Een gestandaardiseerde methode voor de analyse van lever sinusoïdale endotheelcellen en hun fenestraties van Scanning Electron Microscopy
30 april 2015
De fenestreerde lever sinusoidale endotheelcel is een biologisch belangrijk filtersysteem dat sterk wordt beïnvloed door verschillende ziekten, toxines en fysiologische toestanden. Deze veranderingen hebben een aanzienlijke invloed op de leverfunctie. We beschrijven methoden voor de standaardisatie van de meting van de grootte en het aantal fenestraties in deze cellen.
Het algemene doel van deze procedure is om het lever-sinusoïdale endotheel te analyseren. Dit wordt bereikt door eerst een lever te isoleren en deze te perfunderen met fixeermiddel. Vervolgens wordt de lever in blokken gesneden en gedehydrateerd ter voorbereiding op elektronenmicroscopie.
Vervolgens worden de levermonsters sputter gecoat en onder een elektronenmicroscoop bekeken. Ten slotte worden de elektronenmicrografieën geanalyseerd en worden de diameter en frequentie van de fenestraties en het percentage porositeit berekend. Uiteindelijk wordt elektronenmicroscopie gebruikt om veranderingen in het lever-sinusoïdale endotheel onder verschillende omstandigheden te laten zien.
Deze methode geeft ons inzicht in de ultrastructuur en morfologie van de leverbloedvaten in hun endotheel. Het kan ook worden gebruikt om de nieren en de hersenen op dezelfde manier te onderzoeken. Alle procedures waarbij dieren worden gebruikt, worden uitgevoerd volgens de lokale wetgeving. Dit werk is goedgekeurd door het Sydney Local Health District Animal Welfare Committee.
De toegestane procedures worden beschreven in de projectlicentiedocumentatie en volgen richtlijnen die het welzijn van het dier te allen tijde waarborgen. Dit is een niet-overlevenschirurgie. Na het bereiden van fixeermiddel, volgens het tekstprotocol, warm de perfusiebuffer en fixeermiddel op tot 35 tot 37 graden Celsius.
Zodra het dier is verdoofd met een enkele intraperitoneale injectie van ketamine en xylazine, beoordeel het niveau van sedatie door middel van het intrekken van de achterpoten en een staartprik. Vervolgens, met botte schaar, maak een Y-incisie in de buik van het dier om de lever en de poortader bloot te leggen. Bind vervolgens twee zeer losse hechtingen rond de poortader, één proximaal van de lever en de andere verder van de lever.
Canuleer de poortader met een geschikte IV-canule. Draai vervolgens de hechtingen aan om de canule te bevestigen. Gebruik nu vijf tot twintig milliliter PBS, opgewarmd tot 37 graden Celsius, en begin de perfusie met een druk van 10 centimeter H2O.
Vermijd dat luchtbellen de lever binnendringen, wat artefacten zou produceren en een te hoge luchtdruk, die de lever zal beschadigen, doorknip de abdominale en thoracale vena CVA om de buffer vrij uit de lever te laten stromen. Dit voorkomt hoge terugdruk, schade aan lever-, sinusoïdale en endotheelcellen of LCC's. Zodra de lever bloedvrij is, vervang de PBS met elektronenmicroscopie of EM-fixeermiddel en perfuseer tot de lever hard en erg bleek is.
Ongeveer vijf minuten. Snijd vervolgens de lever met het scalpel in blokken van één tot twee kubieke millimeter. Gebruik EM-fixeermiddel om te post.
Fixeer het weefsel bij vier graden Celsius gedurende 24 tot 72 uur. Breng vervolgens het weefsel over in 0,1 molair natriumcatebuffer en bewaar het gedurende maximaal 12 maanden bij vier graden Celsius om de monsters voor rasterelektronenmicroscopie of SEM te monteren. Na het dehydrateren van de monsters volgens het tekstprotocol, label de basis van de metalen SEM-stubs en breng dubbelzijdig koolstoftape aan op de bovenkant van de stubs onder een dissectiemicroscoop, visualiseer de monsters om het oppervlak met de beste sinusoïden voor SEM te identificeren.
Leg een gekozen oppervlak met de bovenkant naar boven op het koolstoftape-oppervlak van de stub en plak het stevig op de stub. Na het uitvoeren van sputtercoating en SEM volgens het tekstprotocol, open een afbeelding in Image J en gebruik een schaalbalk inbegrepen in de afbeelding om de schaal in te stellen met behulp van het polygoonhulpmiddel in Image J rond het gehele platte gebied van de LSEC, inclusief gefenestreerde en gefenestreerde gebieden, sluit eventuele grote stukken puin die zich op het oppervlak van de cel bevinden en die fenestraties kunnen verbergen. Om de diameter van de fenestraties te meten, plaats een lijn door de langste diameter van elke fenestratie door het lijngereedschap te selecteren.
Druk op M om de lijn te meten en op D om de lijn permanent op de afbeelding te tekenen. Deze lijn wordt gedefinieerd als de diameter van de fenestraties en zal nu beschikbaar zijn in het resultatenvak van Image J. Meet alle openingen die grotere gaten zijn in het LSEC-cytoplasma van meer dan 250 nanometer, evenals fenestraties. Bereken de oppervlakte van openingen die niet cirkelvormig zijn door er omheen te tekenen en gebruik Image J om hun oppervlakte te berekenen. Kopieer de gegevens van het resultatenvak in Image J naar een Excel-spreadsheet.
