Papieren Inrichtingen voor isolatie en karakterisering van extracellulaire blaasjes
April 3rd, 2015
Dit protocol Gegevens methode extracellulaire blaasjes (EV), kleine membraneuze deeltjes vrijgemaakt uit cellen te isoleren, van slechts 10 pl serummonsters. Deze benadering omzeilt de noodzaak van ultracentrifugatie, vereist slechts enkele minuten testtijd en maakt de isolatie van EV uit monsters van beperkte omvang.
Het algemene doel van deze procedure is om extracellulaire vesicles te isoleren met behulp van een op papier gebaseerd platform. Dit wordt bereikt door eerst te lamineren met twee polystyreen platen met cirkelvormige cellulose, papier uitgesneden op een array van geregistreerde doorlopende gaten. De tweede stap is het chemisch binden van moleculen die extracellulaire vesicles zouden binden aan de papier test zone.
Vervolgens kan het biologische monster direct op de papier test zone worden gepipetteerd en extracellulaire vesicles worden geïsoleerd na de spoel stap. De laatste stap is het karakteriseren, gevangen extracellulaire vesicles met behulp van elektronenmicroscopie, Eliza of transcriptomische analyse. Uiteindelijk kunnen subsetten van extracellulaire vesicles van zo klein als 10 microliter serum monsters worden gezuiverd en geconcentreerd.
Dus het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals ultra educatie is dat het veel zachter is om te assembleren en het is eenvoudig uit te voeren. Het demonstreren van de procedure zal een afgestudeerde student zijn. Begin met twee vellen polystyreen, maak een array van cirkelvormige uitgesneden delen.
Elk met een diameter van minder dan vijf millimeter met een handmatige pons of cad, geautomatiseerde snijplotter. Bovendien snijd een reeks van vijf millimeter diameter chromatografie, papier schijven met een pons. Plaats een polystyreen blad op de werktafel en leg een enkele papier schijf op elk overeenkomstig doorgaand gat.
Leg de papier schijven door ze te registreren en de tweede polystyreen laag erop te leggen. Controleer de algehele uitlijning voordat u de sandwich in een thermische lamineerder bindt. Begin vervolgens met chemische oppervlakte wijzigingen op de papier schijven door het gelamineerde apparaat in een plasma kamer te plaatsen.
Activeer kort de papier oppervlakte met zuurstofplasma bij het loslaten van de vacuümkamer, breng het papier apparaat onmiddellijk over in de cyline oplossing en incubeer gedurende 30 minuten. Zet kamertemperatuur. Verwijder overtollige cy lijnen door het apparaat te spoelen met vijf milliliter 200 proof ethanol.
Incubeer vervolgens het apparaat met A-G-M-B-S linker oplossing gedurende 15 minuten. Zet kamertemperatuur. Verwijder overtollige linker moleculen met overvloedige hoeveelheden ethanol spoelingen.
Incubeer vervolgens het apparaat met avadon gedurende één uur bij vier graden Celsius en verwijder ongebonden avadon met een vijf milliliter PBS spoeling. Het apparaat kan vervolgens doorgaan naar de antilichaam bindingsstap of worden opgeslagen bij vier graden Celsius gedurende vier weken indien nodig. Na Aden binding pipet 10 microliters blokkeringsoplossing op de blootgestelde papier schijf gebieden en incubeer het papier gedurende 10 minuten.
Bij kamertemperatuur, herhaal de toevoeging van 10 microliters blokkeringsoplossing en de 10 minuten kamertemperatuur incubatie. Twee keer meer om de bio functionering van het blootgestelde papier substraat te voltooien, pipet 10 microliters van de biotinyleren vangen moleculen op de schijven en incubeer gedurende 10 minuten Bij kamertemperatuur voor extracellulaire vesicles, kunnen de vangen moleculen van keuze anti CD 63 antilichamen of een xin vijf zijn. Herhaal de 10 microliter pipetting en de 10 minuten incubatie processen.
Twee keer meer Na hechting van het vang molecuul. Was overtollige moeilijkheden af door 10 microliters van de juiste spoel buffer op elke papier schijf te pipetten.
Incubeer de spoel gedurende één minuut bij kamertemperatuur en herhaal de stappen van 10 microliter spoelen en één minuut incubatie nog twee keer. Het volledig functionele papier apparaat is nu klaar voor het isoleren van extracellulaire vesicles uit serum of vocht humor Voor serum verwerking. Verzamel 10 milliliter perifeer bloed in een vacutainer buis en draai de buis voorzichtig vijf keer om.
Plaats de buis in verticale positie en wacht 30 minuten. Zet kamertemperatuur, centrifugeer het bloed monster gedurende 15 minuten. Zet kamertemperatuur.
Breng de bovenste heldere serumlaag over naar een schone plastic buis en gooi de lagere semi-vaste fase weg. Klaar het serum bij een hogere centrifugatie snelheid gedurende 30 minuten. Zet kamertemperatuur.
Breng het supernatant over in een verse buis en verwijder fijne deeltjes door het supernatant door een 0.8 micrometer filter te laten passeren. Het resulterende gefilterde serum kan onmiddellijk worden gebruikt of worden opgeslagen bij negatieve 80 graden Celsius. Als de extracellulaire vesicles uit humor moeten worden geëxtraheerd, verzamel aqueus humor van patiënten rechtstreeks door invasieve procedures en bewaar de monsters bij negatieve 80 graden Celsius.
Tot gebruik, zijn er geen filtratie of klaring stappen nodig voor vitreuze humor monsters. Om extracellulaire vesicles te isoleren uit serum of vocht humor, pipet vijf microliters van het biologische monster op elke bio functioneel papier substraat schijf. Incubeer de spot gedurende één minuut bij kamertemperatuur en herhaal de vijf microliter pipetting en de één minuut incubatie processen.
