Name: Zuurstof-Glucose beroving en reoxygenatie als een In Vitro Ischemie-reperfusie letsel model voor de studie bloed-hersenbarrière Dysfunction (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Leer een in vitro ischemie-reperfusie letselmodel met zuurstof-glucose beroving en reoxygenatie om bloed-hersenbarrière disfunctie te bestuderen. Deze methode helpt onderzoekers celreacties te analyseren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We erkennen Scott en White Ziekenhuis Research Grants Program voor financiële steun en de Texas A &amp; M Health Science Center College of Medicine Geïntegreerde Imaging Laboratorium voor het gebruik van de confocale laser microscoop. Wij erkennen Mr Glen Cryer voor hulp bij manuscript uitgeven.

1. Het zaaien van endotheelcellen <ol><li> Verkrijgen van primaire kweken van RBMEC&#39;s ​​uit volwassen Sprague Dawley ratten (of in de handel te verkrijgen hen). </li><li> Ontwikkel RBMECs in 100 cm fibronectine (50 ug / ml) beklede petrischaaltjes met ratten hersenen endotheelcel medium. Verander het medium elke twee dagen tot confluentie bereikt. </li><li> Bij het bereiken van 80-90% confluentie voorzichtig wassen van de cellen in 5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) door zwenken. De cellen worden vervolgens losgemaakt door ze bloot te stellen aan 1 ml van 0,25% trypsine warme ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) -oplossing, geëquilibreerd tot 37 ° C. </li><li> Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 2-5 minuten totdat de cellen losgemaakt en verspreid. OPMERKING: Tik op de cultuur schotel naar de cellen los. Uitzicht cellen onder de microscoop om volledige loslating van cellen bevestigen van het oppervlak van de schaal. </li><li> Voeg 5 ml compleet medium aan de petrischaal om trypsine te neutraliseren.Pipetteer het medium dat losgemaakte cellen en het verzamelen in een 15 ml centrifugebuis. . </li><li> Centrifugeer het medium dat endotheelcellen bij 220 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Zuig het supernatant en het behoud van de pellet met cells.Suspend de pellet in 3-5 ml vers rattenhersenen groei endotheelcellen medium door voorzichtig te mengen op en neer met pipet cellen worden vervolgens geteld met behulp van geautomatiseerde cel balie of een hemocytometer. </li><li> Breng de celsuspensie in fibronectine (50 ug / ml) vooraf beklede steriele kamer 8 en geleidingssysteem, 0,7 cm 2 / putje met een zaaidichtheid varieert tussen 10.000-15.000 cellen per putje. Groeien de cellen bij 37 ° C tot confluentie bereikt Opmerking: Voor het uitvoeren van Western blots of andere experimenten kunnen cellen worden gekweekt in 10 cm celcultuurschalen of speciale gerechten zoals vereist door het experiment. </li></ol> 2. Zuurstof en glucose beroving-reoxygenation In VitroModel OPMERKING: De volgende protocol is aangepast van Zulueta et al. 1997; Zhu H et al. 2012 8,9. <ol><li> Gebruik de hypoxia celcultuur systeem om de effecten van van OGD-R RBMECs in (zie figuur 1) te bestuderen. Instelling en kalibreer de hypoxia cel kweeksysteem voor aanvang van de proef, volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Verwijder de confluente kamer slides (stap 1,8) vanaf de 37 ° C incubator. Vervang het volledige medium in de kamer dia met gedeoxygeneerd, zonder glucose Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM) en geplaatst in hypoxie kamer met 95% N2 en 5% CO2 gedurende 2 uur bij 37 ° C, bij OGD toestand wordt nagebootst. </li><li> Beweeg de cellen terug naar de incubator met 95% O2, 5% CO2 bij 37 ° C en voorzien van verse rattenhersenen endotheelcellen volledig medium en incubeer gedurende nog 1 uur bij 37 ° C. OPMERKING: Deze stap betekent een reoxygenatie situatie. </li><li> Gebruik de kamer dia&#39;s voor immunofluorescentie lokalisatie en rhodamine phalloidin etikettering (zie paragraaf 3). </li></ol> 3. Immunofluorescentie lokalisatie van ZO-1 en F-actine Labeling behulp Rhodamine Phalloidin <ol><li> Expose de kamer slides met RBMEC monolagen tot 100 pi Opti-MEM / verminderde serum media / goed voor 1 uur. Was de kamer slides 3 maal in 100 ui met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,0-7,2). </li><li> Fixeer de cellen met 100 pi 4% paraformaldehyde in PBS (pH 7,0-7,2) gedurende 15 min en de kamer objectglaasjes wassen 3 keer in PBS (pH 7,0-7,2). </li><li> Permeabilize de cellen met 100 pl 0,5% Triton X-100 in PBS (pH 7,0-7,2) voor nog eens 15 min. Blokkeer met 100 gl 2% runderserumalbumine (BSA) in PBS gedurende een uur. Na deze stap ofwel vlek / label cellen hetzij voor ZO-1 of f- actine. <ol><li> Voor immunofluorescentie staining incuberen van de cellen met anti-konijnen primair antilichaam tegen ZO-1 in 1: 150, bereid in 2% BSA-PBS O / N bij 4 ° C. Was de cellen 3 keer in PBS (pH 7,0-7,2). Incubeer met 100 pl fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) gemerkte anti-konijn secundair antilichaam gedurende 1 uur bij KT. </li><li> Voor Rhodamine Phalloidin labeling, na blokkering, blootstellen van de cellen aan 100 gl rhodamine phalloidin in 1:50 verdunning bereid in 2% BSA-PBS, gedurende 20 min. </li><li> Was de cellen van immunofluorescentie kleuring en rhodamine phalloidin labeling in PBS (pH 7,0-7,2). Monteer de kamers met behulp van montage media met anti-fade reagens met DAPI. </li></ol></li><li> Visualiseren cellen met behulp van een 60 X water immersie objectief en cellen worden gescand in een enkel optisch vlak onder een confocale microscoop. </li></ol>