Voor verdere analyse worden de volgende formules gebruikt voor het uitvoeren van fenestratieberekeningen. De gemiddelde fenestratiediameter is gelijk aan het gemiddelde van alle fenestratiediameters. De fenestratieoppervlakte is gelijk aan pi r vierkant waarbij R wordt berekend op basis van individuele fenestratiediameters.
Het percentage porositeit is gelijk aan sigma pi R vierkant gedeeld door het totale geanalyseerde gebied en microns maal 100. Sluit de som van het gebied van de openingen uit van deze berekening. Om de gegevens in publicaties te presenteren, bevat de fenestratiediameter een verklaring waarin wordt bevestigd dat grensdiameters zijn gebruikt om fenestraties te definiëren. Fenestratiefrequentie en porositeit bevatten ook een verklaring waarin wordt bevestigd of openingen in de analyse zijn opgenomen en een frequentieverdelingsgrafiek van de fenestratiediameter en het aantal leverblokken, evenals afbeeldingen. Lage vergroting door SEM onthult een vlak oppervlak van het levermonster met een blootgestelde ruimte die groot genoeg is om veel grote levervaten en sinusoïden te observeren, inclusief het poortgebied en centrale ES, zoals hier getoond.
Het is essentieel om de juiste plaatsing van het leverblok op de montagestub te waarborgen om duidelijke beelden van de sinusoïden te verkrijgen en de glistencapsule, die alle details van de sinusoïden van de lever moet bedekken, moet worden vermeden. Om deze reden, zoals hier getoond, maakt hogere vergroting het mogelijk om LSEC-fenestraties te observeren. De platen van hepatocyten kunnen op bloedvaten lijken, maar kenmerken zoals de BLI helpen bij de oriëntatie.
Deze figuur toont aan dat hoge perfusiedruk artefacten kan veroorzaken, zoals grote openingen in het endotheel, waarvan wordt aangenomen dat ze worden veroorzaakt door het samensmelten van de LSEC SIV-platen
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel bespreekt de fenestreerde lever-sinusoïdale endotheelcel, die dient als een cruciaal filtersysteem beïnvloed door verschillende ziekten en fysiologische toestanden. De methoden voor het standaardiseren van de meting van fenestratiegrootte en -aantal in deze cellen worden gedetailleerd beschreven.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Pathofysiologie
Achtergrond
- Het lever-sinusoïdale endotheel speelt een vitale rol in de leverfunctie.
- Veranderingen in fenestratie kunnen ziektetoestanden aangeven.
- Elektronenmicroscopie is een cruciaal hulpmiddel voor het bestuderen van deze cellen.
- Standaardisatie van meettechnieken is essentieel voor reproduceerbaarheid.
Doel van het onderzoek
- Om het lever-sinusoïdale endotheel te analyseren.
- Om methoden te ontwikkelen voor het meten van fenestratiekenmerken.
- Om de impact van verschillende omstandigheden op de leverfunctie te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Isolatie van de lever en perfusie met fixeermiddel.
- Snijden van de lever in blokken en dehydratie voor elektronenmicroscopie.
- Sputtercoating van levermonsters.
- Onderzoek onder een elektronenmicroscoop en analyse van micrografieën.
Belangrijkste resultaten
- Meting van fenestratiediameter en -frequentie.
- Berekening van percentage porositeit in levermonsters.
- Identificatie van veranderingen in het lever-sinusoïdale endotheel onder verschillende omstandigheden.
Conclusies
- Elektronenmicroscopie is effectief voor het bestuderen van lever-sinusoïdale endotheelcellen.
- Standaardiseerde meettechnieken verhogen de betrouwbaarheid van de gegevens.
- Begrip van fenestratie veranderingen kan inzichten verschaffen in de levergezondheid.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations enables mechanistic de-risking in hepatotoxicity and metabolic disease target validation. Standardized SEM-based analysis provides predictive confidence for assessing compound-induced endothelial changes, supporting early go/no-go decisions in discovery pipelines. This method enhances translational continuity by linking ultrastructural phenotypes to liver function outcomes across preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying fenestration diameter, frequency, and porosity as functional readouts of LSEC phenotype.
- Operational Value: Enables biological de-risking through reproducible ultrastructural assessment of endothelial permeability mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports predictive confidence in target selection by linking fenestration dynamics to disease-relevant physiological states.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline fenestration metrics.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through fixed perfusion, fixation, and image analysis protocols.
- Strategic Value: Highlights screening readiness via quantitative, SEM-derived outputs suitable for high-content endothelial phenotyping.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by enabling detection of fenestration alterations in response to toxins, aging, or disease states.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation via consistent LSEC morphometric analysis.
- Portfolio Impact: Addresses risk-adjusted advancement decisions by providing empirical data on endothelial integrity under experimental conditions.
Pipeline & Workflow Integration
Positions the method within the discovery continuum from target validation through preclinical assessment, where endothelial integrity informs mechanism-based compound evaluation.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, or biological de-risking via fenestration morphometry.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, or quantitative outputs when supported by the article.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, or statistical outputs that help teams compare conditions across experimental groups.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity or biomarker alignment only when the source supports it.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in endothelial function assessment.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of LSEC phenotyping workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in liver-targeted programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantifiable endothelial changes.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in electron microscopy sample preparation and morphometric analysis.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including SEM, sputter coater, and image analysis software.
- Cross-team standardization requirements for fixation, dehydration, and imaging protocols across laboratories.
- Adaptation considerations across model systems such as kidney and brain endothelium as noted in the source.
- Practical limitations supported by source material including artifact avoidance from perfusion pressure and proper sample orientation.
