Name: In Vivo Dynamiek van retinale Microgliale Activering Tijdens Neurodegeneratie: Confocal oftalmoscopisch Imaging en Cell Morphometry in Mouse Glaucoom (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Leer de dynamiek van microglia in een muismodel van chronisch glaucoom met behulp van in vivo confocale ophthalmoscopie. Deze methode maakt niet-invasieve monitoring van celactivatie en morfologie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken het Scientific Computing and Imaging Institute van de Universiteit van Utah voor het gebruik van FluoRender software (R01GM09815). Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Glaucoma Research Foundation, Melsa M. en Frank Theodore Barr Foundation en het US National Institute of Health, (R01EY020878 en R01EY023621) aan M.L.V., en (R01EY017182 en R01EY017950) aan B.K.A.

In vivo beeldvorming wordt uitgevoerd in pathogeenvrije faciliteiten met protocollen door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Utah goedgekeurd. Opmerking: Deze imaging protocol wordt gebruikt voor reporter muizen die retinale microglia en infiltrerende monocyten / macrofagen tot expressie groen-fluorescerend eiwit (GFP) onder de controle van de fractalkine receptor locus (CX3CR1). 1. In vivo beeldvorming van het netvlies GFP + Microglia door Confocale Laser Scanning Ophthalmoscopie (cSLO) <ol><li> Zet het water gecontroleerd verwarmingssysteem, ingesteld om de muis temperatuur tussen 35-37 ºC te stabiliseren tijdens de procedure, en sluit twee verwarming pads. <ol><li> Start de confocale laser scanning oftalmoscoop (cSLO) systeem (Figuur 2A). Open het cSLO programma, voer de informatie die de individuele muis zal identificeren en stel een hoornvlies kromming van 2 mm (Patiëntgegevens menu). </li></ol></li><li> Bereid je voor op imaGing. Veilig te passen een schone 55º wide-field objectief op zijn socket. Bereid de oftalmoscoop imaging platform door het veiligstellen van een verwarmingselement bedekt met schoon papier. Gebruik clips om de pad en papier plat en houd ze uit het blokkeren van de beweging van het objectief. </li><li> Verdoven de muis door intraperitoneale injectie van 1,3% 2,2,2-tribroomethanol en 0,8% tert-amyl alcohol (250 mg / kg lichaamsgewicht; 0,5 ml / 25 g lichaamsgewicht) met een 30½ G naald bevestigd aan een 1 ml wegwerpbare syringe. Keer terug muis aan zijn kooi, hield meer dan een verwarmingselement. LET OP: De levering van de narcose door injectie versus inademing maakt gemakkelijker positionering van de muis voor de beeldvorming en onbelemmerde toegang tot de ogen, vrij van de neus kegels en slangen. </li><li> Zodra het dier stopt met bewegen en niet reageert op de staart knijpen, opwekken pupilverwijding met Tropicamide en fenylefrine (0,5% elk), door het plaatsen van het dier vatbaar en die beide ogen met de druppels van 7 min. </li><li> Na 5 min, pkant de muis gevoelig in het midden van de oftalmoscoop platform en fit contactlenzen boven de ogen, aanbrengen minimale druk. OPMERKING: Contactlenzen zijn klein en fragiel, maar kan voorzichtig met de vingers worden behandeld, hoewel tang plaats 40 kan worden gebruikt. Het gebruik van contactlenzen is optioneel, maar aanbevolen als het minimaliseert droge ogen en blijft transparantie van het hoornvlies tijdens de beeldvorming. </li><li> Na 7 min, oriënteren de muis met het rechteroog tegenover de objectieflens en de baan evenwijdig aan de objectieflens, waardoor het dier ongebreidelde nabij de rand van het platform (Figuur 2B). Om afbeeldingen van vergelijkbare verzadiging en oriëntatie verzamelen steeds bezorgd om de afstand tussen oog objectieflens, en de uitlijning van het oog om het lichtpad gedurende beeldvorming