Isolatie van mononucleaire cellen uit het centrale zenuwstelsel van ratten met EAE

Hallo, ik ben Christine Beaton. Ik ben assistent-onderzoeker in het laboratorium van George Chen in de afdeling Fysiologie en Biofysica van de University of California Irvine. Vandaag ga ik u laten zien hoe u mononucleaire cellen uit het centrale zenuwstelsel van ratten isoleert.

Deze procedure omvat het diep anesthetiseren van de rat om een cardiale perfusie uit te voeren, zodat er geen bloedcontaminatie in het centrale zenuwstelsel achterblijft. Nadat we deze hebben verwijderd, nemen we de hersenen en het ruggenmerg uit om met behulp van een celzeef een enkelcel-suspensie te maken; vervolgens isoleren we de mononucleaire cellen middels een dubbellaagse Percoll-gradiënt. Laten we beginnen.

Ik ben nu klaar om de cardiale perfusie uit te voeren, dus ik zal al het materiaal laten zien dat ik daarvoor nodig heb. Het eerste wat we nodig hebben is een stolp, en hieronder hebben we keukenpapier geplaatst dat is gedrenkt in een vluchtig anestheticum. U kunt halothaan of isofluraan gebruiken.

Het volgende dat we nodig hebben is een manier om de rat vast te zetten en een manier om het bloed op te vangen. Daarom hebben we deze geïmproviseerde installatie om de ratten te perfunderen. Je gebruikt hiervoor een naald van 21 gauge, waarbij we een zoutoplossing perfunderen via een zwaartekrachtgestuurd IV-perfusiesysteem.

Als u geen toegang heeft tot een van deze systemen, kunt u ook meerdere spuiten met zoutoplossing vullen en deze handmatig perfunderen. Maar dit is veel eenvoudiger. Daarnaast hebben we een spuitcilinder van 10 ml nodig waarin we Kim wipes hebben geplaatst.

En ik ga er een beetje anestheticum in doen, om op de neus van de rat aan te brengen, zodat deze tijdens de procedure diep onder narcose blijft. En dan heb je natuurlijk instrumenten nodig. Vandaag zal ik geen steriele procedure uitvoeren, omdat ik de cellen niet in kweek ga brengen.

Alle instrumenten die ik gebruik zijn niet steriel. Maar uiteraard, als u cellen wilt kweken, is het raadzaam om steriele instrumenten te gebruiken. Voor de doeleinden van deze video gebruik ik een rat die reeds is overleden.

Ik zal de procedure langzaam uitvoeren om het u stap voor stap te kunnen tonen. Uiteraard zou u bij een echte procedure een rat nodig hebben die diep onder narcose is, maar niet dood. Het is noodzakelijk dat het hart nog klopt.

Laten we beginnen met deze rat. Ik heb de rat op zijn rug geplaatst, met de achterzijde van mij afgewend, en ik heb de verzadigde team-doekjes over de neus gelegd. De eerste stap is vervolgens controleren of de rat diep geanestheseerd is.

Dit moet u dus vóór elk van deze procedures doen. Ik pak mijn pincet en knijp in de rat, en er is geen enkele reactie. Als er wel een reactie is, moet u de rat terugplaatsen in de belger om er zeker van te zijn dat deze diep geanestheseerd is.

Vervolgens gebruik ik 70% ethanol om de bovenste helft van de rat in te weken. Daarna open ik de borstholte. Eerst snijd ik de huid los en open ik deze aan de zijkant.

Vervolgens ga ik de holte zelf openen. Deze massa hier is het hart. Hier ziet u het rechteratrium.

Dat is waar ik ga snijden om het bloed te laten uitstromen. En om vervolgens het hele lichaam te perfunderen, moet ik mijn naald in de linker ventrikel plaatsen. Dus ik ga mijn naald hier precies naar binnen voeren.

Zodra de naald is ingebracht, open ik de IV-slang om de zoutoplossing te laten doorstromen en laat ik dit vijf tot 10 minuten lopen. Als de perfusie goed is, zult u een verkleuring zien van de rode pols, de rode neus en natuurlijk de ogen van de rat, wat aantoont dat het bloed het lichaam van de rat verlaat. Dat betekent dat de perfusie goed moet zijn.

Hier is de rat na de cardiale perfusie. Zoals u kunt zien, zijn de neus, de oren en de ogen van deze rat niet langer roze of rood. Ze zijn volledig wit, wat aantoont dat de perfusie goed is verlopen.

Al of het grootste deel van het bloed heeft de vlekken van de rat verlaten. Nu de rat cardiaal is geperfuseerd, moet ik de kop eraf snijden. Ik moet de rat onthoofden.

