Name: Productie, karakterisering en toepassingsmogelijkheden van een 3D Tissue-engineered Human Slokdarmkanker Mucosale Model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Verken de productie en karakterisering van een 3D weefsel-geïngeerd model van het menselijke slokdarmepitheel met primaire cellen en een gedeceleulariseerd porcine scaffold. Dit platform ondersteunt onderzoek naar slokdarmbiologie en regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn dankbaar dat de heer Roger Ackroyd, de heer Andrew Wyman en de heer Chris Stoddard, Consultant Chirurgen op Sheffield Teaching Hospitals NHS Foundation Trust, voor hun hulp bij het verwerven van slokdarmkanker weefselmonsters en hun steun aan ons werk. Wij danken Ashraful Haque voor zijn hulp opnemen tumorcellijnen in het model. Wij erkennen dankbaar financiële steun voor deze studie door subsidies van de Bardhan Research en Education Trust (BRET) en Yorkshire Cancer Research (YCR).

Menselijke slokdarm cellen worden verkregen van patiënten die maag of slokdarm operatie. Geïnformeerde toestemming is verkregen voor het weefsel te worden gebruikt voor onderzoeksdoeleinden, en het weefsel anoniem gebruikt onder de juiste ethische goedkeuringen (SSREC 165/03, Human Research Tissue Bank Licence 12179). 1. Isolatie van de Mens Slokdarmkanker epitheelcellen <ol><li> Werken in een laminaire stroming weefselkweek kap en met steriele techniek bereidt de epitheliale kweekmedium door menging Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM) en Ham&#39;s F12 in een 3: 1 verhouding (v: v). Voeg 10% (v / v) FCS, 10 ng / ml epidermale groeifactor, 0,4 ug / ml hydrocortison, 1,8 x 10 -4 M adenine, 5 ug / ml insuline, 5 ug / ml transferrine, 2 x 10 -7 M triiodothyronine, 1 x 10 -10 M choleratoxine, 2 x 10 -3 M glutamine, 100 IU / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, en 0,625 ug / ml amfotericine B. </li><li> Met behulp van standaardsteriele technieken, zet 11 ml DMEM, 10% FCS, 2 x 10 -3 M L-glutamine, 100 IU / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, en 0,625 ug / ml amfotericine B in een T75 weefselkweek kolf. Voeg 1 x 10 6 lethaal bestraalde 3T3 fibroblasten 12 in 1 ml van hetzelfde medium en incubeer overnacht bij 37 ° C in een 5% CO 2, vochtige atmosfeer. Dit zal een voederlaag voor de volgende kweken van epitheliale cellen. </li><li> Met behulp van een scalpel en naar aanleiding van de aanbevelingen van een histopathologist, ontleden een ongeveer 2 cm 2 monster van weefsel uit de ziektevrije achtergrond regio oesofageale plaveiselcelcarcinoom slijmvlies verkregen van patiënten die maag- of slokdarmkanker operatie. Transport naar het laboratorium in een 50 ml container steriel transportmedium (PBS 100 IU / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 0,625 ug / ml amfotericine B) bij kamertemperatuur. </li><li> Op dit moment, bewaar het weefsel in de transportmedium tot 12 uur (overnacht) bij 4 ° C, gemakshalve; echter niet langer opslagfunctie gebruikt omdat zij leiden tot verminderde levensvatbaarheid van de cellen. </li><li> Werken in een laminaire stroming weefselkweek kap en met steriele techniek steriliseren een scalpel door het weken in 70% ethanol gedurende 5 minuten. Spoel in steriele PBS. </li><li> Plaats het weefsel in een steriele petrischaal en gebruik de scalpel te snijden in 0,5 cm strips. Voeg 5 ml 0,1% (gew / vol) trypsine in PBS om de petrischaal, plaats het deksel op de schaal en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. </li><li> Voeg 5 ml FCS aan het weefsel in de petrischaal om het trypsine te remmen. Houd de strook van weefsel met een steriel pincet, voorzichtig schrapen de epitheliale oppervlak met de scalpel voor 1-2 min per strip aan de epitheliale cellen in het omringende medium te verwijderen. Verwijder de geschraapt weefsel en zet apart. Herhaal deze procedure voor alle weefselstrips. </li><li> Verzamel het medium dat het vrijstaande epitheliale cellen in een 15 ml centrifugebuisen centrifuge (5 min, 200 x g). Giet het supernatant en resuspendeer de pellet in 12 ml van epitheliale medium (beschreven in stap 1.1). </li><li> Giet af en het medium uit de feeder cellaag in de T75 fles bereid in stap 1.2 weggooien. Gebruik een steriele pipet om de celsuspensie die de vers geïsoleerde epitheelcellen aan de kolf en incubeer bij 37 ° C in een 5% CO 2, vochtige atmosfeer. </li><li> Na 24 uur giet af en gooi het kweekmedium, die ook de cel puin zal bevatten, en te vervangen door 12 ml vers epitheliale medium. Verder incuberen bij 37 ° C in een 5% CO 2, vochtige atmosfeer. Kolonies zullen beginnen te verschijnen in de volgende 24 tot 48 uur en kan worden bekeken door het plaatsen van de kolf onder een standaard lichtmicroscoop. Giet het verbruikte kweekmedium en vervangen door een gelijk volume vers medium elke 2-3 dagen. </li><li> Zodra de kolf 80% confluentie, passage van de cellen 13 bereikt. Splits de cells in een verhouding van 1: 5 tot celaantallen te verhogen voor toepassing bij het model. Volg stap 1,2 tot voedingslagen van bestraalde 3T3 cellen vast in elke kolf die wordt ontvangen epitheelcellen 24 uur vóór passage van de cellen. Opmerking: Gebruik de epitheelcellen in de slokdarm model hieronder beschreven tussen passages 1 en slechts 4. </li></ol> 2. Isolatie van Human Slokdarmkanker fibroblasten <ol><li> Werken in een laminaire stroming kabinet en het gebruik van steriele techniek, neem de opzij gezet in stap 1.7 weefsel. Leg ze in een steriele petrischaal en gehakt fijn door te hakken met een steriele scalpel. Voeg 10 ml 0,5% (w / v) collagenase A oplossing en plaats het deksel op de petrischaal en incubeer bij 37 ° C geïncubeerd in een 5% CO 2, vochtige atmosfeer. </li><li> Breng het digest op een 15 ml centrifugebuis en gecentrifugeerd (10 min, 200 x g), giet uit de bovenstaande vloeistof en resuspendeer de pellet in 10 ml van fibroblast kweekmedium (DMEM 10% FCS, 2 x 10 -3 M L-glutamine, 100 IU / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, en 0,625 ug / ml amfotericine B). </li><li> Plaats de suspensie in een T75 kolf en geïncubeerd bij 37 ° C in een 5% CO 2, vochtige atmosfeer. Na 24 uur giet het medium, dat puin zal bevatten en te vervangen door 12 ml vers fibroblast medium. Vervang het kweekmedium om de 2 tot 3 dagen en passage cellen eenmaal ze 80% confluentie 13 bereikt, splitsing van de cellen in een 1: 5 verhouding celaantallen stijgen. Opmerking: Gebruik de fibroblast cellen in de hieronder beschreven tussen passages 4 en slechts 10 model. </li></ol> 3. Voorbereiding van de De-cellularized Slokdarmkanker Steiger <ol><li> Verkrijgen intact esophagi varkens in het slachthuis van vers geslachte Landrace varkens die worden gebruikt voor de productie van levensmiddelen. Een enkele slokdarm voldoende steigers voor ongeveer 30 afzonderlijke constructies. Let op: Als gevolg van de uitgebreide en tijd consuming sterilisatie protocol vereist, is het normaal de moeite waard het verkrijgen en verwerken van een minimum van 10 esophagi in een keer. </li><li> Onmiddellijk plaatsen van de vers uitgesneden slokdarm naar een 180 ml steriele pot met ongeveer 150 ml 10% povidon-joodoplossing gedurende 5 min elke verontreinigende microbiële reduceren. Breng de slokdarm naar een tweede pot die ongeveer 100 ml steriel PBS bevattende 200 IU / ml penicilline, 200 ug / ml streptomycine, en 1,25 ug / ml amfotericine B. <ol><li> Plaats de deksel op de houder en transporteren esophagi naar het laboratorium bij kamertemperatuur. Twee of drie esophagi kan in elke container, afhankelijk van hun grootte. </li></ol></li><li> Eenmaal in het laboratorium, het handvat van het weefsel in een laminaire stroming kap met behulp van een aseptische techniek om microbiële besmetting te minimaliseren. Steriliseer pincetten, scharen en scalpelbladen door onderdompeling gedurende 5 minuten in 70% ethanol, en spoelen in steriel PBS. </li><li> Behandel de esophagus met steriele pincet. Met behulp van de schaar, de lengte opengesneden de slokdarm. Spoel het weefsel door het plaatsen van de slokdarm naar een 180 ml steriele pot die ongeveer 100 ml steriel PBS en voorzichtig schudden om vuil te verwijderen. </li><li> Reinig een kurk dissectie board door te besproeien rijkelijk met 70% ethanol en laten drogen. </li><li> Verwijder de slokdarm van de PBS, en het gebruik van steriele naalden, pin uit de slokdarm op het bord, slijmvliesoppervlak bovenste. Pak het mucosale oppervlak aan één uiteinde van de slokdarm met steriele pincet en weg te trekken van het bord. Hierdoor wordt het slijmvlies te scheiden van de onderliggende submucosa. <ol><li> Vervolgens een steriele scalpel de slokdarm longitudinaal ontleden langs de lamina propria, verwijderen kunnen de dissectie vordert om de mucosa weg te heffen. </li></ol></li><li> Bewaar de ontleed slijmvlies en de onderliggende submucosa weggooien. </li><li> Knip en gooi de meest proximale en distale 2 cm van tHij mucosa aangezien er een