Name: Een enzymatische methode om mesenchymale stamcellen te redden van klonterde beenmergmonsters (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Leer een enzymatische methode om mesenchymale stamcellen te redden uit geklonterde beenmergmonsters met urokinase. Dit protocol biedt een snelle en kosteneffectieve oplossing voor stamcelonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de Swiss National Foundation Grant CR3I3_140717/1 en de Swiss Paraplegic Foundation.

OPMERKING: Human beenmergaspiraten uit het bekken werden verzameld van toestemming donoren met goedkeuring van de ethische commissie van het kanton Luzern. Canine beenmergaspiraten uit het bekken werden verzameld hond eigenaar consent.Human (ong. 20 ml) en honden (ong. 10 ml) beenmergaspiraten waren anti-gecoaguleerd door toevoeging van 15 ml 3,8% natriumcitraat onmiddellijk na verwijdering in de operatiekamer. De monsters werden overgebracht naar het laboratorium voor verwerking op dezelfde dag als ingetrokken. 1. Bereiding van Urokinase (Vóór 1 st gebruik) <ol><li> Reconstitueren urokinase met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) volgens de instructies van de fabrikant: Voeg 10 ml PBS aan het septum inlaat kolf met een injectiespuit 10 ml. Los de droge stof door werveling tot 50.000 injectie units (U) per ml te verkrijgen. </li><li> Bereid 500 ul porties (25.000 U elk) in sterile buizen. WINKEL aliquots -20 ° C en gebruiken wanneer vereist voor ten minste 6 maanden. </li></ol> 2. Preparatief Stappen (Voorafgaand aan iedere Bone Marrow Treatment) <ol><li> Ontdooi een aliquot van urokinase (25,000 U) per geklonterd beenmergaspiraat (weggezogen volumes tot 25 ml met succes behandeld met een hoeveelheid van 25.000 U). </li><li> Verwarm een ​​waterbad of schudincubator tot 37 ° C. </li></ol> 3. Enzymatische Digest van het Clot <ol><li> Voer alle werkzaamheden in een laminaire stroming bioveiligheid kast om microbiële besmetting van het beenmerg monsters tijdens de verwerking te voorkomen. Bij het werken met potentieel besmettelijk menselijk materiaal, is het gebruik van beschermende handschoenen en een zorgvuldige behandeling geadviseerd. </li><li> Plaats een 100 urn zeef cel op een steriele buis van 50 ml. Giet de beenmergaspiraat door de cel zeef, het kantelen van de zeef of bewegen rond het stolsel materiaal. Gebruik een steriele pipet tip voorbetere doorstroming door het filtergaas. OPMERKING: Vermijd elke verdunning van het stolsel, bijvoorbeeld door het wassen van het stolsel met PBS. Urokinase werkt indirect vereist componenten van het serum (bijv., Plasminogeen) van de biopsie doeltreffende digest. Terwijl de voortzetting van de procedure het stolsel materiaal, kan het filtraat bij kamertemperatuur bewaard tot gebruik in stap 3.6. </li><li> Transfer het beenmerg stolsel materiaal in een lege cel cultuur schotel met behulp van een steriel pincet. Snijd het vuil in kleine stukjes van ongeveer 2 mm 3 met een steriele scalpel. </li><li> Breng de kleine deeltjes van het stolsel in een 50 ml reageerbuis met de steriele pincet. Zorg ervoor dat het gehakt stolsel heeft een natte verschijning. Indien droog lijkt, gebruik van sommige van het filtraat uit stap 3.1 te bevochtigen. </li><li> Vermaal het stolsel door en neer te pipetteren voor 5 keer met behulp van een 5 ml microtiter- pipet. Voeg 1 portie van urokinase aan het monster. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C ofwel in een waterbad ofeen schudden (zachtjes) incubator. </li><li> Vermaal door en neer te pipetteren voor 5 keer met behulp van een 5 ml pipet. Voer deze stap in een bioveiligheid kast. Incubeer nog eens 30 minuten bij 37 ° C. Na de incubatie, vermaal nogmaals 5 keer met een 5 ml pipet. Pass over een verse 100 micrometer cel zeef te bundelen met het filtraat uit stap 3.2. </li><li> Centrifugeer de celsuspensie bij omgevingstemperatuur gedurende 10 min bij 500 x g. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de celpellet in media zoals hieronder beschreven of volgens de standaardprocedure van laboratorium MSC expansie cultuur. </li></ol> 4. Zaaien voor uitbreiding van de Cel Cultuur en CFU Platen <ol><li> Resuspendeer de cellen (bestaande uit erythrocyten en mononucleaire cellen) in 50 ml basismedium: alfa-MEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 U / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine en 2,5 mg / ml amfotericine B . Tel de cellen 1:10 verdund in trypaanblauw oplossing met behulp van een Neubauer chamber. </li><li> Plaat de cellen in celkweek kolven bij de dichtheid van 5 x 10 7 cellen / cm2 en geïncubeerd in een bevochtigde incubator bij 37 ° C. Indien beschikbaar, gebruik hypoxische (5% zuurstof) voorwaarden. Voor de CFU assay controle plaat 10 9 cellen in een celkweek schaal van 10 cm diameter. </li><li> Na 3 dagen kweken worden mesenchymale stamcellen aan de celkweek schotel bevestigd terwijl andere cellen in suspensie blijven. Verander het medium met basaal medium aangevuld met 5 ng / ml basische fibroblast groeifactor (bFGF). Voor de CFU-test controle, behandel de celkweekschaaltje evenzo. </li><li> Verder celkweek voor een totaal van 2 weken uitwisseling media drie keer per week. Als cellen meer dan 80% samenvloeiing, gesplitst door behandeling met trypsine. Voor de CFU assay controle wisselen de media eveneens, maar de cellen niet opgesplitst tijdens de twee weken. </li></ol> 5. Giemsa Stain voor CFU Assay <ol><li> Bereid 10 ml van Giemsa-oplossing per gerecht: dilute de stockoplossing (7,6 g / l Giemsa in glycerol: methanol) 1:10 in steriel water (altijd voor te bereiden een frisse werkende verdunning). </li><li> Verwijder de media uit de cel cultuur schotel en was de cellen met PBS. Wees zeer voorzorg bij de toepassing van vloeistof aan de petrischaal en te voorkomen dat het wassen uit de cellen. </li><li> Fix cellen in pure methanol gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi de Methanol. Voeg de Giemsa-oplossing en incubeer gedurende 60 min in een bevochtigde incubator bij 37 ° C. </li><li> Was tweemaal met PBS. Lucht droog de plaat hoofd eerst op een stuk keukenpapier. Tel de kolonies handmatig. Dit wordt het best bereikt door een markeerstift op de achterkant van de plaat. </li></ol> 6. MSC Differentiatie <ol><li> Canine MSC differentiatie OPMERKING: Canine MSC&#39;s werden in chondrogene en osteogene adipogenic lineages gedifferentieerd door stimulatie met de juiste media voor vier weken. </li><li> Voor Adipogenic differentiatie, cultuur MSC&#39;s in monolaag op 4 x 10 5 ceLLS / cm2 afwisselend twee verschillende kweekomstandigheden als volgt; <ol><li> Cultuur in adipogenese onderhoudsmedium DMEM + GlutaMAX, 3% FBS, 100 eenheden / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine, 2,5 pg / ml amfotericine B en 170 mM insuline. </li><li> Cultuur in vetcel- inducerende media met het onderhoud medium aangevuld met 3% FBS, 5% konijnenserum, 1 uM dexamethason, 500uM 3-Isobutyl-1-methylxanthine, 33 uM biotine, 5 uM rosiglitazon en 17 uM pantothenaat 16. </li><li> Revel de vetdruppels door kleuring met Oil Red-O. In het kort, fix cellen met 10% formaldehyde, wassen met PBS en vlekken met 0,35% Olie rode O in isopropanol. </li></ol></li><li> Voor osteogene differentiatie cultuur MSCs in monolaag 7 x 10 3 cellen / cm2 en stimuleren het volgende: <ol><li> Geavanceerde DMEM (GIBCO) + GlutaMAX, 5% FBS, 100 eenheden / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine, 2,5 pg / ml amfotericine B, 501, M L-ascorbinezuur 2-fosfaat, 10 mM ß-glycerofosfaat en 100 nM dexamethason. </li><li> Identificeer de mineralisatie deposito&#39;s van Von Kossa vlek (5% AgNO 3). Kort vast de cellen met 10% formaldehyde, wassen met PBS en vlek met 5% AgNO3 in gedestilleerd water. </li></ol></li><li> Chondrogene differentiatie <ol><li> Cut blokjes (3 mm per zijde) van een spons gevormde medische inrichting, gevormd uit gevriesdroogde collageen type I, en als dragermateriaal voor cel 17 te ondersteunen. </li><li> Zaad MSCs op de bovenkant van de kubussen bij een concentratie van 4 x 10 6 cellen / ml (~ 70.000 cellen / cube). </li><li> Vóór de toevoeging van