Een gestandaardiseerde methode voor de analyse van lever sinusoïdale endotheelcellen en hun fenestraties van Scanning Electron Microscopy
30 april 2015
De fenestreerde lever sinusoidale endotheelcel is een biologisch belangrijk filtersysteem dat sterk wordt beïnvloed door verschillende ziekten, toxines en fysiologische toestanden. Deze veranderingen hebben een aanzienlijke invloed op de leverfunctie. We beschrijven methoden voor de standaardisatie van de meting van de grootte en het aantal fenestraties in deze cellen.
Het algemene doel van deze procedure is het analyseren van het lever-sinusoïdaal endotheel. Dit wordt bereikt door eerst een lever te isoleren en deze te perfunderen met fixatiemiddel. Vervolgens wordt de lever in blokjes gesneden en gedehydrateerd ter voorbereiding op elektronenmicroscopie.
Vervolgens worden de levermonsters gesputtercoat en onderzocht met een elektronenmicroscoop. Ten slotte worden de elektronenmicrografieën geanalyseerd en worden de diameter en frequentie van de fenestraties en het percentage porositeit berekend. Uiteindelijk wordt elektronenmicroscopie gebruikt om veranderingen in het lever-sinusoïdaal endotheel onder verschillende omstandigheden aan te tonen.
Deze methode biedt ons inzicht in de ultrastructuur en morfologie van de bloedvaten in het endotheel van de lever. Ze kan ook op dezelfde wijze worden gebruikt om de nier en de hersenen te onderzoeken. Alle procedures waarbij dieren worden gebruikt, worden uitgevoerd volgens de lokale wetgeving. Dit werk is goedgekeurd door het Sydney Local Health District Animal Welfare Committee.
De toegestane procedures zijn beschreven in de documentatie van de projectlicentie en volgen richtlijnen die op elk moment het welzijn van het dier waarborgen. Dit is een niet-overlevingsoperatie. Nadat het fixatief volgens het tekstprotocol is voorbereid, worden de perfusiebuffer en het fixatief verwarmd tot 35 tot 37 °C.
Zodra het dier is geanestheseerd met een enkele intraperitoneale injectie van ketamine en xylazine, wordt de graad van sedatie beoordeeld door middel van de terugtrekreflex van de achterpoten en een knijptest in de staart. Maak vervolgens met botte scharen een Y-incisie in de buikholte van het dier om de lever en de poortader bloot te leggen. Bind daarna twee zeer losse hechtingen rond de poortader, één proximaal ten opzichte van de lever en de andere meer distaal ten opzichte van de lever.
Cannuleer de poortader met een IV-canule van een passende maat. Trek vervolgens de hechtingen aan om de canule te fixeren. Begin nu de perfusie bij een druk van 10 cm H2O met gebruik van 5 tot 20 ml PBS, voorverwarmd tot 37 °C.
Voorkom dat er luchtbellen in de lever terechtkomen, aangezien dit artefacten en een te hoge luchtdruk zou veroorzaken, wat de lever kan beschadigen; doorsnij de vena cava abdominalis en thoracalis zodat de buffer vrij uit de lever kan stromen. Dit voorkomt een hoge tegendruk en beschadiging van de lever, de sinusoidale en endotheliale cellen of LCC's. Zodra de lever bloedvrij is, vervangt u de PBS door fixeerder voor elektronenmicroscopie (em) en perfuseert u totdat de lever hard is geworden en zeer bleek is.
Ongeveer vijf minuten. Snijd vervolgens met het scalpel de lever in blokjes van één tot twee kubieke millimeter. Gebruik fixatiemiddel voor de naconservering.
Fixeer het weefsel bij vier graden Celsius gedurende 24 tot 72 uur. Breng het weefsel vervolgens over naar 0,1 molar natrium-CAE-buffer en bewaar dit bij vier graden Celsius tot maximaal 12 maanden om de specimens voor scanningelektronenmicroscopie of SEM te monteren. Nadat de monsters volgens het tekstprotocol zijn gedehydrateerd, labelt u de basis van de metalen SEM-stubs en brengt u onder een dissectiemicroscoop dubbelzijdige koolstofband aan op de bovenkant van de stubs; visualiseer de monsters om het oppervlak met de beste sinusoïden voor SEM te identificeren.
Plaats het kant, met de gekozen zijde naar boven, op het koolstoftape-oppervlak van de stub en plak het stevig vast. Nadat sputter coating en SEM zijn uitgevoerd volgens het tekstprotocol, opent u een afbeelding in ImageJ en gebruikt u de in de afbeelding ingebedde schaalbalk om de schaal in te stellen. Gebruik de polygoon-tool in ImageJ om het gehele platte oppervlak van de LSEC te omtrekken, inclusief gefenestreerde en niet-gefenestreerde gebieden; sluit grote stukken debris uit die zich op het celoppervlak bevinden en fenestraties kunnen maskeren. Om de diameter van de fenestraties te meten, trekt u met de lijn-tool een lijn door de langste diameter van elke fenestratie.