sessies. Clip lange snorharen interfereren met observatie van het oog. OPMERKING: Voor de volgende 8-10 min, zal de muis niet bewegen of knipperen, en zal de adem met zachte bewegingmenten, die worden gevolgd door de cSLO Eye Tracking ART (automatische real time) modus, die de scankop positie gebaseerd op fundus monumenten met een hoog contrast aanpast. Voorbij die tijd, beginnen muizen hijgen en te knipperen, waardoor beeldvorming onpraktisch. </li><li> Wanneer beeldvorming wordt uitgevoerd zonder contactlenzen toepassing PBS daalt tot beide ogen elke 2-3 min om uitdroging te voorkomen. </li><li> Verzamel een fundus beeld van het retinale vaatstelsel en de optische schijf, gericht op de binnenste retina. <ol><li> Selecteer de infrarood-mode (IR) en de instellingen aan te passen aan 820 nm excitatie, 100% laservermogen, 40-60% gevoeligheid (Figuur 2C). </li><li> Werken in high-speed modus (12,6 frame / sec), zoek het oog met behulp van de joystick naar de oftalmoscoop rijden. Bij lage vergroting, inspecteren het hoornvlies en lens voor letsel of ondoorzichtigheid, en sluiten van de studie ogen met gebreken of letsel dat zal invloed hebben op de beeldvorming van de retina (figuur 3A). </li><li> Zoek de optische schijf gebied (het oppervlak vande oogzenuw hoofd, ONH) door dichter bij het oog brengen van de doelstelling, dan centreren het beeld op en vergrendel deze positie door schroeven van de joystick. Deze afstemming van het oog om de oftalmoscoop is de sleutel tot het verkrijgen zelfs concentreren en emissie over het beeld. </li><li> Visualiseren inwendige vlakken van de retina, en het ONH, met de grote bloedvaten op het glasachtige oppervlak van het netvlies als referentie brandpuntsvlak (59 en 60 D), of dieper (55 D) in ogen tonen uitgegraven optic discs. De optimale nadruk moet oplossen circulerende bloedcellen binnen grote bloedvaten, met hun lumen en muren duidelijk onderscheiden. </li><li> Optimaliseer image verzadiging door het aanpassen van de knop op het touch screen bedieningspaneel, totdat een witte halo van uniforme verlichting overspant in het grootste deel van het gebied 55º fundus rond de optische schijf (met behulp van een lichte overbelichting). Vervolgens laat de verzadiging contrast optimaliseren totdat bloedcellen bewegen langs de grote bloedvaten duidelijk worden opgelost. Als brandpunt donkergebieden blijven bestaan, niet te wijten aan het netvlies schade, opnieuw uitlijnen het oog van de camera tot een uniform helder beeld wordt verkregen. Deze aanpassing is fundamenteel voor reproduceerbare sets van de beelden vast te leggen in de positie en de kwaliteit. </li><li> Verzamel een hoge-resolutie infraroodbeeld van de centrale retina (1,4-1,7 mm in diameter, afhankelijk van leeftijd), gemiddeld 30 frames direct (4,7 frames / sec, genormaliseerd), om signaal-ruisverhouding te verbeteren (figuur 2D ). </li></ol></li><li> Onmiddellijk een fluorescentiebeeld van GFP + microglia en / of infiltrerende monocyten gelokaliseerd in het binnenste vlakken van de retina en ONH verkrijgen. OPMERKING: Optimalisatie van de IR fundus beeld van de retina bepaalt de resolutie van het fluorescentiebeeld van GFP + cellen alsmede de omvang van binnenste retina overspannen. Als de inwendige vlakken van de retina, die kan worden gedetecteerd door slechte resolutie van het vaatstelsel gericht, resulteert in gedimd GFP + cellen views (figuur 3B). Het niet IR satu passenrantsoen correct en uniform beïnvloedt de fluorescentie afbeelding (FA), de invoering van artefactuele variaties in GFP + cellen intensiteit en omvang (figuur 3C). <ol><li> Swich naar imaging-modus (FA) fluorescentie in het touch screen panel, met blauw, 488 nm laser