Gecontroleerde Microfluïdische Milieu voor Dynamic Onderzoek van Red Blood Cell Aggregation
4 juni 2015
Het protocol beschreven gegevens een experimentele procedure om rode bloedcel (RBC) aggregaten kwantificeren onder gecontroleerde en constante afschuifsnelheid, gebaseerd op beeldverwerkingstechnieken. Het doel van dit protocol is het RBC totale afmetingen naar de desbetreffende afschuifsnelheid in een gecontroleerde omgeving microfluidic.
Het algemene doel van deze procedure is om aggregaten van rode bloedcellen in de microcirculatie direct te kwantificeren, dynamisch onder gecontroleerde en constante afschuifsnelheden. Dit wordt bereikt door eerst rode bloedcel-suspensies en een dubbele y-microkanaal met een fosfaatgebufferde zoutoplossing in te werken, waardoor een constante afschuiving in de bloedlaag ontstaat. De tweede stap is het visualiseren en vastleggen van de stroming met een hogesnelheidscamera.
Gebruik vervolgens beeldverwerkingstechnieken om de opname te verwerken en de gemiddelde aggregaatgrootte en de aggregaatgrootteverdeling in het microkanaal te bepalen. De laatste stap is het bepalen van de bloedstroomsnelheid door de verplaatsing te volgen van fluorescerende deeltjes die in het microkanaal zijn geïnjecteerd tussen twee opeenvolgende frames. Ten slotte wordt de afschuifsnelheid in het microkanaal berekend op basis van de bloedstroomsnelheid en de dikte van de bloedlaag om de aggregaatgroottes te relateren aan de overeenkomstige lokale afschuifsnelheid.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de lichttransmissiemethode, is dat de aggregaten van rode bloedcellen dynamisch in de microscopische shear flow worden geanalyseerd, in tegenstelling tot de statistische benadering van andere technieken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen binnen het hemoradiologische veld, zoals het begrijpen van de omstandigheden waaronder aggregaten van rode bloedcellen worden gevormd en het in kaart brengen van het bloedradiologische gedrag in de microcirculatie. Begin met het vervaardigen van microkanalen van 120 microns breed, 60 microns hoog en zeven millimeter lang volgens standaard fotolithografische methoden.
Verzamel vervolgens bloedcellen van gezonde vrijwillige donoren en bereid rode bloedcel-suspensies voor met hematocrietwaarden van 5, 10 en 15%, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol; combineer één milliliter van elke rode bloedcel-suspensie met 60 µL van een 1%-oplossing met fluorescerende tracerdeeltjes. Schud de buis voorzichtig om de oplossing te mengen. Combineer daarnaast hetzelfde volume tracerdeeltjes met één milliliter PBS bij een pH van 7,4.
Vul een glazen spuit van 25 µL met de traceroplossing die rode bloedcellen bevat en een glazen spuit van 100 µL. Zorg ervoor dat er bij het gebruik van de traceroplossing in PBS geen luchtbellen in het systeem aanwezig zijn. Plaats vervolgens het microkanaal op de tafel van een omgekeerde microscoop die is verbonden met een hogesnelheidscamera die in staat is om 18 frames per seconde of meer vast te leggen, en een microparticle image velocimetry-systeem.
Verbind elke spuit via slang naar een van de inlaatpoorten van het microfluïdische kanaal en plaats ze vervolgens in de houder van dezelfde spuitenpomp. Programmeer de spuitenpomp om de 25 µL spuit te doseren met een snelheid van 2 µL per uur. Vanwege het verschil in grootte zal de 100 µL spuit hiermee ook met vier keer die snelheid worden gedoseerd.
Wijzig de stroomsnelheid tussen de experimenten om verschillende afschuifsnelheden te testen. Gebruik een kalibratieraster met de 20x lens om de hogesnelheidscamera te kalibreren. Start vervolgens de pomp om de twee oplossingen in het microkanaal te beginnen te dispenseren.