Druk op M om de lijn te meten en op D om de lijn permanent op de afbeelding te tekenen. Deze lijn wordt gedefinieerd als de fenestratie-diameter en is nu beschikbaar in het resultatenvenster van ImageJ. Meet alle openingen (gaps) die grotere gaten in het LSEC-cytoplasma zijn van meer dan 250 nanometers, evenals de fenestraties. Bereken de oppervlakte van openingen die niet cirkelvormig zijn door de omtrek te volgen en ImageJ te gebruiken om hun oppervlakte te berekenen, waarna de gegevens vanuit het resultatenvenster van ImageJ naar een Excel-werkblad worden overgezet.
Voor verdere analyse kunnen de volgende formules worden gebruikt voor het uitvoeren van fenestratieberekeningen. De gemiddelde fenestratiediameter is gelijk aan het gemiddelde van alle fenestratiediameters. De fenestratieoppervlakte is gelijk aan pi r kwadraat, waarbij R wordt berekend op basis van de individuele fenestratiediameters.
Het porositeitspercentage is gelijk aan sigma pi R kwadraat gedeeld door het totale geanalyseerde oppervlak in microns maal 100; sluit het totale oppervlak van de openingen uit deze berekening uit. Om de gegevens in publicaties te presenteren, dient de fenestratie-diameter te worden vermeld, samen met een verklaring waarin wordt bevestigd dat grensdiameters zijn gebruikt om de fenestraties, de fenestratiefrequentie en de porositeit te definiëren. Voeg ook een verklaring toe waarin wordt bevestigd of openingen in de analyse zijn meegenomen, en een frequentieverdelingsgrafiek van de fenestratie-diameter en het aantal leverblokken, evenals afbeeldingen. Bij lage vergroting met SEM is een plat oppervlak van het leverpreparaat zichtbaar met een blootgesteld gebied dat groot genoeg is om veel grote levervaten en sinusoïden waar te nemen, inclusief het portale tractus en de centrale ES, zoals hier getoond.
Het waarborgen van de juiste plaatsing van het leverblok op de montagepen is essentieel voor het verkrijgen van heldere beelden van de sinusoïden; het glanzende kapsel, dat alle details van de sinusoïden van de lever bedekt, moet worden vermeden. Om deze reden, zoals hier getoond, maakt een hogere vergroting de observatie van LSEC-fenestraties mogelijk. De platen hepatocyten kunnen lijken op bloedvaten, maar kenmerken zoals de BLI helpen bij de oriëntatie.
Deze figuur demonstreert dat een hoge perfusiedruk artefacten kan veroorzaken, zoals grote gaten in het endotheel die vermoedelijk worden veroorzaakt door coalescentie van de LSEC SIV-platen en die eenvoudig te identificeren zijn onder SEM; het vermijden van het celmembraan direct boven de kernen, wat zichtbaar is als een uitstulping onder het oppervlak van de LSEC, zal bijdragen aan de nauwkeurigheid van de berekeningen voor fenestratiedichtheid en porositeit. Ten slotte bieden kwantificeringen van de diameter, dichtheid en frequentie van LSEC-fenestraties een empirische meting van de fenestraties en maken zij metingen mogelijk van veranderingen veroorzaakt door veroudering, ziekte, toxines of therapieën. Na de perfusieprocedure kan het weefsel worden verwerkt voor andere technieken, zoals transmissie-elektronenmicroscopie, om de cellulaire ultrastructuur en mitochondriale structuur te bestuderen.
Het kan ook worden gebruikt voor histologie.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een gestandaardiseerd protocol voor het analyseren van de morfologie van lever-sinusoïdale endotheelcellen (LSECs) met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM). De methode maakt een nauwkeurige meting mogelijk van de grootte, frequentie en porositeit van de fenestraties, wat cruciaal is voor het begrijpen van hoe fysiologische, pathologische en farmacologische factoren de leverfunctie beïnvloeden.
Belangrijkste Componenten van de Studie
Wetenschapsgebied
- Leverbiologie
- Cellulaire morfologie
- Elektronenmicroscopie
Achtergrond
- LSECs beschikken over transcellulaire fenestraties die de overdracht van stoffen van het bloed naar het leverparenchym faciliteren.
- Fenestraties zijn dynamisch en kunnen in grootte en aantal variëren als reactie op ziekten, geneesmiddelen of fysiologische toestanden.
- Een nauwkeurige kwantificering van fenestraties is essentieel voor het bestuderen van leverfunctie en pathologie.
- Gestandaardiseerde beeldgevings- en analyseprotocollen zijn nodig voor de reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid tussen studies.
Doel van de studie
- Om een reproduceerbaar protocol te bieden voor de fixatie, verwerking en SEM-analyse van LSECs.
- Om nauwkeurige meting van de diameter, frequentie en porositeit van fenestraties mogelijk te maken.