<ol><li>Eltzschig, H. K., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia+and+reperfusion--from+mechanism+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation.</a> Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).</li>
<li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lycium+barbarum+polysaccharides+reduce+intestinal+ischemia%2Freperfusion+injuries+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Interact%22%5BJournal%5D)">Lycium barbarum polysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats.</a> Chem Biol Interact. 204 (3), 166-172 (2013).</li>
<li>Kaur, C., Ling, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+brain+barrier+in+hypoxic-ischemic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Neurovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Blood brain barrier in hypoxic-ischemic conditions.</a> Curr Neurovasc Res. 5 (1), 71-81 (2008).</li>
<li>Khatri, R., McKinney, A. M., Swenson, B., Janardhan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier%2C+reperfusion+injury%2C+and+hemorrhagic+transformation+in+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier, reperfusion injury, and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke.</a> Neurology. 79 Suppl 1. (13), S52-S57 (2012).</li>
<li>Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+for+the+investigation+of+brain+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Experimental models for the investigation of brain ischemia.</a> Cardiovasc Res. 39, 106-120 (1998).</li>
<li>Ogawa, S., Gerlach, H., Esposito, C., Pasagian-Macaulay, A., Brett, J., Stern, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+modulates+the+barrier+and+coagulant+function+of+cultured+bovineendothelium.+Increased+monolayer+permeability+and+induction+of+procoagulant+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hypoxia modulates the barrier and coagulant function of cultured bovineendothelium. Increased monolayer permeability and induction of procoagulant properties.</a> J Clin Invest. 85 (4), 1090-108 (1990).</li>
<li>Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+generation+of+reactive+oxygen+species+in+endothelial+cellsexposed+to+anoxia-reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation.</a> Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baicalin+reduces+the+permeability+of+the+blood-brain+barrier+during+hypoxia+in+vitro+by+increasing+the+expression+of+tight+junction+proteins+in+brain+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells.</a> J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).</li>
<li>Abramov, A. Y., Scorziello, A., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+distinct+mechanisms+generate+oxygen+free+radicals+in+neurons+and+contribute+to+cell+death+during+anoxia+and+reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation.</a> J Neurosci. 27 (5), 1129-1138 (2007).</li>
<li>Gundimeda, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+tea+polyphenols+precondition+against+cell+death+induced+by+oxygen-glucose+deprivation+via+stimulation+of+laminin+receptor%2C+generation+of+reactive+oxygen+species%2C+and+activation+of+protein+kinase+Cepsilon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon.</a> J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).</li>
<li>Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+targets+in+cerebral+ischemia+for+developing+novel+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics.</a> Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).</li>
<li>Alluri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Oxygen+Species-Caspase-3+Relationship+in+Mediating+Blood-Brain+Barrier+Endothelial+Cell+Hyperpermeability+Following+Oxygen-Glucose+Deprivation+and+Reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation.</a> Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).</li>
<li>Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+and+ROCK+signaling+in+VEGF-induced+microvascular+endothelial+hyperpermeability%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability.</a> Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).</li>
<li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP+actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin.</a> J Vis Exp. (57), (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