Hiervoor maak ik gebruik van standaard laboratoriummateriaal. Ik ga nu de hersenen uit de rat verwijderen. Daarom maak ik eerst alle vacht nat met 70% ethanol om te voorkomen dat er overal haren gaan vliegen.

Vervolgens ga ik eerst de huid verwijderen. Aangezien ik de hersenen niet voor histologie zal gebruiken en ze in kleine stukjes zal snijden, ben ik niet overdreven voorzichtig bij het netjes verwijderen ervan. In één stuk zal ik mijn schaar inbrengen aan de basis van de schedel, precies hier waar de hersenen verbonden zijn met het ruggenmerg.

Vervolgens snijd ik het bot aan beide zijden door en verwijder ik de bovenkant. Dit herhaal ik meerdere malen. Hierdoor is de hersenen nu volledig blootgelegd.

En zoals u kunt zien, is de perfusie goed verlopen omdat de hersenen volledig helder zijn. Bij een niet-geperfundeerd dier zou u zien dat de bovenste laag van de hersenen volledig bedekt is met rode haarvaten, rode bloedcapillairen; u ziet ze hier helemaal niet, wat betekent dat de perfusie succesvol was. Ik ga nu de hersenen eruit scheppen, waarbij ik erop let dat ik de bulbus olfactorius niet achterlaat, en ik plaats ze in een buis met ijskoud PBS.

Nu ga ik de hersenen in de buis met PBS plaatsen, zonder al te veel zorg te besteden aan het intact houden ervan; ik zal de oogzenuwen doorsnijden en met behulp van een spatel komen de hersenen vrij eenvoudig naar buiten. Vervolgens zal ik het ruggenmerg uit dezelfde rat verwijderen. Ook hier zal ik, aangezien we het in kleine stukjes gaan snijden, niet al te voorzichtig zijn om het volledig schoon te verwijderen, zolang ik maar het geheel eruit krijg.

Ik maak eerst een incisie in de huid langs de hele wervelkolom, en de wervelkolom is hier zichtbaar. Vervolgens verwijder ik het vlees hier, zodat de wervelkolom over de gehele lengte is blootgelegd. En precies hier is het ruggenmerg te zien.

Bij een muis kun je beide uiteinden opensnijden en met de spuit PBS inspuiten, waardoor het ruggenmerg er bijna in één stuk uitkomt. Maar bij ratten is dat niet zo eenvoudig. Ik moet het opensnijden en het ruggenmerg eruit scheppen.

Ik maak nu aan beide zijden een insnijding en, net zoals bij de hersenen, snijd ik het bot weg zodat het ruggenmerg vrijkomt. Net als bij de hersenen is het ruggenmerg volledig wit, wat aantoont dat de cardiale perfusie goed is verlopen. Dit doe ik langs de gehele wervelkolom.

Vervolgens ga ik naar het niveau van de rechterheupen, dat zich hier bevindt. Daarna gebruik ik de pincet om — het ziet er niet erg netjes uit — het ruggenmerg eruit te trekken en in de buis met de hersenen te plaatsen. Nu heb ik zowel de hersenen als het ruggenmerg van de rat in mijn buis en ben ik klaar om mijn single-cell suspensie voor te bereiden.

Ik ben nu klaar om een enkelcel-suspensie van mijn centraal zenuwstelsel voor te bereiden. Hiervoor heb ik een petrischaal van 10 centimeter nodig, waarin ik een cellenzeef van 70 micron zal plaatsen. Daarnaast gebruik ik de zuiger van een spuit van 1 ml, en ik heb een pincet en een schaar nodig.

Ik plaats mijn monster in de celzeef en zorg ervoor dat er niets in de buis achterblijft. Vervolgens snijd ik het in kleine stukjes, waarbij zowel de hersenen als het ruggenmerg worden gemengd. Wanneer alles volledig is fijngehakt, gebruik ik de zuiger van de O'Neill-spuit om het door de zeef te drukken.

U zult zien dat de PBS buiten de cell trainer geleidelijk troebeler wordt naarmate de individuele cellen erdoorheen gaan. Als ik mijn celsuspensie zou willen mengen, zou ik dat natuurlijk in een weefselkweekkast doen en zou ik mijn vingers er niet in steken. Nu de PBS troebel is, zal ik deze voor de eerste keer opvangen en in een 50 ml buis plaatsen.