Bepaal een optimale belichtingstijd van de camera voor een heldere beeldvorming van de aggregaten. Het is belangrijk om te wachten tot de stroming een stationaire toestand heeft bereikt voordat er metingen worden verricht.
Wanneer de gestage toestand binnen drie tot vijf minuten is bereikt, vult u de spuit opnieuw om het mengsel te homogeniseren en de rode bloedcellen in suspensie te houden. Zodra een gestage stroom is bereikt, begint u de beweging van de rode bloedcellen te registreren.
Registreer de stroming gedurende zeven seconden. Gebruik een programma voor beeldverwerking om het contrast van elke gemaakte grijswaardenafbeelding te verbeteren met de methode van histogram-equalisatie. Zet vervolgens de grijswaardenafbeeldingen om in binaire afbeeldingen.
Stel de drempelwaarde zorgvuldig in door verschillende waarden te testen en de waarde te kiezen waarbij alle aggregaten correct worden gedetecteerd. Vul indien nodig de gaten in die overeenkomen met openingen binnen één aggregaat. Detecteer vervolgens de cellen door naburige witte pixels in het binaire beeld te bepalen, zodat aangrenzende cellen als aggregaten worden beschouwd.
Label de verschillende gedetecteerde aggregaten van rode bloedcellen en zet de binaire afbeelding vervolgens om in een rood-groen-blauw afbeelding voor een betere visualisatie. Leg tenslotte de rood-groen-blauw afbeelding over de originele afbeelding heen. Om de efficiëntie van de beeldbewerking te verifiëren, berekent u het oppervlak van elk gedetecteerd aggregaat in het frame op basis van het aantal gedetecteerde pixels.
Verwerk alle frames op dezelfde manier. Bereken vervolgens het gemiddelde van de gedetecteerde aggregaatgroottes in elk frame, en daarna het gemiddelde van de resultaten van alle frames. Om de gemiddelde aggregaatgrootte voor elke opname van de rode bloedcel-suspensies te verkrijgen, worden de resultaten omgerekend naar vierkante micrometers met behulp van de schaalverdeling van de afbeelding.
Bereken vervolgens de oppervlakte van één rode bloedcel om een representatieve waarde te bepalen. Schat het aantal rode bloedcellen binnen elk gedetecteerd aggregaat zodra de gegevens zijn verkregen. Schakel bij gebruik van de hogesnelheidscamera over naar de dubbelgepulste camera die wordt gebruikt voor het microparticle image velocimetry-systeem.
Gebruik een imaging-software, zoals hier getoond, voor de beeldacquisitie van de stroming en de beeldverwerking voor de bepaling van het snelheidsveld. Zorg dat u een beschermbril draagt en schakel vervolgens het lasersysteem en de camera in. Plaats een micrometer onder de microscoop en gebruik het resulterende beeld om het systeem te kalibreren.
Start vervolgens de vloeistofstroom en visualiseer de deeltjes in beide vloeistoffen. Bepaal het middenvlak van het microkanaal door te focussen op de snelste en helderste deeltjes in de stroom. Stel vervolgens het tijdsinterval tussen de frames in op ongeveer twee milliseconden, zodat de snelste deeltjes vijf tot 10 pixels bewegen tussen beide beelden, en begin met het opnemen van de stroom O.Stel de software zo in dat er 100 paren beelden worden vastgelegd voor alle verschillende rode bloedcel-suspensies en voor verschillende afschuifsnelheden.
Na de beeldvoorverwerking kiest u de grootte en vorm van het correlatievenster, evenals het percentage overlap tussen de beelden. Druk de resultaten uit als een gemiddeld snelheidsveld, berekend uit de 100 beeldparen, en de root mean square error in de snelheid.
Schakel de laser, de camera en de computer uit. Zodra alle metingen en beeldverwerkingen zijn voltooid, wordt de afschuifsnelheid berekend door eerst de bloeddikte in het microkanaal te detecteren en te schatten op basis van de opname van de hogesnelheidscamera. Hiervoor worden alle frames in de specifieke opname gemiddeld om een achtergrondbeeld van de video te verkrijgen.
