Productie, karakterisering en toepassingsmogelijkheden van een 3D Tissue-engineered Human Slokdarmkanker Mucosale Model
May 18th, 2015
Dit manuscript beschrijft de productie, karakterisering en toepassingsmogelijkheden van een tissue engineered 3D-oesofageale construct bereid uit normale primaire menselijke slokdarm fibroblast en squameuze epitheelcellen gezaaid binnen een de-cellularized varkens schavot. De resultaten tonen de vorming van een volwassen gelaagd epitheel gelijk aan de normale menselijke esophagus.
Het algemene doel van deze procedure is om een 3D-weefselgebouwd model van het humane slokdarm epitheel te produceren voor gebruik als experimenteel platform. Dit wordt bereikt door eerst normale humane slokdarm fibroblasten en epitheelcellen te isoleren uit humane slokdarm weefselmonsters. In de tweede stap worden de fibroblasten gezaaid op een de-epitheliale acellulaire, poreuze signaal, slokdarm scaffold, en gedurende zeven dagen gekweekt.
Vervolgens wordt het scaffold omgekeerd en worden de geïsoleerde humane slokdarm epitheelcellen gedurende vier dagen aan de cultuur toegevoegd. In de laatste stap wordt het model verplaatst naar de lucht-vloeistof interface voor een verdere vijf dagen cultuur, waardoor een volwassen gestratificeerde epitheel kan ontwikkelen. Uiteindelijk wordt immunohistochemie gebruikt om belangrijke markeringen van proliferatie en differentiatie uitgedrukt door de model epitheelcellen te karakteriseren.
De belangrijkste voordelen van deze techniek boven conventionele 2D-celcultuur zijn dat het cellen toestaat om de cel, cel en celmatrix interacties te hebben die ze in vivo zouden hebben. En met behulp van deze techniek kunnen we een volwassen gestratificeerde plaveiselepitheel produceren, vergelijkbaar met het normale slokdarm. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode om drie redenen worstelen.
Eén, het kan een uitdaging zijn om ervoor te zorgen dat de meerderheid van de epitheelcellen zich niet differentiëren voordat ze in het scaffold worden opgenomen. Twee, er moet voorzichtigheid worden betracht om ervoor te zorgen dat de juiste lucht-vloeistof interface wordt geboden tijdens de periode waarin het epitheel aan het rijpen is. En drie, het kan een uitdaging zijn om de integriteit gedurende de gehele kweekperiode te handhaven.
Om humane slokdarm epitheelcellen te isoleren, plaatst u het geoogste humane slokdarm plaveisele mucosa weefsel in een steriele petrischaal en gebruik een met ethanol gesteriliseerde scalpel om het weefsel in strips van 0,5 centimeter te snijden. Incubeer vervolgens het weefsel in 0,1% tryine bedekt bij 37 graden Celsius, en stop de vertering na een uur met vijf milliliter FCS. Vervolgens, terwijl de strips met een pincet worden vastgehouden, schraap de epitheeloppervlak gedurende één tot twee minuten per strip zachtjes met de scalpelmes om de epitheelcellen in het omringende medium te verwijderen. Wanneer alle strips zijn geschraapt, brengt u het medium dat de losgekomen epitheelcellen bevat over in een 15 milliliter centrifugeerbuis.
Nadat de cellen zijn gecentrifugeerd, gooit u de senna weg en suspendeert u de pellet in 12 milliliter epitheelmedium. Gooi vervolgens het medium weg uit een feeder celcultuur en gebruik een steriele pipette om de epitheelcellen op de feeder cellen te plateren om de humane slokdarm fibroblasten te isoleren. Breng de geschraapte weefselstrips over in een steriele petrischaal en snijdt u tenslotte het weefsel met de scalpel in kleine stukjes.
Verteer de stukjes in 10 milliliter 0,5% Collagenase a oplossing bedekt bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide met een bevochtigde atmosfeer overnacht. De volgende dag, brengt u de vertering over in een 50 milliliter centrifugeerbuis en centrifugeert u de cellen. Resuspendeert u de pellet in 10 milliliter fibroblast kweekmedium.
