In Vivo Dynamiek van retinale Microgliale Activering Tijdens Neurodegeneratie: Confocal oftalmoscopisch Imaging en Cell Morphometry in Mouse Glaucoom

Het algemene doel van het volgende experiment is om de microgliadynamiek in een muismodel van chronisch glaucoom te karakteriseren middels in vivo confocale beeldvorming van het netvlies. Dit wordt bereikt door niet-invasieve maandelijkse confocale oftalmoscopie of CSLO om de fluorescerende microglia op het netvlies en de papil van de oogzenuw te visualiseren. Live-beeldanalyse met behulp van drempelwaarde-gebaseerde segmentatie van het cellichaam (SOMA) en morpho kwantificeert veranderingen in het aantal microgliacellen en de activatie.

De resultaten tonen aan dat maandelijkse CSLO-beeldvorming in levende muizen kan worden gebruikt om de kinetiek van de distributie van de microgliaceldichtheid en de morfologische activatie te monitoren tijdens de vroege progressie van chronische neurodegeneratie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals tweefoton confocale beeldvorming van GFP-positieve microglia in het muizenbrein, is dat CSLO-beeldvorming van het netvlies directe observatie en monitoring van microgliacellen mogelijk maakt gedurende de progressie van neurodegeneratieve aandoeningen door veroudering in het intacte organisme. Ik kreeg voor het eerst het idee voor deze methode nadat we ex vivo hadden aangetoond dat microglia een intense activatie en clustering vertoonden in het centrale deel van jonge DBA/2J-muizen op leeftijden die voorafgingen aan detecteerbare neurodegeneratie.

Om vast te stellen of deze vroege aangeboren immuunveranderingen die voorafgingen aan detecteerbaar glaucoom de neurodegeneratie veroorzaakten, moesten we een in vivo-aanpak ontwikkelen om microglia-veranderingen te volgen. Caesar Romero, een technicus in mijn laboratorium, zal de procedure voor live-beeldacquisitie demonstreren. Start ter voorbereiding het CSLO-systeem en voer de sessie-informatie in. Bereid vervolgens de beeldvorming veilig voor.

Bevestig een schone 55 graden groothoekobjectieflens. Plaats twee minuten na toediening van het anestheticum een muis op het beeldplatform en verwijd beide pupillen met mydriatische druppels. Bevestig vijf minuten later of de muis is geanestheseerd.

Bedek vervolgens elk oog met contactlenzen door minimale druk uit te oefenen. Positioneer de muis zodanig dat het rechteroog het objectief raakt en de oogkas parallel aan de lens staat. Het dier hoeft niet gefixeerd te worden, maar moet op een constante afstand van het objectief worden gehouden.

Terwijl het oog gedurende de volgende 10 tot 15 minuten is uitgelijnd, zal de muis niet bewegen of knipperen terwijl de oogbewegingen worden gevolgd door het CSLO live-imaging-systeem. Start de imaging-sessie door een fundusbeeld van het binnenste netvlies te verzamelen. Hiervoor.

Selecteer de infraroodmodus, die overeenkomt met een excitatiegolflengte van 820 nanometer. Stel vervolgens het laservermogen in op 100% en de gevoeligheid op een waarde tussen 40 en 60%. Lokaliseer daarna, door snel te werken, het oog met behulp van de joystick om de oftalmoscoop te oriënteren en bereid u voor om een fundusbeeld van de optische schijf en de retinaire vasculatuur vast te leggen. Inspecteer het hoornvlies en de lens op letsel of troebeling.

Sluit ogen uit van de studie die defecten of letsels vertonen die de beeldverwerving kunnen beïnvloeden. Breng nu het objectief dichter bij het oog om het gebied van de papil te lokaliseren, wat het oppervlak van de kop van de oogzenuw of ONH is. Centreer vervolgens het beeld op de ONH.

Het correct positioneren van de ONH is essentieel voor het verkrijgen van een gelijkmatige focus en emissie over het gehele beeld. De volgende stap is het visualiseren van de binnenste lagen van het netvlies, evenals de ONH. Gebruik voor een referentiebrandvlak de grote bloedvaten die zich op het vitreale oppervlak van het netvlies bevinden, wat overeenkomt met 59 en 60 dioptrieën, of zelfs dieper bij 55 dioptrieën in uitgeholde gebieden van de oogzenuwschijf.