groter aantal submucosale klieren en een dikkere lamina propria in die gebieden, respectievelijk 7. </li><li> Met een scalpel om de resterende weefsel in 5 cm2 gesneden. Plaats alle de cut weefsel in een 180 ml steriele pot met ongeveer 150 ml steriele PBS en schud voorzichtig om het weefsel te spoelen. Indien voor meer dan vijf esophagi tegelijk kan het noodzakelijk zijn om meerdere potten daarvan en de drie daaropvolgende stappen gebruikt. </li><li> Met steriele pincet, breng de gesneden weefsel in een 180 ml pot met 150 ml steriel 1 M NaCl, 200 IU / ml penicilline, 200 ug / ml streptomycine en 1,25 ug / ml amfotericine B. Incubeer gedurende 72 uur bij 37 ° C. </li><li> Plaats het weefsel in een frisse 180 ml pot met 150 ml steriel PBS. Het epitheel is begonnen zichtbaar te scheiden van het onderliggende weefsel. Zachtjes schil de los epitheel van het varken slokdarm met steriele pincet en weggooien. <ol><li> Overgebleven tkwestie in een frisse 180 ml pot en voeg 150 ml steriele PBS. Schud zachtjes gedurende 5 min te wassen. Giet het PBS en herhaal nog tweemaal met verse PBS. </li></ol></li><li> Doe alle weefsel in een 500 ml glazen flesje met 400 ml steriel 80% (v / v) glycerol oplossing gedurende 24 uur bij kamertemperatuur geroerd. Breng 400 ml van steriele 90% (v / v) glycerol oplossing gedurende nog eens 24 uur. </li><li> Bewaren in 400 ml steriele 100% glycerol oplossing bij kamertemperatuur gedurende ten minste 4 maanden uitdrogen en steriliseren weefsel terwijl de integriteit van de basaalmembraan. </li></ol> 4. De productie van de Cultuur Media <ol><li> Bereid gechelateerde pasgeboren kalfsserum voor toepassing in het kweekmedium. <ol><li> Giet 100 g Chelex 100 in een glazen 1 liter fles en voeg gedeïoniseerd water. Het exacte volume is niet kritisch, maar voldoende water worden toegevoegd aan de Chelex poeder bedekken. Voeg een magnetische roerder en steriliseren in de autoclaaf (121 ° C gedurende15 min). </li><li> Laat de fles af te koelen en de Chelex om zich te vestigen. In een laminaire flowkast giet het overtollige water, voeg 500 ml pasgeboren kalverserum (NCS) en laat een nacht roeren bij 4 ° C. </li><li> Stop met roeren en laat het Chelex om zich te vestigen, dit kan tot 30 min. In een laminaire flowkast decanteer het gechelateerde serum met een steriele pipet, verzorgen de Chelex en opslag niet te verstoren in 10 ml porties bij -20 ° C. </li></ol></li><li> Bereid drie verschillende media in een laminaire stroming kast, te beginnen met de pro-proliferatieve en eindigend met pro-differentiatieve formuleringen. <ol><li> Bereid Composite Medium I bestaat uit DMEM en Ham F12 in een 3: 1 verhouding (v: v), 4 x 10 -3 M L-glutamine, 0,5 ug / ml hydrocortison, 1 x 10 -4 M O -phosphorylethanolamine, 2 x 10 -12 M triiodothyronine, 1,8 x 10 -4 M adenine, 1,88 x 10 -3 M CaCl 2, 4 x 10 -12 M progesteron, 10 ug / ml inSulin, 10 gg / ml transferrine, 10 ng / ml seleen, 1 x 10 -3 M ethanolamine en 0,1% (v / v) gecheleerd NCS. </li><li> Bereid Composite Medium II Composite Medium I dan vervangen gechelateerde serum met 0,1% (v / v) niet-gechelateerde NCS. </li><li> Bereid Composite Medium III Composite Medium II welaten progesteron en verhoging serum 2% (v / v) niet-gechelateerde NCS. </li></ol></li></ol> 5. De productie van de Human Esophageal Mucosa Model <ol><li> Voer alle werkzaamheden in een laminaire stroming kap, met behulp van aseptische techniek om een ​​steriele omgeving te behouden. Steriliseer alle gereedschappen door het weken in 70% ethanol gedurende 5 minuten, voor het spoelen in steriel PBS. </li><li> De dag voordat het nodig is, hydrateren de acellulaire varkens esophageal scaffold. Een stuk van scaffold vereist voor elke construct wordt bereid. <ol><li> Om het weefsel plaats voldoende stukken van varkens steiger hydrateren in een pot met 100 ml steriel PBS, ageren en genieten voor de 10 min. Decant de PBS en te vervangen door verse PBS. Herhaal het wasproces vijfmaal verwijdering van alle sporen glycerol te verzekeren. </li></ol></li><li> Test de steiger steriliteit door het incuberen van het weefsel overnacht gerehydrateerd in 100 ml DMEM bij 37 ° C. Als er geen verandering in de kleur of troebelheid van het kweekmedium aan het eind van de incubatieperiode het skelet wordt verondersteld steriel zijn. Zodra steriliteit is bevestigd, plaatst de 5 cm 2 acellulaire scaffold in een 6 wei-plaat, submucosale kant naar boven. </li><li> Plaats een steriele chirurgisch stalen ring (inwendige diameter 10 mm, uitwendige diameter 20 mm) op het midden van elke steiger en voorzichtig aandrukken met steriele forceps, een voldoende afdichting met het weefsel te verzekeren. </li><li> Oogst de fibroblasten via trypsine-EDTA 13 om een celsuspensie te produceren. Tel de cellen met een hemocytometer 14. Centrifugeer de celsuspensie (10 min, 200 x g). Resuspendeer de celpellet in een Aangepast decorte volume van fibroblast medium tot een uiteindelijke celgetal van 2,5 x 10 6 cellen per ml produceren. </li><li> Voeg 0,2 ml van fibroblast medium, dat 5 x 10 5 mens slokdarm fibroblasten, in elke ring. Bedek het hele gebied rond de buitenkant van de ring met ongeveer 2 ml van fibroblast medium. Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO 2, vochtige atmosfeer. </li><li> Na 24 uur verwijdert de ringen en fibroblast medium en voeg ten minste 5 ml vers fibroblast medium aan elk putje zodat de steiger zich geheel in medium. Kweek gedurende 1 week bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde atmosfeer vervangen van het medium elke 2 tot 3 dagen. </li><li> Na 1 week verwijder de 6 goed platen met de steigers om een ​​laminaire overstroming kap, verwijder het medium en keer elke steiger met behulp van een steriel pincet, het plaatsen van het mucosale oppervlak bovenste. Dit tijdstip is aangeduid als dag 0. </li><li> Plaats de stalen ringen aan het slijmvliesoppervlak in het midden vanhet weefsel in stap 5.4. </li><li> Bereid de T75 kolven van epitheelcellen van 13 trypsine. Nadat de PBS te wassen en voorafgaand aan het toevoegen van trypsine-EDTA-oplossing, voeg 2 ml steriel 0,02% (w / v) EDTA-oplossing aan elke kolf. Incubeer gedurende 2 minuten bij 37 ° C. Tik op de kolf voorzichtig om selectief los de i3T3 feeder laag terwijl de epitheelcellen bevestigd. Opmerking: Het is meestal niet praktisch of nodig patiënt overeenkomen met de epitheelcellen van de reeds opgenomen in het model de voorafgaande week fibroblasten. </li><li> Giet de EDTA-oplossing die het voederlaag toevoegen trypsine-EDTA-oplossing om de epitheelcellen 13 oogsten. Tel de cellen met een hemocytometer 14. Centrifugeer de celsuspensie (10 min, 200 x g). Resuspendeer de cel pellet in een geschikt volume van Composite Medium 1 tot een uiteindelijke celgetal van 5 x 10 6 cellen per ml produceren. </li><li> Voeg 0,2 ml van Composite Medium I, met 1 x 10 6 epitheelcellen in de ring. Bedek het hele gebied rond de buitenkant van de ring met ongeveer 2 ml van Composite Medium I en plaats de constructen in de incubator bij 37 ° C in een 5% CO 2, vochtige atmosfeer. </li><li> Na 24 uur (dag 1) verwijder de ringen en medium en voeg ten minste 5 ml vers Composite Medium I, zodat de steigers zijn geheel onder water en terug naar de incubator. Na nog eens 24 uur (dag 2) Verwijder het medium en vervangen door ten minste 5 ml Composite Medium II en zorgt op de steigers zijn geheel onder water en terug naar de incubator. </li><li> Op dag 4 place steriele medische kwaliteit roestvrij staal gaas roosters (2 cm breed x 2 cm lang x 0,5 cm hoog), in de frisse 6 well platen, één per construct. Gebruik steriele pincet om de constructen te brengen op de bovenzijde van de stalen roosters, slijmvliesoppervlak boven. <ol><li> Voeg voldoende Composite Medium III zodat de vloeistof bereikt de onderzijde van de samengestelde, maar het oppervlakblootgesteld aan de lucht, zorgt dit ervoor dat het monster wordt op een lucht-vloeistof grensvlak. Het juiste volume medium gevraagd, zal variëren afhankelijk van de dikte van het skelet, het volume van de put en de precieze hoogte van de roestvrij stalen rooster. </li></ol></li><li> Handhaaf de samenstellingen bij een lucht-water grensvlak gedurende tussen 10 en 20 dagen (dag 14 tot dag 24), afhankelijk van de vereisten van het experiment. Vervang de Composite Medium III met vers medium elke 2 tot 3 dagen (maandag, woensdag, vrijdag is een gebruiksvriendelijke regime). Let op: Na 5 dagen bij een lucht-vloeistof interface (Dag 9) de constructen hebben een voldoende rijp oesofageale epitheel worden gebruikt in experimenten van de invloed van omgevingsfactoren op de slokdarm epitheel. </li><li> Aan het eind van het experiment, bevestig de constructen voor histologische analyse en immunohistochemische kleuring 7 of extract eiwit 15 of RNA 11,16 van het epitheel voor verdere analysis. Desgewenst behoudt het geconditioneerde kweekmedium voor analyse van extracellulaire signaalmoleculen 17. </li></ol>

