Name: Live-Imaging van Nicotine Induced Calcium Signaling en neurotransmitterafgifte Samen ventrale hippocampus Axons (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Leer live-imaging van calciumsignalering en neurotransmitterafgifte in de ventrale hippocampus-accumbens-circuit. Deze co-cultuurmethode maakt real-time analyse van pre- en postsynaptische mechanismen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Yehui Qin en Mallory Myers voor technische ondersteuning. We danken ook Dr. Sigismund Huck voor het verstrekken van het anti-α4-ECD antilichaam. Dit werk wordt ondersteund door een National Institutes of Health-subsidie NS22061 aan L. W. R.

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de Zorg en gebruik van proefdieren uitgevoerd (NIH Publications No. 80-23, herzien 2012) en studies werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en te gebruiken voor onderzoek Commissies bij Stony Brook University (# 1618 en # 1792). 1. vHipp-NACC Synaptic Co-culturen <ol><li> Offer muizen (postnatale dag 0-3, van wild-type (WT) of α7 nAChRs transgene muis lijn) met CO 2. Onthoofden elke pup en sla de staart in een 1,5 ml centrifugebuis voor post facto genotypering. Voer de volgende stappen in een gesteriliseerde kap. </li><li> Verwijder de bovenkant van de schedel met een schaar en forceps de gehele hersenen bloot. Vanaf het moment waar de cerebrale cortex gedeelte van elkaar caudaal, het verkrijgen van een coronale sectie die het achterste cortex inclusief de vHipp 5,21 onder een dissectie microscoop bevat. </li><li> Ontleden vHipp weefsel stroken met het CA1-subiculum regio volgens een ontwikkeling van de hersenen van muizen atlas 22 (Figuur 1A). Transfer naar een 35 mm cultuur schotel met koude cultuur media (4 ° C), snijd ze in kleine dunne plakjes (ongeveer 100 micrometer x 100 micrometer microslices). </li><li> Pre-incubeer 12 mm poly-D-lysine / laminine beklede dekglaasjes in 24 well weefselkweek platen met kweekmedium (~ 500 ul) gedurende ten minste 30 min in de incubator bij 37 ° C. Verwijder media voordat plating microslices. </li><li> Plaat met een vuur gepolijste Pasteur pipet in het midden van het dekglaasje met een minimale hoeveelheid medium (~ 50 pi gemaakt met ~ 20 stuks microslices) voor bevestiging van de explantaten vergemakkelijken. Plate vHipp microslices afkomstig van een enkel dier (ofwel de + / + of - / - genotype van de transgene α7 lijn) op elke dekglaasje. </li><li> Na de explantaten vestigen op de dekglaasje, zachtjes toe te voegen extra media (~ 100 pi) door The wand zodat het niveau van het materiaal hoog genoeg is om volledig te bedekken de explantaten op de periferie, maar niet die in het midden van het dekglaasje. </li><li> Na een O / N incubatie bij 37 ° C, 5% CO 2-incubator, dispergeren NACC neuronen uit embryonale dag 18 tot postnatale dag 1 WT-muizen en aan de explantaten. <ol><li> Ontleden NACC weefsels volgens een zich ontwikkelende hersenen van muizen atlas 20 (Figuur 1B). </li><li> In kleine stukjes gesneden (ongeveer 500 pm × 500 micrometer microslices) en transfer naar een 15 ml buis. </li><li> Behandel met 0,25% trypsine (2 ml) gedurende 15 min bij 37 ° C. Wash weefsel brokken driemaal wassen met koud medium (5 ml, 4 ° C), gevolgd door een wassing in koud kweekmedium (5 ml, 4 ° C). Laat schorsing te rusten voor 5 min in elke wasbeurt stap, en giet af supernatant zorgvuldig. </li><li> Distantiëren cellen door zachte trituratie in 2 ml van de cultuur media met een licht-vuur gepolijste Pasteur pipet. </li><li> Transfer celsuspensie aan een andere 15 ml buis en centrifugeer bij 2000 x rpm gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in kweekmedia op 1 ml per 6 pups. Verspreiden cellen door voorzichtig pipetteren in de media meerdere malen met een vuur gepolijste Pasteur pipet. </li><li> Voeg 0,25 ml van verspreide NACC cellen om elke dekglaasje met vHipp explantaten. </li><li> Handhaaf de kweken in een bevochtigde 37 ° C, 5% CO2 incubator. Plaats de cultuur platen op bevochtigde steriele gaasjes mechanisch stabiliseren en luchtvochtigheid te behouden, het vergemakkelijken van synapsvorming. </li></ol></li></ol> 2. Immunocytochemie <ol><li> Fix kweken (5-7 dagen in vitro) in 4% paraformaldehyde / 4% sucrose / PBS (~ 500 ul per dekglaasje, 20 min, RT). </li><li> Permeabilize kweken met 0,25% Triton X-100 / PBS (~ 500 ul per dekglaasje, 5 min, kamertemperatuur). </li><li> Block kweken met 10% normaal donkey serum in PBS (~ 500 ul per dekglaasje, 30 