Maar ik blijf er goed op letten en ik ga wat meer PBS toevoegen aan mijn celzeef en ik ga het erdoor drukken. Omdat het centrale zenuwstelsel zoveel vet bevat, is het een van de organen waarvan ik een celisoleerd suspensie met deze techniek het moeilijkst vind om voor te bereiden. Ik heb al mijn CNS meerdere keren door de celzeef geperst en ik heb de volledige enkelcel-suspensie verzameld.

En hier is de buis die ik tot 50 mL heb gevuld met PBS met daarin mijn enkelcel-suspensie, bereid uit het centraal zenuwstelsel van de rechterzijde. Nu ga ik deze buis centrifugeren om deze voor te bereiden op de gradiënt; de cellen zijn nu klaar met centrifugeren. We hebben nu een pellet, dus ik ga het supernatant verwijderen en mijn cellen opnieuw suspenderen in 20 mL van 30% Percoll in PBS.

Vervolgens voeg ik dit toe aan 10 µL 70% perkel in PBS voor de migratie. Ik gooi het supernatant weg. Ik breek het pellet om er zeker van te zijn dat de cellen in een enkelvoudige suspensie zitten en niet als een klont in het pellet.

Nu heb ik mijn suspensie van CNS-cellen als enkelcel-suspensie. Ik ga deze cellen suspenderen in 20 ml 30% Percoll in PBS, en deze 20 ml gaan we over 10 ml 70% Percoll in PBS leggen. Daarna zal ik het centrifugeren.

Ik ga nu mijn 20 mL CNS-suspensie nemen en deze langzaam bovenop de 70% Percoll-laag aanbrengen om het gemakkelijker te maken. U kunt ook een kleurstof zoals fenolrood aan een van de lagen toevoegen, maar ik weet niet precies wat het effect daarvan op de cellen is, mocht dit effect bestaan. Daarom probeer ik dit te vermijden.

U moet langzaam genoeg gaan zodat de twee lagen niet mengen, dus u wilt geen grote turbulentie in uw onderste laag hebben. Naarmate de bovenste laag dikker wordt, kunt u versnellen. Nu heb ik mijn cellen aan de gradiënt toegevoegd.

De heldere laag hieronder is de 70%perkel-laag, en de troebele laag bovenop is een 30%perkel-laag die mijn enkelcel-suspensie bevat. Ik ga deze buis nu 20 minuten in de centrifuge plaatsen, waarna ik de laag mononucleaire cellen kan visualiseren als alles goed is gegaan. De gradiënt is nu gecentrifugeerd.

Centrifuge dus, zoals altijd, een gradiënt; wees er zeer voorzichtig mee om de rem uit te schakelen, zodat deze de gradiënt niet verstoort door te snel af te remmen. Nu hebben we onze lagen. Bovenop de gradiënt bevindt zich een vetlaag die ik ga verwijderen om contaminatie van mijn cel-suspensie te voorkomen.

En op de interface tussen de twee lagen van 30% en 70% perkel ziet u dat de interface niet scherp is, maar wazig, en dat is waar de cellen zich bevinden. Zodra ik de cellen heb verwijderd, zult u zien dat de interface veel scherper zal zijn. Dus ik ga nu het grootste deel van het vet op de bovenste laag verwijderen en dit simpelweg in mijn afvalcontainer doen.

Ik hoef niet alles te verwijderen, maar ik wil genoeg weghalen zodat mijn pipet niet volledig bedekt is wanneer ik naar beneden ga om de monocle-cellen op te halen. Wat ik nu ga doen, is met een andere transferpipet naar het niveau van de interface gaan om mijn cellen te oogsten. Nu heb ik verschillende milliliters bij de interface verzameld.

Ik heb waarschijnlijk alle cellen die ik kon verkrijgen verzameld. Het aantal mononucleaire cellen in dat CZS was erg laag. Nu heb ik mijn mononucleaire cellen in de buis.

Ik vul deze buis tot 50 ml met PBS en centrifugeer de cellen om ze te pelletteren, waardoor het percoll wordt weggewassen. Ik raad aan om ze minstens een paar keer te wassen met een volle buis PBS om er zeker van te zijn dat al het percoll is verwijderd. Daarna zijn de cellen klaar voor elke procedure die u met hen wilt uitvoeren.

Vandaag heb ik laten zien hoe u mononucleaire cellen uit het centraal zenuwstelsel van ratten kunt isoleren. Zodra u deze mononucleaire cellen heeft, kunt u ze uiteraard verder zuiveren om bijvoorbeeld T-lymfocyten uit de populatie te isoleren. Wat ik met deze cellen ga doen, is een flowcytometrie-assay uitvoeren om de celpopulaties in mijn brein te detecteren.

En veel succes met uw celisolatie.