<ol><li>Pera, M., Manterola, C., Vidal, O., Grande, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+esophageal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of esophageal adenocarcinoma.</a> J. Surg. Oncol. 92 (3), 151-159 (2005).</li>
<li>Manea, G. S., Lupusoru, C., Caruntu, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+study+on+the+effect+of+bile%2C+and+bile+and+hydrochloric+acid+mixture+on+the+esophageal+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Rom.+J.+Morphol.+Embryol%22%5BJournal%5D)">Experimental study on the effect of bile, and bile and hydrochloric acid mixture on the esophageal mucosa.</a> Rom. J. Morphol. Embryol. 50 (1), 61-66 (2009).</li>
<li>Andl, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+receptor+mediates+increased+cell+proliferation%2C+migration%2C+and+aggregation+in+esophageal+keratinocytes+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo.</a> J. Biol. Chem. 278 (3), 1824-1830 (2003).</li>
<li>Underwood, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+primary+oesophageal+squamous+epithelial+cells+with+HET-1A+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">A comparison of primary oesophageal squamous epithelial cells with HET-1A in organotypic culture.</a> Biol. Cell. 102 (12), 635-644 (2010).</li>
<li>Nystrom, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> J. Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).</li>
<li>Okawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+interplay+between+EGFR+overexpression%2C+hTERT+activation%2C+and+p53+mutation+in+esophageal+epithelial+cells+with+activation+of+stromal+fibroblasts+induces+tumor+development%2C+invasion%2C+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The functional interplay between EGFR overexpression, hTERT activation, and p53 mutation in esophageal epithelial cells with activation of stromal fibroblasts induces tumor development, invasion, and differentiation.</a> Genes & Development. 21 (21), 2788-2803 (2007).</li>
<li>Green, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+characterization+of+an+organotypic+tissue-engineered+human+esophageal+mucosal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">The development and characterization of an organotypic tissue-engineered human esophageal mucosal model.</a> Tissue Eng Part A. 16 (3), 1053-1064 (2010).</li>
<li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+induces+immortalization+of+human+esophageal+keratinocytes+without+p16INK4a+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Telomerase induces immortalization of human esophageal keratinocytes without p16INK4a inactivation.</a> Mol. Cancer Res. 1 (10), 729-738 (2003).</li>
<li>Bhargava, S., Chapple, C. R., Bullock, A. J., Layton, C., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+buccal+mucosa+for+substitution+urethroplasty%5BTitle%5D)+AND+%22BJU.+Int%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered buccal mucosa for substitution urethroplasty.</a> BJU. Int. 93 (6), 807-811 (2004).</li>
<li>Ralston, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes+contract+human+dermal+extracellular+matrix+and+reduce+soluble+fibronectin+production+by+fibroblasts+in+a+skin+composite+model%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Plast.+Surg%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes contract human dermal extracellular matrix and reduce soluble fibronectin production by fibroblasts in a skin composite model.</a> Br. J. Plast. Surg. 50 (6), 408-415 (1997).</li>
<li>Green, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsatile+exposure+to+simulated+reflux+leads+to+changes+in+gene+expression+in+a+3D+model+of+oesophageal+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pulsatile exposure to simulated reflux leads to changes in gene expression in a 3D model of oesophageal mucosa.</a> Int. J. Exp. Pathol. 95 (3), 216-228 (2014).</li>
<li>Wang, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+culture+of+epithelial+cells+from+primary+breast+carcinomas+using+irradiated+3T3+cells+as+feeder+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol.+Res.+Pract%22%5BJournal%5D)">Selective culture of epithelial cells from primary breast carcinomas using irradiated 3T3 cells as feeder layer.</a> Pathol. Res. Pract. 197 (3), 175-181 (2001).</li>
<li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsinizing+and+subculturing+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Trypsinizing and subculturing mammalian cells.</a> J. Vis. Exp. (16), e755(2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+Hemacytometer+to+Count+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2014).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Am.+J.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> N. Am. J. Med. Sci. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
<li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nat. Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).</li>
<li>Morgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometric+bead+array%3A+a+multiplexed+assay+platform+with+applications+in+various+areas+of+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytometric bead array: a multiplexed assay platform with applications in various areas of biology.</a> Clin. Immunol. 110 (3), 252-266 (2004).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+abnormal+expression+of+retinoic+acid+receptor-beta%2C+p+53+and+Ki67+protein+in+normal%2C+premalignant+and+malignant+esophageal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">The abnormal expression of retinoic acid receptor-beta, p 53 and Ki67 protein in normal, premalignant and malignant esophageal tissues.</a> World J. Gastroenterol. 8 (2), 200-202 (2002).</li>
<li>Moll, R., Divo, M., Langbein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+keratins%3A+biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The human keratins: biology and pathology.</a> Histochem. Cell Biol. 129 (6), 705-733 (2008).</li>
<li>Rice, R. H., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+in+human+epidermal+cells+of+a+soluble+protein+precursor+of+the+cross-linked+envelope%3A+activation+of+the+cross-linking+by+calcium+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Presence in human epidermal cells of a soluble protein precursor of the cross-linked envelope: activation of the cross-linking by calcium ions.</a> Cell. 18 (3), 681-694 (1979).</li>
<li>Eves, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoma+invasion+in+reconstructed+human+skin+is+influenced+by+skin+cells+-+investigation+of+the+role+of+proteolytic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Melanoma invasion in reconstructed human skin is influenced by skin cells - investigation of the role of proteolytic enzymes.</a> Clin. Exp. Metastasis. 20 (8), 685-700 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit manuscript beschrijft de productie en karakterisering van een biologisch relevante menselijke esophagus mucosale model geschikt voor gebruik als een experimenteel platform om het effect van blootstelling aan milieustressoren op de esophagus epithelium bestuderen. De belangrijkste stappen voor de succesvolle productie van een humaan oesofageale slijmvlies model zijn: ervoor zorgen dat de meeste epitheelcellen proliferatieve blijven zitten en nog niet begonnen te differentiëren voordat ze ...

