Name: Surface Enhanced Raman Spectroscopy Detectie van biomoleculen met behulp van EBL Fabricated Nanostructured Substrates (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Leer SERS-detectie van biomoleculen met behulp van EBL-gefabriceerde nanogestructureerde substraten. Deze methode maakt gevoelige detectie van eiwitten en aptameren mogelijk voor nanobiotechnologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag bedanken: David Wishart, Valentyna Semenchenko, Mark McDermott, Michael Woodside en Albert Cao voor hun hulp bij het ontwikkelen en voorbereiden van de eiwitconjugaten evenals de DNA-aptamer; T. M. Fahim Amin, Mosa Sharmin Aktar en Trevor Olsen voor hun hulp bij de bereiding van monsters, Jonathan Mane voor zijn hulp bij het genereren van afbeeldingen van de moleculaire structuren; en de financieringsbronnen, waaronder de National Research Council of Canada – National Institute for Nanotechnology (NRC-NINT), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) en de University of Alberta voor het ondersteunen van het werk.

1. Voorbereiding van de ondergrond <ol><li> Gebruik een halfgeleider blokjes snijden zaag om een ​​fused silica (FS) wafel gesneden in 1 cm × 1 cm of kleiner dobbelstenen. </li><li> Schone monsters in een piranha-oplossing (H 2 SO 4: H 2 O 2, 3: 1; LET OP: sterke oxidator) bad 28 voor 15 minuten, spoel dan de dobbelstenen in gedeïoniseerd water en droog in stikstof. </li><li> Plaats de monsters op een kookplaat naar boven bij 180 ° C gedurende 15 min. Koel de monsters na het verwijderen van de kookzone RT. </li><li> Voor Ontwerpen 1 en 3, ga dan naar stap 2. </li><li> Voor Ontwerp 2, plaatst het monster in een elektronenbundel verdampingskamer en jas met een 10 nm laag van Ni. </li></ol> 2. Fabricage van Nano-patroon PMMA Maskers Met behulp Elektronenbundellithografie (EBL) <ol><li> Spin-coat het PMMA resist en geleidende lagen op de substraten. <ol><li> Gebruik een wafer spinner met een stofzuiger klauwplaat en plaats monsters afzonderlijk in het centrum aan de boorkop. Plaats1 druppel polymethylmethacrylaat (PMMA) tegen het midden van de monsters met een glazen pipet en centrifugeren op 3500 tpm gedurende 60 sec met een 2 seconden aanlooptijd. </li><li> Bak de substraten bij 180 ° C gedurende 3-5 min. Na het bakken de substraten Koel de monsters tot kamertemperatuur. </li><li> Met afgekoeld de substraten en teruggevoerd naar de spinner klem, verspreid een druppel geleidende polymeer op het substraat. Spin het substraat voor 40 sec bij 3.000 toeren per minuut met een 2 sec ramp-tijd. Bak monsters bij 80 ° C gedurende 1 min. </li></ol></li><li> Voeren EBL blootstelling volgens de standaard procedure 16,17,18,29. <ol><li> Met aanwijzingen van de fabrikant, een voor belichting ontwerp gebruik feature doses uit Tabel 1 met de kleinst mogelijke stapgrootte bundel. </li><li> Laad het monster in de electron beam lithografie kamer. Als de EBL systeem niet autofocus heeft, gebruik dan een kleine kras weg van waar het patroon moet worden blootgesteld en weg van de kraal rand voor scherpstellinging. </li><li> Met behulp van instructies van de fabrikant, het uitvoeren van de benodigde aandacht en astigmatisme correctie evenals write veld uitlijning in voorkomend geval, en bloot de steekproef. Te zorgen voor de juiste belichting en beste patroon kwaliteit, gebruik maken van een 30 keV elektronenbundel energie en 7,5 micrometer opening voor de blootstellingen. </li></ol></li><li> Verwijder het geleidende polymeer en ontwikkelen blootgestelde monsters. <ol><li> Bereid een beker met gedeïoniseerd (DI) water voor het verwijderen van het geleidende polymeer en een tweede bekerglas met een elutievloeistof (IPA: H2O, 7: 3) ​​en roer gedurende 5 min bij kamertemperatuur. Bereid isopropanol (hoge zuiverheid) in een derde beker als spoelmiddel. </li><li> Met een pincet, plaatst de monsters in het water voor 3 sec om het geleidende polymeer film te verwijderen, plaats dan het monster in de ontwikkelaar en beweeg de pincet langzaam op en neer voor 20 sec. Onmiddellijk over de substraten isopropanol en spoel gedurende 10 seconden en droog het monster met stikstof. </li> &lt;/ Ol&gt; </li></ol> 3. edelmetaal Nanostructures Fabrication <ol><li> Plaats de monsters ondersteboven in de elektronenbundel verdamper systeem waarmee het verdampte metaal wordt afgezet op het voorvlak van de monsters. Stort een 10 nm dikke Au-laag op de monsters voor Ontwerpen 1 en 3, en een 10 nm dik Ag laag voor Ontwerp 2 met een snelheid van ongeveer 0,1 nm / sec. </li><li> Vul een sonicatie systeem om de aanbevolen hoogte met water en vul een aparte beker met aceton. Plaats een monster gezicht in de bodem van de beker en laat het monster inwerken gedurende 10 min. Houdt het bekerglas, plaats het in het waterbad en laat de hoogte van de aceton om de hoogte van het water te passen en zet de geluidsgolven systeem. Laat sonicatie optreden voor maximaal 60 sec. </li><li> Met dezelfde werkwijze als beschreven in stap 3.1, bereiden uniform Au en Ag pad substraten door afzetting van 10 nm dikke metalen films FS (Designs 1 en 3) en Ni-beklede FS (Ontwerp 2) substrAtes overslaan van stap 2. </li></ol> 4. Bio-functionalisering van Substrates <ol><li> Bereid Ontwerp 1 monsters: <ol><li> Bereid een 1 mM oplossing van 11-mercaptodecanoic acid (MUA) in ethanol bij kamertemperatuur. Sonificeer 10 min. </li><li> Dompel juiste nanogestructureerde substraat in de oplossing van MUA 48 uur. Spoel het monster met ethanol drie keer en droog gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Bereid een 75 mM oplossing van N-ethyl-N &#39;- (3- (dimethylamino) propyl) carbodiimide (EDC) in DI-water. Bereid een 15 mM oplossing van N-hydroxysuccinimide (NHS) in DI-water. </li><li> Met een micropipet wordt 100 ul van NHS op de Au op het substraat en voeg onmiddellijk 100 ui EDC op hetzelfde gebied. Incubeer gedurende 1 min tot de zelf-geassembleerde monolaag (SAM) van MUA activeren. </li><li> Plaats 100 ul druppel van proteïne A oplossing (47 pM) op dezelfde plaats van het substraat en slaat het monster gedurende 24 uur bij 5 ° C in een meerdere compartimenten Petri dish met 1 ml DI water in een ander compartiment, en met een gesloten deksel. </li><li> Spoel het monster in DI-water 3 keer door onder voortdurend roeren de monsters in afzonderlijke bekers voor 20 sec in elk bekerglas. Laat niet de monsters te drogen na het spoelen of tijdens het spoelen. </li><li> Ga verder met stap 5. </li></ol></li><li> Bereid Ontwerp 2 monsters: <ol><li> Bereid een 0,9 mM oplossing van glucose bindend eiwit (EUR) in kaliumfosfaatbuffer (K 2 HPO 4, 25 mM, pH 7,5). Bereid een 100 mM oplossing van D-glucose in de buffer. </li><li> Meng 30 ui van 100 mM D-glucose-oplossing en 30 ui 0,9 mM GBP oplossing wordt met een 1 ml plastic microbuisjes houder en een micropipet. Incubeer gedurende 30 min. </li><li> Borg 20 ul van de ligand vrij GBP oplossing en de ligand gebonden GBP oplossing each op de voorbereide ondergrond met een micropipet. Bewaar de monsters bij 5 ° C gedurende 24 uur in een petrischaal met een deksel gesloten. </li><li> Spoel de monsters 3 keer in dekaliumfosfaat bufferoplossing bij kamertemperatuur. </li><li> Ga verder met stap 5. </li></ol></li><li> Bereid Design 3 monsters: <ol><li> Verdun de dopamine bindende aptameer (DBA) oplossing tot een concentratie van 1 uM met de TRIS-EDTA-buffer met een uiteindelijke pH van 7,4. </li><li> Bereid een dopamine oplossing voor een 5 uM concentratie door meting van de dopamine poeder op een analytische balans en het fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) mengen van een roerder kraal gedurende 5 min. </li><li> Deponeer 20 ul druppel van de DBA oplossing op het oppervlak van elk substraat en laat de monsters zitten gedurende 1 uur bij KT met een deksel over de petrischaal. </li><li> Spoel de monsters 3 keer in een kaliumfosfaatbuffer (K 2 HPO 4, 25 mM, pH 7,5). </li><li> Plaats de monsters rechtop op een cleanroom rang doekje om de achterzijde te drogen met behoud van een film op de voorzijde van het substraat. Stel een monster terzijde als controle. </li><li> Breng 5 ul druppel van de oplossing dopamine on het oppervlak van de bestaande druppel van de PBS-bufferoplossing aan de overige monsters met de gewenste dopamine concentraties. Incubeer het monster gedurende 10 min. </li><li> Een druppel van de oplossing op de dopamine Au pad oppervlak zonder aptameer. Incubeer gedurende 10 min. </li><li> Spoel de monsters in de kaliumfosfaat bufferoplossing 3 keer. </li></ol></li></ol> 5. Raman spectroscopie <ol><li> Plaats elk monster in een waterdichte kamer om verdamping door laserbelichting voorkomen. <ol><li> Vul een plastic spuit met chemisch inert hoog vacuüm vet, plaats monsters op glasplaatjes en breng enkele millimeters vet rond de monsters zonder het monsters. </li><li> Plaats een microscoop dekglaasje bovenop de substraten en zachtjes aandrukken om een ​​afdichting te vormen, waardoor een dunne vloeistof interface tussen de substraten en de dekglaasjes zonder dat de buffer in aanraking komt met de vacuüm vet. </li></ol></li><li> Met behulp van eenoptische Raman microscoop kunnen verkrijgen nadruk op het oppervlak van de metaal-nano gevormde gebied te bemonsteren zonder het inschakelen van de laser. </li><li> Voer Raman sampling 18,19 met een laser intensiteit tussen 2,4-3,1 mW met een totale duur van minder dan 20 seconden om schade aan het monster te voorkomen een objectief van 10x vergroting. Verwerven Raman spectra voor monsters van ontwerpen 1, 2 en 3 met de golflengten zoals aangegeven in tabel 1. Ook verwerven controle Raman spectra oplossingen van proteïne A, GBP en D-glucose en dopamine poeder dienst glasplaatjes metaal nanostructuren als dragers voor vergelijking. </li></ol>