media, zodat de cellen hechten aan de kubussen voor 30 min. </li><li> Handhaaf MSC-collageen constructen chondrogene media bestaande uit DMEM / F12 + GlutaMAX, 2,5% FBS, 100 eenheden / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine, 2,5 pg / ml amfotericine B, 40 ng / ml dexamethason, 50 ug / ml ascorbinezuur -2-fosfaat,50 ug / ml L-proline, 1x insuline-transferrine-Seleen X, en 10 ng / ml transformerende groeifactor-β1. </li><li> Gebruik alcianblauwkleuring om ophoping van proteoglycanen visualiseren in constructies secties. In het kort, vlekken de secties O / N met 0,4% alcianblauw opgelost in 0,01% H 2 SO 4 en 0,5 M guanidinehydrochloride. Vervolgens werden was de secties gedurende 30 min gewassen in 40% DMSO en 0,05 M MgCl2. Cellen werden tegengekleurd met nucleaire snel rood. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotency+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+adult+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.</a> Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).</li>
<li>Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).</li>
<li>Bartholomew, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+suppress+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+prolong+skin+graft+survival+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo.</a> Exp Hematol. 30 (1), 42-48 (2002).</li>
<li>Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Clinical applications of mesenchymal stem cells.</a> J Hematol Oncol. 5, 19(2012).</li>
<li>Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mesenchymal+stem+cells%3A+characterization%2C+differentiation%2C+and+application+in+cell+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy.</a> J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).</li>
<li>Malempati, S., Joshi, S., Lai, S., Braner, D. A., Tegtmeyer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Videos+in+clinical+medicine.+Bone+marrow+aspiration+and+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Videos in clinical medicine. Bone marrow aspiration and biopsy.</a> N Engl J Med. 361 (15), e28(2009).</li>
<li>Cuthbert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-platform+quality+control+assay+to+quantify+multipotential+stromal+cells+in+bone+marrow+aspirates+prior+to+bulk+manufacture+or+direct+therapeutic+use%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Single-platform quality control assay to quantify multipotential stromal cells in bone marrow aspirates prior to bulk manufacture or direct therapeutic use.</a> Cytotherapy. 14 (4), 431-440 (2012).</li>
<li>Veyrat-Masson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+content+of+fresh+bone+marrow%3A+a+proposed+quality+control+method+for+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal content of fresh bone marrow: a proposed quality control method for cell therapy.</a> Br J Haematol. 139 (2), 312-320 (2007).</li>
<li>Lazarus, H. M., Haynesworth, S. E., Gerson, S. L., Rosenthal, N. S., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+and+subsequent+infusion+of+human+bone+marrow-derived+stromal+progenitor+cells+%28mesenchymal+progenitor+cells%29%3A+implications+for+therapeutic+use%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use.</a> Bone Marrow Transplant. 16 (4), 557-564 (1995).</li>
<li>Bertolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+expansion+score+for+tissue-engineering+applications+with+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">An in vitro expansion score for tissue-engineering applications with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2013).</li>
<li>Casiraghi, F., Remuzzi, G., Abbate, M., Perico, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+mesenchymal+stromal+cell+therapy+and+risk+of+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Multipotent mesenchymal stromal cell therapy and risk of malignancies.</a> Stem Cell Rev. 9 (1), 65-79 (2013).</li>
<li>Bonab, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+of+mesenchymal+stem+cell+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Aging of mesenchymal stem cell in vitro.</a> BMC Cell Biol. 7, 14(2006).</li>