Het oesofageale slijmvlies omvat een gelaagd, plaveiselepitheel boven een laag van bindweefsel, de lamina propria, en is één van de eerste locaties aan geconsumeerde milieustressoren tegenkomen. Blootstelling aan voedingstoxines is betrokken bij het ontstaan ​​van slokdarmkanker squameus carcinoom, terwijl duodenogastro-oesofageale reflux is een kritische factor in de pathogenese van Barrett&#39;s metaplasie die is geassocieerd met een verhoogd risico om esophageal adenocarcinoom. Oesofageale carcinomen zijn de 8e meest voorkomende kwaadaardige tumor in het Verenigd Koninkrijk mannen en slokdarmkanker adenocarcinoom neemt snel toe in de westerse wereld 1. Verder is er weinig verbetering in ziekteprognose, met een totale 5-jaars overlevingspercentage van ongeveer 15% geweest. Er is daarom behoefte experimenteerplatforms het effect van blootstelling aan milieustressoren deze esophagus epithelium en hun mogelijke betrokkenheid bij de ontwikke onderzoekenpment van metaplasia of neoplasie. Hoewel geïmmortaliseerde of tumorcellijnen kunnen onderzoekers om de respons van epitheelcellen deze stressoren in vitro bestuderen, blijven ze proliferatieve en niet te differentiëren in de rijpe epitheelcellen op de bovenste lagen van de oesofageale slijmvlies. Voorts kunnen cellijnen die al tumorigenese hebben ondergaan slechts beperkte informatie over de eerste reacties van normale cellen in het epitheel milieufactoren verschaffen; en dit is de fase waarin de mogelijkheden voor therapeutische interventie hoogst kunnen zijn. Tenslotte conventionele celkweek systemen niet de potentieel belangrijke interacties tussen epitheliale en mesenchymale cellen en tussen cellen en de omringende matrix die binnen de weefsels in vivo te vangen. Diermodellen een meer realistische micro-omgeving voor het bestuderen van de reacties van de slokdarm epithelium en kan de kunstmatige inductie van gastro-oesofageale refluxziekte 2 op te nemen. Het kan echter een grotere uitdaging om de milieu stressoren in deze modellen te manipuleren zijn en ze kunnen niet volledig de reactie binnen het menselijke slokdarm vertegenwoordigen. Andere experimentele menselijke esophagus modellen ontwikkeld dat primaire cellen, geïmmortaliseerde cellen of tumorcellijnen gebruik op een collageen of gecombineerde collageen / Matrigel, scaffold met fibroblasten 3,4. Het is minder arbeidsintensief deze scaffolds dan acellulaire esophageal scaffold in dit manuscript beschreven genereren en deze organotypische modellen verschaffen een nuttig hulpmiddel, met name in de studie van tumorinvasie 5,6, waarbij tumorcelinfiltratie in de collageengel gemakkelijk kan worden waargenomen. Maar deze collageen gels hebben niet-inheemse mechanische eigenschappen en gebrek aan bepaalde kenmerken van het oorspronkelijke weefsel, met inbegrip van een specifiek basaal membraan en de appropriate oppervlaktetopografie. Dit kan het gedrag van cellen resulterend in beïnvloeden, bijvoorbeeld slechtere hechting tussen epitheel en scaffold bij gebruik van een collageengel scaffold 7. Bijgevolg zijn de acellulaire varkens esophageal scaffold ontwikkeld met het voordeel dat een biologisch realistische scaffold en dus meer geschikt voor gebruik als experimenteel platform. Ook is gebleken dat het beter is om primaire cellen nemen in de esophagus constructen dan geïmmortaliseerde slokdarm epitheliale cellijnen zoals Het-1A, aangezien deze cellen vormen een gelaagd epitheel maar niet om stratificeren en differentiëren 4,7,8 . Bijgevolg is dit protocol werd aangepast van een methode die al in gebruik in de MacNeil laboratorium voor het maken van tissue engineered huid en het mondslijmvlies 9,10 en bevat een de-cellularized varkens slokdarm steiger in combinatie met primaire menselijke slokdarm epitheliale cellen en fibroblasten. This protocol vormt een volwassen gestratificeerde epitheel, vergelijkbaar met die van de normale menselijke esophagus zoals blijkt uit CK4, CK14, Ki67 en involucrine kleuring. Het resulterende model biedt een experimenteel platform voor reacties op milieustressoren studeren, en daadwerkelijk is gebruikt om veranderingen in genexpressie te onderzoeken in de slokdarm epitheel in reactie op de onderdelen 11 refluxaat.

