Productie, karakterisering en toepassingsmogelijkheden van een 3D Tissue-engineered Human Slokdarmkanker Mucosale Model

Het algemene doel van deze procedure is om een 3D-weefselgebouwd model van het humane slokdarm epitheel te produceren voor gebruik als experimenteel platform. Dit wordt bereikt door eerst normale humane slokdarm fibroblasten en epitheelcellen te isoleren uit humane slokdarm weefselmonsters. In de tweede stap worden de fibroblasten gezaaid op een de-epitheliale acellulaire, poreuze signaal, slokdarm scaffold, en gedurende zeven dagen gekweekt.

Vervolgens wordt het scaffold omgekeerd en worden de geïsoleerde humane slokdarm epitheelcellen gedurende vier dagen aan de cultuur toegevoegd. In de laatste stap wordt het model verplaatst naar de lucht-vloeistof interface voor een verdere vijf dagen cultuur, waardoor een volwassen gestratificeerde epitheel kan ontwikkelen. Uiteindelijk wordt immunohistochemie gebruikt om belangrijke markeringen van proliferatie en differentiatie uitgedrukt door de model epitheelcellen te karakteriseren.

De belangrijkste voordelen van deze techniek boven conventionele 2D-celcultuur zijn dat het cellen toestaat om de cel, cel en celmatrix interacties te hebben die ze in vivo zouden hebben. En met behulp van deze techniek kunnen we een volwassen gestratificeerde plaveiselepitheel produceren, vergelijkbaar met het normale slokdarm. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode om drie redenen worstelen.

Eén, het kan een uitdaging zijn om ervoor te zorgen dat de meerderheid van de epitheelcellen zich niet differentiëren voordat ze in het scaffold worden opgenomen. Twee, er moet voorzichtigheid worden betracht om ervoor te zorgen dat de juiste lucht-vloeistof interface wordt geboden tijdens de periode waarin het epitheel aan het rijpen is. En drie, het kan een uitdaging zijn om de integriteit gedurende de gehele kweekperiode te handhaven.

Om humane slokdarm epitheelcellen te isoleren, plaatst u het geoogste humane slokdarm plaveisele mucosa weefsel in een steriele petrischaal en gebruik een met ethanol gesteriliseerde scalpel om het weefsel in strips van 0,5 centimeter te snijden. Incubeer vervolgens het weefsel in 0,1% tryine bedekt bij 37 graden Celsius, en stop de vertering na een uur met vijf milliliter FCS. Vervolgens, terwijl de strips met een pincet worden vastgehouden, schraap de epitheeloppervlak gedurende één tot twee minuten per strip zachtjes met de scalpelmes om de epitheelcellen in het omringende medium te verwijderen. Wanneer alle strips zijn geschraapt, brengt u het medium dat de losgekomen epitheelcellen bevat over in een 15 milliliter centrifugeerbuis.

Nadat de cellen zijn gecentrifugeerd, gooit u de senna weg en suspendeert u de pellet in 12 milliliter epitheelmedium. Gooi vervolgens het medium weg uit een feeder celcultuur en gebruik een steriele pipette om de epitheelcellen op de feeder cellen te plateren om de humane slokdarm fibroblasten te isoleren. Breng de geschraapte weefselstrips over in een steriele petrischaal en snijdt u tenslotte het weefsel met de scalpel in kleine stukjes.

Verteer de stukjes in 10 milliliter 0,5% Collagenase a oplossing bedekt bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide met een bevochtigde atmosfeer overnacht. De volgende dag, brengt u de vertering over in een 50 milliliter centrifugeerbuis en centrifugeert u de cellen. Resuspendeert u de pellet in 10 milliliter fibroblast kweekmedium.

De kweek in een T 75 fles in een celkweek incubator. Om de decellularized varkens slokdarm scaffolds voor te bereiden, begint u door een varkens slokdarm longitudinaal open te snijden met schaar en een paar pincetten. Was vervolgens de slokdarm in een 180 milliliter steriele pot bevattende 100 milliliter steriele PBS gedurende 10 minuten met zacht schudden om eventueel vuil te verwijderen terwijl het weefsel wordt gespoeld.

Spuit een kurk dissectieschaal met 70% ethanol wanneer de kurk droog is in de slokdarm op het bord met de mucosale kant naar boven. Gebruik nu steriele pincetten om de mucosale oppervlakte aan één uiteinde van de slokdarm vast te grijpen en trek het weefsel weg van het bord om de mucosa van de onderliggende submucosa te scheiden. Gebruik vervolgens een steriele scalpelmes om de slokdarm longitudinaal langs de lanare propria te dissecteren, waarbij de pinnen worden verwijderd terwijl de dissectie vordert om de mucosa te kunnen optillen.

Gooi de onderliggende submucosa weg en gebruik een scalpel om de resterende mucosa in stukken van vijf centimeter in vierkanten te snijden. Was de stukken in 150 milliliter steriele PBS met zachte agitatie zoals net gedemonstreerd. Na vijf minuten, brengt u het weefsel over in een 180 milliliter pot bevattende 150 milliliter van een molaire natriumchloride oplossing.

Gesuppleerd met antibiotica bij 37 graden. Na 72 uur, brengt u het weefsel over in 150 milliliter steriele PBS, op welk punt het epitheel zichtbaar zal beginnen te scheiden van het onderliggende weefsel. Gebruik steriele pincetten en een scalpelmes om het loskomende epitheel te verwijderen en plaats het resterende weefsel in een verse pot van 150 milliliter steriele PBS met drie vijf minuten wasbeurten met zachte agitatie, het weefsel moet nu minimaal vier maanden in glycerol worden bewaard.

Om het scaffold volledig te steriliseren, begint u met de voorbereiding van het slokdarm mucosa model door stukken varkens scaffold die minimaal vier maanden in glycerol zijn gesteriliseerd, te rehydrateren. In 100 milliliter steriele PBS gedurende vijf, 10 minuten agitatie. Vervang de supinate met vers PBS voor elke wasbeurt.

Na de vijfde agitatietest, test u de steriliet van het scaffold met een overnachtelijke incubatie in 100 milliliter DMEM bij 37 graden Celsius. De volgende ochtend, brengt u de scaffolds over in afzonderlijke putjes van een zes putjes plaat, submucosale kant omhoog. Plaats vervolgens een steriele medisch gradige roestvrijstalen ring op het midden van elke scaffold en gebruik steriele pincetten om voorzichtig op de ringen te drukken om een adequate afdichting met het weefsel te garanderen vijf keer.

Plaats de vijf humane slokdarm fibroblasten in 0,2 milliliter fibroblasten medium in het midden van elke ring. Overspoel vervolgens het gebied rond de buitenkant van de ring met minima