OGD-R als een in vitro model voor ischemie-reperfusie schade is goed vastgesteld voor het bestuderen neuronen 10,11. Er zijn ook studies die het effect van OGD op de hersenen endotheelcellen en veranderingen in permeabiliteit en TJ integriteit 9. Echter, onze studie toont het effect van OGD en reoxygenatie, hetgeen nader weergave van ischemische reperfusieschade bij in vivo omstandigheden die na herseninfarct optreden. Hypoxische-ischemische aandoening...

Ischemie-reperfusie (IR) schade blijkt de frequente oorzaak van verschillende verzwakkende complicaties en sterfte geassocieerd met beroerte, myocardiaal infarct, trauma, perifere vaatziekte en hersentrauma 1,2 zijn. IR letsel in hersenvaten is een vroege secundaire verwonding leidt tot ontsteking en oedeem 3. Eén van de ernstige complicaties die optreedt als gevolg van oxidatieve en metabole stress na ontsteking verlies van homeostatische balans wat leidt tot vorming van vrije radicalen, veranderingen in de bloed-hersenbarrière (BBB) ​​tight junctions (TJS) en microvasculaire permeabiliteit 4,5. Momenteel in vivo modellen gebruikt om de effecten van IR schade aan de BBB studie omvatten middelste cerebrale arterie occlusie (MCAO), micro-embolie, en transgene en knockout dieren. Echter, elk heeft zijn nadelen en beperkingen zoals besproken door Hossmann 6. MCAO model wordt gebruikt om de effec bestuderents van redox stress, veranderingen in junctionele mededelingen van de BBB en de interacties tussen de hersenen en immuuncellen. Echter, presenteren zij diverse technische uitdagingen zoals de noodzaak voor nauwkeurige microchirurgische procedures en de moeilijkheden daarin. Micro-embolie breekt ogenblikkelijk beneden de BBB, terwijl het gebruik van transgene of knockout dieren cerebrale ischemie studeren uitdagingen zoals gen-afhankelijke moleculaire invloeden op infarct vorming, veranderingen in vasculaire anatomie en wisselende lichaamsgewicht 6 kunnen hebben. Vandaar dat in vitro modellen van ischémie gevonden toenemende belangstelling laatste tijd voornamelijk vanwege hun toepasbaarheid bij het ​​uitvoeren mechanistische studies drugs. Echter, de resultaten van in vitro studies kunnen niet volledig een in vivo onderzoek vertegenwoordigen en moeten met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd 6. Tegenwerkende effect van lage zuurstofconcentraties op endotheliale celmonolagen en microvasculaire doorlaatbaarheid geweestbestudeerd door Ogawa 7. Rattenhersenen microvasculaire endotheelcellen (RBMECs) werden gebruikt om de in vitro BBB ontwikkelen. De zuurstof-glucose deprivatie en reoxygenatie (OGD-R) techniek in dit protocol is aangepast van studies van Zulueta et al en Zhu et al 8,9. We blootgestelde hersenen endotheelcellen OGD-R door ze in een hypoxia / anoxia cupje met 0% O2, 5% CO2 en 95% N2. De cellen werden later onderzocht op veranderingen in TJ integriteit en stress vezelvorming middels respectievelijk immunofluorescentie lokalisatie en rhodamine phalloidin labeling. Immunofluorescentie kleuring voor zonula-occludens 1 (ZO-1) wordt uitgevoerd TJ integriteit te geven, aangezien ZO-1 is een belangrijke scaffolding membraangebonden TJ eiwit. Rhodamine Phalloidin labeling bepaalt de filamenteus actine (F-actine) in de cel cytoskelet en is een duidelijke indicatie van actine spanning vezelvorming in endotheelcellen. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Het doel van deze methode is om inzicht te geven in de ontwikkeling van OGD-R als een in vitro IR model voor het bestuderen van BBB endotheelcellen TJ integriteit en f-actine stress-fiber vorming. De resultaten zullen informatie verschaffen over het lot van TJ eiwit, ZO-1 en stress fiber vorming na OGD-R. Inzicht in deze relaties gelegenheid om de onderliggende moleculaire mechanismen die in werking treden na OGD-R te bepalen en potentiële therapeutische strategieën om de verstoring BBB volgende OGD-R behandeling te bevorderen ontwikkelen.