<table><tbody><tr><td>Trypsine</td><td>BD Biosciences</td><td>215240</td><td>Bereid 0,1% w/v oplossing in PBS en filter steriliseer. Verwarm in 37&nbsp;&deg;C waterbad voor gebruik.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Labtech</td><td>LM-D1112</td><td>Verwarm in 37&nbsp;&deg;C waterbad voor gebruik</td></tr><tr><td>Ham's F12</td><td>Labtech</td><td>LM-H1236</td><td>Verwarm in 37&nbsp;&deg;C waterbad voor gebruik</td></tr><tr><td>Foetaal Kalfs Serum</td><td>Labtech</td><td>FB-1090</td><td></td></tr><tr><td>Epidermale Groeifactor</td><td>R+D Systems</td><td>236-EG-200</td><td>Bereid 200 &micro;g/ml stockoplossing in 10 mM azijnzuur, 1% FCS</td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0396</td><td>Bereid stockoplossing in PBS en filter steriliseer voor gebruik</td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2786</td><td>Bereid stockoplossing in PBS en filter steriliseer voor gebruik</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2767</td><td>Bereid 10 mg/ml oplossing in 0,01&nbsp;M HCl, verdun 1:10 in gedestilleerd water en filter steriliseer voor gebruik</td></tr><tr><td>Transferrine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2036</td><td>Bereid stockoplossing in gedestilleerd water en filter steriliseer voor gebruik</td></tr><tr><td>Triiodothyronine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2752</td><td>Bereid stockoplossing in gedestilleerd water en filter steriliseer voor gebruik</td></tr><tr><td>Cholera toxine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td>Bereid stockoplossing in water</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td>Merknaam Fungizone</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Oxoid</td><td>BR0014</td><td>Los 1 tablet op in 100&nbsp;ml water en autoclaveer om te steriliseren</td></tr><tr><td>Collagenase A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td><td></td></tr><tr><td>Povidon-jodium oplossing</td><td>Ecolab</td><td>10830E</td><td>Merknaam Videne</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Chelex 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7901</td><td></td></tr><tr><td>Nieuwgeboorte kalfs serum</td><td>Gibco</td><td>26010074</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td>Bereid stockoplossing in DMEM en filter steriliseer voor gebruik</td></tr><tr><td>Ethanolamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9508</td><td>Bereid stockoplossing in DMEM en filter steriliseer voor gebruik</td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td>Bereid stockoplossing in DMEM en filter steriliseer voor gebruik</td></tr><tr><td>O-fosforylethanolamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0503</td><td>Bereid stockoplossing in DMEM en filter steriliseer voor gebruik</td></tr><tr><td>ITS (insuline, transferrine, selenium)</td><td>Lonza</td><td>17-838Z</td><td>Wordt gebruikt voor de bereiding van samengesteld medium</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3924</td><td>Verwarm in 37&nbsp;&deg;C waterbad voor gebruik</td></tr><tr><td>EDTA 0,02% oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8008</td><td>Verwarm in 37&nbsp;&deg;C waterbad voor gebruik</td></tr><tr><td>T75 kweekflacon</td><td>VWR</td><td>734-2313</td><td></td></tr><tr><td>50 ml centrifugeerbuis</td><td>Fisher</td><td>11819650</td><td></td></tr><tr><td>15 ml universele buis</td><td>SLS</td><td>SLS7504</td><td></td></tr><tr><td>180 ml pot</td><td>VWR</td><td>216-2603</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>SLS</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>6 welbewerkte plaat</td><td>VWR</td><td>734-2323</td><td></td></tr><tr><td>roestvrij stalen ringen</td><td></td><td></td><td>Gefabriceerd in huis - medisch graad roestvrij staal, binnendiameter 10 mm, buitendiameter 20 mm</td></tr><tr><td>staalgaasroosters</td><td></td><td></td><td>Gefabriceerd in huis - vellen hebben gaten met een diameter van 0,3 cm, gebogen om rooster 2&nbsp;cm (w) x 2 cm (d) x 0,5 cm (h) te produceren</td></tr><tr><td>ki67</td><td>Novocastra</td><td>KI67-MM1-L-CE</td><td>Kloon MM1. Gebruik bij 1:100.</td></tr><tr><td>CK4</td><td>Abcam</td><td>ab9004</td><td>Kloon 6B10. Gebruik bij 1:200.</td></tr><tr><td>CK14</td><td>Novocastra</td><td>LL002-L-CE</td><td>Kloon LL002. Gebruik bij 1:200.</td></tr><tr><td>Involucrine</td><td>Novocastra</td><td>INV</td><td>Kloon SY5. Gebruik bij 1:100.</td></tr><tr><td>OE21</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>96062201</td><td></td></tr><tr><td>OE33</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>96070808</td><td></td></tr><tr><td>Het-1A</td><td>ATCC-LGC</td><td>CRL-2692</td><td></td></tr><tr><td>Muis 3T3 fibroblasten</td><td>ATCC-LGC</td><td>CRL-1658</td><td>eerder groeiachterstand veroorzaakt door bestraling (60 Gy)</td></tr></tbody></table>