Pas vervolgens de verzadiging van het beeld aan met de knop op het touchpaneel, totdat een witte halo van verlichting het grootste deel van het fundus rond de optische disc beslaat. Selecteer daarna de lagere verzadiging die een uniforme halo oplevert, wat duidt op een optimaal contrast voor dat oog. Het kan nodig zijn om de camera opnieuw uit te lijnen als er donkere gebieden blijven bestaan.

Veramel nu een fundusbeeld met hoge resolutie van het centrale netvlies door 30 in real-time opgenomen frames te middelen om de signaal-ruisverhouding te verbeteren. Dit komt overeen met 4,7 frames per seconde, onmiddellijk genormaliseerd en op dezelfde positie voorbereid om een fluorescentiebeeld van de GFP-positieve cellen vast te leggen. Schakel op het touchscreenpaneel over naar de fluorescentiebeeldvormingsmodus, waarmee de blauwe laser met 488 nanometer laser-excitatie en een barrièrefilterset van 460 tot 490 nanometer wordt geselecteerd, en stel de acquisitie in op 100% laservermogen en 100 tot 125% gevoeligheid.

Maak nu een enkel tweedimensionaal fluorescentiebeeld van het XY-punt van de ONH door 100 x scans te middelen. Leg vervolgens een meerpuntig beeld van het netvlies rond de ONH vast; selecteer 'composite' in het bedieningspaneel en pan vervolgens met de oftalmoscoop over de nasaal-temporale as. De software middelt automatisch de nieuw gescande gebieden en voegt deze in real-time samen.

Als de beeldkwaliteit van delen van het netvlies onvoldoende is om middeling toe te staan, wordt de groene cirkel die het gescande gebied identificeert rood. Het resulterende samengestelde beeld beslaat een gebied tot 1,7 bij vier millimeter. Tijdens de acquisitie van het samengestelde beeld dient men voorzichtig te zijn.

Beelden met een hoge resolutie kunnen verloren gaan wanneer het objectief te snel wordt bewogen voordat het middelen van de scan en het samenvoegen van de beelden (image stitching) zijn voltooid. Wanneer de anesthesie begint uit te werken, moet de beeldsessie worden beëindigd omdat de muis zwaar begint te ademen en beeldvorming onuitvoerbaar wordt. Begin met het sequentieel uitlijnen van de fundusbeelden voor een tijdreeks, waarbij de vasculatuur en de optische schijf als oriëntatiepunten worden gebruikt.

Lijn met behulp van conventionele beeldbewerkingssoftware alle afbeeldingen uit totdat hun O hs overlappen. De bovenste afbeelding wordt semi-transparant weergegeven tijdens het slepen. Roteer vervolgens elke afbeelding in de sequentie totdat de belangrijkste bloedvaten overlappen met de vasculatuur op de vorige afbeelding en sla de opstelling op voor toekomstig gebruik.

Noteer de gecorrigeerde hoek voor elke afbeelding en pas deze toe op de corresponderende enkelvoudige XY-punt fluorescentieafbeelding. Het is nu mogelijk om individuele GFP-positieve microgliacellen in de centrale retina te identificeren door de uitgelijnde TIFF-bestanden te openen in Fluor render. Om alle cellen te visualiseren, vult u het scherm met de afbeelding en stelt u de renderweergave in op 'composite orthogonal' en 'interpolated'.

Definieer vervolgens de eigenschappen 0,58 gamma, 255 verzadigingspunt, 255 luminantie en 195 alpha bij 1,00 schaduwing. Voltooi de selecties door beide RG-kanalen als zichtbaar te markeren. Verberg het B-kanaal door erop dubbel te klikken in het werkveld om individuele cellen te segmenteren.

Selecteer het rode kanaal en pas drempelwaarde-segmentatie toe door de lage drempelwaarde te verhogen totdat de meeste cellen zijn gemaskeerd met minimale overlap en celuitlopers zijn uitgesloten, terwijl de hoge drempelwaarde constant wordt gehouden. Sla ten slotte het bestand met de gemaskeerde cellen op met het capture-commando. Open de afbeelding met de gemaskeerde cellen vervolgens in de rastergrafische editor.

