënt bovenop een ECM gel (waarnaar fibroblasten kunnen worden toegevoegd) wanneer zij een monolaag en vormen dan individueel of collectief dringen in de gel. Invasion kan worden gemeten in termen van het aantal binnenvallende cellen en / of de afgelegde afstand van het gel oppervlak 9. Tumorcellen kunnen ook volledig worden ingebed in een matrix hetzij als celsuspensie of sferoïden - meestal geplaatst tussen twee lagen van ECM gel- waardoor cellen binnendringen van de tumormassa in de omgevende matrix 2,6,10,11. De driedimensionale (3D) tumor sferoïde invasie assay hier beschreven is, een snelle, automatiseerbare invasie systeem door een highly reproduceerbare gestandaardiseerde werkwijze 12 in een 96-well plaat formaat met een sferoïde per putje. BMM wordt direct toegevoegd aan elk putje van een halfvaste matrix waarin tumorcellen binnendringen van het bolvormige lichaam. De omvang van tumorcel invasie gecontroleerd met tussenpozen gedurende 72-96 uur. Deze werkwijze heeft de volgende voordelen ten opzichte van huidige in vitro invasie bovenstaande assays: de tumorcellen zijn georganiseerd in een 3D-structuur nabootsen van een tumor micro-omgeving of een micro-metastase; de bolvormige tumoren zijn zeer reproduceerbaar in grootte; de invasie assay wordt uitgevoerd in situ in dezelfde plaat als tumor sferoïde ontwikkeling zonder de noodzaak om deze secundaire platen bewegen; de werkwijze, gecombineerd met de nieuwste technologie van geautomatiseerde beeldanalyse, zodat zowel hoog gehalte en high throughput analyse van tumorcel invasie. De beeldanalyse wordt uitgevoerd met een beeldvormend cytometer, die een 96-well scansplaat binnen 10 min. Via de samenvloeiing toepassing de mate en snelheid van de invasie bereikt door enkele cellen of celgroepen uitspreiden van de bolvormige tumoren en invasie in de matrix kan worden gemeten in een dynamische wijze. Voor lagere throughput wordt een alternatieve methode voor het gepresenteerde analyse, gebaseerd op het gebruik van een omgekeerde microscoop en standaard beeldverwerkingssoftware.