productie, karakterisering en toepassingsmogelijkheden van een 3d tissue-engineered human slokdarmkanker mucosale model

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

De incidentie van zowel esophageal adenocarcinoom en haar voorloper, Barrett&#39;s Metaplasie, snel stijgen in de westerse wereld. Verder esophageal adenocarcinoom in het algemeen een slechte prognose, met weinig verbetering in overleving afgelopen jaren. Dit zijn moeilijke omstandigheden te bestuderen en er is een gebrek aan geschikte experimentele platformen om aandoeningen van de slokdarm slijmvlies onderzoeken geweest. Een model van de menselijke slokdarm slijmvlies is in de MacNeil laboratorium dat, in tegenstelling tot conventionele 2D celkweek systemen, recapituleert de cel-cel en cel-matrix interacties die in vivo en produceert een volwassen gestratificeerde epitheel vergelijkbaar met die van de normale menselijke ontwikkeling slokdarm. In het kort, het model maakt gebruik van niet-getransformeerde normale primaire menselijke esophagus fibroblasten en epitheelcellen gekweekt bij een-varken afgeleide acellulaire esophageal scaffold. Immunohistochemische karakterisering van dit modeldoor CK4, CK14, Ki67 en involucrine vlekken toont juiste herhaling van de histologie van het normale menselijke slokdarm slijmvlies. Dit model verschaft een robuuste, biologisch relevant testmodel van het menselijke oesofageale slijmvlies. Het kan gemakkelijk worden gemanipuleerd om een ​​aantal research vragen waarbij de effectiviteit van farmacologische middelen en het effect van blootstelling aan milieufactoren zoals alcohol, toxinen, hoge temperatuur of gastro-oesofageale refluxaat componenten onderzoeken. Het model maakt ook langere kweek niet worden bereikt met conventionele 2D celkweek, waardoor onder meer de studie van de effecten van herhaalde blootstelling van een volwassen epitheel aan het agens van belang tot 20 dagen. Verder zijn diverse cellijnen, zoals die afgeleid van oesofageale tumoren of Barrett&#39;s metaplasie kan worden in het model opgenomen processen als tumorinvasie en drugs responsivene onderzoekenss in een biologisch relevante omgeving.

Dit manuscript beschrijft het proces benodigde getoond in schematische vorm in figuur 1, de cultuur 3D-modellen van de menselijke esophagus epithelium succes. Om de geschiktheid van het model te bevestigen als experimenteel platform histologische en immunohistochemische studies uitgevoerd vergelijken van de gekweekte normale humane weefsels esophageal squameuze slijmvlies. Histologische evaluatie van het epitheel door de beschreven werkwijze wordt een volwassen, multi-layere...

Dit manuscript beschrijft de productie, karakterisering en toepassingsmogelijkheden van een tissue engineered 3D-oesofageale construct bereid uit normale primaire menselijke slokdarm fibroblast en squameuze epitheelcellen gezaaid binnen een de-cellularized varkens schavot. De resultaten tonen de vorming van een volwassen gelaagd epitheel gelijk aan de normale menselijke esophagus.