De kweek in een T 75 fles in een celkweek incubator. Om de decellularized varkens slokdarm scaffolds voor te bereiden, begint u door een varkens slokdarm longitudinaal open te snijden met schaar en een paar pincetten. Was vervolgens de slokdarm in een 180 milliliter steriele pot bevattende 100 milliliter steriele PBS gedurende 10 minuten met zacht schudden om eventueel vuil te verwijderen terwijl het weefsel wordt gespoeld.
Spuit een kurk dissectieschaal met 70% ethanol wanneer de kurk droog is in de slokdarm op het bord met de mucosale kant naar boven. Gebruik nu steriele pincetten om de mucosale oppervlakte aan één uiteinde van de slokdarm vast te grijpen en trek het weefsel weg van het bord om de mucosa van de onderliggende submucosa te scheiden. Gebruik vervolgens een steriele scalpelmes om de slokdarm longitudinaal langs de lanare propria te dissecteren, waarbij de pinnen worden verwijderd terwijl de dissectie vordert om de mucosa te kunnen optillen.
Gooi de onderliggende submucosa weg en gebruik een scalpel om de resterende mucosa in stukken van vijf centimeter in vierkanten te snijden. Was de stukken in 150 milliliter steriele PBS met zachte agitatie zoals net gedemonstreerd. Na vijf minuten, brengt u het weefsel over in een 180 milliliter pot bevattende 150 milliliter van een molaire natriumchloride oplossing.
Gesuppleerd met antibiotica bij 37 graden. Na 72 uur, brengt u het weefsel over in 150 milliliter steriele PBS, op welk punt het epitheel zichtbaar zal beginnen te scheiden van het onderliggende weefsel. Gebruik steriele pincetten en een scalpelmes om het loskomende epitheel te verwijderen en plaats het resterende weefsel in een verse pot van 150 milliliter steriele PBS met drie vijf minuten wasbeurten met zachte agitatie, het weefsel moet nu minimaal vier maanden in glycerol worden bewaard.
Om het scaffold volledig te steriliseren, begint u met de voorbereiding van het slokdarm mucosa model door stukken varkens scaffold die minimaal vier maanden in glycerol zijn gesteriliseerd, te rehydrateren. In 100 milliliter steriele PBS gedurende vijf, 10 minuten agitatie. Vervang de supinate met vers PBS voor elke wasbeurt.
Na de vijfde agitatietest, test u de steriliet van het scaffold met een overnachtelijke incubatie in 100 milliliter DMEM bij 37 graden Celsius. De volgende ochtend, brengt u de scaffolds over in afzonderlijke putjes van een zes putjes plaat, submucosale kant omhoog. Plaats vervolgens een steriele medisch gradige roestvrijstalen ring op het midden van elke scaffold en gebruik steriele pincetten om voorzichtig op de ringen te drukken om een adequate afdichting met het weefsel te garanderen vijf keer.
Plaats de vijf humane slokdarm fibroblasten in 0,2 milliliter fibroblasten medium in het midden van elke ring. Overspoel vervolgens het gebied rond de buitenkant van de ring met minima
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit manuscript beschrijft de productie en karakterisering van een 3D weefselkundig model van het humane slokdarm epitheel. Het model wordt gemaakt met normale primaire humane slokdarm fibroblasten en epitheliale cellen die worden gezaaid in een de-gecellulairde porcine scaffold.
Belangrijke studiecomponenten
Gebieden van wetenschap
- Weefseltechniek
- Regeneratieve geneeskunde
- Celbiologie
Achtergrond
- De menselijke slokdarm is een cruciaal orgaan voor de spijsvertering.
- Huidige modellen voor het bestuderen van slokdarmweefsel zijn beperkt.
- Weefseltechniek biedt een potentiële oplossing voor het creëren van functionele weefselmodellen.
- Het begrijpen van de ontwikkeling van slokdarm epitheel is essentieel voor therapeutische toepassingen.
Doel van de studie
- Om een 3D weefselkundig model van het humane slokdarm epitheel te ontwikkelen.
- Om een experimenteel platform te bieden voor het bestuderen van slokdarm biologie.
- Om de proliferatie en differentiatie van epitheliale cellen te karakteriseren.
Gebruikte methoden
- Isolering van normale humane slokdarm fibroblasten en epitheliale cellen uit weefselmonsters.
- Zaaien van fibroblasten op een de-gecellulairde slokdarm scaffold.
- Inversie van de scaffold om epitheliale cellen toe te voegen voor verdere cultuur.
- Cultuur op het lucht-vloeistof grensvlak om de ontwikkeling van gelaagd epitheel te bevorderen.
Belangrijkste resultaten
- Vorming van een volwassen gelaagd epitheel, vergelijkbaar met normaal menselijk slokdarmweefsel.
- Succesvolle karakterisering van belangrijke markeren van proliferatie en differentiatie.
- Demonstratie van de geschiktheid van de scaffold voor weefseltechniek toepassingen.
- Mogelijke toepassingen in regeneratieve geneeskunde en ziektemodellering.
Conclusies
- Het ontwikkelde 3D model imiteert het humane slokdarm epitheel effectief.
- Dit model kan dienen als een waardevol hulpmiddel voor toekomstig onderzoek.
- Verdere studies kunnen de toepassingen ervan in medicijntesten en ziekteonderzoek verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Biopharma R&D faces a critical need for physiologically relevant human esophageal models to improve predictive confidence in drug response and disease mechanism studies. This 3D tissue-engineered esophageal mucosal model enables robust interrogation of cell-cell and cell-matrix interactions, supporting translational continuity from early discovery through preclinical research. Its flexibility to incorporate normal, metaplastic, or tumor-derived cells positions it as a reusable platform for mechanistic de-risking and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a human-relevant, stratified epithelial context.
- Supports biological de-risking by recapitulating in vivo cell interactions and tissue architecture.
- Facilitates functional target validation through manipulation of environmental and pharmacological exposures.
- Provides a platform for mechanistic studies of disease progression and cellular response.
Screening & Assay Development
- Prepares validated 3D biological systems for downstream compound screening workflows.
- Enables assay standardization and reproducibility through extended culture and controlled exposures.
- Delivers quantitative outputs via immunohistochemical and histological characterization.
- Supports reliable evaluation of drug efficacy and toxicity in a mature epithelial environment.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by modeling normal, metaplastic, and neoplastic esophageal mucosa.
- Enables study of chronic and repeated exposures, supporting translational biomarker discovery.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions by modeling tumor invasion and drug responsiveness.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation in a human tissue context.
Pipeline & Workflow Integration
This model bridges early discovery, lead identification, and preclinical research by providing a physiologically relevant platform for hypothesis testing and compound evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in a stratified human tissue model.
- Screening: Enables reproducible, quantitative assay outputs for compound and environmental factor testing.
- Analytics: Provides immunohistochemical and histological readouts for comparative analysis.
- Translational Research: Models disease progression and biomarker response in a human-relevant system.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, modifiable platform adaptable to various cell types and research questions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in esophageal research.
- Operational Value: Standardizes 3D tissue culture, enabling reproducibility and scalability across studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust preclinical data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of esophageal disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation, 3D tissue culture, and scaffold preparation.
- Demands access to specialized instrumentation for tissue processing and immunohistochemical analysis.
- Necessitates cross-team standardization of culture conditions and analytical endpoints.
- Adaptable to various cell sources, including tumor and metaplastic lines, for diverse research needs.
- Culture maintenance and air-liquid interface setup present practical challenges for new users.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:05
Human Esophageal Epithelial Cell and Fibroblast Isolation
4:08
De-cellularized Pig Esophageal Scaffold Preparation
6:27
Human Esophageal Mucosa Model Preparation
9:44
Results: Representative 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosa
11:26
Conclusion