<table><tbody><tr><td>Proox model 110</td><td>Biospherix</td><td>Model 110</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, geen glucose</td><td>Gibco, Life technologies</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine Phalloidin</td><td>Life technologies</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 Konijn Polyklonaal Antilichaam</td><td>Life technologies</td><td>617300</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab Tek II-CC 8&nbsp;well steriele, glas&nbsp;schuifjes&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>177402</td><td></td></tr><tr><td>FITC-gelabeld anti-konijn secundair antilichaam&nbsp;</td><td>Santa cruz</td><td>sc-2090</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Thermo scientific</td><td>SH 30028.03</td><td>Elk ander beschikbaar PBS kan worden gebruikt</td></tr></tbody></table>

zuurstof-glucose beroving en reoxygenatie als een<em&gt; in vitro</em&gt; ischemie-reperfusie letsel model voor de studie bloed-hersenbarrière dysfunction

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemie-reperfusie (IR) letsel is bekend dat het een belangrijke bijdrage leveren aan de morbiditeit en mortaliteit geassocieerd met ischemische beroerte. Ischemische cerebrovasculaire accidenten zijn goed voor 80% van alle beroertes. Een veelvoorkomende oorzaak van IR schade is de snelle instroming van fluïda na een acute / chronische occlusie van bloed, voedingsstoffen, zuurstof aan het weefsel triggering de vorming van vrije radicalen. Ischemische beroerte wordt gevolgd door de bloed-hersenbarrière (BBB) ​​dysfunctie en vasogeen hersenoedeem. Structureel tight junctions (TJS) tussen de endotheelcellen spelen een belangrijke rol bij het handhaven van de integriteit van de bloed-hersenbarrière (BBB). IR letsel is een vroege secondaire verwonding leidt tot een niet-specifieke, inflammatoire reactie. Oxidatieve en metabole stress na ontsteking veroorzaakt secundaire hersenschade waaronder BBB permeabiliteit en verstoring van de tight junction (TJ) integriteit. Ons protocol presenteert een in vitro &lt;/ Em&gt; voorbeeld van zuurstof-glucose deprivatie en reoxygenatie (OGD-R) op de hersenen van de rat endotheelcellen TJ integriteit en de vorming van stress vezels. Tegenwoordig worden meerdere in vivo experimentele modellen worden gebruikt om de effecten van IR letsel te onderzoeken; maar ze hebben verschillende beperkingen, zoals de technische problemen bij het uitvoeren van operaties, gen afhankelijke moleculaire invloeden en moeilijkheden bij het bestuderen mechanistische relaties. Toch kan in vitro modellen helpen overwinnen veel van deze beperkingen. Het gepresenteerde protocol kan worden gebruikt om de verschillende moleculaire mechanismen en mechanistische relaties bestuderen potentiële therapeutische strategieën. Echter, de resultaten van in vitro studies verschillen van de standaard in vivo studies en moeten met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd.

Cellen gekweekt op fibronectine voorbeklede Nunc II kamer dia&#39;s werden OGD-R onderworpen door het plaatsen in een Biospherix ProOx model 110 kamer. Na het onderwerpen van cellen aan OGD-R, werden ze bewerkt voor ZO-1 junctionele kleuring middels immunofluorescentie techniek zoals getoond in figuur 2 en cytoskelet samenstel aangeven F-actine vorming stress-vezels gebruikt rhodamine label phalloidin vlek zoals in figuur 3. Controle cellen die waren niet onderworpen aan OGD-R toonde vo...

Ischemische-reperfusie (IR) schade is geassocieerd met een hoge mate van morbiditeit en mortaliteit. Het doel van het in vitro model van zuurstof-glucose deprivatie en reoxygenatie (OGD-R) dat hier wordt beschreven, is om de effecten van ischemie reperfusie schade op een verscheidenheid aan cellen te beoordelen, met name op endotheelcellen van de bloed-hersenbarrière (BBB).