min, RT) voordat Antibody kleuring. Incubeer met primaire antilichamen O / N bij 4 ° C. Gebruik de volgende primaire antilichamen: anti-nAChRs (α 4 -ECD 1: 500, anti-α 5 subunits, 1: 500), anti-vesiculaire glutamaat transporter 1 (1: 250), anti-GAD65 (1: 100). </li><li> Was de primaire antilichamen met PBS (3 keer / ~ 500 ul per dekglaasje, 5 min) en vervolgens incubeer culturen in secundaire antilichamen geconjugeerd met Alexa 488 (~ 500 ul per dekglaasje, 1: 500) of Alexa 594 (~ 500 ul per dekglaasje , 1: 500) gedurende 1 uur bij 37 ° C. </li><li> Incubeer culturen αBgTx geconjugeerd met Alexa 594 (~ 500 ul per dekglaasje, 1: 1000 in cultuurmedia) gedurende 45 min bij 37 ° C voorafgaand aan fixatie etiketteren oppervlak α7 * nAChRs. </li><li> Mount en seal dekglaasjes. </li><li> Beelden vastleggen met een fluorescentiemicroscoop uitgerust met Plan-Apochromat doelstellingen (20X met 0,8 NA of 63x olie met 1.4 NA) en een CCD-camera. </li></ol> 3. FM1-43 Based Vesicular Fusion <ol><li> Handhaving van culturen (5-7 dagen in vitro) in een imaging kamer, monteren de kamer op de draaiende schijf confocale microscoop. Continu perfuseren (1 ml / min) met HBS cocktail bij RT. </li><li> Stop perfusie en belasting culturen met 10 uM FM1-43 in 56 mM K + ACSF (~ 500 ul) gedurende 90 sec (vlekken), wassen externe kleurstof weg gedurende 15 minuten met Ca 2+ vrije HBS met ADVASEP-7 (0,1 mM) naar membraangebonden FM1-43 vangen. </li><li> Stimuleren van de kweken met 56 mM K + ACSF (~ 500 ul) zonder FM1-43 voor 120 sec (ontkleuren), herladen kweken met FM1-43 onder dezelfde omstandigheden en nawassen met Ca2 + vrij HBS bevattende ADVASEP-7 voor 15 min. </li><li> Acquire FM1-43 fluorescentie beelden met draaiende schijf confocale microscoop voorzien van een Plan-Apochromat doelstelling (60X water met 1.4 NA, excitatie 488 nm, emissie 530 nm) en foto&#39;s maken met een CCD-camera. </li><li> Verzamel basislijn FM1-43 fluorescentiebeelden (elke 2 s gedurende 1 min) Als pre-nicotine control; toepassen nicotine (1 uM) door snelle perfusie (2 ml / min) gedurende 1 min, en daarna wassen nicotine met HBS cocktail. Houd capture time-lapse beelden voor, tijdens en na de nicotine toepassing elke 2 seconden voor 5 min. </li><li> Kwantificeren FM1-43 fluorescentie-intensiteit vóór (F vlekken) en na (F ontkleuren) nicotine toepassing op elke synaptische Bouton. </li><li> Bereken totale bedrag van afgeefbare FM1-43 fluorescentie langs vHipp axonen door het kwantificeren van het verschil van FM1-43 fluorescentie-intensiteit voor en na nicotine applicatie (AF = F vlekken -F ontkleuren). Analyseer fractie van de fluorescentie-intensiteit dalen na nicotine de volgende vergelijking: F = afname% AF / F kleuring. </li></ol> 4. Calcium Imaging <ol><li> Snel - (7 dagen in vitro 5) met een normale HBS, laad dan culturen met 5 pM Fluo-4 Ca 2+ indicator (Spoel culturenAM ester) en 0,02% Pluronic F-127 in HBS (2 ml) gedurende 30 min bij 37 ° C en 5% CO 2. </li><li> Spoel de Fluo-4-oplossing met HBS (3 keer / 5 min). Terug culturen incubator (37 ° C / 5% CO 2) gedurende ten minste 30 min. </li><li> Handhaving van culturen in dezelfde beeldvorming kamer en dezelfde voorwaarden als beschreven in FM1-43 gebaseerd vesiculaire fusie sectie (zie stap 3.1). </li><li> Verzamel Fluo-4 fluorescentie beelden van axonale projecties van de vHipp micro-schijfjes met een Plan-Apochromat doelstelling (60X water met 1.4 NA, excitatie 488 nm, emissie 530 nm) en een CCD-camera. </li><li> Verzamel basislijn Fluo-4 fluorescentiebeelden (om de 10 seconden gedurende 2 min) als pre-nicotine control toepassen nicotine (1 uM) door snelle perfusie (2 ml / min) gedurende 1 min, en daarna wassen met HBS nicotine cocktail. Blijf capture time-lapse beelden voor, tijdens en na nicotine gebruik elke 10 sec gedurende 30 minuten. </li><li> Bewaar alle frames van de ruwe fluo-4 fluorescentie beelden, export als een reeks vanAfbeeldingen TIFF-formaat voor verdere analyse. </li><li> Verzamel de geïntegreerde intensiteit van fluo-4 fluorescentie langs vHipp axonen voor en na nicotine applicatie. </li><li> Normaliseren geïntegreerde fluorescentie-intensiteit met de volgende vergelijking: AF / F = 0 (FF 0) / 0 F, waarbij F 0 is de achtergrond-gecorrigeerde pre-nicotine geïntegreerde fluorescentie-intensiteit en F de geïntegreerde fluorescentie-intensiteit langs vHipp axons op elk tijdstip na nicotine applicatie. Analyseren en plot genormaliseerd geïntegreerde fluorescentie-intensiteit. </li></ol>