Productie, karakterisering en toepassingsmogelijkheden van een 3D Tissue-engineered Human Slokdarmkanker Mucosale Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Het algemene doel van deze procedure is het produceren van een 3D-tissue-engineered model van het menselijke slokdarmepitheel voor gebruik als experimenteel platform. Dit wordt bereikt door eerst normale menselijke slokdarmfibroblasten en epitheelcellen te isoleren uit menselijke slokdarmweefselmonsters. In de tweede stap worden de fibroblasten gezaaid op een gedepiteliseerde, acellulaire, poreuze slokdarmscaffold en gedurende zeven dagen gekweekt.Vervolgens wordt het steunstructuur omgekeerd en worden de geïsoleerde humane oesofageale epitheelcellen gedurende vier dagen aan de kweek toegevoegd. In de laatste stap wordt het model overgebracht naar de lucht-vloeistofinterface voor nog eens vijf dagen kweek, zodat een matuur gelaagd epitheel zich kan ontwikkelen. Ten slotte wordt immunohistochemie gebruikt om belangrijke markers van proliferatie en differentiatie te karakteriseren die door de epitheelcellen van het model worden tot expressie gebracht.De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van conventionele 2D-celkweek zijn dat het cellen in staat stelt om de cel-cel- en cel-matrixinteracties te hebben die ze in vivo zouden hebben. Met deze techniek kunnen we een rijp gelaagd plaveiselpitheel produceren dat vergelijkbaar is met dat van een normale slokdarm. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode met drie zaken worstelen.Ten eerste kan het een uitdaging zijn om te waarborgen dat de meeste epitheelcellen niet differentiëren voordat ze in het scaffold worden opgenomen. Ten tweede moet er zorgvuldig worden toegezien op het handhaven van de juiste lucht-vloeistofinterface tijdens de periode waarin het epitheel rijpt. En ten derde kan het een uitdaging zijn om de integriteit gedurende de gehele kweekperiode te behouden.Om menselijke oesofageale epitheelcellen te isoleren, plaatst u het geoogste weefsel van het plaveiselcelepitheel van de slokdarm in een steriele Petrischaal en gebruikt u een met ethanol gesteriliseerde scalpel om het weefsel in stroken van 0,5 centimeter te snijden. Incubeer het weefsel vervolgens in 0,1% trypsine, afgedekt bij 37 °C, en stop de digestie na een uur met vijf milliliter FCS. Houd daarna de stroken vast met een pincet en schraap het epitheelioppervlak voorzichtig met het scalpelblad gedurende één tot twee minuten per strook om de epitheelcellen in het omringende medium vrij te maken. Wanneer alle stroken zijn geschraapt, overbrengt u het medium met de losgekoppelde epitheelcellen naar een centrifugebuis van 15 milliliter.Nadat de cellen zijn gecentrifugeerd, wordt de senna weggegooid en wordt het pellet opnieuw gesuspendeerd in 12 milliliters epitheliaal medium. Verwijder vervolgens het medium van een feeder-celcultuur en gebruik een steriele pipet om de epitheliale cellen op de feeder-cellen uit te platen om de menselijke oesofageale fibroblasten te isoleren. Breng de afgeschraapte weefselstrips over in een steriele Petrischaal en hak het weefsel tot slot fijn met het scalpel.Verteer de stukjes gedurende de nacht in 10 milliliters een 0.5% Collagenase-oplossing bij 37 graden Celsius en 5% carbon dioxide in een bevochtigde atmosfeer. Breng het digestaat de volgende dag over naar een 50 milliliter centrifugebuis en centrifugeer de cellen naar beneden. Resuspendeer het pellet in 10 milliliters fibroblast cultuurmedium.De cultuur in een T 75-fles in een celkweekincubator. Om de gedecellulariseerde scaffolds van varkensslokdarm voor te bereiden, begint u met het longitudinaal opensnijden van een varkensslokdarm met een schaar en een pincet. Was de slokdarm vervolgens gedurende 10 minuten met voorzichtig schudden in een steriele pot van 180 milliliter met 100 milliliters steriele PBS om eventueel vuil te verwijderen terwijl het weefsel wordt gespoeld.Spray een kurken dissectieplaat met 70% ethanol. Wanneer de kurk droog is, plaats de slokdarm op de plaat met de mucosa naar boven. Gebruik nu steriele pincetten om het mucosale oppervlak aan één uiteinde van de slokdarm vast te pakken en trek het weefsel van de plaat af om de mucosa van de onderliggende submucosa te scheiden. Dissecteer vervolgens de slokdarm longitudinaal langs de lamina propria met een steriel scalpelblad, waarbij de pinnen worden verwijderd naarmate de dissectie vordert, zodat de mucosa kan worden opgetild.Verwijder de onderliggende submucosa en gebruik een scalpel om de resterende mucosa in vierkante stukjes van vijf centimeter te snijden. Was de stukjes in 150 milliliters steriele PBS met zachte agitatie, zoals zojuist gedemonstreerd. Breng het weefsel na vijf minuten over in een pot van 180 milliliter die 150 milliliters van een één molar natriumchloride-oplossing bevat.Aangevuld met antibiotica bij 37 °C. Na 72 uur wordt het weefsel overgebracht naar 150 milliliters steriele PBS, waarna het epitheel zichtbaar zal zijn begonnen los te raken van het onderliggende weefsel. Gebruik een steriele pincet en een scalpellamel om het loslatende epitheel te verwijderen en plaats het resterende weefsel in een nieuw potje met 150 milliliters steriele PBS. Was het weefsel drie keer gedurende vijf minuten onder milde agitatie; het weefsel moet vervolgens gedurende minimaal vier maanden in glycerol worden bewaard.Om het steunstructuur volledig te steriliseren, begint men de preparatie van het model van het slokdarmslijmvlies door stukken varkenssteunstructuur, die gedurende ten minste vier maanden in glycerol zijn gesteriliseerd, te rehydrateren. Dit gebeurt in 100 milliliter steriele PBS gedurende vijf agitaties van 10 minuten. Vervang het supernatant bij elke wasbeurt door verse PBS.Controleer na de vijfde agitatietest de steriliteit van het steunstructuur door een incubatie gedurende één nacht in 100 milliliters DMEM bij 37 degrees Celsius. Breng de volgende ochtend de steunstructuren over naar individuele putjes van een zes-wells plaat met de submucosale zijde naar boven. Plaats vervolgens een steriele ring van roestvrij staal van medische kwaliteit op het centrum van elke steunstructuur en gebruik een steriele pincet om vijf keer voorzichtig op de ringen te drukken om een adequate afdichting met het weefsel te waarborgen.Centreer de vijf humane oesofageale fibroblasten in 0,2 milliliters fibroblastmedium in het midden van elke ring. Vul vervolgens het gebied rondom de buitenkant van de ring met ten minste twee milliliters extra fibroblastmedium en incubeer de scaffolds in een celkweekincubator. Verwijder na 24 uur de ringen en vervang het medium in elke well door ten minste vijf milliliters verse fibroblasten.Medium, waarbij erop wordt gelet dat de scaffolds volledig zijn ondergedompeld. Gooi na één week het medium weg en gebruik een pincet om de scaffolds om te keren, zodat het mucosale oppervlak naar boven is gericht. Plaats de ringen terug op de scaffolds en voeg vervolgens een keer het centrum van de zes epitheelcellen in 0,2 milliliters composietmedium toe, één in het centrum van elke ring.Vul het gebied buiten de ring op met ongeveer twee milliliters composiet medium één en plaats de constructen terug in de incubator. Verwijder na 24 uur de ringen en vervang het medium in elke put door ten minste vijf milliliters vers composiet medium één, waarbij u ervoor zorgt dat de scaffolds volledig zijn ondergedompeld. Vervang na nogmaals 24 uur het medium door ten minste vijf milliliters composiet medium twee.Plaats op dag vier steriele rasters van roestvrij staal van medische kwaliteit in de putjes van een nieuwe six-wellplaat en transfer de constructen met de mucosale zijde naar boven naar de rasters. Voeg tot slot voldoende compositummedium drie toe tot aan de onderzijde van het compositum, terwijl het oppervlak aan de lucht wordt blootgesteld, om ervoor te zorgen dat het monster op een lucht-vloeistofgrensvlak wordt gehouden. Het meest uitdagende deel van de procedure is het instellen van het lucht-vloeistofgrensvlak.Als het niet duidelijk is of het rooster in vloeibaar contact staat met een steriele pipetteertip, is het gemakkelijker om te zien of de pipette is ondergedompeld. Alternatief kunt u proberen de plaat voorzichtig te schudden, aangezien vloeistof gemakkelijker zichtbaar is wanneer deze beweegt, en controleren of er vloeistof op het rooster aanwezig is zonder uw monster te bedekken. Hierbij vertoont de logische beoordeling van het epitheel een matuur, meerlaags gelaagd plaveiselpitheel, vergelijkbaar met maar dunner dan dat waargenomen bij de normale menselijke slokdarm, waarbij de cellen progressief platter worden en uiteindelijk kernloos raken naarmate ze naar het oppervlak migreren.Immunohistochemische karakterisering van belangrijke markers voor proliferatie en differentiatie laat zien dat de microanatomie van het modelepitheel vergelijkbaar is met die van het normale menselijke slokdarmepitheel. Zo wordt een vergelijkbare expressie van cytokeratine 14 waargenomen in zowel de natuurlijke slokdarm als het modelepitheel, waarbij de kleuring beperkt is tot de cellen in de basale laag. Dit model is succesvol aangepast om tumorcellen te incorporeren door de primaire epitheelcellen te vervangen door carcinoomcellen, wat de flexibiliteit van het model aantoont.Squameuze carcinoomcellen produceren bijvoorbeeld een epitheel dat op het construct zichtbaar is als een duidelijk geel gebied met grote spleten binnen het epitheel, wat waarschijnlijk wijst op de aanwezigheid van dysfunctionele cellia-moleculen; de inclusie van oesofageale adenocarcinoomcellen in het model resulteert in een grote mate van scaffolddegradatie, die met het blote oog zichtbaar is als een verdunning van de scaffold. Na twee weken groei op de lucht-vloeistofinterface is dit bevestigd via H&amp;E-analyse als een duidelijke afname van de dikte van de scaffold in het gebied onder de cellen. Na deze procedure kunnen andere methoden voor genexpressie, zoals northern- of western blotting, worden toegepast op hetzelfde weefsel om vragen te beantwoorden zoals: hoe reageert het epitheel op omgevingsstress? Dit biedt dus een zeer waardevolle bron om na de ontwikkeling meer vragen in meer diepte te onderzoeken.Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in Barrett-metaplasie om het effect van blootstelling aan specifieke refluxcomponenten op de genexpressie in de normale menselijke slokdarm te bestuderen.