Twee keer meer Na affiniteits binding, spoel ongebonden vesicles af door eerst 10 microliters van de juiste spoel buffer te pipetten. Incubeer de buffer gedurende één minuut bij kamertemperatuur en herhaal de stappen van 10 microliter spoelen en de daaropvolgende incubatie. Twee keer meer.
De gevangen extracellulaire vesicles zijn nu klaar voor de volgende downstream assays om de gevangen vesicles op het functionele papier ondersteuning te fixeren, pipet 10 microliters van 0.5 x karnofsky fixatief op elke papier schijf. Laat de cross-linking reactie gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur doorgaan en spoel alle schijven met overvloedige hoeveelheden PBS gedurende vijf minuten. Volgende, dehydrateer de papier substratum door de volgende wassen in volgorde toe te passen.
Een 35% ethanol incubatie, twee 50% ethanol incubaties, twee 70% ethanol incubaties, twee 95% ethanol incubaties, en vier 100% ethanol incubaties. Laat voor elke individuele was de ethanol oplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op de papier schijven incuberen. Wanneer het papier apparaat boter droog is, sputter coat de monsters met een 18 nanometer laag palladium goud in een metalen sputter.
P
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode om extracellulaire vesikel (EV's) te isoleren uit kleine serummonsters met behulp van een op papier gebaseerd platform. De aanpak omzeilt ultracentrifugatie en vereist slechts enkele minuten testtijd.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Extracellulaire Vesikel
Achtergrond
- Extracellulaire vesikel zijn kleine membraanhoudende deeltjes die door cellen worden afgegeven.
- Het isoleren van EV's is cruciaal voor verschillende biologische analyses.
- Traditionele methoden vereisen vaak grote monsters en een uitgebreide verwerkingstijd.
- Deze methode staat het gebruik van beperkte serummonsters toe.
Doel van de studie
- Om een snelle en efficiënte methode te bieden voor het isoleren van EV's.
- Om de analyse van EV's uit kleine biologische monsters mogelijk te maken.
- Om de verdere karakterisering van geïsoleerde EV's te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Het lamineren van polystyreenplaten met ronde sjablonen van cellulosepapier.
- Het chemisch koppelen van moleculen om EV's aan de papiertestzone te binden.
- Het pipetten van biologische monsters op de papiertestzone.
- Het karakteriseren van gevangen EV's met behulp van elektronenmicroscopie, ELISA of transcriptoomanalyse.
Belangrijkste resultaten
- EV's kunnen worden geïsoleerd uit zo weinig als 10 μl serum.
- De methode is snel en vermijdt de noodzaak van ultracentrifugatie.
- Geïsoleerde EV's kunnen effectief worden gekarakteriseerd.
- Deze aanpak verbetert de toegankelijkheid van EV-analyse in onderzoek.
Conclusies
- Het op papier gebaseerde platform is een haalbaar alternatief voor EV-isolatie.
- Deze methode kan EV-onderzoek aanzienlijk stroomlijnen.
- Toekomstige studies kunnen deze techniek gebruiken voor verschillende toepassingen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Efficient isolation and characterization of extracellular vesicles (EVs) is a critical bottleneck in translational biomarker discovery and early-stage drug development. This paper-based immunoaffinity platform enables rapid, low-volume EV capture and analysis, reducing reliance on ultracentrifugation and large sample inputs. The approach supports scalable, reproducible workflows for EV-based target validation and mechanistic de-risking across discovery and preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of EV subpopulations for pathway and target validation.
- Supports mechanistic de-risking by isolating disease-relevant EVs from minimal samples.
- Facilitates rapid hypothesis testing with quantitative EV marker analysis.
Screening & Assay Development
- Prepares validated EV samples for downstream phenotypic or molecular assays.
- Standardizes EV isolation for reproducible, quantitative readouts in screening workflows.
- Enables scalable assay development with minimal sample and equipment requirements.
Translational & Preclinical Research
- Aligns EV isolation with translational biomarker strategies using clinically relevant fluids.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by supporting RNA and protein profiling of EVs.
- Reduces risk of sample loss or degradation, supporting robust preclinical decision-making.
Pipeline & Workflow Integration
This paper-based EV isolation method integrates from early discovery through preclinical research, enabling rapid sample processing and downstream molecular characterization.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and target de-risking by enabling selective EV capture and analysis.
- Screening: Provides reproducible, quantitative EV isolation for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Supports SEM, ELISA, and transcriptomic readouts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment by isolating EVs from clinically relevant fluids with minimal input.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, scalable platform adaptable across disease models and sample types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in EV-based studies.
- Operational Value: Streamlines workflows with standardized, low-volume, and equipment-light protocols.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and capital-efficient biomarker and target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by enabling robust, reproducible EV analytics across programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoaffinity chemistry and EV biology for optimal marker selection.
- Needs access to basic laboratory equipment and analytical tools such as SEM and ELISA readers.
- Demands cross-team standardization of capture molecules and assay conditions for reproducibility.
- Adaptable to various biological fluids but may require protocol optimization for different matrices.
- Sample input limitations and marker specificity must be considered for translational applications.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:18
Fabrication of Paper Devices
4:04
Serum and Aqueous Humor Sample Collection and Processing
5:09
Isolation of Extracellular Vesicles
5:56
Downstream Assay Example 1: Scanning Electron Micoscopy
7:04
Downstream Assay Example 2: Paper-based ELISA
8:04
Downstream Assay Example 3: RNA Isolation
10:26
Results: Characterization of Captured Extracellular Vesicles
11:24
Conclusion