<ol><li>Changeux, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+nicotinic+receptors%3A+structure+and+regulation%2C+role+in+learning+and+reinforcement%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Brain nicotinic receptors: structure and regulation, role in learning and reinforcement.</a> Brain Res Brain Res Rev. 26 (2-3), 198-216 (1998).</li>
<li>Levin, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+receptor+subtypes+and+cognitive+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Nicotinic receptor subtypes and cognitive function.</a> J Neurobiol. 53 (4), 633-640 (2002).</li>
<li>Dani, J. A., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+acetylcholine+receptors+and+nicotinic+cholinergic+mechanisms+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Nicotinic acetylcholine receptors and nicotinic cholinergic mechanisms of the central nervous system.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 699-729 (2007).</li>
<li>Mineur, Y. S., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+receptors+and+depression%3A+revisiting+and+revising+the+cholinergic+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Nicotine receptors and depression: revisiting and revising the cholinergic hypothesis.</a> Trends Pharmacol Sci. 31 (12), 580-586 (2010).</li>
<li>Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+elicits+prolonged+calcium+signaling+along+ventral+hippocampal+axons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Nicotine elicits prolonged calcium signaling along ventral hippocampal axons.</a> PloS one. 8 (12), e82719(2013).</li>
<li>McGehee, D. S., Heath, M. J., Gelber, S., Devay, P., Role, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+enhancement+of+fast+excitatory+synaptic+transmission+in+CNS+by+presynaptic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nicotine enhancement of fast excitatory synaptic transmission in CNS by presynaptic receptors.</a> Science. 269 (5231), 1692-1696 (1995).</li>
<li>Gray, R., Rajan, A. S., Radcliffe, K. A., Yakehiro, M., Dani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+synaptic+transmission+enhanced+by+low+concentrations+of+nicotine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hippocampal synaptic transmission enhanced by low concentrations of nicotine.</a> Nature. 383 (6602), 713-716 (1996).</li>
<li>Dickinson, J. A., Kew, J. N., Wonnacott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+alpha+7-+and+beta+2-containing+nicotinic+acetylcholine+receptors+modulate+excitatory+amino+acid+release+from+rat+prefrontal+cortex+nerve+terminals+via+distinct+cellular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic alpha 7- and beta 2-containing nicotinic acetylcholine receptors modulate excitatory amino acid release from rat prefrontal cortex nerve terminals via distinct cellular mechanisms.</a> Mol Pharmacol. 74 (2), 348-359 (2008).</li>
<li>Zappettini, S., Grilli, M., Salamone, A., Fedele, E., Marchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-synaptic+nicotinic+receptors+evoke+endogenous+glutamate+and+aspartate+release+from+hippocampal+synaptosomes+by+way+of+distinct+coupling+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pre-synaptic nicotinic receptors evoke endogenous glutamate and aspartate release from hippocampal synaptosomes by way of distinct coupling mechanisms.</a> Br J Pharmacol. 161 (5), 1161-1171 (2010).</li>
<li>Zappettini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+nicotinic+alpha7+and+non-alpha7+receptors+stimulate+endogenous+GABA+release+from+rat+hippocampal+synaptosomes+through+two+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Presynaptic nicotinic alpha7 and non-alpha7 receptors stimulate endogenous GABA release from rat hippocampal synaptosomes through two mechanisms of action.</a> PloS one. 6 (2), e16911(2011).</li>
<li>Fabian-Fine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+distribution+of+the+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunit+in+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural distribution of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor subunit in rat hippocampus.</a> J Neurosci. 21 (20), 7993-8003 (2001).</li>
<li>Jones, I. W., Barik, J., O'Neill, M. J., Wonnacott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha+bungarotoxin-1.4+nm+gold%3A+a+novel+conjugate+for+visualising+the+precise+subcellular+distribution+of+alpha+7%2A+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Alpha bungarotoxin-1.4 nm gold: a novel conjugate for visualising the precise subcellular distribution of alpha 7* nicotinic acetylcholine receptors.</a> J Neurosci Methods. 134 (1), 65-74 (2004).</li>
<li>Nashmi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+alpha4beta2+nicotinic+acetylcholine+receptors+assessed+with+functional+fluorescently+labeled+subunits%3A+effects+of+localization%2C+trafficking%2C+and+nicotine-induced+upregulation+in+clonal+mammalian+cells+and+in+cultured+midbrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Assembly of alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons.</a> J Neurosci. 23 (37), 11554-11567 (2003).</li>
<li>Drenan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+trafficking%2C+pentameric+assembly%2C+and+subunit+stoichiometry+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors+containing+fluorescently+labeled+alpha6+and+beta3+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits.</a> Mol Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological%2C+pharmacological%2C+and+molecular+evidence+for+alpha7-nicotinic+acetylcholine+receptors+in+rat+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological, pharmacological, and molecular evidence for alpha7-nicotinic acetylcholine receptors in rat midbrain dopamine neurons.</a> J Pharmacol Exp Ther. 311 (1), 80-91 (2004).</li>
<li>Parikh, V., Ji, J., Decker, M. W., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+beta2+subunit-containing+and+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptors+differentially+control+glutamatergic+and+cholinergic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal beta2 subunit-containing and alpha7 nicotinic acetylcholine receptors differentially control glutamatergic and cholinergic signaling.</a> J Neurosci. 30 (9), 3518-3530 (2010).</li>
<li>Nayak, S. V., Dougherty, J. J., McIntosh, J. M., Nichols, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+changes+induced+by+different+presynaptic+nicotinic+receptors+in+separate+populations+of+individual+striatal+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) changes induced by different presynaptic nicotinic receptors in separate populations of individual striatal nerve terminals.</a> J Neurochem. 76 (6), 1860-1870 (2001).</li>
<li>Richards, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+alpha4%2A+nicotinic+receptors+revealed+by+superecliptic+phluorin%3A+effects+of+a+beta4+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+mutation+and+chronic+exposure+to+nicotine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Trafficking of alpha4* nicotinic receptors revealed by superecliptic phluorin: effects of a beta4 amyotrophic lateral sclerosis-associated mutation and chronic exposure to nicotine.</a> J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).</li>
<li>Colombo, S. F., Mazzo, F., Pistillo, F., Gotti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+trafficking+and+up-regulation+of+nicotinic+ACh+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, trafficking and up-regulation of nicotinic ACh receptors.</a> Biochem Pharmacol. 86 (8), 1063-1073 (2013).</li>
<li>St John, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+trafficking+of+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacol+Sin%22%5BJournal%5D)">Cellular trafficking of nicotinic acetylcholine receptors.</a> Acta Pharmacol Sin. 30 (6), 656-662 (2009).</li>
<li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+type+III+neuregulin+1+is+required+for+sustained+enhancement+of+hippocampal+transmission+by+nicotine+and+for+axonal+targeting+of+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic type III neuregulin 1 is required for sustained enhancement of hippocampal transmission by nicotine and for axonal targeting of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors.</a> J Neurosci. 28 (37), 9111-9116 (2008).</li>
<li>Jacobowitz, D. M., Abbott, L. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJacobowitz%2C+DM+%22Chemoarchitectonic+Atlas+of+the+Developing+Mouse+Brain%22">Chemoarchitectonic Atlas of the Developing Mouse Brain</a>. , CRC Press. New York. (1998).</li>
<li>Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+fluorescent+staining+and+destaining+of+living+vertebrate+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals.</a> J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).</li>
<li>Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+fluorescent+styryl+dye+FM1-43+to+visualize+synaptic+vesicles+exocytosis+and+endocytosis+in+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals.</a> Methods Mol Biol. 689, 137-148 (2011).</li>
<li>Garduno, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+alpha4beta2+nicotinic+acetylcholine+receptors+increase+glutamate+release+and+serotonin+neuron+excitability+in+the+dorsal+raphe+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors increase glutamate release and serotonin neuron excitability in the dorsal raphe nucleus.</a> J Neurosci. 32 (43), 15148-15157 (2012).</li>
<li>Guo, J. Z., Liu, Y., Sorenson, E. M., Chiappinelli, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+released+and+exogenous+ACh+activates+different+nicotinic+receptors+to+enhance+evoked+glutamatergic+transmission+in+the+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Synaptically released and exogenous ACh activates different nicotinic receptors to enhance evoked glutamatergic transmission in the lateral geniculate nucleus.</a> J Neurophysiol. 94 (4), 2549-2560 (2005).</li>
<li>Szabo, S. I., Zelles, T., Vizi, E. S., Lendvai, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+nicotine+on+spiking+activity+and+Ca2%2B+dynamics+of+dendritic+spines+in+rat+CA1+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">The effect of nicotine on spiking activity and Ca2+ dynamics of dendritic spines in rat CA1 pyramidal neurons.</a> Hippocampus. 18 (4), 376-385 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De co-kweek bereiding beschreven re-capituleert ventrale hippocampus-accumbens circuits in vitro. Dit preparaat vergunningen betrekkelijk eenvoudige en betrouwbare behandeling van de ruimtelijke en temporele profielen waardoor activatie van presynaptische nAChRs wekken verhoogde glutamaterge transmissie 5, 21. Co-culturen worden gedefinieerd als de groei van verschillende specifieke celtypes in een gerecht die fysiologische omstandigheden kunnen verschaffen in vitro</...