Verwijder tenslotte de bloedlaag door het gemiddelde beeld van alle frames visueel te inspecteren en de rand van de bloedlaag handmatig te bepalen. Bepaal vervolgens handmatig de snelheidswaarde voor de corresponderende bloeddiktheid uit het geëxtraheerde snelheidsprofiel en bereken de afschuifsnelheid door de snelheidswaarde te delen door de bloedlaagdikte. De hier getoonde diktes zijn de netto bewegingen van vier aggregaten van rode bloedcellen die in drie opeenvolgende frames zijn gedetecteerd.
De grote aggregaten van meer dan 30 cellen zijn in het rood weergegeven. De middelgrote aggregaten tussen negen en 30 cellen zijn in het groen weergegeven, en kleine aggregaten van minder dan negen cellen zijn in het blauw weergegeven. De snelheid van een aggregaat varieert afhankelijk van de positie in het getoonde microkanaal.
Hier zijn de snelheidsprofielen van de rode bloedcellen gesuspendeerd bij 5% hematocrit, 10% hematocrit en 15% hematocrit bij een stroomsnelheid van 10 microliters per uur. Men kan zien dat de snelheid aan beide randen naar nul neigt, zoals verwacht, en het buigpunt tussen de twee stroombanen varieert licht tussen de hematocritniveaus; naarmate de totale afschuifsnelheid toeneemt, neemt de grootte van de aggregaten in elk hematocritniveau af. Dit komt doordat de afschuifkracht in het microkanaal groter is dan de aggregeerkracht, waardoor de rode bloedcellen disaggregeren.
Tijdens deze procedure is het belangrijk om te zorgen voor een goede beeldkwaliteit van de stroming in het microkanaal en een voldoende contrast tussen de stromende rode bloedcellen en de achtergrond van het beeld. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe kwalitatief en kwantitatief aggregaten van rode bloedcellen onder gecontroleerde stromingscondities kunnen worden geanalyseerd.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode om aggregaten van rode bloedcellen (RBC) te kwantificeren onder gecontroleerde afschuifsnelheden met behulp van beeldverwerkingstechnieken. De studie heeft tot doel de grootte van RBC-aggregaten te correleren met de afschuifsnelheden in een microfluïdische omgeving.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microfluidica
- Hematologie
- Beeldbewerking
Achtergrond
- Aggregaten van rode bloedcellen spelen een cruciale rol in de microcirculatie.
- Het begrijpen van afschuifsnelheden is essentieel voor het bestuderen van de bloedstroomdynamiek.
- Beeldverwerkingstechnieken kunnen de analyse van RBC-aggregaten verbeteren.
- Deze studie maakt gebruik van een microkanaal-opstelling voor gecontroleerde experimenten.
Doel van de studie
- Om RBC-aggregaten in een microfluïdische omgeving te kwantificeren.
- Om aggregaatgroottes te correleren met lokale afschuifsnelheden.
- Om het begrip van het bloedstroomgedrag in de microcirculatie te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van RBC-suspensies in een fosfaatgebufferde zoutoplossing.
- Visualisatie van de stroming met behulp van een hogesnelheidscamera.
- Beeldbewerking om de gemiddelde aggregaatgrootte en -distributie te bepalen.
- Berekening van de afschuifsnelheid op basis van de bloedstroomsnelheid en de laagdikte.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kwantificering van de groottes van RBC-aggregaten.
- Vaststelling van een relatie tussen aggregaatgroottes en afschuifsnelheden.
- Demonstratie van het effectieve gebruik van beeldverwerkingstechnieken.
- Inzichten in de dynamiek van RBC-gedrag in de microcirculatie.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van RBC-aggregaten.
- De bevindingen verbeteren het begrip van de bloedstroom in microfluïdische systemen.