<li>Niku, S. D., Hoon, D. S., Cochran, A. J., Morton, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+lymphocytes+from+clotted+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of lymphocytes from clotted blood.</a> J Immunol Methods. 105 (1), 9-14 (1987).</li>
<li>De Vis, J., Renmans, W., Segers, E., Jochmans, K., De Waele, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+immunophenotyping+of+leukemia+cells+in+clotted+blood+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric immunophenotyping of leukemia cells in clotted blood and bone marrow.</a> J Immunol Methods. 137 (2), 193-197 (1991).</li>
<li>St Antoine, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+thrombolytic+drugs+on+clotted+blood+and+bone+marrow+specimens+to+generate+usable+cells+for+cytogenetic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pathol+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Application of thrombolytic drugs on clotted blood and bone marrow specimens to generate usable cells for cytogenetic analyses.</a> Arch Pathol Lab Med. 135 (7), 915-919 (2011).</li>
<li>Kisiel, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+in+vitro+proliferation+of+canine+mesenchymal+stem+cells+derived+from+bone+marrow%2C+adipose+tissue%2C+muscle%2C+and+periosteum%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum.</a> Am J Vet Res. 73 (8), 1305-1317 (2012).</li>
<li>Bertolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+different+commercial+scaffolds+on+the+in+vitro+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells+to+nucleus+pulposus-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Spine+J%22%5BJournal%5D)">Influence of different commercial scaffolds on the in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells.</a> Eur Spine J. 21, Suppl 6. S826-S838 (2012).</li>
<li>Makridakis, M., Roubelakis, M. G., Vlahou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%3A+insights+into+the+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Stem cells: insights into the secretome.</a> Biochim Biophys Acta. 1834 (11), 2380-2384 (2013).</li>
<li>Benvenuti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosiglitazone+stimulates+adipogenesis+and+decreases+osteoblastogenesis+in+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol+Invest%22%5BJournal%5D)">Rosiglitazone stimulates adipogenesis and decreases osteoblastogenesis in human mesenchymal stem cells.</a> J Endocrinol Invest. 30 (9), RC26-RC30 (2007).</li>
<li>Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+differentiation+of+purified%2C+culture-expanded+human+mesenchymal+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro.</a> J Cell Biochem. 64 (2), 295-312 (1997).</li>
<li>Patel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+banking+for+research--bench+to+bedside+and+back--myth%2C+reality+or+fast+fading+reality+at+the+dawn+of+a+personalised+healthcare+era%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Bank%22%5BJournal%5D)">Tissue banking for research--bench to bedside and back--myth, reality or fast fading reality at the dawn of a personalised healthcare era.</a> Cell Tissue Bank. 12 (1), 19-21 (2011).</li>
<li>Smith, H. W., Marshall, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cell+signalling+by+uPAR%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of cell signalling by uPAR.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 23-36 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Routinematig proeven we beenmerg terwijl de patiënt ondergaat een operatie (in ons geval vooral wervelkolom chirurgie), met het voordeel dat slechts weinig extra werk heeft verricht door het personeel in de operatiekamer te voeren. Hoewel de monsters onmiddellijk na verwijdering worden gemengd met natriumcitraat, vele monsters werden gedeeltelijk gestold bij hun aankomst in het laboratorium voor verwerking. In dit stadium zou resampling om clotted exemplaren te vervangen afzonderlijke extra ingreep weer noodzakelijk pla...