<ol><li>Sapsford, K. E., Tyner, K. M., Dair, B. J., Deschamps, J. R., Medlintz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+Nanomaterial+Bioconjugates%3A+A+Review+of+Current+and+Emerging+Purification+and+Characterization+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analyzing Nanomaterial Bioconjugates: A Review of Current and Emerging Purification and Characterization Techniques.</a> Anal. Chem. 83, 4453-4488 (2011).</li>
<li>Walcarius, A., Minteer, S. hD., Wang, J., Yu, L., Merkoçi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomaterials+for+Bio-Functionalized+Electrodes%3A+Recent+Trends%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Nanomaterials for Bio-Functionalized Electrodes: Recent Trends.</a> J. Mater. Chem. B. 1, 4878-4908 (2013).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications%2C+Techniques%2C+and+Microfluidic+Interfacing+for+Nanoscale+Biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid.+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Applications, Techniques, and Microfluidic Interfacing for Nanoscale Biosensing.</a> Microfluid. Nanofluid. 7, 149-167 (2009).</li>
<li>Rassaei, L., Singh, P. S., Lemay, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lithography-Based+Nanoelectrochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Lithography-Based Nanoelectrochemistry.</a> Anal. Chem. 83, 3974-3980 (2011).</li>
<li>Wong, L. S., Khan, F., Micklefield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Covalent+Protein+Immobilization%3A+Strategies+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Selective Covalent Protein Immobilization: Strategies and Applications.</a> Chem. Rev. 109, 4025-4053 (2009).</li>
<li>Ley, C., Holtmann, D., Mangold, K. -M., Schrader, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+Histidine-Tagged+Proteins+on+Electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Immobilization of Histidine-Tagged Proteins on Electrodes.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 88, 539-551 (2011).</li>
<li>Kim, D., Herr, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Immobilization+Techniques+for+Microfluidic+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Protein Immobilization Techniques for Microfluidic Assays.</a> Biomicrofluidics. 7, 041501(2013).</li>
<li>Anker, J. N., Hall, W. P., Lyandres, O., Shah, N. C., Xhao, J., Van Duyne, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensing+with+Plasmonic+Nanosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Biosensing with Plasmonic Nanosensors.</a> Nature Materials. 7, 442-453 (2008).</li>
<li>Bantz, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Progress+in+SERS+Biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.Chem%22%5BJournal%5D)">Recent Progress in SERS Biosensing.</a> Phys.Chem. 13, 11551-11567 (2011).</li>
<li>Sharma, B., Frontiera, R. R., Henry, A. -I., Ringe, E., Van Duyne, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SERS%3A+Materials%2C+Applications%2C+and+the+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Mater.+Today%22%5BJournal%5D)">SERS: Materials, Applications, and the Future.</a> Mater. Today. 15, 16-25 (2012).</li>
<li>Kleinman, S. L., Frontiera, R. R., Henry, A. -I., Dieringer, J. A., Van Duyne, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating%2C+Characterizing%2C+and+Controlling+Chemistry+with+SERS+Hot+Spots%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.Chem.Chem.Phys%22%5BJournal%5D)">Creating, Characterizing, and Controlling Chemistry with SERS Hot Spots.</a> Phys.Chem.Chem.Phys. 15, 21-36 (2013).</li>
<li>Fan, M., Andrade, F. S., Brolo, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+on+the+Fabrication+of+Substrates+for+Surface+Enhanced+Raman+Spectroscopy+and+their+Applications+in+Analytical+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">A Review on the Fabrication of Substrates for Surface Enhanced Raman Spectroscopy and their Applications in Analytical Chemistry.</a> Anal. Chim. Acta. 693, 7-25 (2011).</li>
<li>Cao, Y., Li, D., Jiang, F., Yang, Y., Zh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Metal+Nanostructure+for+SERS+Application%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanomater%22%5BJournal%5D)">Engineering Metal Nanostructure for SERS Application.</a> J. Nanomater. 123812, 1-12 (2013).</li>
<li>Glembocki, O., Rendell, R., Alexson, D., Prokes, S., Fu, A., Mastro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dielectric-Substrate-Induced+Surface-Enhanced+Raman+Scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+B%22%5BJournal%5D)">Dielectric-Substrate-Induced Surface-Enhanced Raman Scattering.</a> Phys. Rev. B. 80, 085416(2009).</li>
<li>Merlen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Enhanced+Spectroscopy+with+Gold+Nanostructures+on+Silicon+and+Glass+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Sci%22%5BJournal%5D)">Surface Enhanced Spectroscopy with Gold Nanostructures on Silicon and Glass Substrates.</a> Surf. Sci. 605, 1214-1218 (2011).</li>
<li>Muhammad, M., Buswell, S. C., Dew, S. K., Stepanova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopatterning+of+PMMA+on+Insulating+Surfaces+with+Various+Anticharging+Schemes+Using+30+keV+Electron+Beam+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vac.+Sci.+Technol.+B%22%5BJournal%5D)">Nanopatterning of PMMA on Insulating Surfaces with Various Anticharging Schemes Using 30 keV Electron Beam Lithography.</a> J. Vac. Sci. Technol. B. 29, 06F304(2011).</li>
<li>Peters, R., Fito, T., Gutierrez-Rivera, L., Dew, S. K., Stepanova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+Multilayer+Systems+in+Electron+Beam+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vac.+Sci.+Technol.+B%22%5BJournal%5D)">Study of Multilayer Systems in Electron Beam Lithography.</a> J. Vac. Sci. Technol. B. 31, 06F407(2013).</li>
<li>Gutierrez-Rivera, L., Peters, R., Dew, S., Stepanova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+EBL+Fabricated+Nanostrucutred+Substrates+for+SERS+Detection+of+Protein+A+in+Aqueous+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vac.+Sci.+Technol.B%22%5BJournal%5D)">Application of EBL Fabricated Nanostrucutred Substrates for SERS Detection of Protein A in Aqueous Solution.</a> J. Vac. Sci. Technol.B. 31, (2013).</li>
<li>Gutierrez-Rivera, L., Peters, R., Dew, S., Stepanova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-Enhanced+Raman+Spectroscopy+Detection+of+Protein-Ligand+Binding+Using+D-glucose+and+Glucose+Binding+Protein+on+Nanostructured+Plasmonic+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Detection of Protein-Ligand Binding Using D-glucose and Glucose Binding Protein on Nanostructured Plasmonic Substrates.</a> , (2014).</li>
<li>Peters, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Fabrication+and+Testing+of+Surface-Enhanced+Raman+Spectroscopy+Substrates+for+the+Detection+of+Biomolecules+%5BMSc+%5D%22">Fabrication and Testing of Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Substrates for the Detection of Biomolecules [MSc Thesis]</a>. , University of Alberta. (2014).</li>
<li>Gouda, H., Torigoe, H., Saito, A., Sato, M., Arata, Y., Shimada, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dmensional+Solution+Structure+of+the+B+Domain+of+Staphylococcal+Protein+A%3A+Comparisons+of+the+Solution+and+Crystal+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Three-Dmensional Solution Structure of the B Domain of Staphylococcal Protein A: Comparisons of the Solution and Crystal Structures.</a> Biochemistry. 31, 9665-9672 (1992).</li>
<li>Cuneo, M. J., Johnson, S. J., Beese, L. S., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Resolution+Structure+of+E.+Coli+Glucose%2FGalactose+Binding+Protein+Bound+with+Glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Research+Collaboratory+for+Structural+Bioinformatics+%28RCSB%29+Protein+Data+Bank%22%5BJournal%5D)">High Resolution Structure of E. Coli Glucose/Galactose Binding Protein Bound with Glucose.</a> Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB) Protein Data Bank. , (2009).</li>
<li>Humphrey, W., Dalke, A., Schulten, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VMD+-+Visual+Molecular+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Molec.+Graphics%22%5BJournal%5D)">VMD - Visual Molecular Dynamics.</a> J. Molec. Graphics. 14, 33-38 (1996).</li>
<li>Walsh, R., DeRosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+Function+in+the+DNA+Homolog+of+the+RNA+Dopamine+Aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Comm%22%5BJournal%5D)">Retention of Function in the DNA Homolog of the RNA Dopamine Aptamer.</a> Biochem. Biophys. Res. Comm. 388, 732-735 (2009).</li>
<li>Akitomi, J., Kato, S., Yoshida, Y., Horii, K., Furuich, M., Waga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ValFold%3A+Program+for+the+Aptamer+Truncation+Process%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Inf%22%5BJournal%5D)">ValFold: Program for the Aptamer Truncation Process.</a> Biomed. Inf. 7, 38-40 (2011).</li>
<li>Han, K., Lee, Y., Kim, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PseudoViewer%3A+Automatic+Visualization+of+RNA+Pseudoknots%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">PseudoViewer: Automatic Visualization of RNA Pseudoknots.</a> Bioinformatics. 18, S321-S327 (2002).</li>
<li>Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periplasmic+Binding+Proteins%3A+a+Versatile+Superfamily+for+Protein+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Periplasmic Binding Proteins: a Versatile Superfamily for Protein Engineering.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 14, 495-504 (2004).</li>
<li>Benson, D. E., Conrad, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+Bioelectronic+Interfaces+by+Exploiting+Hinge-Bending+Motions+in+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Design of Bioelectronic Interfaces by Exploiting Hinge-Bending Motions in Proteins.</a> Science. 293, 1641-1644 (2001).</li>
<li>Bozic, S., Chorzempa, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBozic%2C+S+%22Pirahna+Cleaning%22">Pirahna Cleaning</a>. , University of Alberta. (2011).</li>
<li>Mohammad, M. A. Raith 150TWO SOP. , University of Alberta. (2011).</li>
<li>Schmidt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+Atomic+and+Molecular+Electronic+Structure+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comput.+Chem%22%5BJournal%5D)">General Atomic and Molecular Electronic Structure System.</a> J. Comput. Chem. 14, 1347-1363 (1993).</li>
<li>Bode, B. M., Gordon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MacMolPlt%3A+a+Graphical+User+Interface+for+GAMESS%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Mol.+Graph.+Mod%22%5BJournal%5D)">MacMolPlt: a Graphical User Interface for GAMESS.</a> J. of Mol. Graph. Mod. 16, 133-138 (1998).</li>
<li>Bright, A., Devi, T. S. R., Gunasekaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectroscopical+Vibrational+Band+Assignment+and+Qualitative+Analysis+of+Biomedical+Compounds+with+Cardiovascular+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Chem.+Tech.+Res%22%5BJournal%5D)">Spectroscopical Vibrational Band Assignment and Qualitative Analysis of Biomedical Compounds with Cardiovascular Activity.</a> Int. J. Chem. Tech. Res. 2, 379-388 (2010).</li>
<li>Bandekar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amide+Modes+and+Protein+Conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Amide Modes and Protein Conformation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1120, 123-243 (1992).</li>
<li>Barth, A., Zscherp, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+Vibrations+Tell+About+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">What Vibrations Tell About Proteins.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 35, 369-340 (2002).</li>
<li>Chrimes, A. F., Khoshmanesh, K. h, Stoddart, P. R. M. itchellA., Kalantar-Zadeh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+and+Raman+Microscopy%3A+Current+Applications+and+Future+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Microfluidics and Raman Microscopy: Current Applications and Future Challenges.</a> Chem. Soc. Rev. 42, 5880-5906 (2013).</li>
<li>Park, S. -K., Lee, N. -S., Lee, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrational+Analysis+of+Dopamine+Neutral+Base+based+on+Density+Functional+Force+Field%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.-Korean+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Vibrational Analysis of Dopamine Neutral Base based on Density Functional Force Field.</a> Bull.-Korean Chem. Soc. 21, 959-968 (2000).</li>
<li>Briand, E., Salmain, M., Compère, C., Pradier, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+Protein+A+on+SAMs+for+the+elaboration+of+immunosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Coll.+Surf.+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Immobilization of Protein A on SAMs for the elaboration of immunosensors.</a> Coll. Surf. B: Biointerfaces. 53, 215-224 (2006).</li>
<li>Lakowicz, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiative+decay+engineering%3A+2.+Effects+of+Silver+Island+Films+on+Fluorescence+Intensity%2C+Lifetimes%2C+and+Resonance+Energy+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Radiative decay engineering: 2. Effects of Silver Island Films on Fluorescence Intensity, Lifetimes, and Resonance Energy Transfer.</a> Analytical biochemistry. 301, 261-277 (2002).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