<table><tbody><tr><td>Corning Matrigel basement membrane matrix</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>354234</td><td>Houd op 4 &amp;deg;C om stolling te voorkomen en te dispenseren met gekoelde pipetpunten</td></tr><tr><td>Cultrex basement membrane extract, PathClear</td><td><a href="http://www.trevigen.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Trevigen</a></td><td>3432-005-01</td><td>Houd op 4 &amp;deg;C om stolling te voorkomen en te dispenseren met gekoelde pipetpunten</td></tr><tr><td>96-wells plaat met ultra-lage hechting</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td><a href="http://www.miltenyibiotec.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Miltenyi Biotec</a></td><td>130-093-825</td><td>Voeg toe 100 &amp;mu;l 1% BSA (w/v) in water om 100 &amp;mu;g EGF. Naar 25 &amp;mu;l voeg hiervan toe 4,975 &amp;mu;l RHB-A-medium om een 5 &amp;mu;g/ml werkvoorraad. Verdeel in aliquoten en bewaar bij -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>RHB-A medium</td><td><a href="http://www.stemcellsinc.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Stem Cells Inc.</a></td><td>SCS-SF-NB-01</td><td>Voor het verdunnen van EGF</td></tr><tr><td>DMEM</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GIBCO</a></td><td>31966-021</td><td>Voorverwarmen 37 &amp;deg;C waterbad voor gebruik</td></tr><tr><td>Foetaal runderserum</td><td><a href="http://www.biosera.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Biosera</a></td><td>1001/500</td><td>Verhit bij 56 &amp;deg;C om complement te inactiveren voor gebruik</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GIBCO</a></td><td>12605</td><td>Celdisassociatie-oplossing</td></tr><tr><td>Celigo-cytometer</td><td><a href="http://www.nexcelom.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Nexcelom Bioscience</a></td><td>Geen gegevens beschikbaar</td><td>Gespecialiseerde apparatuur voor beeldacquisitie en -analyse. Handmatige beeldacquisitie via microscopie en onafhankelijke software voor beeldanalyse vormen een alternatief.</td></tr><tr><td>IX70 omgekeerde microscoop</td><td><a href="http://www.olympus.co.uk/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Olympus</a></td><td>Omdat er geen brontekst is verstrekt, kan ik geen vertaling produceren. Voer a.u.b. de Engelse tekst in die u wilt laten vertalen naar het Nederlands.</td><td>Wordt gebruikt met een camera voor handmatige beeldvastlegging</td></tr><tr><td>Retiga Exi Fast 1394 digitale camera</td><td><a href="http://www.qimaging.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Qimaging</a></td><td>Omdat er geen brontekst is verstrekt, kan ik geen vertaling genereren. Raadpleeg a.u.b. de brontekst en stuur deze naar mij door voor vertaling.</td><td>Bevestigd aan de microscoop voor handmatige beeldvastlegging</td></tr><tr><td>Image-Pro Plus 7.0</td><td><a href="http://www.mediacy.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Mediacybernetica</a></td><td>Omdat er geen brontekst is verstrekt, kan ik geen vertaling produceren. Voeg alstublieft de Engelse tekst toe die u vertaald wilt hebben naar het Nederlands.