Surface Enhanced Raman Spectroscopy Detectie van biomoleculen met behulp van EBL Fabricated Nanostructured Substrates

Het algemene doel van het volgende experiment is het vervaardigen en karakteriseren van geconjugeerde nanobiologische systemen die solide nanogestructureerde substraten met geïmmobiliseerde biomoleculen verbinden. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van ultrahoge resolutie elektronenbundel litografie of EBL om arrays van kleine metalen nanostructuren op gefuseerde silica-ondersteuningen te verkrijgen. Als tweede stap worden de substraten in oplossing geplaatst en worden biomoleculen op hun oppervlakken geïmmobiliseerd, waardoor de nanobiologische interfaces worden geproduceerd.

Vervolgens wordt oppervlakteversterkte ramenspectroscopie of SIRS gebruikt om de biologische moleculen op de interfaces te onderzoeken. De resulterende sir-spectra vertonen ramen-modi die kenmerkend zijn voor de specifieke moleculen met intensiteiten die sterk afhankelijk zijn van het substraatontwerp. Het belangrijkste voordeel van onze aanpak ten opzichte van bestaande technieken zoals infraroodspectroscopie is dat de gevoeligheid aanzienlijk kan worden verbeterd door oppervlakteplasma en resonantie binnen de metaalnanostructuren.

Onze aanpak creëert zeer selectieve oppervlakken die gemakkelijk kunnen worden bestuurd door de combinatie van moleculaire functionele bewerkingen en elektronenbundel litografie. Deze methode kan sleutelvragen beantwoorden in meerdere gebieden, van exploratief onderzoek in structurele biologie of door polymeren gemobiliseerd onderzoek tot de ontwikkeling van verschillende apparaten die nanobiologische interfaces omvatten. Deze methode kan inzicht bieden in de structurele eigenschappen van biomoleculen met implicaties die zich uitstrekken tot medische diagnose of milieudetectie.

Over het algemeen kunnen individuen die nieuw zijn in deze methode worstelen, omdat het aspecten van nanofabricage, oppervlaktefunctionalisering, biochemie en spectroscopie omvat, die traditioneel niet met elkaar verbonden zijn. Om te beginnen, spincoat de polymethylmethacrylaat of PMMA, resist en geleidende lagen op de substraten. Om dit te bereiken, gebruik een waferspinner met een vacuümklem en plaats de monsters afzonderlijk in het midden op de klem. Plaats een druppel PMMA-resist op het midden van de monsters met behulp van een glazen pipette.

Spin vervolgens 60 seconden op 3.500 RPM met een acceleratietijd van twee seconden. Bak vervolgens de substraten gedurende drie tot vijf minuten op 180 graden Celsius. Nadat de substraten zijn gebakken, koel de monsters af tot kamertemperatuur met de gekoelde substraten en breng ze terug naar de spinnerklem. Verspreid een druppel geleidend polymeer op het substraat.

Spin het substraat gedurende 40 seconden op 3000 RPM met een tweede oplopende tijd na het spinnen. Bak de monsters gedurende een minuut op 80 graden Celsius na het uitvoeren van elektronenbundel litografie of EBL-blootstelling zoals beschreven in het tekstprotocol. Bereid een beker voor met geïoniseerd water om het geleidende polymeer te verwijderen. Bereid vervolgens een tweede beker voor met een ontwikkelingsmengsel en roer gedurende vijf minuten, stel de kamertemperatuur in.

Ten slotte bereid isopropanol in een derde beker voor als spoelmiddel met behulp van pincetten. Plaats de monsters drie seconden in het water om de geleidende polymeerfilm te verwijderen. Plaats vervolgens het monster in de ontwikkelaar en beweeg de pincetten langzaam omhoog en omlaag gedurende 20 seconden, breng de substraten onmiddellijk over in het isopropanol en spoel gedurende 10 seconden langer voordat u het monster droogt met stikstof. Laad de monsters ondersteboven in het elektronenbundel verdampersysteem om toe te staan dat het verdampte metaal wordt afgezet op de voorkant van de monsters.

Deponeer een 10 nanometer dikke goudlaag op de monsters voor ontwerpen een en drie en een 10 nanometer dikke zilverlaag voor ontwerp. Twee met een snelheid van ongeveer 0,1 nanometer per seconde. Vul vervolgens een sonicatiesysteem tot de aanbevolen hoogte met water en vul een afzonderlijke beker met aceton.

Plaats een monster met de voorkant omhoog op de bodem van de beker en laat het monster 10 minuten weken terwijl u de beker vasthoudt. Plaats het in het waterbad en laat de hoogte van het aceton overeenkomen met de hoogte van het water. Schakel vervolgens het sonicatiesysteem in.

Laat sonicatie gedurende maximaal 60 seconden plaatsvinden. Om ontwerp één monsters eerst voor te bereiden, bereidt u een oplossing van één millimolar MUA en ethanol bij kamertemperatuur voor en soniceer gedurende 10 minuten. Dompel de juiste nanogestructureerde substraat 48 uur lang in de oplossing van MUA.

Spoel vervolgens het monster drie keer met ethanol en droog gedurende vijf minuten. Stel de kamertemperatuur in. Bereid vervolgens een 75 millimolar oplossing van EDC en gedestilleerd water voor.

Bereid ook een 15 millimolar oplossing van NHS in gedestilleerd water voor met behulp van een micropipet. Deponeer 100 microliters NHS op het goud op het substraat en voeg onmiddellijk 100 microliters EDC toe op hetzelfde gebied. Incubeer gedurende één minuut om de zelfassemblagelaag van MUA te activeren. Plaats vervolgens een druppel van 100 microliter eiwit, een oplossing op hetzelfde gebied van het substraat.

Plaats het monster in één compartiment van een petrischaal met één milliliter gedestilleerd water in een ander compartiment. Sluit de petrischaal af met een deksel en bewaar het monster gedurende 24 uur bij vijf graden Celsius. Spoel vervolgens het monster drie keer in gedestilleerd water door de monsters continu in afzonderlijke bekers gedurende 20 seconden in elke beker te dompelen, laat de monsters na het spoelen of tijdens het spoelen niet drogen voor de ontwerp twee monsters.

Bereid een 0,9 millimolar oplossing van glucose-bindend eiwit of GBP in kaliumfosfaatbuffer voor. Bereid ook een 100 millimolar oplossing van DG-glucose in de buffer voor. Meng vervolgens 30 microliters van de D-glucose-oplossing en 30 microliters van de GBP-oplossing.

Gebruik een plastic microbuiscontainer van één milliliter en een micropipet om 30 minuten te incuberen, vervolgens 20 microliters van de ligandvrije GBP-oplossing en 20 microliters van de ligandgebonden GBP-oplossing op de voorbereide substraten te deponeren. Gebruik een micropipet om de monsters gedurende 24 uur bij vijf graden Celsius op te slaan in een petrischaal met een afgedicht