Cholinerge modulatie circuit exciteerbaarheid bij aan fundamentele aspecten van cognitie en veranderde cholinerge modulatie is een kenmerk van neurodegeneratieve en neuropsychiatrische stoornissen, waaronder de ziekte van Alzheimer, ziekte van Parkinson, schizofrenie en verslaving 1-4. Een gevestigde mechanisme cholinerge vergemakkelijking van synaptische transmissie in het centrale zenuwstelsel is via directe activatie van nAChRs gelokaliseerd op pre-synaptische plaatsen. Activatie van deze pre-synaptische receptoren leidt tot intracellulaire Ca2 + ([Ca2 +] i) in presynaptische terminals verhoogd - zowel direct, door de relatief hoge geleiding door calcium bepaalde nAChR subtypes en indirect via intracellulaire signalering cascades 5, en zodoende neurotransmitter release. In feite is de activatie van presynaptische nAChRs in verband met veranderingen in afgifte van diverse neurotransmitters zoals glutamaat, GABA, ACh, eennd dopamine 6-10. Hoewel deze werkwijze is onderzocht Indirect door elektrofysiologische werkwijzen op diverse synapsen, optische reporters van [Ca2 +] i en synaptische vesicles recycling mogelijk directer en tijdelijk nauwkeurige meting van presynaptische verschijnselen. Pre-synaptische lokalisatie van nAChRs is overtuigend aangetoond met directe immuno-goud etikettering van nAChRs bij het ​​elektron microscopische (EM) niveau 11,12. Verscheidene andere technieken zijn ook gebruikt voor de nAChR lokalisatie indirect pakken, onder detectielocaties van nAChRs subunit- fluorescerend eiwit chimaera in gekweekte neuronen 13,14, elektrofysiologische registratie van nAChR stromen in synaptische terminals 15,16, bewaken nicotine geïnduceerde veranderingen in [Ca 2+] i in synaptische zenuwuiteinden door live cell imaging 17, en indirecte controle van de neurotransmitters in de synaptische terminal doorlive cell imaging technieken fluorescente indicatoren, waaronder exocytose van synaptische blaasjes bekeken styrylkleurstoffen amfipatische FM kleurstoffen (FM1-43 en FM4-64) en / of synapto-pHluorin en specifieke neurotransmitter fluorescente reporters, zoals CNiFERs van ACh en iGluSnFr voor glutamaat 18-20. Kortom, deze de huidige benaderingen voor de identificatie van pre-synaptische lokalisatie van nAChRs zijn ingewikkeld en vereisen speciale systemen en technieken voor betrouwbare identificatie en fysiologische bewaking van pre-synaptische activiteit mogelijk. Hier beschrijven we protocollen en apparatuur voor een in vitro co-kweeksysteem van een ventrale hippocampus (vHipp) - nucleus accumbens (NACC) schakeling die directe toegang tot het identificeren en zowel pre- en postsynaptische elementen van synaptische transmissie analyse verschaft. We tonen voorbeelden van pre-synaptische lokalisatie van nAChRs en de live-cell imaging van nAChR gemedieerde Ca 2+ signalering en neurotransmitter vrijlating along vHipp axonen. Een natuurlijke (en eenvoudige) uitbreiding van het protocol hier gepresenteerde is de bereiding van pre- en post-synaptische contacten omvat neuronen van verschillende genotypen. Op deze wijze wordt de bijdrage van een bepaald genproduct aan de pre- en / of postsynaptische mechanismen van modulatie kan direct worden bepaald.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Culture Media (50 ml)</td></tr><tr><td>Neurobasal&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>10888022</td><td>48 ml</td></tr><tr><td>B-27 Supplements</td><td>GIBCO</td><td>0080085-SA</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>GIBCO</td><td>10908-010</td><td>0.5 ml</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>GIBCO</td><td>35050-061</td><td>0.5 ml</td></tr><tr><td>Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td colspan="4">2. washing media (HBSS, 100 ml)</td></tr><tr><td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>14175-095</td><td>99 ml</td></tr><tr><td>HEPES ( 1M)</td><td>GIBCO</td><td>15630-130</td><td>1 ml</td></tr><tr><td colspan="4">3. HEPES buffered saline&nbsp; (HBS)&nbsp;&nbsp; pH=7.3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888&nbsp;</td><td>135 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333&nbsp;</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp;</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>CaCl2,</td><td>Sigma</td><td>C1016&nbsp;</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G0350500&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td colspan="4">4. HBS Cocktail for live imaging pH=7.3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888&nbsp;</td><td>135 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333&nbsp;</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp;</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>CaCl2,</td><td>Sigma</td><td>C1016&nbsp;</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G0350500&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>tetrodotoxin&nbsp;</td><td>Tocris</td><td>1078</td><td>2 &micro;M</td></tr><tr><td>bicuculline</td><td>Tocris</td><td>131</td><td>10 &micro;M</td></tr><tr><td>D-AP-5</td><td>Tocris</td><td>105</td><td>50 &micro;M</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris</td><td>1045</td><td>20 &micro;M</td></tr><tr><td>LY341495</td><td>Tocris</td><td>1209</td><td>10 &micro;M</td></tr><tr><td colspan="4">5. Calcium-free&nbsp; HBS&nbsp;&nbsp; pH=7.3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888&nbsp;</td><td>135 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333&nbsp;</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp;</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G0350500&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td colspan="4">6. 56 mM Potassium ACSF pH=7.4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>119 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td>56 mM</td></tr><tr><td>MgSO4.7H</td><td>Sigma</td><td>M1880</td><td>1.3 mM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td>2.5 mM</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>26.2 mM</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G0350500&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr></tbody></table>