</td><td>Software gebruikt voor het aansturen van de camera en microscoop voor handmatige beeldacquisitie</td></tr><tr><td>Image-Pro Analyzer 7.0</td><td><a href="http://www.mediacy.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Media-cybernetica</a></td><td>Kunt u de brontekst verstrekken die u vertaald wilt hebben? Zodra u de tekst aanlevert, zal ik deze nauwkeurig vertalen naar wetenschappelijk Nederlands, conform uw specifieke richtlijnen voor JoVE-inhoud.</td><td>Zelfstandige beeldanalysesoftware voor handmatige meting van de grootte van sferoïden</td></tr><tr><td>Excel 2010</td><td><a href="http://www.microsoft.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Microsoft</a></td><td>Omdat er geen brontekst is verstrekt, kan ik geen vertaling produceren. Voer alstublieft de Engelse tekst in die u vertaald wilt hebben naar het Nederlands.</td><td>Wetenschappelijke grafiek- en statistische software</td></tr><tr><td>Prism 6.0</td><td><a href="http://www.graphpad.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GraphPad</a></td><td>Omdat u geen brontekst heeft verstrekt, kan ik geen vertaling genereren. Voer a.u.b. de Engelse tekst in die u naar het Nederlands vertaald wilt hebben.</td><td>Wetenschappelijke grafische en statistische software</td></tr></tbody></table>

driedimensionale (3d) tumor spheroid invasion assay

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasie van omringende normale weefsels wordt algemeen beschouwd als een essentieel kenmerk van kwaadaardig (in tegenstelling tot goedaardige) tumoren. Voor bepaalde kankers in het bijzonder (bijvoorbeeld hersentumoren zoals glioblastoom multiforme en plaveiselcelcarcinoom van het hoofd en de nek -. SCCHN) is een oorzaak van ernstige morbiditeit en kan levensbedreigend zelfs bij afwezigheid van metastasen op afstand zijn. Bovendien kankers die een recidief na behandeling nog vaak aanwezig met een agressiever fenotype. Daarom is er een mogelijkheid om het proces van invasie richten op nieuwe therapieën die complementair zijn aan standaard anti-proliferatieve middelen zouden kunnen zijn. Tot nu toe is deze strategie werd gehinderd door het ontbreken van een robuuste, reproduceerbare assays die geschikt zijn voor een gedetailleerde analyse van de invasie en voor drug discovery. Hier bieden we een eenvoudige micro-plaat methode (op basis van uniforme, zelfassemblerende 3D bolvormige tumoren), die een groot potentieel voor een dergelijke stu heeftoverlijdt. We illustreren de assay platform met een humane glioblastoma cellijn en ook SCCHN model waarbij de ontwikkeling van resistentie tegen gerichte epidermale groeifactor receptor (EGFR) remmers gepaard met verhoogde matrix-invasief potentieel. We bieden ook twee alternatieve methoden van semi-automatische kwantificatie: de ene met een imaging cytometer en een tweede die gewoon nodig standaard microscopie en beeld vast te leggen met een digitale beeldanalyse.