Mesenchymale stamcellen (MSC&#39;s) spelen een belangrijke rol in de regeneratieve geneeskunde en tissue engineering. Ze kunnen migreren, differentiëren in verschillende celtypes 1 en inenten, waardoor ze de ideale kandidaten voor autologe therapieën 2,3 maakt. De laatste tijd, klinische studies met behulp van MSC&#39;s voor bot en kraakbeen reparatie, graft-versus-host ziekte of hart-en vaatziekten werden gelanceerd 4. Deze MSC&#39;s kunnen worden geoogst uit de navelstreng of vetweefsel maar veelbelovende resultaten werden verkregen uit beenmerg afgeleide stamcellen 5. De iliac crest maakt een aanzienlijke hoeveelheid beenmerg verzamelen en dient derhalve hoofdplaats aspiratie 6. De kwaliteit van het aspiraat afneemt met toenemende hoeveelheid beenmerg ingetrokken. Terwijl de eerste 5 ml beenmergaspiraat bevatten MSC&#39;s van hoge kwaliteit, de intrekking van grotere volumes leidt tot verwatering van het aspireren met perifere bloed fROM De vaatrijke bot 7. Door de onderhavige megakaryocyten en bloedplaatjes, beenmerg aspiraten zijn verklonteren, tenzij anticoagulantia gebruikt. Maar zelfs met anticoagulantia, kunnen stolsels voordoen. In beenmerg MSCs slechts een klein deel van het totale celpool 8 en moet in kweek geëxpandeerd meeste tissue engineering of therapeutische toepassingen 4. De kwaliteit van een dergelijke cultuur is grotendeels afhankelijk van de initiële cel zwembad, dwz., Diversiteit en een hoog startnummer 9. Lage aantallen MSC&#39;s uit de markt nemen kan gedeeltelijk verklaard worden door donor variabiliteit. Aan de andere kant, MSC&#39;s van lage kwaliteit monsters vereisen een langere tijd in cultuur en uitgebreid passage naar het gewenste aantal cellen te bereiken. In beide gevallen verlengd passages is een bron van celsenescentie en kan leiden tot verlies van differentiatie potentieel 10. Daarom geoptimaliseerde protocollen die cel y kunnen maximaliserenield en te voorkomen dat nadelige gevolgen moeten worden ontwikkeld 11,12. Toen we begonnen te werken met honden MSC&#39;s, we waren verbaasd om te zien dat ongeveer drie op de vier honden beenmerg monsters bevatte stolsels, terwijl gelukkig clotted menselijke stalen (één op de tien) waren minder frequent. Aan de andere kant was het geen verrassing, dat zagen we veel lagere opbrengst van MSC&#39;s uit gestolde monsters. Om de steeds terugkerende probleem van de gestolde monsters op te lossen, het protocol ontwikkelden we met behulp van de trombolyticum urokinase in plaats van resampling. Trombolytische therapie kan levensbedreigende situaties als afsluiting van de bloedvaten hartaanval, beroerte of embolieën door ongewenste stolling tegengaan. Zij werken door afbraak van de stolsels door enzymatische splitsing van fibrine door plasmine en enzymatische plasminogeen activatoren. Ondanks het ruime gebruik voor de behandeling van patiënten, slechts zeer weinig publicaties bestaan ​​die gebruikt trombolytische activiteitenvoor laboratorium toepassingen gestolde monsters redden, vooral gericht op lymfocyten. In 1987, Niku et al. de toepassing beschreven van streptokinase voor het oplossen van bloedstolsels resulteert in functionele lymfocyten 13 en vier jaar later, De Vis et al. uitgebreid gebruik van streptokinase leukemiecellen isoleren uit bloed en beenmerg flowcytometrische toepassingen 14. Een meer recente publicatie suggereert het gebruik van Alteplase voor de diagnostiek van kanker 15. Tijdens het gebruik van de dezelfde enzymatische benadering, ons protocol richt zich op de isolatie van multipotente MSC vorm beenmerg om een ​​hulpmiddel voor onderzoekers op het gebied van stamcellen bieden.

```html
<table><tbody><tr><td>Basal Medium Components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PenStrep 100X</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Human FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine</td><td>Amimed</td><td>1-23S50-I</td><td></td></tr><tr><td>FBS Heat Inactivated</td><td>Amimed</td><td>2-01F36-I</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Applichem</td><td>A1907</td><td></td></tr><tr><td>Adipogenic Medium Components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM-HAM F12 + GlutaMAX</td><td>Amimed</td><td>1-26F09-I</td><td></td></tr><tr><td>Insulin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit serum&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>16120099</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Applichem</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Biotin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R2408</td><td></td></tr><tr><td>Pantothenate&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5155</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red-O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Osteogenic Medium Components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbic acid 2-phosphate</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-glycerophosphate</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Silver nitrate (AgNO3)</td><td>Sigma</td><td>S6506</td><td></td></tr><tr><td>Chondrogenic Medium Components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biopad - sponge shaped medical device&nbsp;</td><td>Euroresearch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-proline&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5607</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selenium X</td><td>Gibco</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>Human transforming growth factor-&beta;1&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>Sigma</td><td>A3157</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear fast red</td><td>Sigma</td><td>N8002</td><td></td></tr><tr><td>Generic</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tri-Sodium citrate dihydrate</td><td>Applichem</td><td>A3901</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Applichem</td><td>964.9100</td><td></td></tr><tr><td>Urokinase</td><td>Medac</td><td>1976826</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa stain</td><td>Applichem</td><td>A0885</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Applichem</td><td>A0877</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric acid (H2SO4)</td><td>Applichem</td><td>A0655</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Applichem</td><td>A1584</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride (MgCl2)</td><td>Applichem</td><td>A3618</td><td></td></tr><tr><td>Guanidine hydrochloride</td><td>Applichem</td><td>A1499</td><td></td></tr><tr><td>Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml reaction tube</td><td>Axygen</td><td>SCT-50ML-25-S</td><td></td></tr><tr><td>10 ml syringe</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>Sterican needle (22G)</td><td>Braun</td><td>4657624</td><td></td></tr><tr><td>1.7 ml Microtubes</td><td>Brunschwig</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>6.05935</td><td></td></tr><tr><td>sterile forceps</td><td>Bastos Viegas, SA</td><td>489-001</td><td></td></tr><tr><td>sterile scalpel</td><td>Braun</td><td>5518059</td><td></td></tr><tr><td>Primaria cell cuture dish</td><td>Falcon</td><td>353803</td><td></td></tr><tr><td>C-Chip Neubauer Improved</td><td>Bioswisstech</td><td>505050</td><td></td></tr><tr><td>cell culture flask - Flask T300</td><td>TPP</td><td>90301</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microbiological biosafety cabinet class II</td><td>Skan</td><td>82011500</td><td></td></tr><tr><td>water bath</td><td>Memmert</td><td>1305.0377</td><td></td></tr><tr><td>Stripettes Serological Pipette 5ml</td><td>Corning</td><td>4487-200ea</td><td></td></tr><tr><td>microscope</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>humidified incubator Heracells 240</td><td>Thermo scientific</td><td>51026331</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge 1S-R</td><td>Thermo scientific</td><td>75004331</td><td></td></tr></tbody></table>
```