SERS is het verkrijgen van een erkenning als een bijzonder krachtige techniek van bio-detectie met vele unieke voordelen. De relatie met moleculaire vibraties laat toe selectie identificeren &quot;vingerafdrukken&quot; van specifieke te analyseren vanuit SERS spectra, terwijl de extreem hoge gevoeligheid maakt het mogelijk opsporen van zeer kleine hoeveelheden van de analyt 9,10,11,35. Bovendien SERS een destructieve techniek die relatief ongevoelig voor water, en daardoor is zeer geschikt voor het sonderen biologische materialen in hun natuurlijke waterige omgeving 9. De gepresenteerde resultaten benadrukken deze voordelen evenals verdere sterke potentieel van SERS te tonen als een zeer flexibel label-free techniek van bio-detectie. In drie uitvoeringen gebruik monolagen van verschillende substraat geïmmobiliseerde biomoleculen zijn Raman modi gedetecteerd dat vertrouwen kon worden toegeschreven aan de specifieke analyten. Dat de detectie van deze biomoleculen, or hun liganden zijn gebleken dienst vlakke oppervlakken van gesmolten silica als drager voor SERS substraten maakt het ontwerpen verenigbaar met de huidige elektronica en microfluïdische instellingen veelbelovende talrijke toepassingen in verband met nieuwe bio-elektronische interfacing platforms biologische materialen met oppervlakken van elektronische en elektrochemische apparaten 2,3. Belangrijk in twee van de drie ontwerpen SERS detectie aangetoond voor specifieke binding van kleine moleculen, zoals glucose en dopamine, gebruik monolagen van het oppervlak geïmmobiliseerde eiwit en aptameer respectievelijk de erkenning elementen. Er moet echter verscheidene aspecten worden opgevangen om een ​​efficiënte SERS bio-detectie in de instelling &quot;on-chip&quot; te bereiken. Allereerst een bekend probleem dat gemeenschappelijk is voor de meeste biomoleculen hun neiging te breken, vooral bij blootstelling aan niet-natuurlijke omstandigheden zoals droge enviving of intense laserlicht. Het hele protocol, hebben we het belang van altijd houden van de bio-gefunctionaliseerde monsters ondergedompeld in passende oplossingen gedurende de gehele experiment, vanaf de voorbereiding van de monsters aan de overname van Raman spectra benadrukt. Voor laatstgenoemde heeft een aangepaste waterdichte kamer ontworpen (Figuur 7) om verdamping van de vloeistof tijdens laser blootstelling vermijden. De duur van de blootstelling en laserintensiteit moet worden beperkt zoals beschreven in stap 5.3 van het protocol om beschadiging van de monsters te vermijden. De uitkomsten van de SERS detectie zijn gevoelig voor de geometrie van het gebruikte substraat, en met name de inter-feature scheiding van de metallische nanostructuren gevonden. Zoals blijkt uit de figuren 8 en 9, de SERS intensiteit van Design 1 monsters sterk afhankelijk van de breedte van de spleten tussen Au nano-punten op fused silica. Van de drie reeksen van Au nanodots getest in dit ontwerp (figuur 8), wordt de hoogste Raman intensiteit bereikt met Array I, waarbij de smalste openingen tussen de Au eigenschappen heeft en daarom geeft efficiënter elektromagnetisch veld verbetering. Zoals figuur 9 toont, wordt de besturing van inter-feature scheidingen op het niveau van 10-20 nm of minder vereist. Gebruikmakend van EBL voor het vervaardigen van SERS substraten, zoals hier blijkt, biedt een efficiënte oplossing die specifiek voor het regelen van de breedte van de inter-functie hiaten. Bij een positieve-tint EBL weerstaan ​​zoals PMMA, kan de grootte van gaten in PMMA maskers worden gevarieerd door eenvoudigweg veranderen van de blootstellingsdoses. Na lift-off dit tot verschillende maten van metaal stippen, en de breedte van de spleten tussen de punten kan worden afgesteld zoals gewenst door EBL juiste belichting selecteren doses 18. De andere uitdaging is de optimalisatie van SERS substraat geometrie voor specifieke bio-detectie applicatie. Hoewel de toename van het increases met een daling van de inter-functie gaten, de relatief grote omvang van biologische moleculen legt beperkingen op hoe smal de gaten kunnen zijn. Dit blijkt uit de resultaten voor Design 2, waarbij de immobilisatie werkwijze is zodanig dat het eiwit efficiënt bindt alleen aan het oppervlak van edelmetaal stip, maar niet om de punten zelf (zie figuur 3B). Zoals blijkt uit figuur 10, de SERS spectra ongestructureerde Ag elektroden geen band van het analyt tonen. Hoewel de pads vertonen een nano-kristallijne structuur met een zeer dunne tussen de eilanden gaten (zie figuur 6F) deze lacunes zijn te smal om een eiwitmolecuul tegemoet te komen. Nog een ander aspect van complexiteit wordt toegevoegd wanneer eiwit-ligand-binding te detecteren. In figuur 10, de SERS CH banden zijn groter in de spectra van ligand gebonden GBP dan in het vrije ligand is, die hypothetisch kan worden verklaard door een verandering in de conformatie GBPna binding van D-glucose 2 7,27, resulterend in een meer rigide structuur met verhoogde Raman activiteit. Bij een vergelijking van de twee nanostructuur substraten, de CH band uit-ligand gratis eiwit is sterker in SERS spectra verkregen met de nano-stippen substraat, terwijl zowel het eiwit en glucose CH bands uit-ligand gebonden eiwit zijn meer uitgesproken met de nano-zeshoeken substraat. Twee factoren zullen naar verwachting resulteren in deze verschillen, de beschikbaarheid van ruimte tussen Ag voorzien waar de GBP kon binden aan Ni, en de gevoeligheid van het ligand gebonden en ligand vrij eiwit aan de elektromagnetische verhoging van de Raman scattering in de &quot;hot spots&quot; tussen deze functies. Enerzijds de nano-puntenpatroon biedt een relatief grotere inter-feature waar Ni coating is beschikbaar voor het eiwit te binden, die een meer uitgesproken CH band waargenomen voor glucosevrije GBP op Ag nano-dots substraat kan verklaren. Aan de andere kant, vanwege hun niet-uniform structuur (zie figuur 6D), Ag nano-zeshoeken zou kunnen zijn gevoelig voor een sterkere elektromagnetische verbetering in de smalle openingen tussen Ag eilanden binnen de nano-zeshoeken resulterend in sterkere CH trillingen bands uit glucose gebonden GBP op de nano-zeshoeken substraat tonen. Sommige details van deze wisselwerking nodig verdere controle en optimalisatie van SERS substraten voor complexe analyten met grote eiwitten zoals het GBP nog in de pijplijn. Het is duidelijk dat SERS detectie van ligandbinding gebruik geïmmobiliseerd biomoleculen als herkenningselement vergemakkelijkt wanneer slechts de ligand Raman actief in een geselecteerd gebied, terwijl de andere componenten niet. Dit is het geval van Design 3, waar uitgesproken SERS bands van aptamer gebonden dopamine worden verkregen (Figuur 11). De aptamer dopamine-pair vertoont een uitstekende specificiteit en de SERS spectrum omvat uitgesproken bands zonder noemenswaardige achtergrond signaal. <p class="jove_content"&gt; Toekomst opmars van de label-fee SERS technologie zou uitgebreide testen van SERS enhancement biomoleculen &#39;signaal met een brede waaier van verschillende oppervlakte nanostructuur ontwerpen te betrekken. Het gebruik van direct-write elektronenbundellithografie aan verschillende nanostructuren te fabriceren met een uitstekende niveau van controle over de grootte, vorm, en inter-functie scheiding, in combinatie met de monstervoorbereiding protocollen hier wordt gepresenteerd, zou vergemakkelijken vergelijking en cross-validatie van de verkregen resultaten door verschillende onderzoeksgroepen. Dit zou de grote uitdaging van de reproduceerbaarheid te pakken wanneer SERS substraten worden gefabriceerd in dienst alternatieve &quot;bottom-up&quot; methoden 11,12,13, waardoor een betere controle van de grootte van metalen nanostructuren en positie naar een betrouwbare identificatie van optimale substraat ontwerp voor een breed scala aan toepassingen. Schaalbaarheid van deze technieken kan vervolgens worden verbeterd door het combineren EBL met complementaire nanolithografie methodes zoals nanoimprintlithografie 19 in de richting van de toekomstige massa-productie van nanoschaal ontwerpen geoptimaliseerd in dienst van de afstembare EBL technieken.

Mogelijkheden om conjugaat nano-biologische systemen interfacing solide nanostructuren en biologische polymeren te ontwikkelen en te karakteriseren worden steeds belangrijker om verdere vooruitgang in de volgende generatie bio-sensing en bio-bediening technologieën 1,2. Dit houdt in multidisciplinaire studies over een aantal onderzoeksgebieden, zoals de fabricage van relevante solid-state componenten (micro- of nano-elektroden, nano-engineering coatings, nanodraden, of nanodeeltjes) 2,3,4; immobilisatie van biomoleculen aan de oppervlakken gewenste bioconjugaten 5,6,7 creëren; en controle nano-biologische interfaces 1. In de meeste gevallen, de selectie van optimale fabricage, bio-functionalisering en karakteriseringsmethoden sterk onderling verbonden. Het is duidelijk dat de keuze van nanofabricage technieken worden bepaald door de eisen van de halfgeleider componenten van het systeem, wordt grotendeels bepaald door de detectiemethode, die turn wordt bepaald door de aard van de betrokken biopolymeren en het doel van het toezicht op de interface. Uit een grote verscheidenheid aan technieken toegepast bioconjugaat systemen 1,3, Raman spectroscopie (SERS) karakteriseren ontstaan ​​als een veelbelovende methode voor de detectie van chemische en biologische species op oppervlakken 8,9,10,11. SERS telt inelastische verstrooiing van monochromatisch licht per oppervlak geïmmobiliseerde biomoleculen (figuur 1) waardoor de vangst van unieke signaturen overeenstemmen met moleculaire vibraties. Dit vermogen om onderscheid te maken tussen verschillende moleculen zonder tussenkomst labels, complexe chemie of tijdrovende stappen, maakt SERS een potentieel zeer efficiënte methode van bio-detectie. Een ander belangrijk voordeel van SERS is de hoge gevoeligheid. De excitatie van gelokaliseerde oppervlakteplasmonen door licht interactie met edele metalen nanostructuren (SERS substraten) verhoogt drastisch de intensity Raman verstrooiing door de analyt, waardoor de detectie van zeer kleine hoeveelheden moleculen van monolagen naar de single-molecule limit 8,9,10,11. Tenslotte meeste biomoleculen vereisen waterige oplossing stabiel. Omdat het water heeft vaak een beperkte Raman activiteit, wordt achtergrond signaal van waterige monsters geminimaliseerd 9. Toepassingen van SERS hebben een exponentiële toename van de afgelopen tien jaar 10 tentoongesteld. Echter, een veel besproken uitdaging SERS dat de elektromagnetische versterking van Raman verstrooiing hangt sterk af van de grootte, vorm en afstand van metalen nanostructuren waar plasmon golven geïnduceerd 11,12,13. Om een ​​efficiënte en reproduceerbare SERS metingen te bereiken, controle over het substraat geometrie is vereist bij de afmetingen op nanoschaal. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig1.jpg" /> Figuur 1. Scheem van Raman spectroscopie. Tal van methoden gebruikt om SERS substraten 11,12,13 fabriceren kunnen grofweg worden ingedeeld in bottom-up en top-down-methoden. Werkwijzen van het eerste type dienst verschillende processen van zelfassemblage of gerichte chemische synthese nanostructuren te produceren. Vaak gericht voorbeelden omvatten immobilisatie van monodisperse nanopartikels op vaste dragers 11,12,13, thermische, sputteren of elektrochemische afzetting van ruw metaal films 11,12 en diverse chemische synthesewerkwijzen 13. Hoewel dergelijke technieken vaak relatief eenvoudig en goedkoop te zijn, de meeste van hen zijn uitgedaagd door een gebrek aan controle over de plaats van de structuren en beperkte sample to sample reproduceerbaarheid. In tegenstelling, top-down lithografie technieken gebruiken manipuleerbare instrumenten zoals deeltjesstralen om gewenste patronen op oppervlakken te creëren. Eén van de meest gebruiktenanolithografie methoden, electron beam lithografie (EBL), biedt uitstekende controle over de functies neer op minder dan 10 nm en ook een flexibiliteit om verschillende substraat ontwerpen op vaste dragers 11,12. In EBL, een bundel elektronen gericht tot een vlek van enkele nanometers scans diameter over een oppervlak van een elektron gevoelig materiaal (resist) veroorzaakt een chemische verandering in belichte gebieden. Voor positieve toon weerstaat zoals polymethylmethacrylaat (PMMA), elektronenbundel belichtingsapparaat leidt splitsing van de polymeerketens waaruit de weerstand, waardoor een verhoogde oplosbaarheid in een geschikt oplosmiddel (ontwikkelaar). Het proces van electron-beam lithografie omvat spin-coating van een uniforme laag resist op een substraat; blootstelling van het beoogde resist materiaal in een vacuümkamer met een elektronenstraal; en ontwikkeling van het monster aan de oplosbare gebieden te verwijderen. Diëlektrische dragers onder metallische nanostructuren, zoals gesmolten silica, hebben bEen een significante toename van de intensiteiten SERS door lokalisatie van plasmon golven vergeleken met andere materialen zoals silicium 14,15. Echter EBL patroon op diëlektrische substraten, in het bijzonder op nanoschaal, een veelzijdige uitdaging te wijten aan de opbouw tijdens de blootstelling te laden. Eerder hebben wij aangetoond 16,17 dat deze problemen kunnen worden overwonnen door het plaatsen van geleidende polymeerlagen boven de resist. Figuur 2 toont een schema van het totale fabricageproces met EBL belichting en ontwikkeling gevolgd door metaalafzetting en lancering metallische nanostructuren op gefuseerd produceren silica ondersteunt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig2.jpg" /> Figuur 2. Schema van eLectron lithografie, metalen afzetting, en lancering processtappen gebruikt om metalen nanostructuren op diëlektrische substraten 16-19 te fabriceren. In dit artikel presenteren we de hele reeks van processtappen waarbij SERS substraten fabricage door EBL, bio-functionalisering van de substraten, en verzamelen van de Raman spectra. Drie ontwerpen verkend in onze recente werken 18,19 worden aangepakt (zie figuren 3 en 4, en tabel 1). In Design 1, wordt recombinant eiwit A geïmmobiliseerd op biologisch gefunctionaliseerde Au nanostructuren op een gefuseerde silica (FS) steun 18 en SERS detectie van het eiwit wordt aangetoond. In Design 2, recombinant-glucose bindend eiwit 21,26,27 met en zonder ligand (D-glucose) wordt geïmmobiliseerd door middel van histidine-tags in de ruimten tussen Ag nanostructuren op Ni-beklede FS en de binding van glucose aan het eiwit gedetecteerd. In Design 3, gethioleerd-dopamine bindend DNEen aptameer 19,23 geïmmobiliseerd op Au nanostructuren op FS en de binding van dopamine door geïmmobiliseerde aptameer aangetoond. Inclusief alle relevante experimentele stappen van voorbereiding van de ondergrond tot Raman spectra acquisitie, en vertegenwoordiger van verschillende biomoleculen en strategieën van immobilisatie, deze voorbeelden zijn nuttig voor een breed scala aan toepassingen, van exploratie onderzoek ondervragen nano-biologische interfaces door SERS aan de ontwikkeling van SERS biosensoren van kleine moleculen in dienst eiwit- of aptamer-ligand binding als een erkenning methode. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig3.jpg" /> Figuur 3. Schema van drie representatieve ontwerpen met behulp van verschillende biomoleculen, methoden van immobilizatie, en substraat materialen: (A) eiwit A geïmmobiliseerd op het edelmetaal nano-stippen gefunctionaliseerde door een zelf-geassembleerde monolaag (SAM) van 11-mercaptodecanoic zuur (MUA) in DI-water; (B) histidine-gemerkt glucose bindend eiwit (EUR) gecomplexeerd met D-glucose geïmmobiliseerd op het substraatoppervlak tussen edelmetaal nano-dots; (C) thiol-beëindigd dopamine binding aptamer aangevuld met dopamine (DBA) geïmmobiliseerd op edelmetaal nano-stippen. Zie verdere details in tabel 1. In Ontwerp 2 geïllustreerd door paneel (B), werd een monster zonder de corresponderende ligand ook voorbereid voor vergelijking. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig4.jpg" /> Figuur 4.Biomoleculen toegepast in drie uitvoeringen: (A) proteïne A; (B) glucose bindend eiwit en D-glucose; (C) dopamine binding DNA aptamer en dopamine. Het eiwit tertiaire structuren (a) en (b) uit Protein Data Bank, PDB ID 1BDD 20 en 2HPH 21 respectievelijk en getekend met VMD voor LINUXAMD64, versie 1.9.1 22. De aptameer secundaire structuur (c) wordt voorspeld uit de sequentie 23 met ValFold 24 software en getekend met PseudoViewer 3.0 25. De letters G, A, T, en C komen overeen met guanine, adenine, thymine en cytosine nucleotiden, respectievelijk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <table border="0" fo:keep-together.within-page="always" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Ontwerp 1 </td&gt; <td> Ontwerp 2 </td><td> Ontwerp 3 </td></tr><tr><td> Biopolymeer </td><td> Proteïne A </td><td> Glucose-bindend eiwit (GBP) </td><td> Dopamine bindende aptameer (DBA) </td></tr><tr><td> Binder </td><td> 11-Mercaptoundecanoic zuur (MUA) zelf-geassembleerde monolaag (SAM) </td><td> Histidine-tags </td><td> Thiol linkers </td></tr><tr><td> Ligand </td><td> Geen </td><td> D-glucose </td><td> Dopamine </td></tr><tr><td> Oplossing </td><td> Gedemineraliseerd water (DI) </td><td> Kaliumfosfaatbuffer </td><td> Tris (hydroxymethyl) aminomethaan (TRIS) en ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) buffer; Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) </td></tr><tr><td> Substraat </td><td> Au structuren op FS </td><td> Ag structuren Ni-beklede FS </td><td> Au structuren op FS </td></tr><tr><td> Patterned area </td><td> 4 urn x 10 urn </td><td> 4 micrometer x 8 urn </td><td> 4 urn x 10 urn </td></tr><tr><td rowspan="3"> Patroon </td><td rowspan="3"> Au stippen, 50 nm toonhoogte </td><td> Ag stippen, 40 nm toonhoogte </td><td> Au zeshoeken, 200 nm toonhoogte </td></tr><tr><td> Ag zeshoeken, 200 nm toonhoogte </td><td> Au ongestructureerde pads </td></tr><tr><td> Ag ongestructureerde pads </td><td></td></tr><tr><td rowspan="4"> EBL blootstellingsdoses </td><td> Dots: </td><td> Dots: 105 uC / cm2 </td><td rowspan="4"> Zeshoeken: 180 uC / cm2 </td></tr><tr><td> Array I 120 uC / cm 2 </td><td> Zeshoeken: 170 uC / cm2 </td></tr><tr><td> Array II 96 uC / cm 2 </td><td></td></tr><tr><td> Array III 72uC / cm 2 </td><td></td></tr><tr><td> Laserexcitatiegolflengte </td><td> 532 nm </td><td> 532 nm </td><td> 780 nm </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Drie ontwerpen van nano-biologische systemen.

<table><tbody><tr><td>11-mercaptundecaanzuur (MUA)</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma Aldrich</a></td><td>450561&amp;nbsp; ALDRICH</td><td>Gebruikt voor oppervlaktefunctionalisering in Ontwerp 1</td></tr><tr><td>Geleidend polymeer</td><td><a href="http://www.mrc.co.jp" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Mitsubishi Rayon</a></td><td>aquaSAVE-57xs</td><td>Een laag met een dikte van 70 nm wordt gebruikt als antistatische coating voor EBL-belichtingen</td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Samenwerkingslaboratorium.</td><td></td><td>Ligand in Ontwerp 2</td></tr><tr><td>Dopamine</td><td>Samenwerkingslab.</td><td></td><td>Ligand in Ontwerp 3</td></tr><tr><td>Dopamine-bindend aptameer (DBA)</td><td><a href="http://www.idtdna.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Integrated DNA Technologies Inc.</a></td><td>5'- /Thiol Modifier C6 S-S/&amp;nbsp;AAAAAAAAAA GTCTCTGTGT GCGCCAGAGA ACACTGGGGC AGATATGGGC CAGCACAGAA TGAGGCCC-3'&amp;nbsp;</td><td>Biopolymeer in Ontwerp 3</td></tr><tr><td>Wafers van gefuseerd silica</td><td><a href="http://www.markoptics.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Mark Optics&lt;br/&gt;</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucosebindend eiwit (GBP)</td><td><a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/gi%7C145579532" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Samenwerkingslaboratorium.</a></td><td>&lt;a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/gi|145579532"&gt;PDB ID 2HPH&lt;/a&gt;</td><td>Biopolymeer in Ontwerp 2</td></tr><tr><td>Hoogvacuümvet</td><td><a href="http://www.dowcorning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Dow Corning</a></td><td></td><td>Gebruikt om de waterdichte kamer af te dichten</td></tr><tr><td>Waterstofperoxide 30%, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>J.T. Baker</td><td></td><td>Gebruikt voor piranha-oplossing</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-ethyl-&lt;em&gt;N'&lt;/em&gt;-(3-(dimethylamino)propyl)carbodiimide (EDC)</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma Aldrich</a></td><td>03450 FLUKA</td><td>Gebruikt voor immobilisatie van biopolymeer in Ontwerp 1</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Hydroxysuccinimide (NHS)</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma Aldrich</a></td><td>130672 ALDRICH</td><td>Gebruikt voor immobilisatie van biopolymeer in Ontwerp 1</td></tr><tr><td>Kaliumfosfaatbuffer</td><td>Samenwerkingslaboratorium.</td><td></td><td>Buffer gebruikt bij Raman-bemonstering</td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferd&amp;nbsp; zoutoplossing (PBS)</td><td>Samenwerkingslaboratorium.</td><td></td><td>Oplosmiddel in Design 3</td></tr><tr><td>Polymethylmethacrylaat (PMMA) 950 A2</td><td><a href="http://www.microchem.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> MicroChem&amp;nbsp;</a></td><td></td><td>Een 90 nm dikke laag wordt gebruikt als positieve EBL-resist.</td></tr><tr><td>Recombinant proteïne A</td><td><a href="http://www.proteinmods.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Protein Mods Inc</a></td><td>&lt;a href="http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1bdd"&gt;PDB-ID 1BDD&lt;/a&gt;</td><td>Biopolymeer in Ontwerp 1</td></tr><tr><td>Zwavelzuur 96%, H₂SO₄&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>J.T. Baker</td><td></td><td>Gebruikt voor piranha-oplossing</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethaan (TRIS) en ethylendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) buffer</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma Aldrich</a></td><td>T9285 SIGMA</td><td>Buffer in Design 3
&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Apparatuur&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Naam&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Bedrijf&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalogusnummer&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Opmerkingen&lt;/strong&gt;&lt;br /&gt;</td></tr><tr><td>Dicingzaag</td><td>Diamond Touch Technology Inc.&lt;br /&gt;(17301 W Colfax Ave #&amp;nbsp;152, Golden, CO)</td><td></td><td>Wordt gebruikt om de FS-wafer te snijden</td></tr><tr><td>Elektronenstraalverdampingsapparaat</td><td><a href="http://www.lesker.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Kurt J. Lesker</a></td><td></td><td>Gebruikt voor Au- en Ag-verdamping</td></tr><tr><td>Elektronenstraalevaporator</td><td><a href="http://www.ultrahivac.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Johnsen Ultravac (JUV)</a></td><td>JuV E-gun</td><td>Gebruikt voor Ni-verdamping</td></tr><tr><td>Microscoopdekglaasjes (25 mm)</td><td><a href="http://www.fishersci.ca" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Fisher Scientific</a></td><td>12-545-102</td><td>Gebruikt in waterdichte kamer</td></tr><tr><td>Microscoopglaasjes (3&amp;times;1 inch)</td><td><a href="http://www.fishersci.ca" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Fisher Scientific</a></td><td></td><td>Gebruikt in waterdichte kamer</td></tr><tr><td>Raith 150&lt;sup&gt;Twee&lt;/sup&gt; EBL-belichtingssysteem</td><td><a href="http://www.raith.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Raith Inc.</a></td><td>Raith 150&lt;sup&gt;TWEE&lt;/sup&gt;&amp;nbsp; systeem</td><td>Gebruikt voor EBL-belichtingen</td></tr><tr><td>Raman-microscoop</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thermo Scientific</a></td><td>Nicolet Almega XR</td><td>Gebruikt voor Raman-spectroscopie</td></tr><tr><td>Sonicatorsysteem</td><td><a href="http://www.bransonic.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Branson</a></td><td></td><td>Gebruikt voor lift-off en het mengen van oplossingen</td></tr><tr><td>Spinner</td><td><a href="http://www.brewerscience.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Brewer-spinner en warmteplaat</a></td><td>Cee 200X en Cee 1300X</td><td>Gebruikt voor het spin-coaten van PMMA en geleidende polymeren</td></tr></tbody></table>

surface enhanced raman spectroscopy detectie van biomoleculen met behulp van ebl fabricated nanostructured substrates

Surface Enhanced Raman Spectroscopy Detection of Biomolecules Using EBL Fabricated Nanostructured Substrates

Productie en karakterisering van conjugaat nano-biologische systemen interfacing metallische nanostructuren op vaste dragers met geïmmobiliseerde biomoleculen gerapporteerd. De gehele sequentie van relevante experimentele stappen wordt beschreven, waarbij de fabricage van nanogestructureerde substraten elektronenstraal lithografie, immobilisatie van biomoleculen op het substraat, en de karakterisatie gebruik-Raman-spectroscopie (SERS). Drie verschillende ontwerpen van nano-biologische systemen worden gebruikt, met inbegrip van proteïne A, glucose-bindend eiwit, en een dopamine bindend DNA aptamer. In de laatste twee gevallen, de binding van de respectieve liganden, D-glucose en dopamine, is ook inbegrepen. De drie soorten biomoleculen geïmmobiliseerd op nanogestructureerde substraten door verschillende methoden, en de resultaten van SERS beeldvorming gerapporteerd. De mogelijkheden van SERS om trillingsmodes detecteren van het oppervlak geïmmobiliseerde eiwitten, alsook de eiwit-ligand een vastleggend aptameer-ligand binding worden gedemonstreerd. De resultaten tonen de invloed van het oppervlak nanostructuur geometrie biomoleculen immobilisatie strategie Raman activiteit van de moleculen en de aanwezigheid of afwezigheid van het ligand bindt de SERS-spectra verkregen.

Verzamelen control Raman spectra voor de hoofdcomponenten, waaronder vrije eiwitten in oplossing en vrije liganden in oplossing of in poedervorm zonder metaal bevattende substraten is belangrijk voor een juiste vergelijking mogelijk als voor interpretatiedoeleinden. Figuur 5A toont een typische Raman spectrum voor gratis proteïne A in DI-water op een glasplaatje zonder nano-gestructureerde ondergronden. Twee banden met de hoogste Raman intensiteit, de band bij 2931 cm -1 en 1091 cm -1, corresponderen met trillingen met CH en CS banden respectievelijk. Andere banden met een lagere Raman intensiteit zoals 563 cm -1, 1450 cm -1, 1653 cm -1 en 2426 cm -1, kan worden toegeschreven aan een superpositie van trillingsmodes 18,32,33,34. Controle Raman spectra voor het vrije ligand GPB in bufferoplossing met drie verschillende concentraties van 0,3, 0,9 en 1,3 mM, zijn weergegeven in figuur 5B. In t<html> hij erachter, de brede band rond 3400 cm -1 komt overeen met het oplosmiddel 35, terwijl de band bij 2935 cm -1 is vibraties waarbij CH bindingen van het eiwit 32,33. Figuur 5C toont de hoge golflengte Raman spectrum voor D-glucose in bufferoplossing voor verschillende concentraties: 1, 6, 100, 200, en 400 mM. Wanneer de concentratie van glucose toeneemt, CH bindingen trillingen banden ontstaat op 2890 cm -1 en 2960 cm -1. Controle Raman spectra van dopamine in kristalvorm verkregen met zowel 532 nm en 780 nm excitatie golflengte zijn weergegeven in figuur 5D. Veel van het Raman spectrum afkomstig van de benzeenring buigen en CH binding delen van de molecule 19,36. Sommige banden bij ongeveer 3000 cm -1 alleen waargenomen bij de 532 nm maar niet 780 nm excitatie golflengte. = Upload / 52712 / 52712fig5.jpg &quot;/&gt; Figuur 5. Controle Raman spectrum van proteïne A in DI water verkregen bij 532 nm excitatie golflengte 18 (A); Raman spectra van ligand vrij glucose bindingseiwit in bufferoplossing verkregen bij 532 nm excitatiegolflengte (B); Raman spectra van D-glucose in bufferoplossing verkregen bij 532 nm excitatie golflengte (C); en spectra van dopamine poeder verkregen bij 532 nm en 780 nm excitatie golflengte 19 (D). Alle spectra regelmatig Raman spectra van oplossingen (a, b, c) en poeder (d) op glasplaatjes zonder nanogestructureerde substraten. In (D), de toewijzing van Raman verschuiving regimes aan verschillende moleculaire vibraties werd gedaan met behulp van Algemene Atoom- en Molecuulfysica Elektronenstructuur System (GAMESS) 30 en MacMolPlt 31 software zoals elders 19 beschreven. Herdrukt paneel (a) met toestemming van 18 Amerieen Vacuum Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> Om SERS spectra te verkrijgen voor-oppervlak geïmmobiliseerde biomoleculen, worden substraten bestaande uit metalen nanostructuren op fused silica dragers vervaardigd zoals beschreven in de stappen 1-3. De kwaliteit van producten van substraten wordt geanalyseerd met scanning elektronenmicroscopie (SEM). De standaard SEM procedures worden elders beschreven 16,17,18, 19 en niet in het onderhavige protocol. Figuur 6 toont representatief SEM afbeeldingen van Au en Ag nano-dots en nano-hexagon structuren (panelen ad), alsmede niet -structured Au en Ag pads (panelen e en f, respectievelijk). De volgende stappen omvatten immobilisatie van biologisch materiaal op de nanogestructureerde substraten gebruikmaking drie uitvoeringen in tabel 1, en ​​verwerving van de SERS spectra. In o<html> estellen een waterige omgeving gedurende Raman beeldvorming handhaven, wordt elk monster geplaatst in de corresponderende oplossing (zie tabel 1), afgedekt met een dunne glazen deksel en gesloten in figuur 7. <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig6.jpg" /> Figuur 6. Scanning elektronenmicroscoop (SEM) beelden van 10 nm dikke Au en Ag oppervlak nanostructuren toegepast als SERS substraten: (A, B) arrays van nanodots; (C, D) arrays van nano-zeshoeken; (E, F) ongestructureerde pads. Ondergronden met Au structuren (links) in dienst FS ondersteunt, terwijl ondergronden met Ag structuren (rechts) gebruik maken van een 10 nm dik Ni coating op de FS. De beelden werden verkregen zoals elders 16,17,18 beschreven.pg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken. <img alt="Figuur 7" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig7.jpg" /> Figuur 7. Regeling van water-proof kamer voor Raman beeldvorming van bio-gefunctionaliseerde monsters in oplossing. In Design 1, wordt recombinant eiwit A geïmmobiliseerd op de substraten gefunctionaliseerde door een zelf-geassembleerde monolaag van 11-mercaptodecanoic zuur (MUA) in DI-water 18. De substraten in dit ontwerp omvatten drie reeksen Au stippen met een 50 nm hoogte en variërende onderlinge dot afstanden fused silica (zie figuren 6A en 8). Werkwijze eiwitimmobilisatie begint met de vorming van een SAM op de substraten. Om covalente binding tussen de SAM en het eiwit te verkrijgen worden de carbonzuurgroepen van SAMs omgezet in amine reactieve NHS-ester door behandeling met een mengsel van N </em&gt; ethyl-N &#39;- (3- (dimethylamino) propyl) carbodiimide (EDC) oplossing en N-hydroxysuccinimide (NHS) oplossing in DI water. Immobilisatie van proteïne A ontstaat door verplaatsing van de NHS groeperen op lysineresten van het eiwit 37. Een voorbeeld van beeldvorming monsters voor Ontwerp 1 met eiwit A geïmmobiliseerd op Au nanostructuren wordt getoond in figuur 9. Een optische microscoop beeld van de monsters, waarbij drie reeksen biologisch gefunctionaliseerde Au nanodots verschillende inter-dot openingen omvatten Figuur 9A toont (zie ook figuur 3aa en 8), en Figuur 9B toont de spectrale Raman kartering deze arrays. Men kan zien dat de hoogste Raman intensiteiten worden gevonden Array I, wanneer de inter-punt spleetbreedten smalste, terwijl lagere intensiteiten worden verkregen Array III met de grootste inter-dot gaten. Dit kan worden verklaard door een sterkere plasmon koppeling effect geproduceerd door hogere elektrische fieLDS in de smalle ruimten tussen de stippen 18. Figuur 9C toont de sterkste SERS spectra verkregen Arrays I en II. De spectra vertonen verscheidene banden (1630 cm -1, 1964 cm -1, 2280 cm -1, 2577 cm -1 en 2916 cm -1) nabij de Raman vormen van vrij proteïne A in oplossing gezien in figuur 5A. Toe te rekenen aan trillingen van verschillende bindingen gevonden in proteïnen, deze banden ofwel verschijnen vergelijkbare locaties in zowel geïmmobiliseerd eiwit in oplossing