3D tumor sferoïde invasie wordt beoordeeld met behulp van een eenvoudige, reproduceerbare, geautomatiseerde werkwijze schematisch geïllustreerd in Figuur 1: reproduceerbaar sized bolvormige tumoren worden verkregen door platen ULA cellen in 96-well platen met ronde bodem. 4 dagen na de initiatie sferoïden worden ingebed in BMM. Dit zorgt voor een semi-vaste structuur waarin tumorcellen binnendringen en verspreiden van de sferoïde. Sferoïden zijn centraal gelegen aan de basis van elk putje en invasie in de BMM wordt gemakkelijk gevolgd met intervallen vanaf t = 0 tot 72-96 uur via een beeldvormend cytometer. Dit kan volledig geautomatiseerde beeldanalyse bieden. Voorbeelden van verschillende soorten kankercel invasie zijn geïllustreerd in figuren 2 -. 4 de zeer kwaadaardige humane glioblastoma multiforme (GBM) cellijn U-87 MG, vormt een dichte, bolvormige 3D structuur en wordt hier gebruikt om hersentumoren illustreren waarbij de lokale invasie is een belangrijke levensbedreigendefunctie. Eenmaal ingebed in BMM, cellen van U-87 MG bolletjes verspreid met een typische &quot;starburst&quot; invasie patroon 12. Tumorcellen radiaal in de matrix waarin ze handhaven van een 3-dimensionale vorm. Het proces wordt gevolgd gedurende een periode van 72 uur zoals getoond in figuur 2 voor U-87 MG sferoïden, wanneer de mate van tumorcel invasie, met vermelding van de cellulaire processen en invadopodia vergroten wanneer BMM is duidelijk zichtbaar. Volledig geautomatiseerde beeldanalyse met behulp van een afbeelding cytometer maakt een nauwkeurige kwantificering van de tumorcel invasie in de tijd. De kwantificering in figuur 2 wordt verkregen zoals weergegeven in figuur 1, waarbij de geautomatiseerde analyse produceert segmentatie rond de cel uitsteeksels uitstrekken in de BMM van de U-87 MG sferoïde lichaam. Merk op dat voor deze cellijn wordt de tumor sferoïde lichaam betrokken in de bepaling van de binnengedrongen zone. Een ander patroon van invasion werd getoond door menselijke squameuze hoofd en nek kanker cellijnen. CAL CAL S en R zijn isogene maar CAL S is gevoelig voor en CAL R resistent tegen EGFR tyrosine kinase inhibitors 14. Bij afwezigheid van EGF noch cellijn binnengedrongen in de BMM (figuur 3) Aangezien de concentratie van EGF verhoogd (tot 2,5 ng / ml), kunnen de sferoïden lijken &quot;bud&quot;. Bij de hogere concentraties van EGF (40 en 80 ng / ml) de mate van invasie verminderde. Dit strookt met de klassieke klokvormige dosisrespons op EGF in termen van invasie die eerder gerapporteerd 15. In 20 ng / ml EGF, vinger-achtige uitsteeksels geëxtrudeerd uit het hoofdgedeelte van CAL R sferoïden terwijl CAL S cellen waren minder invasieve na 72 uur (figuur 3). Dit verschil invasie bleek 48 uur na sferoïden in BMM (bevattende 20 ng / ml EGF voor maximale verschil tussen cellijnen werden geplaatst) En hoogste na 72 uur (Figuur 4). Deze beelden werden snel verkregen middels een beeldvormend cytometer, als U-87 MG. Echter, in dit geval een alternatieve methode illustreren, werd de mate van invasie manueel gekwantificeerd middels stand-alone beeldanalyse software en grafisch weergegeven (figuren 3 en 4). Deze resultaten illustreren een fenotypisch verschil tussen de geneesmiddel-gevoelige en resistente cellen die kunnen worden gebruikt om te screenen op verbindingen die specifiek zullen antagoniseren de drug resistant, invasief fenotype. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig1.jpg" /> Figuur 1. Schematische weergave van 3D-tumor sferoïde invasie assay. De workflow toont de stappen van de methode houdt in, waaronder representatieve beelden van de U-87 MG glioblastoom spheroids net na het integreren BMM (bovenste paneel; t = 0) en na de invasie<html> in BMM (onderste paneel; t = 72 uur) met en zonder de segmentatie dat het gebied dat door de binnenvallende cellen meet. Bar = 100 micrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig2.jpg" /> Figuur 2. Tijdsverloop van U-87 MG glioblastoom sferoïde invasie in BMM. U-87 MG 3D sferoïde invasie in BMM werd gevolgd en gekwantificeerd tot 72 uur met behulp van een beeldvormende cytometer. (A) Representatieve beelden en (B) kwantificering van tumorcelinvasie getoond. Bar = 500 pm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> re 3 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52686 / 52686fig3.jpg &quot;/&gt; Figuur 3. CAL R (resistent) en CAL S (gevoelige) tumor sferoïde invasie. (A) Vertegenwoordiger beelden en (B) handmatig kwantificering van EGF dosisafhankelijke CAL R en CAL S tumor sferoïde invasie worden getoond. Bar = 500 pm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig4.jpg" /> Figuur 4. Cellen uit CAL R (resistent) sferoïden zijn meer invasief dan CAL S (gevoelige) bolvormige tumoren wanneer geplaatst in BMM. Bij EGF stimulatie CAL R bolvormige tumoren vertonen een meer uitgesproken invasie dan CAL S. (A) Representatieve beelden en (B) handmatig kwantificering van invasie getoond. Bar = 500 pm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Invasie van omliggende normale weefsels is een typerend kenmerk van kwaadaardige tumoren. We bieden hier een eenvoudige, semi-geautomatiseerde microplaattest van invasie in een natuurlijke 3D biomatrix die met een aantal modellen van gevorderde menselijke kankers is geëxemplifeerd.

Driedimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Het algemene doel van deze procedure is het bieden van een in vitro, semi-geautomatiseerde, driedimensionale microplate-assay voor tumorcelinvasie. Dit wordt bereikt door eerst tumor-sferoïden van reproduceerbare grootte te genereren in suspensie in 96-wells platen met een ronde bodem en ultralage hechting, met één sferoïde per well. De tweede stap is het verwijderen van delen van het medium en het direct toevoegen van basement membrane-achtige matrix of BMM aan elke well om een semi-solide matrix te verkrijgen waarin tumorcellen vanuit het sferoïde lichaam kunnen invaderen.Vervolgens wordt de invasie van het tumorsferoïde op intervallen gemonitord over een periode van 72 tot 96 uur, waarbij de beeldacquisitie ofwel automatisch op een cytometer of handmatig via een microscoop wordt uitgevoerd. De laatste stap is het analyseren van de tumorcelinvasie met behulp van een geautomatiseerde cytometer of imaging-software. Uiteindelijk wordt de 3D tumorsferoïde-invasieassay gebruikt om kankerinvasie in vitro te modelleren in een formaat dat fysiologisch relevanter is en geschikter voor targetvalidatie en drugscreening-studies.Wij geloven dat deze techniek complementair is aan de eenvoudige tweedimensionale celproliferatie-assays die gewoonlijk worden gebruikt voor targetvalidatie en drugscreening in kankeronderzoek, omdat het ons ook in staat stelt om invasie te onderzoeken, wat een cruciaal aspect is van kankerprogressie in een fysiologisch relevant driedimensionaal formaat. Ik kreeg voor het eerst het idee voor deze methode toen ik de 3D-tumorfenotype-groei op microplaten optimaliseerde. Ik dacht dat het goed zou zijn om dezelfde opstelling te gebruiken en ook naar de invasie te kijken; het resultaat was eenvoudig: slechts een deel van het medium uit elke put verwijderen en vervangen door een matrix die lijkt op het basaalmembraan.Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien het in het begin lastig kan zijn om de steroïden in een centrale positie van elke put te houden na overdracht van de BMM. Dit kan leiden tot een suboptimale beeldanalyse doordat de steroïden zich in verschillende brandvlakken bevinden. Met ervaring.Dit komt zelden voor, maar indien nodig kan het proces worden vergemakkelijkt door de plaat voorzichtig te centrifugeren. Om alle BMM overnacht op ijs te starten, bewaar een set steriele filtertips voor P 10 E 200 en P 1000 pipetten en steriele buisjes bij minus 20 °C. Plaats daarnaast de ultra low attachment 96-well platen met vier dagen oude steroïden op ijs.Verwijder met een meerkanaalpipet voorzichtig 100 µL groeimedium per putje uit de sparrow-platen. Richt de tip bij deze stap naar de binnenwand van de U-bodem. Vermijd hierbij contact met de bodem van het putje en de locatie van de sfeer.Om verstoring van de steroïden te minimaliseren, wordt het BMM met ijskoude tips overgebracht naar ijskoude buisjes. Voor cytokine-geïnduceerde invasie of voor evaluatiestudies naar geneesmiddelen worden reagentia aan het BMM toegevoegd met behulp van ijskoude tips. Gebruik bijvoorbeeld epidermale groeifactor of EGF om de invasie van Cal S- en cal r-plaveiselcelcarcinoomcellen te stimuleren.Dispenseer vervolgens voorzichtig 100 µL van het BMM in de ubo-well, waarbij de tip naar de binnenwand van de well wordt gericht. Deze stap is het meest kritisch.Wat betreft de optische beeldanalyse moeten de steroïden in het midden van de well blijven. Herhaal deze stap voor alle benodigde wells, waarbij vijf tot zes replica's per conditie worden gebruikt. Indien nodig, vervang de tip door een vers gekoelde tip met behulp van een steriele naald.Verwijder eventuele luchtbellen. Controleer met een microscoop visueel of de steroiden centraal gepositioneerd zijn; indien dit niet het geval is, centrifugeer de plaat dan 3 minuten bij 300 ×g en 4 °C. Dit zorgt ervoor dat de steroiden zich centraal in elke well bevinden.Plaats de plaat vervolgens in een incubator bij 37 °C en laat het BMM na één uur stollen. Gebruik een multikanalspipet om voorzichtig 100 µL compleet groeimedium per well toe te voegen voor studies naar cytokine-geïnduceerde invasie of evaluaties van geneesmiddelen.Voeg cytokines of remmers toe aan het medium voor geautomatiseerde beeldacquisitie. Scan de platen op de cytometer met regelmatige tussenpozen. Selecteer, beginnend vanaf tijd nul, de applicatie voor confluentie.Controleer vervolgens of het sterioscoopbeeld scherp is. Pas indien nodig de focus handmatig aan en stel de focusoffset in onder de bemonsteringsinstellingen.Scan met de selector één centraal gezichtsveld. Na toevoeging van BMM zouden de tumorsteroïden in een centrale positie moeten zijn gebleven. Er is daarom geen noodzaak om de volledige put in de software te scannen.Definieer de te scannen wells door deze op de plaatkaart te markeren. Klik