een enzymatische methode om mesenchymale stamcellen te redden van klonterde beenmergmonsters

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Mesenchymale stamcellen (MSC's) - meestal verkregen uit beenmerg - vereisen vaak expansiekweek. Ons protocol gebruikt urokinase van klinische kwaliteit om stolsels in het beenmerg af te breken en MSC's vrij te maken voor verder gebruik. Dit protocol biedt een snelle en goedkope alternatief voor beenmergresampling. Beenmerg is een belangrijke bron van MSC's, die interessant zijn voor weefselengineering en autologe stamceltherapieën. Bij onttrekking kan beenmerg stol, omdat het het hele hematopoëtische systeem omvat. De resulterende stolsels bevatten ook MSC's die verloren gaan voor expansiekweek of directe stamceltherapie. We hebben ervaren dat 74% van de hondenbotmergmonsters stolsels bevatte en minder dan de helft van het aantal stamcellen opleverde dat werd verwacht van ongestolde monsters. Daarom hebben we een protocol ontwikkeld voor enzymatische vertering van die stolsels om arbeidsintensieve en kostbare beenmergresampling te vermijden. Urokinase - een klinisch goedgekeurd en gemakkelijk verkrijgbaar trombolytisch medicijn – verwijdert de beenmergstolsels bijna volledig. Als gevolg hiervan leveren behandelde beenmergaspiraten vergelijkbare aantallen MSC's op als ongestolde monsters. Ook na behandeling met urokinase behielden de cellen hun metabolische activiteit en het vermogen om te differentiëren in chondrogene, osteogene en adipogeene lijnen. Ons protocol redt gestolde bloed- en beenmergmonsters zonder de kwaliteit van de cellen te beïnvloeden. Dit maakt hersampling overbodig, vermindert de bemonsteringskosten aanzienlijk en maakt het gebruik van gestolde monsters voor onderzoek of therapie mogelijk.