Zuurstof-Glucose beroving en reoxygenatie als een<em&gt; In Vitro</em&gt; Ischemie-reperfusie letsel model voor de studie bloed-hersenbarrière Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

Het algemene doel van deze procedure is om de rol van zuurstof- en glucoseprivatie aan te tonen als in vitro ischemie-reperfusieschademodel voor het bestuderen van dysfunctie van de bloed-hersenbarrière. Dit wordt bereikt door hersenendotheelcellen, gekweekt in chamber slides, bloot te stellen aan zuurstof- en glucoseprivatie door het medium te vervangen door gedeoxygeniseerd medium zonder glucose en ze gedurende twee uur in een hypoxiekamer te plaatsen; vervolgens worden de cellen gedurende een uur teruggebracht naar normale omstandigheden om reoxygenatie te bewerkstelligen. Na verwerking van de cellen wordt immunofluorescentiekleuring van ZO-1 en Rodamine-Phalloidine-labeling van filamenteus actine uitgevoerd.De cellen worden vervolgens afgebeeld met een 60 x waterimmersielenz op een confocale microscoop om enkelvoudige optische coupes voor analyse te verkrijgen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Hem Nega, een promovendus in mijn laboratorium. Zorg aan het begin van de procedure dat primaire cultuur RBM-cellen van volwassen Sprague-Dawley ratten aanwezig zijn. Commercieel verkrijgbare lijnen zijn ook acceptabel.Kweek de R BM EECS in schalen van 100 centimeter die zijn gecoat met fibronectine, cultiveer ze in groeimedium voor ratten hersenendotheelcellen en ververs het medium om de dag. Laat de cellen groeien tot ze 80 tot 90% confluent zijn. Was de cellen vervolgens voorzichtig met vijf milliliter PBS.Los vervolgens de cellen van de plaat door eerst één milliliter warme 0,25% tripsin-EDTA-oplossing toe te voegen en de plaat te zwenken. Incubeer de cellen daarna gedurende twee tot vijf minuten. Tik tegen de zijkant van de schaal om de loslating van de cellen te bevorderen en observeer de cellen onder een microscoop om te bevestigen dat ze zijn losgelaten.Om de trypsinisatie te beëindigen, voegt u vijf milliliter compleet medium toe, pipetteert u vervolgens het medium met de losgekoppelde cellen uit en verzamelt u dit in een 15 milliliter centrifugebuis. Centrifugeer het medium met de cellen bij 220 G gedurende vijf minuten, aspireer vervolgens het supernatant en gooi dit weg. Resuspendeer daarna het celpellet in drie tot vijf milliliter vers medium door de cellen voorzichtig door een vijf milliliter pipette te laten stromen.Tel nu de cellen en breng 20 tot 30 000 cellen over naar elke put van een acht-put chamber slide die is gecoat met fibrine en actine. Uiteraard kunnen ze voor andere toepassingen ook op een andere manier worden gekweekt. Incubeer vervolgens de chamber slide tot de cellen ter voorbereiding confluent zijn.Stel het hypoxie-celkulturesysteem in en kalibreer dit. Volgens de instructies van de fabrikant moet de omgeving in de kamer bestaan uit 95% stikstof, 5% kooldioxide en een temperatuur van 37 °C. Deoxygeneer vervolgens glucosevrij DMEM door dit gedurende vier tot zes uur in de hypoxiekamer te plaatsen.Begin met het stressen van de cellen door het medium te vervangen door gedeoxygeneerd glucosevrij DMEM, en plaats de cellen vervolgens gedurende twee uur in de hypoxiekamer. Na twee uur worden de cellen teruggeplaatst in compleet medium voor rattenhersenendotheelcellen. Zuurstofverzadig de cellen vervolgens opnieuw door ze een uur lang terug te brengen naar normale omstandigheden.Begin met het blootstellen van elke put met R-B-M-E-C monolagen aan 100 tot 200 µL optimaal serumarm medium en laat deze een uur incuberen. Was vervolgens de kamerdia's drie keer met 100 tot 200 µL PBS per put per wasbeurt. Fixeer de cellen met 4%paraldehyde in PBS, laat de dia's 15 minuten incuberen bij kamertemperatuur en was de cellen drie keer af met PBS zoals voorheen.Permeabiliseer nu de cellen door 100 tot 200 µL 0,5% Triton X 100 in PBS aan elke well toe te voegen en laat de plaat nog 15 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Nadat de cellen zijn gepermeabiliseerd, brengt u de blokkeringsoplossing aan en laat u deze een uur lang inwerken op de cellen bij kamertemperatuur. Voer vervolgens ofwel immunofluorescentie uit voor het ZO-1 protein, of label F-actine.Om immunofluorescentie van de cellen voor ZO-1 uit te voeren, worden deze overnacht bij 4 °C geïncubeerd met het primaire antilichaam. Was de cellen de volgende dag drie keer met PBS, zoals bij het verwijderen van het fixatief. Incubeer de cellen vervolgens gedurende een uur bij kamertemperatuur in 100 tot 200 µL FITC-geconjugeerd anti-konijn secundair antilichaam om de cellen te labelen met rhodamine.Nadat de blokkeringsoplossing een uur lang is aangebracht, worden de cellen gedurende 20 minuten blootgesteld aan 100 tot 200 microliters R domine Phin in een verdunning van 1:50 in 2% B-S-A-P-B-S. Na de incubatie met het secundaire antilichaam of R domine Phin worden de cellen opnieuw 3 keer gewassen met PBS, zoals eerder beschreven. Verwijder vervolgens de kamers door het elastiek eraf te pellen.Ga verder met het monteren van de preparaten met een medium dat anti-fade bevat en maak een DPI-afbeelding. De cellen worden met confocale microscopie in één vlak waargenomen met een 60 x objectief. Cellen zijn gekweekt in een met fibronectine gecoate kamer.De preparaten werden onderworpen aan OGDR door ze in een hypoxiekamer te plaatsen, zoals beschreven. De cellen werden vervolgens verwerkt voor ZO-1 junctioneel.Kleuring van controlecellen toonde een continue junctionele integriteit, terwijl cellen met zuurstof- en glucosegebrek discontinue juncties vertoonden. Daarnaast werden cytoskeletale veranderingen waargenomen met behulp van phalloidine-labeling om F-actine aan te tonen. Controlecellen vertoonden geen of minimale F-actine stressfiberformatie, terwijl cellen die waren blootgesteld aan OGDR een toegenomen stressfiberformatie vertoonden.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u zuurstof- en glucoseprivatie en reoxygenatie uitvoert. Dit kan worden gebruikt als model voor ischemie-reperfusieschade om de bloed-hersenbarrière, de integriteit van tight junctions en stress-vezelvorming te bestuderen.