vervolgens op 'start scan'. Selecteer voor geautomatiseerde beeldanalyse de applicatie voor confluentie.Pas in het analyse-tabblad de applicatie-instellingen aan om een nauwkeurige segmentatie rond het steroïd te verkrijgen, inclusief celuitlopers en invaderende podia die zich in de BMM uitstrekken. Pas de instellingen aan voor elke tumorcellijn en/of op verschillende tijdstippen. Controleer of de analyse-instellingen geschikt zijn voor andere steroïden in de plaat door op een paar verschillende putjes te klikken.Als de segmentatie een steroïde niet nauwkeurig omlijnt, pas dan de applicatie-instellingen verder aan. Klik op 'start analysis' op het tabblad met resultaten. Controleer meerdere wells om de kwaliteit van de analyse te verifiëren voordat de data op well-niveau naar een spreadsheetprogramma worden geëxporteerd.Herhaal de analyse voor alle tijdspunten en bereken vervolgens de gemiddelde procentuele confluentie voor de replica-putjes en zet de invasie tegenover de tijd uit in een staafdiagram. Gebruik de gewenste wetenschappelijke grafiek- en statistische software voor handmatige beeldacquisitie; gebruik een omgekeerde microscoop uitgerust met het 10 x objectief om op intervallen een afbeelding van elke tumorsteroïde vast te leggen. Begin bij T gelijk aan nul tot T tussen 72 en 96 uur.Afhankelijk van de snelheid van de invasie van de betreffende cellijn, gebruikt u een Forex-objectief wanneer een geïnvadeerd gebied te groot is om volledig binnen het gezichtsveld van 10x te worden vastgelegd. Sla elke afzonderlijk verworven afbeelding op voor handmatige beeldanalyse. Open de afbeeldingen van de stage graphe in de beeldanalyse.De gekozen software voor kalibratie is images of a stage graphe taking. Gebruik hiervoor zowel 10 x als vier x objectieven. Voer de grafische metingen, de eenheden en de gebruikte objectieven in en voer de kalibratie uit.Deze stap is slechts één keer vereist voor de daaropvolgende beeldanalyse. Laad simpelweg de vereiste kalibratie-instellingen. Open vervolgens de afbeeldingen van de invasie-assay en selecteer de kalibratie-instellingen op basis van het microscoopobjectief dat is gebruikt om de afbeeldingen te verkrijgen.Meet het oppervlak dat door de steroïden wordt beslagen in de gebruikte software. Ga naar 'measure' en selecteer 'count size'. Kies 'while', laad vervolgens de instellingen en selecteer de vooraf vastgestelde assay-instellingen.Kies vervolgens voor tellen. Het steroïde moet dan nauwkeurig gesegmenteerd zijn. Exporteer de metingen als verschillende parameters naar een spreadsheet en noteer de relevante beeldinformatie in de spreadsheet.Plot tot slot de gemiddelde oppervlakte van de herhaalde steroïden of invasie tegenover de tijd met behulp van wetenschappelijke grafische en statistische software. Hier getoond als een voorbeeld van kanker-celinvasie waargenomen in de U 87 MG glioblastoom-cellijn, die kan worden gebruikt om hersentumorinvasie te illustreren. Zodra ze in BMM-cellen zijn ingebed, verspreiden ze zich met een typisch sterburst-invasiepatroon; dit proces wordt gedurende een periode van 72 uur gevolgd.Volledig geautomatiseerde beeldanalyse. Het gebruik van een beeldcytometer resulteert in een segmentatie rondom de celuitlopers en maakt een nauwkeurige kwantificering van de invasie van tumorcellen mogelijk. Let erop dat voor deze cellijn het steroïdenlichaam wordt uitgesloten van de meting van het geïnfiltreerde oppervlak.Volledig geautomatiseerde beeldanalyse kan eenvoudig worden uitgevoerd en biedt kwantificering van tumorcelinvasie in de loop van de tijd. Een ander patroon van celinvasie wordt vertoond door humane isogene plaveiselcelcarcinoomcellen uit hoofd-halsregio. Kankercellijnen Cal S zijn gevoelig voor, en CAL R zijn resistent tegen EGFR tyrosinekinaseremmers.In afwezigheid van EGF innudeerde geen van beide cellijnen de BMM; in aanwezigheid van EGF werden vingerachtige uitstulpingen uit het hoofdlichaam van Cal ars steroiden geëxtrudeerd. Hoewel Cal s cellen minder invasief waren na 72 uur, werden de afbeeldingen in dit geval snel verkregen met behulp van een beeldcytometer en, om een alternatieve methode te illustreren, werd de mate van invasie handmatig gekwantificeerd met behulp van zelfstandige beeldanalyse-software. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat elke cellijn geoptimaliseerd moet worden voor het vermogen om steroiden te vormen, de zaaidichtheid van de cellen, de samenstelling van de matrix en de beeld- en analyse-instellingen. Na deze procedure kan dezelfde methode ook worden aangepast om 3D-weefselinvasie te beoordelen met behulp van bijvoorbeeld tumoren in co-cultuur met embryo-lichamen om een complex weefsel na te bootsen, of andere organoïden zoals astrocyten voor glioom, cryptculturen voor gastro-intestinale kankers, of lever voor hepatocellulair carcinoom en colonkanker-metastasen.