- Om de studie van morfologische veranderingen van LSECs onder diverse experimentele condities te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Perfusiefixatie van de lever met behulp van verwarmde buffers en fixatiemiddelen.
- Dissectie en sectie van leverweefsel in kleine blokjes.
- Dehydratatie, inbedding en sputter-coating van monsters voor SEM.
- SEM-beeldvorming bij verschillende vergrotingen om LSEC-fenestraties te visualiseren.
- Kwantitatieve beeldanalyse met ImageJ om de diameter, frequentie en het percentage porositeit van de fenestraties te meten.
Belangrijkste resultaten
- SEM maakt een duidelijke visualisatie mogelijk van de fenestraties van LSEC's en de lever-sinusoïdale structuren.
- Een juiste perfusiedruk en weefselbehandeling zijn cruciaal om artefacten zoals kunstmatige openingen te voorkomen.
- Kwantitatieve analyse levert empirische gegevens op over de diameter, dichtheid en porositeit van de fenestraties.
- Het protocol maakt het mogelijk om morfologische veranderingen in LSEC's te detecteren die zijn veroorzaakt door veroudering, ziekten, toxines of therapieën.
Conclusies
- Dit gestandaardiseerde SEM-protocol biedt betrouwbare en reproduceerbare metingen van LSEC-fenestraties.
- Nauwkeurige morfologische analyse ondersteunt studies naar leverfunctie en pathologie.
- De methode kan worden aangepast voor analyse van andere organen, zoals de nieren en de hersenen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Nauwkeurige kwantificering van fenestraties in lever-sinusoïdale endotheelcellen maakt mechanistische risicoanalyse mogelijk bij hepatotoxiciteit en validatie van targets voor metabole ziekten. Gestandaardiseerde SEM-gebaseerde analyse biedt voorspellende zekerheid bij het beoordelen van door verbindingen geïnduceerde endotheelveranderingen, wat vroege go/no-go-beslissingen in discovery-pipelines ondersteunt. Deze methode verbetert de translationele continuïteit door ultrastructurele fenotypes te koppelen aan resultaten van de leverfunctie in preklinische modellen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door de diameter, frequentie en porositeit van fenestraties te kwantificeren als functionele read-outs van het LSEC-fenotype.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicovermindering mogelijk via een reproduceerbare ultrastructurele beoordeling van endotheliale permeabiliteitsmechanismen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt het voorspellende vertrouwen bij de selectie van targets door fenestratiedynamiek te koppelen aan ziekterelateerde fysiologische toestanden.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream compound screening door baseline-metrieken voor fenestratie vast te stellen.
- Operationele waarde: Pakt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid aan via vaste protocollen voor perfusie, fixatie en beeldanalyse.
- Strategische waarde: Benadrukt de screening-gereedheid via kwantitatieve, op SEM gebaseerde output die geschikt is voor high-content endotheliale fenotypering.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Bespreekt de relevantie voor ziekten door detectie mogelijk te maken van veranderingen in fenestraties als reactie op toxines, veroudering of ziektebeelden.
- Operationele waarde: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie via consistente morfometrische analyse van LSEC's.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door empirische gegevens te leveren over de endotheliale integriteit onder experimentele condities.
Integratie van Pipeline & Workflow
Plaatst de methode binnen het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie tot preklinische beoordeling, waarbij endotheliale integriteit bijdraagt aan de mechanismegebaseerde evaluatie van verbindingen.
- Discovery Biology: Legt uit hoe de methode hypothesetoetsing, padverduidelijking of biologische risicovermindering ondersteunt via fenestratie-morfometrie.
- Screening: Beschrijft de gereedheid van de assay, reproduceerbaarheid of kwantitatieve resultaten wanneer dit door het artikel wordt ondersteund.
- Analytics: Benadrukt metingen, read-outs of statistische resultaten die teams helpen om condities tussen experimentele groepen te vergelijken.
- Translational Research: Verbindt de methode met preklinische continuïteit of biomarker-afstemming, uitsluitend wanneer de bron dit ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit in plaats van een eenmalige techniek.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Predictieve betrouwbaarheid, targetvalidatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit bij de beoordeling van de endotheel functie.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van LSEC-fenotyperingsworkflows.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium bij programma's gericht op de lever.
- Portfolio-impact: Risico-gecorrigeerde prioritisering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van kwantificeerbare endotheelveranderingen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in monstervoorbereiding voor elektronenmicroscopie en morfometrische analyse.
- Behoeften aan instrumentatie en analytische infrastructuur, waaronder SEM, sputtercoater en software voor beeldanalyse.
- Eisen voor standaardisatie tussen teams voor fixatie-, dehydratatie- en beeldvormingsprotocollen over verschillende laboratoria heen.
- Overwegingen voor aanpassing aan modelssystemen, zoals het endotheel van de nieren en de hersenen, zoals vermeld in de bron.
- Praktische beperkingen ondersteund door bronmateriaal, waaronder het vermijden van artefacten door perfusiedruk en een juiste oriëntatie van het monster.