live-imaging van nicotine induced calcium signaling en neurotransmitterafgifte samen ventrale hippocampus axons

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Aanhoudende verbetering van axonale signalering en verhoogde neurotransmitterafgifte door de activering van presynaptische nicotinerge acetylcholinereceptoren (nAChR's) is een belangrijk mechanisme voor neuromodulatie door acetylcholine (ACh). De moeilijkheid met toegang tot het onderzoeken van de signaalmechanismen binnen intacte axonen en op zenuwuiteinden zowel in vitro als in vivo heeft de voortgang in de studie van de presynaptische componenten van synaptische plasticiteit beperkt. Hier introduceren we een gen-chimère bereiding van ventrale hippocampale (vHipp)–accumbens (nAcc) circuit in vitro die directe live beeldvorming mogelijk maakt om zowel de pre- als postsynaptische componenten van transmissie te analyseren terwijl selectief de genetische profielen van de pre- versus postsynaptische neuronen worden gevarieerd. We demonstreren dat projecties van vHipp-microslices, als presynaptische axonale input, meerdere, betrouwbare glutamaterge synapsen vormen met postsynaptische doelen, de verspreide neuronen uit nAcc. De presynaptische lokalisatie van verschillende subtypes van nAChR's wordt gedetecteerd en de presynaptische nicotinerge signaaloverdracht gemedieerde synaptische transmissie wordt gemonitord door gelijktijdige elektrofysiologische registratie en live celbeeldvorming. Deze bereiding biedt ook een informatieve aanpak om de pre- en postsynaptische mechanismen van glutamaterge synaptische plasticiteit in vitro te bestuderen.