of iets naar iets hogere golfgetallen wanneer geïmmobiliseerd. In tegenstelling, SERS spectra van vergelijkbare nanostructuur substraten gefunctionaliseerde door MUA SAM zonder het eiwit blijkt een heel ander patroon 18, waarin wordt bevestigd dat figuur 9 vertegenwoordigt SERS in kaart brengen van het oppervlak geïmmobiliseerd eiwit A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een foto</a><html> grotere versie van deze figuur. <img alt="Figuur 8" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig8.jpg" /> Figuur 8. SEM beelden van drie reeksen van Au nanodots op FS substraat gebruikt in Design 1 18. De arrays hebben dezelfde 50 nm pitch en iets andere dot radii resulteert in verschillende breedtes van inter-dot hiaten. Dit wordt bereikt door verschillende EBL blootstellingsdoses PMMA maskers voor de drie arrays produceren (zie tabel 1). Hogere doses blootstelling leiden tot bredere gaten in PMMA maskers, waardoor voor grotere Au dot maten na metallisatie en lancering. Overgenomen met toestemming van 18 Amerikaanse Vacuum Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> les / ftp_upload / 52712 / 52712fig9.jpg &quot;/&gt; Figuur 9. SERS beeldvorming van substraat geïmmobiliseerd proteïne A in Design 1 18. (A) het optische microscoop van het monster met drie reeksen van Au nanodots met 50 nm pek en verschillende inter-dot openingen op een fused silica substraat (zie Figuur 6), bio-gefunctionaliseerde zoals getoond in figuur 3A. (B) Raman kaart brengen van het monster. (C) SERS spectra van puntmatrix I en II. In paneel (B), de verticale as de afstand over het substraat, de horizontale as de Raman shift en de legenda geeft het Raman intensiteiten. Verticale stippellijnen in panelen (B) en (C) vertegenwoordigen referentie Ramanbanden van vrij proteïne A in oplossing en (*) in paneel (C) geeft SERS bands Array I. De Raman-spectra werden verkregen 532 nm excitatiegolflengte. Overgenomen met toestemming van 18 Amerikaanse Vacuum Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig9large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> In Design 2, wordt recombinant glucose bindend eiwit (EUR) 21 gecomplexeerd met D-glucose (ligand) geïmmobiliseerd op de juiste substraten in kaliumfosfaat bufferoplossing. Monsters met geïmmobiliseerde ligand vrij GBP worden ook bereid ter vergelijking. In dit ontwerp, is glucose bindend eiwit aan het oppervlak door middel van een histidine-tag, die goed Ni maar niet bindt aan edelmetalen 6. Aangezien de substraten omvatten reeksen Ag nano-dots, nano-zeshoeken en ongestructureerde Ag pads op Ni-beklede FS (figuren 6B, 6D en 6F, respectievelijk), kan men verwachten dat de meeste van geïmmobiliseerd proteïne moleculen zich in spleten tussen Ag nanostructuren waarbij Ni bekleding avbaar. De Raman-spectra verkregen geïmmobiliseerde glucose vrij en gebonden glucose GBP worden getoond in Figuren 10A en 10B respectievelijk. Al deze spectra vertonen een brede band bij ongeveer 3300 cm -1, wat overeenkomt met de bufferoplossing 35. De verkregen met een ongestructureerde Ag pad spectra bevatten slechts deze enkele band en geen eiwit vibratiemodi niet laten zien, waaruit blijkt dat geïmmobiliseerde eiwit niet wordt gevonden op de Ag oppervlak zoals verwacht. In tegenstelling, de spectra verkregen met arrays van Ag nano-dots en nano-zeshoeken vertonen banden rond 1550 cm -1 en 2900 cm -1, waarbij de analyt 32,33 vertegenwoordigen. Vooral de brede band rond 1550 cm -1, zogenaamde amide II band, toegeschreven aan bindingen trillingen in proteïnen 33,34 peptide. In het geval beschouwd, deze band staat voor een superpositie van de vibratiemodi GBP geïmmobiliseerd op Ni oppervlakte tussen Ag functies, en illustreert SERS versterking van deze modi in de nabijheid van edele metalen nanostructuren als de substraten met nano-dots of nano-zeshoeken worden gebruikt. Deze band is zeer zwak voor het eiwit in oplossing in afwezigheid van SERS enhancement (figuur 5B) en afwezig Ag pads zonder Ni oppervlak beschikbaar voor de eiwitbinding, maar het is goed uitgesproken voor nanogestructureerde substraten met enkele Ni oppervlak toegankelijk voor eiwit te binden. Maar nog belangrijker voor de onderhavige studie zijn de andere, smallere banden rond ongeveer 2900 cm-1 die kan worden toegeschreven aan CH binding wibrations 32,33. Het spectrum van glucosevrije GBP toont een uitgesproken band bij 2933 cm -1 met nano-punten substraat en een zwakke maar waarneembare band bij eenzelfde golflengte met nano-zeshoeken substraat (Figuur 10A). Anders dan het geval van glucose vrij proteïne, de SERS-spectra van glucose gebonden GBP getoond in Figu<html> opnieuw 10B vertonen twee banden die overeenkomen met CH bindingen trillingen regimes, op 2850 cm-1 en 2910 cm -1. De banden zijn goed uitgesproken in het spectrum van glucose gebonden GBP op nano-zeshoeken substraat, en ze kunnen ook worden gezien in het spectrum van GBP op nano-dots substraat. De band bij 2850 cm -1 redelijk dicht bij de 2890 cm -1 een in de besturing Raman spectrum van D-glucose in oplossing, en daarom kan worden toegeschreven aan gebonden glucose aan het eiwit, terwijl de andere band (bij 2,910 cm -1) toegeschreven aan CH binding trillingen van zowel eiwit en glucose. Men kan dit verschil in SERS handtekeningen glucosevrije en glucose-gebonden substraat geïmmobiliseerd GBP concluderen waarneembaar in deze regio, en CH band trillingen van proteïnegebonden glucose detecteerbaar onder toepassing van de beschreven ontwerpen. 10.jpg &quot;/&gt; Figuur 10. SERS spectra van ligand-vrij (A) en-ligand gebonden (B) glucose-bindend eiwit geïmmobiliseerd op drie verschillende substraten in Design 2. De spectra werden verkregen met 780 nm golflengte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig10large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie te bekijken van dit cijfer.</a> In Design 3, wordt de aangepaste dopamine bindende aptameer (DBA) met thiol beëindiging 23 geïmmobiliseerd op het substraat in tris (hydroxymethyl) aminomethaan (TRIS) ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) bufferoplossing, en de dopamine wordt dan aan het geïmmobiliseerde aptameer 19 gebonden. De substraten voor dit ontwerp bevatten reeksen Au nano-zeshoeken FS (figuur 6C). Ongestructureerde Au pads (figuur 6E) worden ook gebruikt voor controledoeleinden. Aangezien DNA intrinsiek fluorescent 38, 780 nm excitatie waveleng<html> th wordt gebruikt in Design 3 deze factor verminderen. In dit ontwerp, is de erkenning element (aptamer) niet Raman die actief zijn in de regio van Raman verschuivingen beschouwd in figuur 11, terwijl dopamine toont een significante Raman activiteit in deze regio. Aangezien signaal van monsters blootgesteld aan alleen dopamine zonder geïmmobiliseerde aptameer wijst verkregen dopamine banden 19 worden de waargenomen SERS banden verwachting afkomstig aptamer gebonden dopamine. Figuur 11 vergelijkt de SERS-spectra van geïmmobiliseerde aptameer op goud nanostructuren vóór en na de toevoeging van dopamine. Zoals verwacht, ofwel geïmmobiliseerde dopamine vrij aptameer vertonen Ramanbanden. Daarentegen, een aantal uitgesproken Raman banden waargenomen in dopamine gebonden geïmmobiliseerd aptameer. De posities van de meeste bands in Figuur 11 liggen dicht bij die van kristallijne dopamine, zij het ​​met verschillen in amplitude. igure 11 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52712 / 52712fig11.jpg &quot;/&gt; Figuur 11. SERS spectra van ligand-vrij (paarse lijn) en-ligand gebonden (blauwe lijn) dopamine-bindend aptamer geïmmobiliseerd op Au nano-zeshoek substraten in Design 3 19. De rode lijn toont een controle SERS spectrum van dopamine poeder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig11large.jpg" target="_blank">Gelieve klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