production-characterization-potential-uses-3d-tissue-engineered-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In this video, we demonstrate the preparation of a decellularized pig esophagus scaffold, with its biochemical architecture and composition preserved, for tissue engineering applications.

Decellularized Porcine Esophageal Scaffold Preparation: A Technique to Generate Acellular Scaffold from a Pig Esophagus

This video describes an in vitro culture technique to generate human organotypic esophageal constructs by co-culturing primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells within a decellularized porcine scaffold. These 3D culture models mimic the function and physiology of their in vivo tissue counterparts.

Esophageal 3D Raft Culture Model: An In Vitro Culture Technique to Generate Human Esophageal Mucosa Model

Methoden om menselijke 3D tumorweefsels maken als testsystemen worden beschreven. Deze technologieën zijn gebaseerd op een van cellen ontdane biologische Gevasculariseerd Steiger (BioVaSc), primaire humane cellen en tumor cellijn, die kan worden gekweekt in statische als onder dynamische omstandigheden in een stroom bioreactor.

Tissue Engineering van een Menselijke 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Tumor Test System

Cellen groeien in een driedimensionale (3-D) milieu vormen een duidelijke verbetering ten opzichte celkweek in 2-D omgevingen (bijvoorbeeld kolven of schalen). Hier beschrijven we de ontwikkeling van een meercellige 3-D model van het organotypische menselijke darmslijmvlies gekweekt onder microzwaartekracht door roterende-wall-vat (RWV) bioreactoren.

Ontwikkeling van een Meercellige Driedimensionale Organotypische model van het menselijk darmslijmvlies geteeld onder Microgravity

Uitbreiding van menselijke kinderen oesofageale epitheelcellen gebruikmaking voorwaardelijke herprogrammering biedt onderzoekers met een patiënt-specifieke populatie van cellen die kunnen worden gebruikt voor de engineering oesofageale constructen autologe implantatie defecten of letsel behandelen en dienen als een reservoir voor therapeutische screeningstesten.

Voorwaardelijke herprogrammeren van Pediatric Human slokdarmkanker epitheelcellen voor gebruik in Tissue Engineering and Disease Investigation

Slokdarmreconstructie is een uitdagende procedure, en de ontwikkeling van een weefsel-engineered slokdarm die regeneratie van slokdarmslijmvlies en spier mogelijk maakt en die kan worden geïmplanteerd als een kunstmatige graft is noodzakelijk. Hier presenteren we ons protocol om een kunstmatige slokdarm te genereren, inclusief steigerproductie, bioreactorteelt en verschillende chirurgische technieken.

Tissue-Engineered Graft voor circumferential slokdarmreconstructie bij ratten

Dit protocol beschrijft de belangrijkste stappen voor het genereren en karakteriseren van muriene orale-oesofageale 3D-organoïden die normale, preneoplastische en plaveiselcelcarcinoomlaesies vertegenwoordigen die worden geïnduceerd via chemische carcinogenese.

Modellering van oraal-oesofageaal plaveiselcelcarcinoom in 3D-organoïden

Organoïde-fibroblast co-culturen bieden een model om de in vivo stamcelniche te bestuderen. Hier wordt een protocol voor slokdarmorganoïde-fibroblast co-culturen beschreven. Bovendien wordt beeldvorming van de hele montage gebruikt om de fibroblast-organoïde interactie te visualiseren.

Functionele karakterisering en visualisatie van slokdarmfibroblasten met behulp van organoïde coculturen

Hier beschrijven we de constructie van een basis driedimensionaal (3D) intestinale cellijnmodelsysteem en een paraffine-inbeddingsprotocol voor lichtmicroscopische evaluatie van vaste darmequivalenten. Kleuring van geselecteerde eiwitten maakt de analyse van meerdere visuele parameters van een enkel experiment mogelijk voor mogelijk gebruik in preklinische onderzoeken naar geneesmiddelen.

Basis driedimensionaal (3D) darmmodelsysteem met een immuuncomponent

Deze studie introduceert een nieuw κ-carrageen sub-microgel suspensiebad, dat opmerkelijke omkeerbare jamming-unjamming overgangseigenschappen vertoont. Deze eigenschappen dragen bij aan de opbouw van biomimetische weefsels en organen in ingebedde 3D-bioprinting. Het succesvol printen van hart-/slokdarmachtige weefsels met hoge resolutie en celgroei demonstreert hoogwaardige bioprinting- en tissue engineering-toepassingen.

Ingebedde bioprinting van weefselachtige structuren met behulp van κ-carrageen sub-microgelmedium

Er wordt een reproduceerbare methode gepresenteerd om 3D-myocardiale weefsels te genereren die smelt-elektrospinnende schrijf- (MEW), polycaprolacton (PCL)-steigers en fibrinehydrogels combineren met hiPSC-afgeleide cardiomyocyten en fibroblasten. Deze techniek biedt nauwkeurige controle over de steigerarchitectuur en kan worden toegepast bij preklinische geneesmiddelentests en modellering van hartaandoeningen.

3D generatie van menselijk myocardweefsel met behulp van smeltelektrospinning schrijven van polycaprolactonsteigers en hiPSC-afgeleide hartcellen

Verken de productie en karakterisering van een 3D weefsel-geïngeerd model van het menselijke slokdarmepitheel met primaire cellen en een gedeceleulariseerd porcine scaffold. Dit platform ondersteunt onderzoek naar slokdarmbiologie en regeneratieve geneeskunde.

Productie, karakterisering en toepassingsmogelijkheden van een 3D Tissue-engineered Human Slokdarmkanker Mucosale Model

Meer video's verkennen