Het feit dat 74% van canine beenmerg monsters (n = 54) die stolsels bij hun aankomst in ons laboratorium (Figuur 1A) met verminderde MSC opbrengsten uit deze monsters, maakte ons geloven dat een aanzienlijk aantal MSC&#39;s werd gevangen in de stolsels . Inderdaad, een eenvoudige DAPI-kleuring van coupes stollen materiaal bevestigt de aanwezigheid van kernhoudende cellen in hoge dichtheid (Figuur 1B). Dit leidt uiteindelijk tot lage aantallen MSC&#39;s beschikbaar voor uitbreiding van d...

Mesenchymale stamcellen worden meestal verkregen uit beenmerg en vereisen expansiekweek. Wanneer monsters stollen voordat ze worden verwerkt, kan een protocol met het (enzymatische) trombolytische medicijn urokinase worden toegepast om het stolsel af te breken. Zo worden cellen vrijgemaakt en beschikbaar voor expansiekweek. Dit protocol biedt een snelle en goedkope alternatief voor herbemonstering.

Een enzymatische methode om mesenchymale stamcellen te redden van klonterde beenmergmonsters

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Het algemene doel van deze procedure is om gestolde beenmergmonsters bruikbaar te maken door de stolsels te verteren met urokinase. Dit wordt bereikt door het beenmergmonster eerst door een celzeef te filteren. Vervolgens wordt het beenmergstolsel in kleine stukjes gesneden.Vervolgens wordt het stolsel overgebracht naar een Falcon-buis en gedigesteerd met urokinase. Ten slotte wordt het gedigesteerde stolselmateriaal gezaaid voor de expansie van mesenchymale stamcellen of MSC's. Uiteindelijk worden de platen vergeleken met een controleplaat met em sustain om de effectiviteit van de digestie te beoordelen.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot autologe stamceltherapie of diagnostiek. Omdat voor een transplantatie de expansie en differentiatie van een groot aantal stamcellen vereist is. We kregen het eerste idee voor deze methode toen we merkten dat veel beenmergmonsters van DOC gestold waren bij aankomst in ons laboratorium.We wilden zulke kostbare monsters simpelweg niet weggooien. Om urokinase te reconstitueren: injecteer 10 milliliters steriele PBS in de septum-inlaatfles en vortex tot een concentratie van 50.000 units per milliliter is opgelost. Verdeel dit in al

an-enzymatic-method-to-rescue-mesenchymal-stem-cells-from-clotted

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Rat MSC's werden geïsoleerd uit dijbeen en dij-en vervolgens verrijkt door magnetische celsortering. Gesorteerde cellen werden bevestigd voor de expressie van de oppervlakte markers door flowcytometrie. Deze cellen werden ook gekweekt in klonale dichtheid aan enkele kolonies vormen en vervolgens deze kolonies werden van elkaar gescheiden door het klonen van cilinders.

Isolatie en Verrijking van Rat mesenchymale stamcellen (MSC&#39;s) en de scheiding van Single-kolonie Derived MSC&#39;s

Een methode om de verdeling van beenmerg hematopoietische stamcellen in flowcytometrie en efficiënt isoleren sterk gezuiverde hematopoietische stamcellen (HSC) analyse beschreven. De isolatie procedure is in hoofdzaak gebaseerd op magnetische verrijking van c-Kit + cellen en cel sortering tot HSCs voor cellulaire en moleculaire studies te zuiveren.