De voorbereiding dienst bestaat uit gen chimerische co-culturen van vHipp-NACC circuits in vitro. Projecties afkomstig van vHipp microslices, als pre-synaptische axonale input, kan synaptische contacten met postsynaptische targets, de verspreide neuronen van NACC te maken. Nicotine veroorzaakt een aanhoudende (≥ 30 min) faciliteren van glutamatergische overdracht van NACC neuronen geïnnerveerd door vHipp axonen 21 en langdurige calcium signalering langs vHipp axonen 5 via pre-synaptische α...

We ontwikkelden een gen-chimerische voorbereiding van de ventrale hippocampale - accumbens-circuit in vitro die direct live beeldvorming mogelijk maakt om presynaptische mechanismen van nicotinische acetylcholine receptoren (nAChR's) gemedieerde synaptische transmissie te analyseren. Deze voorbereiding biedt ook een informatieve aanpak om de pre- en post-sygnatische mechanismen van synaptische plasticiteit te bestuderen.

Live-Imaging van Nicotine Induced Calcium Signaling en neurotransmitterafgifte Samen ventrale hippocampus Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Het algemene doel van deze procedure is om in vitro een gene-chimere preparatie van het ventrale hippocampaal-accumbens circuit te genereren, die directe live imaging mogelijk maakt om zowel de pre- als postsynaptische componenten van de synaptische transmissie te identificeren en te analyseren. Dit wordt bereikt door eerst ventrale hippocampale weefselstrips te disseceren die de CA1-regio bevatten. De tweede stap is om de ventrale hippocampale strips in kleine, dunne plakjes te snijden en deze micro-plakjes vervolgens gedurende de nacht centraal op het dekglas in de 24-wells weefselkweekplaat te plaatsen.Dissekeer vervolgens de nucleus accumbens uit het hersenweefsel. De laatste stap is om de nucleus accumbens-strips met trypsine te dissociëren in verspreide neuronen, de nucleus accumbens-neuronen toe te voegen aan de dekglasplaatjes met ventrale hippocampaal-implantaten en deze vijf tot zeven dagen te incuberen. Uiteindelijk wordt de presynaptische lokalisatie van nicotinische acetylcholine-receptoren en de calciumsignalering en neurotransmitterafgifte gemedieerd door nicotinische acetylcholine-receptoren bepaald.Axonen van de ventrale hippocampus kunnen worden geïdentificeerd en gemonitord middels spinning disc confocale live-cell imaging. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze co-cultuurpreparatie van neuronale micro-slices een eenvoudige herkenning van hun presynaptische axonen en postsynaptische doelcellen mogelijk maakt. De co-cultuurpreparatie recréeert het circuit van de ventrale hippocampus naar de nucleus accumbens in vitro.Dit maakt directe live-imaging van zowel het presynaptische als het postsynaptische compartiment, of beide, mogelijk. Deze in vitro synaptische preparatie maakt high-resolution imaging van de ruimtelijke en temporele effecten van de activatie van presynaptische receptoren op de glutamaterge synaptische transmissie mogelijk. Hierdoor kan informatie worden verkregen over zowel de pre- als postsynaptische mechanismen die bijdragen aan de glutamaterge synaptische plasticiteit vóór de weefselafname.Pre-incubeer 12 millimeter poly-D-lysine gecoate glazen dekglasjes in de 24-well weefselkweekplaten met 500 microliters kweekmedium bij 37 graden Celsius gedurende ten minste 30 minuten. Verwijder vervolgens het medium voordat de micro-slices worden geplaatst om weefsel voor kweek te verzamelen. Verwijder de bovenkant van de schedel om de gehele hersenen van elk geofferde pup bloot te leggen onder een dissectiemicroscoop.Begin bij het punt waar de cerebrale cortices van elkaar gescheiden zijn en maak een coronale doorsnede waarin de posterieure cortices, inclusief de ventrale hippocampus, zijn opgenomen. Disseceer vervolgens de ventrale hippocampale weefsels die de CA1-regio's bevatten eruit. Breng de weefsels daarna over naar een kweekschaal van 35 millimeter met koud kweekmedium.Snijd de weefsels vervolgens verder in kleine dunne plakjes. Plaats de plakjes met een vuurgepolijste Pasteurpipet in het midden van het dekglas. Voeg 50 µL medium toe om de aanhechting van de explantaten te vergemakkelijken.Plaats vervolgens de ventrale hippocampale microsnijplaten op het dekglas. Nadat de X explantaten op het dekglas zijn neergedaald, voegt u voorzichtig 100 µL extra medium langs de wand toe, zodat het mediumniveau hoog genoeg is om de explantaten aan de periferie volledig te bedekken, maar niet die in het centrum van het dekglas. Incubeer de explantaten vervolgens gedurende de nacht in 5% CO2 bij 37 °C voorafgaand aan de dispersie van de nucleus accumbens-neuronen. Neem nu nucleus accumbens-weefsels van wilde-type muizen van embryonale dag 18 tot postnatale dag 1, snijd deze in kleine stukjes en breng ze vervolgens over naar een 15 mL buis.Behandel de weefsels met twee milliliter 0,25% trypsine gedurende 15 minuten bij 37 °C. Was de weefsels vervolgens drie keer met vijf milliliter wasmedium van 4 °C en laat de suspensie tijdens elke wasstap vijf minuten rusten. Was de weefsels daarna in vijf milliliter kweekmedium van 4 °C.Dissocieer vervolgens de cellen door middel van voorzichtig pipetteren in twee milliliters kweekmedium met een licht vlamgepolijste Pasteur-pipet. Breng daarna de celsuspensie over naar een andere buis van 15 milliliter en centrifugeer deze gedurende vijf minuten bij 2000 RPM. Verwijder na vijf minuten het supernatant en resuspendeer de cellen in kweekmedium in een verhouding van één milliliter per zes pellets; verspreid vervolgens de cellen