Vereenvoudigde Human Neutrophil Extracellular traps (NET) Isolatie en Handling

Het algemene doel van het volgende experiment is om een eenvoudig protocol te demonstreren voor het isoleren van neutrofielen, extracellulaire vallen of netten uit menselijk volbloed met behulp van gemakkelijk verkrijgbare reagentia. Dit wordt bereikt door eerst neutrofielen uit menselijk volbloed te isoleren, waarbij een differentiële centrifugatietechniek als tweede stap wordt gebruikt. Geïsoleerde neutrofielen worden gestimuleerd met PMA om netvorming te induceren, ook wel NETose genoemd.

Vervolgens wordt een plaat bereid met een celvrij netisolaat en worden kankercellen toegevoegd om te demonstreren hoe de netten de hechting van de cellen beïnvloeden. De resultaten tonen aan dat de toevoeging van een netmonolaag de hechting van 5 49-kankercellen verbetert en dat deze hechting wordt verminderd wanneer de netten worden afgebroken. Het gebruik van DNAS een Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal.

Gezien de nieuwheid van deze techniek is de behandeling van neutrofielen of cellulaire vallen of netten uiterst moeilijk vanwege hoe kwetsbaar deze structuren zijn. Om te beginnen, verkrijg 80 milliliter vers menselijk volbloed in 14 heparine-gecoate groene bovenbuizen zoals beschreven in het tekstprotocol. Open elke buis en voeg vijf milliliter PBS zonder calcium en magnesium toe aan elke buis.

Voeg vervolgens 15 milliliter lymfocytscheidingsmedium of LSM toe aan elk van de vier 50 milliliter kegelbuizen bij kamertemperatuur. Gebruik vervolgens een 18 gauge naald gemonteerd op een 60 milliliter spuit om voorzichtig het verdunde bloed op de LSM te plaatsen, waardoor een scherpe LSM-bloedinterface ontstaat. Centrifugeer de buizen gedurende 30 minuten bij 800 keer G op 21 graden Celsius zonder te stoppen. Stop de centrifuge voorzichtig en aspireer en gooi de bovenste twee vloeistoflagen en de interface ertussen weg, waardoor alleen de onderste rode laag overblijft. Deze pellet bevat erytrocyten en neutrofielen.

Voeg 20 milliliter PBS en 20 milliliter 6%dextranoplossing toe aan elke buis. Draai elke buis voorzichtig om en laat ze 30 minuten op kamertemperatuur staan. De rode bloedcellen zullen naar de bodem van de buis sedimenteren.

Breng vervolgens de supernatanten over in verse buizen en gooi de pallets weg. Centrifugeer de supernatanten bij 450 keer G bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten en gooi vervolgens het supernatant weg, waardoor de neutrofielenrijke pellet overblijft. Bereid een lyseringsoplossing met 0,5 milliliter lysisbuffer in 4,5 milliliter steriel water.

Voeg in totaal vijf milliliter van de lyseringsoplossing toe aan elke buis en verzamel alle pellets in één fles. Plaats de fles in het donker gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om eventuele resterende rode bloedcellen te verwijderen. Centrifugeer de neutrofielen bij 450 keer G bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten.

Gooi het supernatant weg en was de pellet met vijf milliliter PBS zonder calcium en magnesium. Centrifugeer vervolgens het monster opnieuw bij 450 keer G bij vier graden Celsius en verwijder het supernatant dat de resterende lysisoplossing bevat. Resuspendeer de neutrofielenpellet in 30 milliliter koud RPMI-medium dat is aangevuld met 3% foetaal bovien serum en plaats de buis op ijs om de vorming van neutrofielenextracellulaire vallen of netten te stimuleren.

Voeg 500 nanomolair van PMA toe aan 30 liter van de neutrofielensuspensie in een 150 millimeter bij 25 millimeter vlakke weefselkweekschotel. Met een raster van 20 millimeter, incubeer de cellen gedurende vier uur bij 37 graden Celsius onder 5% koolstofdioxide. Na incubatie, aspireer voorzichtig en gooi het medium weg, zorg ervoor dat de laag netten en neutrofielen die zich aan de bodem van de schotel hechten, niet worden verstoord.

Gebruik vervolgens een pipet om de bodem van elke schotel te wassen met 15 milliliter koud PBS zonder calcium en magnesium, al het aangehechte materiaal moet van de bodem worden verwijderd. Verzamel de wassuspensie in een 15 milliliter kegelbuis en centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 450 keer G. Bij vier graden Celsius zullen neutrofielen en eventuele resterende cellen zich aan de bodem nestelen.

Laat een celvrij netrijk supernatant achter, decanteer vervolgens het supernatant in meerdere 1,5 milliliterbuisjes en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 graden Celsius bij acht keer 18.000 keer G. Om het DNA te pelleten, gooi het supernatant weg en resuspendeer de pellet in PBS zodanig dat de concentratie overeenkomt met twee keer 10 tot de zevende neutrofielen per 100 microliter PBS. Dit celvrije netvoorraad kan worden gebruikt voor volgende experimenten.

Meet de DNA-concentratie van het monster met behulp van spectrofotometrie. Een adequate concentratie zou moeten variëren tussen 140 en 180 nanogram per microliter bij 100 microliter van de netvoorraad in elke put van een 96-puts vlakke bodemplaat en incubeer de plaat een nacht lang bij vier graden Celsius in het donker om de putten te coaten. 12 tot 20 uur later, gebruik een microscoop om de vorming van een uniforme monolaag van celvrije netten op de bodem van de putten te verifiëren. Zodra de monolaag is geverifieerd, aspireer voorzichtig al het niet-aangehechte materiaal uit de putten weg.

Zorg ervoor dat de monolaag op de bodem niet wordt verstoord. Dit is het meest uitdagende aspect van deze procedure. Om een adequate netmonolaag te behouden, moet u de plaat zeer voorzichtig behandelen.

Voeg alle reagentia en cellen langzaam toe aan de zijkant van de putten, aspireer zeer voorzichtig en vermijd contact met de bodem van de put met een zuigtip. Met het niet-aangehechte materiaal verwijderd, voeg voorzichtig 100 microliter van een 1% bovien serumalbumine blokkeringsoplossing toe aan elke put en laat het een uur staan bij kamertemperatuur. Agiteer of schud de plaat niet, omdat dit de netmonolaag kan verstoren.

Bereid vervolgens een 5 49 kankercel voor door ze te oogsten wanneer ze 70 tot 80% confluent zijn. Gebruik standaardtechnieken om de cellen op te schorsen in medium met een concentratie van twee keer 10 tot de vierde cellen per 10