Inverteer de grijswaarden voor directe observatie en stel de resolutie in op 300 DPI of hoger. De RGB-afbeelding wordt opgeslagen als een TIF-bestand. De volgende stap van de live-beeldanalyse betreft de microglia, waarbij segmentatie en morpho worden gebruikt om SATA te identificeren voor area-kwantificatie.

Gebruik software die in staat is tot intensiteitsmetingen en objecttelling op basis van een drempelwaarde. Open het TIFF-bestand met gesegmenteerde cellen en selecteer spline-rescaling voor maximale resolutie en het rode kanaal als zwart-wit voor een betere visualisatie. Kalibreer vervolgens de afbeelding door de horizontale diameter te definiëren als 1,4 tot 1,7 millimeter, afhankelijk van de leeftijd, om individuele cellen te segmenteren.

Pas vervolgens intensiteitsdrempeling toe op het rode kanaal. Open de functie voor drempelintensiteit onder het commando voor objecttelling en accountbijwerking. Gebruik deze functie om tweedimensionale parameters bij te houden voor elke drempelwaarde van het regio van interesse die een individu vertegenwoordigt.

Definieer vervolgens de intensiteitsdrempel in het intensiteitshistogram. Selecteer de laagste 50 tot 60% van de 255 niveaus en verfijn de uiteindelijke drempelwaarde van de individuele cellen. Beoordeel visueel de overlap tussen het blauwe drempelkleurmasker en de grijze omtrek van het cellichaam met behulp van de bedieningselementen in de binaire werkbalk of de objectcatalogus.

Identificeer handmatig somale regio's van belang met meerdere cellen. Scheid deze elementen door de regio's van belang te isoleren. Gebruik hierbij de schakelaar om de cellen nu direct te visualiseren door middel van gebiedsbeperking.

Classificeer microgliacellen als geactiveerd als hun soma-oppervlakken groter zijn dan 50 tot 60 vierkante micron. Classificeer de microglia als gedeactiveerd als ze kleinere soma hebben.

Verifieer ten slotte het proces en controleer de vertakkingscomplexiteit in elke geactiveerde microgliacel door het somatische masker en de enkele XY-puntafbeelding over elkaar heen te leggen met een contrastverhoging van 50%. Het beschreven protocol werd gebruikt om microgliacellen over een groot gebied van de centrale retina te visualiseren. Bij jonge DBA 2J-muizen die heterozygoot CX3CR1-GFP tot expressie brengen, maakte de hoge celresolutie in combinatie met live-image drempelwaardeinstelling en morfometrische analyse de automatische segmentatie van individuele GFP-positieve cellen mogelijk, waardoor de cellen op basis van oppervlakte konden worden onderscheiden. DBA 2J-muizen modelleren chronisch glaucoom en werden maandelijks afgebeeld om de ontwikkeling van lokale microgliose en microglia-activatie te monitoren op leeftijden voorafgaand aan detecteerbare neurodegeneratie, in overeenstemming met de variabele progressie van neurodegeneratie in individuele ogen. Deze analyse onthulde veranderingen in de activatie van retinale microglia en microgliose in de loop van de tijd.

De analyse detecteerde ook dynamische veranderingen in de dichtheid van totale en geactiveerde microglia binnen individuele retina's. De populatiedichtheid van de microglia was niet gekoppeld aan veranderingen in de dichtheid van GFP-expresserende cellen, wat consistent is met andere bevindingen. Hierdoor zou CSLO-analyse kunnen worden gebruikt als een indicator voor vroege ziekteprogressie.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de verzadigingsniveaus van het fluorescentiebeeld van GFP-positieve microglia, gelokaliseerd in het binnenste netvlies, zorgvuldig moeten worden geoptimaliseerd; de reproduceerbaarheid van de CSLO-beelden van het centrale netvlies, evenals het consistente cellulaire detail dat in het centrale netvlies wordt gedetecteerd, hangen na de ontwikkeling kritisch af van deze stap. Dit live-imagingprotocol wordt in ons laboratorium toegepast om de potentiële link te onderzoeken tussen vroege veranderingen in microglia van het netvlies en de oogzenuwkop, en de latere progressie van glaucoom in DBA/2J en in andere modellen van chronische retinale degeneratie. Deze live-imagingstrategie kan mogelijk ook leiden tot vroege detectie van andere chronische pathologieën die eveneens gericht zijn op degeneratie van het netvlies en de oogzenuw, zoals multiple sclerose, de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson.