Papieren Inrichtingen voor isolatie en karakterisering van extracellulaire blaasjes

Het algemene doel van deze procedure is om extracellulaire vesicles te isoleren met behulp van een op papier gebaseerd platform. Dit wordt bereikt door eerst te lamineren met twee polystyreen platen met cirkelvormige cellulose, papier uitgesneden op een array van geregistreerde doorlopende gaten. De tweede stap is het chemisch binden van moleculen die extracellulaire vesicles zouden binden aan de papier test zone.

Vervolgens kan het biologische monster direct op de papier test zone worden gepipetteerd en extracellulaire vesicles worden geïsoleerd na de spoel stap. De laatste stap is het karakteriseren, gevangen extracellulaire vesicles met behulp van elektronenmicroscopie, Eliza of transcriptomische analyse. Uiteindelijk kunnen subsetten van extracellulaire vesicles van zo klein als 10 microliter serum monsters worden gezuiverd en geconcentreerd.

Dus het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals ultra educatie is dat het veel zachter is om te assembleren en het is eenvoudig uit te voeren. Het demonstreren van de procedure zal een afgestudeerde student zijn. Begin met twee vellen polystyreen, maak een array van cirkelvormige uitgesneden delen.

Elk met een diameter van minder dan vijf millimeter met een handmatige pons of cad, geautomatiseerde snijplotter. Bovendien snijd een reeks van vijf millimeter diameter chromatografie, papier schijven met een pons. Plaats een polystyreen blad op de werktafel en leg een enkele papier schijf op elk overeenkomstig doorgaand gat.

Leg de papier schijven door ze te registreren en de tweede polystyreen laag erop te leggen. Controleer de algehele uitlijning voordat u de sandwich in een thermische lamineerder bindt. Begin vervolgens met chemische oppervlakte wijzigingen op de papier schijven door het gelamineerde apparaat in een plasma kamer te plaatsen.

Activeer kort de papier oppervlakte met zuurstofplasma bij het loslaten van de vacuümkamer, breng het papier apparaat onmiddellijk over in de cyline oplossing en incubeer gedurende 30 minuten. Zet kamertemperatuur. Verwijder overtollige cy lijnen door het apparaat te spoelen met vijf milliliter 200 proof ethanol.

Incubeer vervolgens het apparaat met A-G-M-B-S linker oplossing gedurende 15 minuten. Zet kamertemperatuur. Verwijder overtollige linker moleculen met overvloedige hoeveelheden ethanol spoelingen.

Incubeer vervolgens het apparaat met avadon gedurende één uur bij vier graden Celsius en verwijder ongebonden avadon met een vijf milliliter PBS spoeling. Het apparaat kan vervolgens doorgaan naar de antilichaam bindingsstap of worden opgeslagen bij vier graden Celsius gedurende vier weken indien nodig. Na Aden binding pipet 10 microliters blokkeringsoplossing op de blootgestelde papier schijf gebieden en incubeer het papier gedurende 10 minuten.

Bij kamertemperatuur, herhaal de toevoeging van 10 microliters blokkeringsoplossing en de 10 minuten kamertemperatuur incubatie. Twee keer meer om de bio functionering van het blootgestelde papier substraat te voltooien, pipet 10 microliters van de biotinyleren vangen moleculen op de schijven en incubeer gedurende 10 minuten Bij kamertemperatuur voor extracellulaire vesicles, kunnen de vangen moleculen van keuze anti CD 63 antilichamen of een xin vijf zijn. Herhaal de 10 microliter pipetting en de 10 minuten incubatie processen.

Twee keer meer Na hechting van het vang molecuul. Was overtollige moeilijkheden af door 10 microliters van de juiste spoel buffer op elke papier schijf te pipetten.

Incubeer de spoel gedurende één minuut bij kamertemperatuur en herhaal de stappen van 10 microliter spoelen en één minuut incubatie nog twee keer. Het volledig functionele papier apparaat is nu klaar voor het isoleren van extracellulaire vesicles uit serum of vocht humor Voor serum verwerking. Verzamel 10 milliliter perifeer bloed in een vacutainer buis en draai de buis voorzichtig vijf keer om.

Plaats de buis in verticale positie en wacht 30 minuten. Zet kamertemperatuur, centrifugeer het bloed monster gedurende 15 minuten. Zet kamertemperatuur.

Breng de bovenste heldere serumlaag over naar een schone plastic buis en gooi de lagere semi-vaste fase weg. Klaar het serum bij een hogere centrifugatie snelheid gedurende 30 minuten. Zet kamertemperatuur.

Breng het supernatant over in een verse buis en verwijder fijne deeltjes door het supernatant door een 0.8 micrometer filter te laten passeren. Het resulterende gefilterde serum kan onmiddellijk worden gebruikt of worden opgeslagen bij negatieve 80 graden Celsius. Als de extracellulaire vesicles uit humor moeten worden geëxtraheerd, verzamel aqueus humor van patiënten rechtstreeks door invasieve procedures en bewaar de monsters bij negatieve 80 graden Celsius.

Tot gebruik, zijn er geen filtratie of klaring stappen nodig voor vitreuze humor monsters. Om extracellulaire vesicles te isoleren uit serum of vocht humor, pipet vijf microliters van het biologische monster op elke bio functioneel papier substraat schijf. Incubeer de spot gedurende één minuut bij kamertemperatuur en herhaal de vijf microliter pipetting en de één minuut incubatie processen.

Twee keer meer Na affiniteits binding, spoel ongebonden vesicles af door eerst 10 microliters van de juiste spoel buffer te pipetten. Incubeer de buffer gedurende één minuut bij kamertemperatuur en herhaal de stappen van 10 microliter spoelen en de daaropvolgende incubatie. Twee keer meer.

De gevangen extracellulaire vesicles zijn nu klaar voor de volgende downstream assays om de gevangen vesicles op het functionele papier ondersteuning te fixeren, pipet 10 microliters van 0.5 x karnofsky fixatief op elke papier schijf. Laat de cross-linking reactie gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur doorgaan en spoel alle schijven met overvloedige hoeveelheden PBS gedurende vijf minuten. Volgende, dehydrateer de papier substratum door de volgende wassen in volgorde toe te passen.

Een 35% ethanol incubatie, twee 50% ethanol incubaties, twee 70% ethanol incubaties, twee 95% ethanol incubaties, en vier 100% ethanol incubaties. Laat voor elke individuele was de ethanol oplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op de papier schijven incuberen. Wanneer het papier apparaat boter droog is, sputter coat de monsters met een 18 nanometer laag palladium goud in een metalen sputter.

P