three-dimensional-3d-tumor-spheroid-invasion-assay

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Een test om kwantitatief te meten Transforming Growth Factor (TGF)-β-geïnduceerde invasie in 3-dimensionale collageen gels is beschreven. Deze test maakt gebruik van de MCF10A reeks van cel-lijnen, die verschillende stadia van de ontwikkeling van borstkanker te vertegenwoordigen. Deze methode kan worden vastgesteld om te worden gebruikt met andere cellijnen en kan worden gebruikt om andere potentiële activatoren of inhibitoren van een invasie te onderzoeken.

Sferoïde Assay voor TGF-β-geïnduceerde Invasion Measure

This video demonstrates a method to establish a three-dimensional tumor spheroid and T cell co-culture. An agarose cast with microwells containing tumor spheroids is prepared, followed by the addition of T cells. After incubation, this setup allows studying the interaction of T cells with tumor spheroids in a controlled three-dimensional environment.

A Three-Dimensional Co-culture Model of Infiltrating T Cells in Tumor Spheroids

Source: Guyon, J., et al. A 3D Spheroid Model for Glioblastoma. J. Vis. Exp. (2020)The video demonstrates the generation of a three-dimensional spheroid model of tumor cell invasion. Spheroids are formed from human brain tumor cells and embedded in a collagen matrix. The tumor cells at the spheroid periphery adopt an invasive phenotype, secreting proteases to degrade the collagen and advancing to invade the surrounding matrix.

Generation of a Three-Dimensional Spheroid Model of Tumor Cell Invasion

Deze methode evalueert de invasie van kankercellen uit sferoïden in een omringende 3D-matrix.  Sferoïden worden gegenereerd via de hanging drop-kweekmethode en vervolgens ingebed in een matrix bestaande uit basement membraanmaterialen en type I collageen.  Invasie uit de sferoïden wordt vervolgens gemonitord.

Een Cancer Cell Sferoïde Assay om Invasion beoordelen in een 3D-instelling

De processen die blaas kanker invasie vertegenwoordigen mogelijkheden voor biomerker en therapeutische ontwikkeling. Hier presenteren we een blaas kanker invasie model waarin 3D-cultuur tumor spheroïden, time-lapse beeldvorming en confocale microscopie. Deze techniek is handig voor het definiëren van de kenmerken van de invasieve proces en voor het screenen van therapeutische agenten.

3D-celcultuur voor het bestuderen van de invasie en evalueren van Therapeutics in blaaskanker

Tumor microenvironment is een essentieel onderdeel van kankergroei en invasie. Om kanker progressie na te bootsen, is een biologisch relevante menselijke matrix nodig. Dit protocol introduceert een verbetering voor de drie-dimensionale sferoïde invasie assay in vitro door het toepassen van een menselijke leiomyoma-gebaseerde matrix. Het protocol introduceert ook een computer-based cel invasie analyse.

Volledig menselijke tumor-gebaseerde matrijs in driedimensionele sferoïde invasie assay

Het doel van dit protocol is om een 3D in vitro model te vestigen om de differentiatie van met kanker geassocieerde fibroblasten (CAFs) in een tumor bulk-achtige omgeving te bestuderen, die kan worden aangepakt in verschillende analysesystemen, zoals immunofluorescentie, transcriptionele analyse en Life Cell Imaging.

Een 3D-Spheroid-model als een fysiologisch systeem voor de differentiatie van kanker-geassocieerde fibroblasten en invasies in vitro studies

Hier beschrijven we een gebruiksvriendelijke invasietest voor glioblastoom. Deze test is geschikt voor glioblastoom stamcellen-achtige cellen. Een Fiji macro voor eenvoudige kwantificering van invasie, migratie en proliferatie wordt ook beschreven.

Een 3D Spheroid Model voor Glioblastoom

De gepresenteerde aanpak evalueert tegelijkertijd kankercelinvasie in 3D-sferoïde testen en T-celcytotoxiciteit. Sferoïden worden gegenereerd in een steiger-vrije agarose multi-microwell gegoten. Co-cultuur en inbedding in type I collageen matrix worden uitgevoerd in hetzelfde apparaat dat het mogelijk maakt om kankercel invasie en T-cel gemedited cytotoxiciteit te controleren.

Monitoring Cancer Cell Invasion en T-Cell Cytotoxicity in 3D Cultuur

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de fabricage van een sferoïde beeldvormingsapparaat. Dit apparaat maakt dynamische of longitudinale fluorescentiebeeldvorming van kankercelsferoïden mogelijk. Het protocol biedt ook een eenvoudige beeldverwerkingsprocedure voor de analyse van kankercelinvasie.

Time-Resolved Fluorescentie Beeldvorming en analyse van kankercelinvasie in het 3D Spheroid Model

Invasie is een belangrijk biologisch fenomeen bij de ontwikkeling en progressie van kanker. Dit proces wordt beïnvloed door niet-neoplastische cellen en componenten van de micro-omgeving van de tumor. Het doel van deze studie is het beschrijven van een alternatieve methode voor het analyseren van tumorcelinvasie in vitro met behulp van driedimensionale (3D) culturen.

Alternatieve strategie om in vitro celinvasie van 3D-culturen te analyseren

Leer een semi-geautomatiseerde 3D tumor spheroid invasie-assay voor kankeronderzoek met behulp van een basementmembraan-achtige matrix. Deze methode maakt tijdsafhankelijke monitoring van kankercelinvasie mogelijk.

Driedimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Meer video's verkennen