- Toekomstige toepassingen kunnen studies naar bloedziekten en therapieën omvatten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Het begrijpen van de dynamiek van aggregatie van rode bloedcellen onder gecontroleerde afschuifsnelheden biedt cruciale inzichten in de bloedreologie die relevant zijn voor de microcirculatie en vasculaire gezondheid. Deze microfluïdische benadering maakt een kwantitatieve beoordeling van aggregaatvorming en -disaggregatie mogelijk, wat mechanistische studies in de hematologie en hemoreologie ondersteunt. De methode helpt bij het verminderen van risico's bij targetvalidatie door biofysische parameters te koppelen aan functionele uitkomsten in het bloedstroomgedrag.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken met betrekking tot aggregatiepaden van rode bloedcellen en modulatoren van de hemorheologische functie.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicovermindering door directe visualisatie en kwantificering van aggregatiedynamiek onder fysiologisch relevante afschuifcondities.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening door reproduceerbare metrieken voor aggregaatgrootte vast te stellen onder gecontroleerde stroming.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en schaalbaarheid van assays door hergebruik van het microfluidische platform en kwantitatieve read-outs op basis van beelden.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Verbindt mechanistische inzichten uit de ontdekkingsfase met preklinische continuïteit door het modelleren van shear-afhankelijk gedrag van RBC's in de microcirculatie.
- Operationele waarde: Informeert risicogestuurde beslissingen voor verdere ontwikkeling door de stabiliteit van aggregaten te correleren met hemodynamische condities die relevant zijn voor de vasculaire functie.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert in het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadidentificatie door shear-afhankelijke fenotypische readouts te leveren die bijdragen aan het mechanistische begrip van bloedstroommodificatoren.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door dynamische observatie van aggregaatvorming en -dissociatie onder gecontroleerde afschuifsnelheden mogelijk te maken.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via gestandaardiseerde microfluïdische omgevingen en kwantitatieve outputs van de aggregaatgrootteverdeling.
- Analytica: Biedt meetbare resultaten, waaronder de gemiddelde aggregaatgrootte, de grootteverdeling en lokale berekeningen van de afschuifsnelheid afgeleid van snelheidsvelden en laagdikte.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit door het gedrag van RBC's in microvasculaire omgevingen die relevant zijn voor ziektebeelden te modelleren.
- Bedrijfsmatige hergebruikbaarheid: Fungeert als een herbruikbaar platform voor het evalueren van verbindingen of condities die de hemorheologische eigenschappen beïnvloeden bij meerdere hematocrietniveaus en afschuifcondities.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in doelwitvalidatie door mechanische ambiguïteit in RBC-plasmainteracties onder stroming te verminderen.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid en standaardisatie door gecontroleerde afschuifsnelheden, gekalibreerde beeldvorming en geautomatiseerde workflows voor beeldverwerking.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege detectie mogelijk te maken van hemorreologische risico's die de veiligheid of werkzaamheid van geneesmiddelen kunnen beïnvloeden.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door verbindingen te identificeren die de aggregatieneiging op een afschuifafhankelijke manier moduleren.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van microfluïdische apparaten, hogesnelheidsbeeldvorming en beeldverwerkingstechnieken voor binaire drempelwaardebepaling en particellabeling.
- Is afhankelijk van microfluïdische fabricagecapaciteiten, hogesnelheidscamera's met een snelheid van ≥18 fps en μPIV-systemen voor de bepaling van het snelheidsveld.
- Maakt cross-team standaardisatie noodzakelijk van de hematocrietpreparatie, de concentratie van tracerdeeltjes en de protocollen voor de stroomsnelheid om de vergelijkbaarheid tussen experimenten te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen bij uitbreiding naar RBC-monsters van zieke patiënten of variërende plasmacondities die de aggregatiekinetiek kunnen beïnvloeden.
- Bevat praktische beperkingen zoals de noodzaak van belvrije systemen, validatie van de steady-state stroming en handmatige validatie van de dikte van de bloedlaag voor de berekening van de afschuifsnelheid.