oxygen-glucose-deprivation-reoxygenation-as-an-vitro-ischemia

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Source: Alluri, H., et.al. Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction. J. Vis. Exp. (2015).The video demonstrates the impact of oxygen-glucose deprivation and subsequent reoxygenation on rat brain microvascular endothelial cells (RBMECs) by simulating hypoxic and nutrient-deprived conditions. These conditions result in ATP depletion, increased intracellular calcium, and the generation of reactive...

Impact of Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation on Cell-Cell Interactions

Bilaterale carotis occlusie combinatie met systemische hypotensie produceert wereldwijde hersenen ischemie in de rat, met schade aan de hippocampus met reproduceerbare ernst. Proefdieren worden verminderd met voorspelbare patronen van hersenbeschadiging, ze herstellen doelmatig en sterftecijfers zijn relatief laag.

2-Vessel Occlusie / Hypotensie: een rat model van Global Brain Ischemie

In vitro traumatisch hersenletsel modellen gewerkt te reproduceren in vivo hersenen vervorming. Stretch-geïnduceerde schade is werkzaam voor astrocyten, neuronen, gliacellen, aorta, en de hersenen endotheelcellen. Echter, maakt gebruik van ons systeem een bloed-hersenbarrière (BBB) ​​model dat eigenschappen die een legitiem model van de BBB om een te vestigen in vitro TBI model bezit.

Strekken in Brain microvasculaire endotheelcellen (CEND) als een<em&gt; In Vitro</em&gt; Traumatisch Hersenletsel Model van de Blood Brain Barrier

Een protocol voor entorhino-hippocampus organotypische slice culturen, die het mogelijk maakt het reproduceren vele aspecten van ischemisch hersenletsel, wordt gepresenteerd. Door het bestuderen van veranderingen in de neurovasculatuur naast veranderingen in de neuronen, dit protocol is een veelzijdig gereedschap plastic veranderingen in hersenweefsel bestuderen na beschadiging.

De Analyse van Neurovascular Verbouwing in Entorhino-hippocampus Organotypische Slice Culturen

Dit protocol beschrijft repetitieve hypoxische preconditie, of korte blootstellingen aan systemische hypoxie die infarctvolumes en bloed-hersenbarrière-storingen verminderen na een voorbijgaande occlusie van de middelste hersenslagader bij muizen. Het beschrijft ook dubbele kwantificering van infarctvolume en bloed-hersenbarrière-storing na een beroerte om de werkzaamheid van neurovasculaire bescherming te beoordelen.

Kwantificering van Neurovasculaire Protection Na Repetitive Hypoxische Voorconditionering en Transient midden cerebrale slagader Occlusie in Muizen

Ischemische beroerte is een complexe gebeurtenis waarin de specifieke bijdrage van astrocyten naar de hersenen van de getroffen regio blootgesteld aan zuurstof glucose ontbering (OGD) moeilijk te bestuderen. Dit artikel introduceert een methodologie voor het verkrijgen van geïsoleerde astrocyten en studeren hun reactiviteit en de proliferatie onder voorwaarden van OGD.

Toezicht Astrocyt reactiviteit en proliferatie in Vitro ischemische-achtige omstandigheden

Het doel van het protocol is te presenteren van een geoptimaliseerde procedure tot vaststelling van een in vitro bloed - hersenbarrière (BBB) model gebaseerd op primaire varkens endothelial hersencellen (pBECs). Het model toont hoge reproduceerbaarheid, hoge dichtheid, en is geschikt voor studies van vervoer en intracellulaire drugontdekking mensenhandel.

Verbeterde methode voor de vaststelling van een In Vitro bloed - hersenbarrière Model gebaseerd op varkens Endothelial hersencellen

Het algemene doel van deze procedure is bedoeld als een zeer reproduceerbaar techniek voor in vivo beoordeling van de verstoring van de bloed - hersen barrière in rat modellen van ischemische beroerte.

In Vivo eenbeoordeling van de verstoring van de bloed - hersen barrière in een Rat Model van ischemische beroerte

Hier presenteren we een eenvoudige aanpak met behulp van specifieke cultuurmedia die de oprichting van neuron- en astrocytenverrijkte culturen, of neuron-glia culturen uit de embryonale cortex, met hoge opbrengst en reproduceerbaarheid mogelijk maakt.

Een cel cultuur model voor het bestuderen van de rol van Neuron-Glia Interacties in Ischemie

Hier beschrijven we de methode voor het vaststellen van een drievoudig celkweekmodel van de bloed-hersenbarrière op basis van primaire microvasculaire endotheelcellen, astrocyten en pericyten van de menselijke hersenen. Dit meercellige model is geschikt voor studies van neurovasculaire eenheidsdisfunctie tijdens ischemische beroerte in vitro of voor de screening van kandidaat-geneesmiddelen.

Een drievoudig primair celkweekmodel van de menselijke bloed-hersenbarrière voor het bestuderen van ischemische beroerte in vitro

De bloed-hersenbarrière (BBB) speelt een cruciale rol bij het in stand houden van een stabiele en gezonde hersenomgeving. BBB-disfunctie wordt in verband gebracht met veel neurologische aandoeningen. We hebben een 3D, stamcel-afgeleid model van de BBB ontwikkeld om cerebrovasculaire pathologie, BBB-integriteit te onderzoeken en hoe de BBB wordt veranderd door genetica en ziekte.

Reconstructie van de bloed-hersenbarrière in vitro om neurologische aandoeningen te modelleren en therapeutisch aan te pakken

Leer een in vitro ischemie-reperfusie letselmodel met zuurstof-glucose beroving en reoxygenatie om bloed-hersenbarrière disfunctie te bestuderen. Deze methode helpt onderzoekers celreacties te analyseren.

Zuurstof-Glucose beroving en reoxygenatie als een In Vitro Ischemie-reperfusie letsel model voor de studie bloed-hersenbarrière Dysfunction (Video) | JoVE Journal

Zuurstof-Glucose beroving en reoxygenatie als een

Meer video's verkennen