Fenotypische analyse en isolatie van Murine hematopoëtische stamcellen en Lineage-geëngageerde voorouders

Een experimentele techniek voor de behandeling van osteochondrale defecten in het konijn kniegewricht beschreven. De implantatie van allogene mesenchymale stamcellen in osteochondrale defecten heeft een veelbelovende ontwikkeling op het gebied van weefsel engineering. De voorbereiding van...

Behandeling van Osteochondrale Defecten in de Rabbit&#39;s kniegewricht door Implantatie van Allogeneic mesenchymale stamcellen in fibrinestolsels

In this video, we demonstrate the isolation and culture of bone marrow stromal cells from the long bones of mice. The isolated adherent BMSCs can be used for further analysis.

Isolation and Culture of Bone Marrow Stromal Cells from a Mouse Tibia

Mesenchymale stamcellen (MSC's) hebben een differentiatiepotentieel naar de osteoblastische lijn wanneer ze worden gestimuleerd met oplosbare factoren of specifieke biomaterialen. Dit werk presenteert een nieuwe optie voor de aflevering van MSC's uit menselijk amnionmembraan (AM-hMSC's) die de boviene botmatrix Nukbone (NKB) gebruikt als een scaffold.

Isolatie van menselijke mesenchymale stamcellen en hun kweek op de poreuze botmatrix

Het kweken van menselijke mesenchymale stromale cellen (hMSCs) met autologe serum, vermindert het risico op afwijzing door xenogene materiaal en andere negatieve effecten. Het staat ook voor het herstel van een subset van mesodermale voorlopercellen, die een frisse hMSCs kan leveren. Inbedding hMSCs in een autoloog fibrinestolsel maakt een eenvoudige bediening en effectieve chirurgische implantatie.

Mesenchymale stromale Cell Cultuur en Levering in autologe Voorwaarden: een slimme aanpak voor orthopedische toepassingen

Dit protocol illustreert een veilige en efficiënte procedure voor het wijzigen van de CD133+ hematopoietische stamcellen. De voorgestelde niet-virale, magnetische polyplex gebaseerde benadering verschaffen een basis voor de optimalisatie van de cel van de stam van de therapeutische effecten ook monitoring van het product door de overheid gereguleerde cel via magnetische resonantie beeldvorming.

Protocol voor MicroRNA overdracht naar volwassen beenmerg-afgeleide hematopoietische stamcellen om cel Engineering gecombineerd met magnetische Targeting

Dit protocol biedt een enzym vrije methode voor het isoleren van mesenchymale stamcellen uit correctie-en lipoaspirate-monsters met behulp van een explant methode. De afwezigheid van harde enzymen of centrifugeer stappen voorziet in klinisch relevante stamcellen die kunnen worden gebruikt voor studies in vitro of teruggeplaatst naar de kliniek.

Een enzym vrije methode voor isolatie en uitbreiding van mesenchymale stamcellen van menselijke adipeus

Hier presenteren we protocollen die isolatie van stromale cellen uit muizenbot, beenmerg, thymus en menselijk thymusweefsel mogelijk maken die compatibel zijn met single-cell multiomics.

Stromale celisolatie van hematopoëtische organen

Dit protocol beschrijft een magnetische kralen-gebaseerde sorteermethode waarbij fycoerythrine (PE)-gelabelde flowcytometrie-antilichamen en anti-PE-microkorrels worden gebruikt om specifieke mesenchymale stamcelsubpopulaties met hoge postsort-doelmarkerpositiviteit en geconserveerde CCK-8-gebaseerde proliferatie/metabole activiteit onder de geteste omstandigheden te isoleren, zonder dure celsorteerders of doelspecifieke op maat gemaakte kralen te vereisen.

Isolatie en validatie van Podoplanine-positieve mesenchymale stamcelsubpopulaties met behulp van een indirecte magnetische kraalstrategie

Leer een enzymatische methode om mesenchymale stamcellen te redden uit geklonterde beenmergmonsters met urokinase. Dit protocol biedt een snelle en kosteneffectieve oplossing voor stamcelonderzoek.

Een enzymatische methode om mesenchymale stamcellen te redden van klonterde beenmergmonsters

Meer video's verkennen