We beschrijven de fabricage en karakterisering van nanobiologische systemen die geïnterfacede nanogestructureerde substraten met geïmmobiliseerde eiwitten en aptameren. De relevante experimentele stappen met betrekking tot lithographische fabricage van nanogestructureerde substraten, bio-functionalisering en karakterisering met behulp van oppervlakte-versterkte Raman-spectroscopie (SERS) worden gerapporteerd. SERS-detectie van op het oppervlak geïmmobiliseerde eiwitten en het onderzoek van eiwit-ligand en aptameer-ligand binding wordt gedemonstreerd.

Surface Enhanced Raman Spectroscopy Detectie van biomoleculen met behulp van EBL Fabricated Nanostructured Substrates

Fabrication and characterization of conjugate nano-biological systems interfacing metallic nanostructures on solid supports with immobilized biomolecules ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het vervaardigen en karakteriseren van geconjugeerde nanobiologische systemen die solide nanogestructureerde substraten met geïmmobiliseerde biomoleculen verbinden. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van ultrahoge resolutie elektronenbundel litografie of EBL om arrays van kleine metalen nanostructuren op gefuseerde silica-ondersteuningen te verkrijgen. Als tweede stap worden de substraten in oplossing geplaatst en worden biomoleculen op hun oppervlakken geïmmobiliseerd, waardoor de nanobiologische interfaces worden geproduceerd.Vervolgens wordt oppervlakteversterkte ramenspectroscopie of SIRS gebruikt om de biologische moleculen op de interfaces te onderzoeken. De resulterende sir-spectra vertonen ramen-modi die kenmerkend zijn voor de specifieke moleculen met intensiteiten die sterk afhankelijk zijn van het substraatontwerp. Het belangrijkste voordeel van onze aanpak ten opzichte van bestaande technieken zoals infraroodspectroscopie is dat de gevoeligheid aanzienlijk kan worden verbeterd door oppervlakteplasma en resonantie binnen de metaalnanostructuren.Onze aanpak creëert zeer selectieve oppervlakken die gemakkelijk kunnen worden bestuurd door de combinatie van moleculaire functionele bewerkingen en elektronenbundel litografie. Deze methode kan sleutelvragen beantwoorden in meerdere gebieden, van exploratief onderzoek in structurele biologie of door polymeren gemobiliseerd onderzoek tot de ontwikkeling van verschillende apparaten die nanobiologische interfaces omvatten. Deze methode kan inzicht bieden in de structurele eigenschappen van biomoleculen met implicaties die zich uitstrekken tot medische diagnose of milieudetectie.Over het algemeen kunnen individuen die nieuw zijn in deze methode worstelen, omdat het aspecten van nanofabricage, oppervlaktefunctionalisering, biochemie en spectroscopie omvat, die traditioneel niet met elkaar verbonden zijn. Om te beginnen, spincoat de polymethylmethacrylaat of PMMA, resist en geleidende lagen op de substraten. Om dit te bereiken, gebruik een waferspinner met een vacuümklem en plaats de monsters afzonderlijk in het midden op de klem. Plaats een druppel PMMA-resist op het midden van de monsters met behulp van een glazen pipette.Spin vervolgens 60 seconden op 3.500 RPM met een acceleratietijd van twee seconden. Bak vervolgens de substraten gedurende drie tot vijf minuten op 180 graden Celsius. Nadat de substraten zijn gebakken, koel de monsters af tot kamertemperatuur met de gekoelde substraten en breng ze terug naar de spinnerklem. Verspreid een druppel geleidend polymeer op het substraat.Spin het substraat gedurende 40 seconden op 3000 RPM met een tweede oplopende tijd na het spinnen. Bak de monsters gedurende een minuut op 80 graden Celsius na het uitvoeren van elektronenbundel litografie of EBL-blootstelling zoals beschreven in het tekstprotocol. Bereid een beker voor met geïoniseerd water om het geleidende polymeer te verwijderen. Bereid vervolgens een tweede beker voor met een ontwikkelingsmengsel en roer gedurende vijf minuten, stel de kamertemperatuur in.Ten slotte bereid isopropanol in een derde beker voor als spoelmiddel met behulp van pincetten. Plaats de monsters drie seconden in het water om de geleidende polymeerfilm te verwijderen. Plaats vervolgens het monster in de ontwikkelaar en beweeg de pincetten langzaam omhoog en omlaag gedurende 20 seconden, breng de substraten onmiddellijk over in het isopropanol en spoel gedurende 10 seconden langer voordat u het monster droogt met stikstof. Laad de monsters ondersteboven in het elektronenbundel verdampersysteem om toe te staan dat het verdampte metaal wordt afgezet op de voorkant van de monsters.Deponeer een 10 nanometer dikke goudlaag op de monsters voor ontwerpen een en drie en een 10 nanometer dikke zilverlaag voor ontwerp. Twee met een snelheid van ongeveer 0,1 nanometer per seconde. Vul vervolgens een sonicatiesysteem tot de aanbevolen hoogte met water en vul een afzonderlijke beker met aceton.Plaats een monster met de voorkant omhoog op de bodem van de beker en laat het monster 10 minuten weken terwijl u de beker vasthoudt. Plaats het in het waterbad en laat de hoogte van het aceton overeenkomen met de hoogte van het water. Schakel vervolgens het sonicatiesysteem in.Laat sonicatie gedurende maximaal 60 seconden plaatsvinden. Om ontwerp één monsters eerst voor te bereiden, bereidt u een oplossing van één millimolar MUA en ethanol bij kamertemperatuur voor en soniceer gedurende 10 minuten. Dompel de juiste nanogestructureerde substraat 48 uur lang in de oplossing van MUA.Spoel vervolgens het monster drie keer met ethanol en droog gedurende vijf minuten. Stel de kamertemperatuur in. Bereid vervolgens een 75 millimolar oplossing van EDC en gedestilleerd water voor.Bereid ook een 15 millimolar oplossing van NHS in gedestilleerd water voor met behulp van een micropipet. Deponeer 100 microliters NHS op het goud op het substraat en voeg onmiddellijk 100 microliters EDC toe op hetzelfde gebied. Incubeer gedurende één minuut om de zelfassemblagelaag van MUA te activeren. Plaats vervolgens een druppel van 100 microliter eiwit, een oplossing op hetzelfde gebied van het substraat.Plaats het monster in één compartiment van een petrischaal met één milliliter gedestilleerd water in een ander compartiment. Sluit de petrischaal af met een deksel en bewaar het monster gedurende 24 uur bij vijf graden Celsius. Spoel vervolgens het monster drie keer in gedestilleerd water door de monsters continu in afzonderlijke bekers gedurende 20 seconden in elke beker te dompelen, laat de monsters na het spoelen of tijdens het spoelen niet drogen voor de ontwerp twee monsters.Bereid een 0,9 millimolar oplossing van glucose-bindend eiwit of GBP in kaliumfosfaatbuffer voor. Bereid ook een 100 millimolar oplossing van DG-glucose in de buffer voor. Meng vervolgens 30 microliters van de D-glucose-oplossing en 30 microliters van de GBP-oplossing.Gebruik een plastic microbuiscontainer van één milliliter en een micropipet om 30 minuten te incuberen, vervolgens 20 microliters van de ligandvrije GBP-oplossing en 20 microliters van de ligandgebonden GBP-oplossing op de voorbereide substraten te deponeren. Gebruik een micropipet om de monsters gedurende 24 uur bij vijf graden Celsius op te slaan in een petrischaal met een afgedicht

surface-enhanced-raman-spectroscopy-detection-biomolecules-using-ebl

Research

JoVE Journal

Engineering

Techniek

Een werkwijze voor de productie en het uitvoeren van het filter gebaseerde Raman spectroscopische (SERS) assay voor de detectie van chemische verontreinigingen (bijvoorbeeld pesticiden ferbam en antibioticum ampicilline) behandeld.

A-filter op basis Surface Enhanced Raman spectroscopische test voor snelle opsporing van chemische verontreinigingen

Nanodeeltje-gebaseerde optische sondes zijn ontworpen als een voertuig voor het detecteren van antigenen met behulp van Raman en UV-Vis spectroscopie. Hier beschrijven we een protocol voor het voorbereiden van dergelijke sondes voor een UV-Vis/Raman spectroscopie immunoassay op een manier die toekomstige multiplexing mogelijkheden kan integreren.

Het vervaardigen van een UV-Vis en Raman spectroscopie Immunoassay Platform

Dit artikel stelt een nieuwe generatie multiparametrische analytische platforms voor met een verhoogde doorvoer voor de karakterisering van extracellulaire vesikelsubsets. De methode is gebaseerd op een combinatie van multiplexed biosensing-methoden met metrologische en morfomechanische analyses door atomaire krachtmicroscopie, gekoppeld aan Raman-spectroscopie, om vesiculaire doelen te kwalificeren die vastzitten op een microarray-biochip.

Multimodaal analytisch platform op een multiplexed surface plasmon resonance imaging chip voor de analyse van extracellulaire vesikel subsets

Dit protocol demonstreert single-molecule surface-enhanced Raman scattering (SERS) metingen met behulp van een DNA origami nanoantenna (DONA) in combinatie met colocalized atomic force microscopy (AFM) en Raman metingen.

Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Scattering Measurements mogelijk gemaakt door Plasmonic DNA Origami Nanoantennas

Ultrasnelle laserablatie in vloeistof is een nauwkeurige en veelzijdige techniek voor het synthetiseren van nanomaterialen (nanodeeltjes [NP's] en nanostructuren [NS's]) in vloeistof/luchtomgevingen. De laser-geablateerde nanomaterialen kunnen worden gefunctionaliseerd met Raman-actieve moleculen om het Raman-signaal van analyten die op of in de buurt van de NS's/NP's worden geplaatst te versterken.

Ultrasnelle lasergeablateerde nanodeeltjes en nanostructuren voor op het oppervlak verbeterde Raman-verstrooiingsgebaseerde detectietoepassingen

Het protocol beschrijft hoe elektrochemische gebeurtenissen op enkele nanodeeltjes kunnen worden gevolgd met behulp van oppervlakte-versterkte Raman-verstrooiingsspectroscopie en beeldvorming.

Elektrochemie volgen op enkele nanodeeltjes met oppervlakte-verbeterde Raman-verstrooiingsspectroscopie en microscopie

In deze studie ontwikkelden we een goedkope oppervlakte-verbeterde Raman scattering (SERS) -gebaseerde vingerafdruk nanoprobe met gunstige biocompatibiliteit om labelvrije levende celbioimaging te tonen en twee bacteriestammen te detecteren, die in detail laten zien hoe SERS-spectra van levende cellen kunnen worden verkregen in een niet-destructieve methode.

Labelvrije oppervlakte-verbeterde Raman Scattering Bioanalyse op basis van Au@Carbon Dot Nanoprobes

Dit protocol beschrijft een fabricagemethode voor een flexibel substraat voor oppervlakteversterkte Raman-verstrooiing. Deze methode is gebruikt bij de succesvolle detectie van lage concentraties R6G en Thiram.

Fabricage van op polydimethylsiloxaan (PDMS) gebaseerd flexibel oppervlakteversterkt Raman-verstrooiingssubstraat (SERS) voor ultragevoelige detectie

Dit protocol beschrijft een eenvoudig proces waarbij gebruik wordt gemaakt van handige plastic micromallen voor eenvoudige micro-embossingbewerkingen om microkanalen te fabriceren op nanogefibrilleerd cellulosepapier, waarbij een minimale breedte van 200 μm wordt bereikt.

Microembossing: een handig proces voor het vervaardigen van microkanalen op microfluïdica op basis van nanocellulosepapier

Hier presenteren we een protocol om individuele kleine extracellulaire blaasjes (sEV's) te analyseren met labelvrije oppervlakte-versterkte Raman-spectroscopie (SERS), waardoor minimaal invasieve ziektediagnostiek en beoordeling van sEV's als therapeutische toedieningsmiddelen mogelijk worden.

Onderzoek naar de toepassing van oppervlakteversterkte Raman Scattering-gebaseerde biosensing van individuele sEV's in ziektediagnose en therapieën

Leer SERS-detectie van biomoleculen met behulp van EBL-gefabriceerde nanogestructureerde substraten. Deze methode maakt gevoelige detectie van eiwitten en aptameren mogelijk voor nanobiotechnologisch onderzoek.

Surface Enhanced Raman Spectroscopy Detectie van biomoleculen met behulp van EBL Fabricated Nanostructured Substrates

Meer video's verkennen