door het medium meerdere keren voorzichtig te pipetteren met een vlamgepolijste Pasteur-pipet.Voeg aan het einde 25 milliliters van de gedispergeerde nucleus accumbens-cellen toe aan elk dekglas met de ventrale hippocampale explantaten. Plaats de kweekplaten op vochtige steriele gaasjes om ze mechanisch te stabiliseren en de vochtigheid te behouden om synapsevorming te faciliteren. Incubeer de platen vervolgens bij 5%CO2 bij 37 degrees Celsius.Overplaats in deze procedure de culturen één voor één naar een beeldkamer. Monteer de kamer op de spinning disc confocale microscoop. Perfuseer het monster continu met HBS-cocktail met een snelheid van één milliliter per minuut bij kamertemperatuur.Stop vervolgens de profusie en kleur de cultuur 90 seconden met 10 micromolar FM 1 43 in 56 millimolar kalium A CSF. Was daarna de externe kleurstof gedurende 15 minuten weg met calciumvrij HBS dat 0,1 millimolar A-D-V-A-S-E-P zeven bevat. Destimuleer de cultuur daarna gedurende 120 seconden met 56 millimolar kalium A CSF zonder FM 1 43.Voor de detectie. Herlaad de cultuur met FM 1 43 onder dezelfde omstandigheden en was opnieuw gedurende 15 minuten met calciumvrij HBS dat A-D-V-A-S-E-P seven bevat. Leg nu de FM 1 43 fluorescentiebeelden vast met een spinning disc confocale microscoop uitgerust met een plan-apochromatisch objectief en captureer de beelden met een CCD-camera.Verzamel de baseline FM 1 43 fluorescentiebeelden elke twee seconden gedurende één minuut als pre-nicotine controle. Dien vervolgens één micromolair nicotine toe via snelle perfusie met twee milliliter per minuut gedurende één minuut, alvorens de nicotine uit te spoelen met HBS-cocktail. Blijf de time-lapse beelden vastleggen voor, tijdens en na de toediening van nicotine elke twee seconden gedurende vijf minuten.Spoel in deze stap de culturen snel af met normaal HBS. Laad de culturen vervolgens met vijf micromolar fluo-4 calciumindicator en 0,02%onic F1 27 in twee milliliter HBS gedurende 30 minuten bij 37 °C en 5% CO2. Was daarna de fluo-4 oplossing drie keer uit met HBS, waarbij elke wasbeurt vijf minuten duurt.Plaats de culturen gedurende ten minste 30 minuten terug in de incubator. Verplaats de culturen vervolgens één voor één naar de beeldvormingskamer. Gebruik dezelfde condities als beschreven in de FM 1-43 gebaseerde procedures voor vesiculaire fusie.Verzamel de baseline flu oh four fluorescentiebeelden van axonale projecties uit de ventrale hippocampale microslices als pre-nicotinecontrole. Pas vervolgens één micromolaire nicotine toe via snelle perfusie met een snelheid van twee milliliters per minuut gedurende één minuut, en spoel de nicotine daarna weg met HBS-cocktail. Blijf de time-lapsebeelden vastleggen voor, tijdens en na de nicotineapplicatie elke 10 seconden gedurende 30 minuten.Deze figuur toont direct aan dat de projecties vanuit de ventrale hippocampale microsnijden glutamaterge zijn en dat de contacten worden gelegd met verspreide GABAerge medium spiny neuronen uit de nucleus accumbens; zowel alfa zeven als niet-alfa zeven nicotinische acetylcholine-receptoren werden aangetroffen langs de ventrale hippocampale axonen, specifiek op de plaatsen waar ventrale hippocampale projecties contact maken met neuronen in de nucleus accumbens. Er moet worden opgemerkt dat de verspreide neuronen uit de nucleus accumbens geen alfa zeven nicotinische acetylcholine-receptoren tot expressie brengen, wat betekent dat de receptorclusters bij de contacten strikt presynaptisch zijn.De time-lapse beelden van fluo-4 calciumfluorescentie langs ventrale hippocampale axonen werden opgenomen met een 60 x water-immersie objectief elke 10 seconden gedurende 30 minuten met een spinning disc confocale microscoop. De opgenomen beelden werden weergegeven op een pseudokleurenschaal en afgespeeld als een video met twee frames per seconde. Deze video laat zien dat de toediening van nicotine leidde tot aanhoudende fluo-4 calciumfluorescentie-activiteit langs levende wild-type ventrale hippocampale axonen.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de ventrale hippocampale micros in een minimaal volume medium moeten worden geplaatst en dat de kweekplaten op vochtige stereo-groeipads moeten worden bewaard. Deze stappen zijn essentieel voor de aanhechting van de micros, de uitgroei van de projecties en de vorming van synapsen. Deze cocultuur maakt het mogelijk om de genotypen van de presynaptische input onafhankelijk van hun postsynaptische doelen te variëren.Daarnaast maakt het de selectieve expressie van exogene genen in beide compartimenten onafhankelijk van elkaar mogelijk. Dit biedt een groot potentieel voor het ontleden van pre- versus postsynaptische mechanismen van synaptische plasticiteit. Na het bekijken van deze video zou u moeten begrijpen hoe u gene-chimerische synaptische cocultures genereert die het circuit van de ventrale hippocampus naar het accumbens nabootsen.Vervolgens zou u live-imagingtechnieken kunnen gebruiken om zowel pre- als postsynaptische neuronen te analyseren.

live-imaging-nicotine-induced-calcium-signaling-neurotransmitter

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We hebben een nieuwe techniek van het kwantificeren van nicotine acetylcholine receptor veranderingen binnen subcellulaire regio's van specifieke subtypes van CNS neuronen beter de mechanismen van de nicotine verslaving te begrijpen met behulp van een combinatie van benaderingen waaronder fluorescerend eiwit tagging van de receptor met behulp van de knock-in aanpak en spectrale confocale beeldvorming.

Spectrale confocale beelden van de fluorescent gelabeld nicotinereceptoren in de knock-in muizen met chronische Nicotine Administratie

This video demonstrates the process of preparing ventral hippocampal and nucleus accumbens tissues from mouse brains for co-culture. Neurons extend projections to form synaptic connections between the ventral hippocampal and nucleus accumbens tissues. This method allows studying neuronal interactions between these two brain regions, offering insights into cognition, behavior, and neurological disorders.

Co-culturing of Ventral Hippocampal and Nucleus Accumbens

This video demonstrates how nicotine-mediated activation of nicotinic acetylcholine receptors in the mouse ventral hippocampus results in sustained calcium signaling along the axons.

Imaging Nicotine-Induced Calcium Signaling along Ventral Hippocampal Axons in Synaptic Co-Cultures

Source: Bancroft, E. A., et al. Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons. J. Vis. Exp. (2020) This video demonstrates the real-time visualization of calcium influx in ventral midbrain neurons derived from mouse embryos. Using a viral vector to express a calcium indicator, the neurons are imaged under a confocal microscope to track changes in fluorescence intensity during spontaneous and neurotransmitter-induced calcium activity.

Visualization of Calcium Influx in Ventral Midbrain Neurons Derived from Mouse Embryos

Source: Lark, A. R., et. al.,  In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates real-time imaging of calcium dynamics using Green fluorescent protein-aequorin bioluminescence in Drosophila's deep brain structures.

Bioluminescence Imaging for Studying Calcium Transients in Drosophila Brain Structures

Dit artikel presenteert een methode voor het bestuderen van nicotinerge acetylcholine-receptoren (nAChRs) in muis hersenen plakjes door nicotine uncaging. Wanneer in combinatie met de gelijktijdige patch klem opname en 2-foton laser scanning microscopie, verbindt nicotine uncaging nicotinerge receptor functie met cellulaire morfologie, bieden een dieper begrip van cholinerge neurobiologie.

Indringende nicotinerge Acetylcholine Receptor functie in muis segmenten van de hersenen via Laser Flash fotolyse van Photoactivatable Nicotine

Deze methode beschrijft een chronische voorbereiding die optische toegang tot de hippocampus van levende muizen mogelijk maakt. Deze voorbereiding kan worden gebruikt voor het uitvoeren van longitudinale optische beeldvorming van neuronale structurele plasticiteit en activiteit-opgeroepen cellulaire plasticiteit over een periode van enkele weken.

Longitudinale Two-photon beeldvorming van dorsale Hippocampal CA1 in levende muizen

Hier presenteren we een protocol waarmee pre-en/of postsynaptisch calcium kan worden gevisualiseerd in de context van Drosophila leren en geheugen. In vivo calcium beeldvorming met behulp van Synaptisch gelokaliseerde calcium sensoren wordt gecombineerd met een klassieke olfactorische conditionerings paradigma zodanig dat de Synaptische plasticiteit onderliggende dit type associatief leren kan worden bepaald.

In vivo optische calcium beeldvorming van leren-geïnduceerde synaptische plasticiteit in Drosophila melanogaster

Het huidige protocol demonstreert een eenvoudige methode voor het traceren van ventrale tegmentale gebied (VTA) glutamaatprojecties naar de hippocampus. Fotostimulatie van VTA-glutamaatneuronen werd gecombineerd met CA1-opname om aan te tonen hoe VTA-glutamaatterminals ca1-putatieve piramidale vuursnelheid in vivo moduleren.

Gecombineerde In Vivo anatomische en functionele tracing van Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in de Hippocampus

Dit artikel demonstreert de voorbereiding van een op maat gemaakt beeldvormingsvenster aangevuld met infusiekanule en de implantatie ervan op het CA1-gebied van de hippocampus bij muizen.

Craniotomie procedure voor het visualiseren van neuronale activiteiten in Hippocampus van zich gedragende muizen

Dit protocol beschrijft in vivo GCaMP-calciumbeeldvorming van intacte trigeminusganglion (TG)-neuronen. Deze beschrijving omvat TG-blootstellingschirurgie, in vivo confocale microscopiebeeldvorming van TG-neuronen, toepassing van somatische stimuli tijdens microscopische beeldvorming van TG-neuronen en analyse van in vivo GCaMP-calciumbeeldvormingsgegevens.

In vivo Calciumbeeldvorming van neuronale ensembles in netwerken van primaire sensorische neuronen in intacte trigeminusganglia

Leer live-imaging van calciumsignalering en neurotransmitterafgifte in de ventrale hippocampus-accumbens-circuit. Deze co-cultuurmethode maakt real-time analyse van pre- en postsynaptische mechanismen mogelijk.

Live-Imaging van Nicotine Induced Calcium Signaling en neurotransmitterafgifte Samen ventrale hippocampus Axons

Meer video's verkennen