Gecontroleerde Microfluïdische Milieu voor Dynamic Onderzoek van Red Blood Cell Aggregation
4 juni 2015
Het protocol beschreven gegevens een experimentele procedure om rode bloedcel (RBC) aggregaten kwantificeren onder gecontroleerde en constante afschuifsnelheid, gebaseerd op beeldverwerkingstechnieken. Het doel van dit protocol is het RBC totale afmetingen naar de desbetreffende afschuifsnelheid in een gecontroleerde omgeving microfluidic.
Het algemene doel van deze procedure is om rode bloedcelaggregaten in de microcirculatie direct te kwantificeren, dynamisch onder gecontroleerde en constante schuifsnelheden. Dit wordt bereikt door eerst in training, suspensies van rode bloedcellen en een dubbel y microkanaal met een fosfaat buffer zoutoplossing, een constante schuif te creëren in de bloedlaag. De tweede stap is om de stroom met een hogesnelheidscamera te visualiseren en op te nemen.
Gebruik vervolgens beeldverwerkingstechnieken om de opname te verwerken en een gemiddelde aggregaatgrootte en de aggregaatgrootteverdeling in het microkanaal te verkrijgen. De laatste stap is om de bloedsnelheid te bepalen door de verplaatsing van fluorescente deeltjes te volgen die in het microkanaal zijn geïnjecteerd tussen twee opeenvolgende frames. Uiteindelijk wordt de schuifsnelheid in het microkanaal berekend op basis van de bloedsnelheid en de dikte van de bloedlaag om de aggregaatgrootten te relateren aan de corresponderende lokale schuifsnelheid.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals de lichttransmissiemethode, is dat de rode bloedcelaggregaten dynamisch in de microscopische schaarse stroming worden geanalyseerd in tegenstelling tot statistisch met andere technieken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van hemo radiologie, zoals het begrijpen van de omstandigheden van de vorming van rode bloedcelaggregaten en het vinden van radiologisch bloedgedrag in microcirculatie. Om te beginnen microkanalen te fabriceren, 120 micron breed, 60 micron hoog en zeven millimeter lang volgens standaard fotolithografische methoden.
Verzamel vervolgens bloedcellen van gezonde vrijwillige donoren en bereid suspensies van rode bloedcellen met vijf, 10 en 15% hematocriet niveaus zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol, combineer één milliliter van elke suspensie van rode bloedcellen met 60 microliter van een 1% oplossing bevattende fluorescente tracerdeeltjes. Schud voorzichtig de buis om de oplossing te mengen. Combineer ook hetzelfde volume tracerdeeltjes met één milliliter PBS bij een pH van 7,4.
Laad een 25 microliter glazen spuit met de traceroplossing die rode bloedcellen bevat en een 100 microliter glazen spuit. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in het systeem aanwezig zijn met de traceroplossing in PBS. Plaats vervolgens het microkanaal op een omgekeerde microscoopstand die is aangesloten op een hogesnelheidscamera die in staat is om 18 frames per seconde of meer op te nemen, en een microdeeltjesbeeldsnelheidssysteem.
Verbind elke spuit via slangen met een van de inlaatpoorten van het microfluïdische kanaal en laad ze vervolgens in de houder van dezelfde spuitpomp. Programmeer de spuitpomp om de 25 microliter spuit te doseren met een snelheid van twee microliters per uur. Dit zal ook de 100 microliter spuit doseren met vier keer die snelheid vanwege hun grootteverschil.
Verander de stroomsnelheid tussen experimenten om verschillende schuifsnelheden te testen. Gebruik een kalibratie ridicule met de 20 x lens op zijn plaats om de hogesnelheidscamera te kalibreren. Start vervolgens de pomp om de twee oplossingen in het microkanaal te doseren.
Bepaal een optimale camera-expositietijd voor duidelijk beeld van de aggregaten. Het is belangrijk om te wachten tot de stroom een stabiele toestand heeft bereikt voordat u metingen verricht.
Als de stabiele toestand binnen drie tot vijf minuten is bereikt. Vul de spuit bij om het mengsel te onderwijzen en houd rode bloedcellen in suspensie. Zodra een stabiele stroom is bereikt, begin met het opnemen van de beweging van de rode bloedcellen.
Neem de stroom gedurende zeven seconden op. Gebruik een programma dat in staat is tot beeldverwerking om het contrast voor elke grijsschaalfoto te verbeteren met behulp van de histogram equalisatie methode. Converteer vervolgens de grijsschaalfoto's naar binaire afbeeldingen.
Stel de drempelwaarde zorgvuldig in door verschillende waarden te testen en de waarde te kiezen waarvoor alle aggregaten correct worden gedetecteerd. Vul indien nodig de gaten aan die overeenkomen met de openingen binnen één aggregaat. Detecteer vervolgens de cellen door aangrenzende witte pixels in de binaire afbeelding te bepalen, zodat aangrenzende cellen als aggregaten worden meegerekend.
Label de verschillende gedetecteerde rode bloedcelaggregaten en converteer vervolgens de binaire afbeelding naar een rood, groen, blauw afbeelding voor betere visualisatie. Leg ten slotte de rood, groen, blauwe afbeelding op de originele afbeelding. Om de efficiëntie van de beeldverwerking te verifiëren, berekent u het gebied van elk gedetecteerd aggregaat in het frame op basis van het aantal gedetecteerde pixels.
Verwerk alle frames op dezelfde manier. Gemiddel vervolgens de gedetecteerde aggregaatgrootten in elk frame en vervolgens de resultaten van alle frames. Om de gemiddelde aggregaatgrootte voor elke opname van de suspensies van rode bloedcellen te verkrijgen, converteert u de resultaten naar vierkante micrometers met behulp van de ridicule afbeelding.
Bereken vervolgens het oppervlak van één rode bloedcel om een representatieve geschatte aantal rode bloedcellen binnen elk gedetecteerd aggregaat te bepalen zodra de gegevens zijn verkregen. Gebruik de hogesnelheidscamera, schakel over naar de dubbel gepulseerde camera die wordt gebruikt voor het microdeeltjesbeeldsnelheidssysteem.
Gebruik een beeldverwerkingssoftware zoals hier getoond voor beeldacquisitie van de stroom en de beeldverwerking voor snelheidsveldbepaling. Zorg ervoor dat u beschermende brillen opzet en zet vervolgens het lasersysteem en de camera aan. Plaats een micrometer onder de microscoop en gebruik het resulterende beeld om het systeem te kalibreren.
Start vervolgens de vloeistofstroom en visualiseer de deeltjes in beide vloeistoffen. Zoek het middelste vlak van het microkanaal door te focussen op de snelste en helderste deeltjes in de stroom. Stel vervolgens het tijdsinterval tussen frames in op ongeveer twee milliseconden zodat de snelste deeltjes vijf tot tien pixels tussen beide beelden bewegen en begin met het opnemen van de stroom O.Stel de software in om 100 paar beelden voor
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode om rode bloedcel (RBC) aggregaten te kwantificeren onder gecontroleerde schuifsnelheden met behulp van beeldverwerkingstechnieken. De studie heeft tot doel RBC aggregaatgroottes te correleren met schuifsnelheden in een microfluïdische omgeving.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Microfluidics
- Hematologie
- Beeldverwerking
Achtergrond
- Rode bloedcel aggregaten spelen een cruciale rol in microcirculatie.
- Het begrijpen van schuifsnelheden is essentieel voor het bestuderen van bloedstroomdynamiek.
- Beeldverwerkingstechnieken kunnen de analyse van RBC aggregaten verbeteren.
- Deze studie maakt gebruik van een microkanaal setup voor gecontroleerde experimenten.
Doel van het onderzoek
- Om RBC aggregaten in een microfluïdische omgeving te kwantificeren.
- Om aggregaatgroottes te relateren aan lokale schuifsnelheden.
- Om de kennis van bloedstroomgedrag in microcirculatie te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van RBC suspensies in een fosfaat buffer zoutoplossing.
- Visualisatie van stroming met behulp van een hogesnelheidscamera.
- Beeldverwerking om gemiddelde aggregaatgrootte en distributie te bepalen.
- Berekening van schuifsnelheid op basis van bloedsnelheid en laagdikte.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kwantificering van RBC aggregaatgroottes.
- Een relatie vaststellen tussen aggregaatgroottes en schuifsnelheden.
- Demonstratie van effectief gebruik van beeldverwerkingstechnieken.
- Inzichten in de dynamiek van RBC gedrag in microcirculatie.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van RBC aggregaten.
- Bevindingen verbeteren het begrip van bloedstroom in microfluïdische systemen.
- Toekomstige toepassingen kunnen onderzoeken naar bloedaandoeningen en therapieën omvatten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding red blood cell aggregation dynamics under controlled shear rates provides critical insights into blood rheology relevant to microcirculation and vascular health. This microfluidic approach enables quantitative assessment of aggregate formation and disaggregation, supporting mechanistic studies in hematology and hemorheology. The method aids in de-risking target validation by linking biophysical parameters to functional outcomes in blood flow behavior.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to RBC aggregation pathways and modulators of hemorheological function.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization and quantification of aggregate dynamics under physiologically relevant shear conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing reproducible aggregate size metrics under controlled flow.
- Operational Value: Enhances assay standardization and scalability through microfluidic platform reuse and quantitative image-based readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects discovery-phase mechanistic insights to preclinical continuity by modeling shear-dependent RBC behavior in microcirculation.
- Operational Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by correlating aggregate stability with hemodynamic conditions relevant to vascular function.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by providing shear-dependent phenotypic readouts that inform mechanistic understanding of blood flow modifiers.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling dynamic observation of aggregate formation and dissociation under controlled shear rates.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized microfluidic environments and quantitative aggregate size distribution outputs.
- Analytics: Provides measurable readouts including average aggregate size, size distribution, and localized shear rate calculations derived from velocity fields and layer thickness.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling RBC behavior in microvascular environments relevant to disease states.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating compounds or conditions affecting hemorheological properties across multiple hematocrit levels and shear conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in RBC-plasma interactions under flow.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization through controlled shear rates, calibrated imaging, and automated image processing workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of hemorheological liabilities that could impact drug safety or efficacy.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying compounds that modulate aggregation propensity in a shear-dependent manner.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device handling, high-speed imaging, and image processing techniques for binary thresholding and particle labeling.
- Depends on microfluidic fabrication capabilities, high-speed cameras capable of ≥18 fps, and μPIV systems for velocity field determination.
- Necessitates cross-team standardization of hematocrit preparation, tracer particle concentration, and flow rate protocols to ensure comparability across experiments.
- Involves adaptation considerations when extending to diseased RBC samples or varying plasma conditions that may alter aggregation kinetics.
- Includes practical limitations such as the need for bubble-free systems, steady-state flow validation, and manual validation of blood layer thickness for shear rate calculation.