excitatie (460-490 nm barrière filter set), en overname-instellingen (100% laservermogen en 100-125% gevoeligheid), die worden gehandhaafd constante voor alle muizen (Figuur 2E). </li><li> Verzamel een enkele tweedimensionale fluorescentie beeld van het netvlies xy-punt, en het beeld van een fundus onmiddellijk vast te leggen op dezelfde positie (100x scan gemiddelde; 55º scan hoek voor beide beelden; figuur 2F). </li><li> Afbeelding van een multipoint vastleggen door het selecteren van &quot;composiet&quot; in het configuratiescherm (figuur 2G) en de oftalmoscoop rechts te verplaatsen en links, panning het netvlies over de neus-temporele as (figuur 2H). NB: Na het één xy-point scannen (100x skan gemiddeld), de software automatisch gemiddelden nieuwe scans van hetzelfde en nieuwe gebieden (omcirkeld met een groene cirkel tijdens optimale scan, of rood als de scan is onhaalbaar), en steken alle xy-posities in real time. De resulterende samengestelde beeld omvat 1,5-1,7 mm op de horizontale as x 3-4 mm in de verticale as (55 ° x 120-124º scanhoek). </li></ol></li><li> Compleet beeldvorming van elke muis binnen 15 minuten na het induceren van anesthesie, voordat knipperen en beweging opnieuw gestart. </li><li> Contactlenzen verwijderen, hydrateren ogen met PBS en de terugkeer van het dier aan zijn opgewarmd kooi, het controleren van het gedrag tot volledig herstel van de beweeglijkheid. </li><li> Longitudinale studies met intermitterende cSLO-beeldvorming sessies hetzelfde individu muis, herhaal beeldvorming niet minder dan 3 dagen na elkaar op de cumulatieve toxiciteit van anesthesie, alsmede hoornvliesirritatie voorkomen. </li></ol> 2. Levende Image Processing and Analysis <ol><li> Sequential beelduitlijning: <ol><li> Richtende fundus beelden voor een tijdreeks van hetzelfde oog met behulp van het vaatstelsel en de optische schijf als oriëntatiepunten. Open alle afbeeldingen in een commerciële dia-show-programma, door het slepen van elk beeld over de voorgaande totdat hun optische schijven af te stemmen op het XY vlak (de bovenste afbeelding verschijnt semi-transparant terwijl wordt gesleept) en draai de bovenste afbeelding tot zijn grote bloedvaten overlappen met het vaatstelsel op de afbeelding hieronder (focus op schepen verst van de optische disc). Noteer de draaihoek voor elk beeld en bewaar deze tijdreeksen voor toekomstig gebruik, het bijhouden van de muis en oog identiteit. </li><li> Lijn de corresponderende reeksen van één xy-point fluorescentiebeelden door toepassing van de geregistreerde hoek met de xy rotatie op elk tijdstip te corrigeren met een rasterafbeelding bewerkingsprogramma. Daarnaast passen resolutie tot 300 dpi (zonder herschalen) en achtergrond (in de RGB-modus, selecteer Levels en proeven van het lumen van een bloedvat zo zwart). Sla deze beeldenals TIF-bestanden, het toevoegen van &quot;afgestemd&quot; om hun namen. </li></ol></li><li> Microgliale cel segmentatie: <ol><li> Om GFP + cellen van het &quot;in lijn&quot; TIF-bestand die overeenkomt met het vroegste tijdstip / leeftijd te identificeren in de centrale retina, open in FluoRender. Zoomen op de afbeelding om het scherm te passen, hier de Render uitzicht (composiet, orthogonale, geïnterpoleerd) en de eigenschappen (0,58 gamma, 255 verzadigingspunt, 255 luminantie, 195 alpha en 1,00 arcering), het selecteren van zowel de RG kanalen als zichtbare (verberg B-kanaal door erop te dubbelklikken in de werkruimte beeld; Figuur 4A). </li><li> Om individuele cellen, drempel het rode kanaal (moet worden gemarkeerd op de Workspace kader), door het verhogen van de lage drempel tot de meerderheid van de cellen worden gemaskeerd (wit) met minimale overlap en celprocessen (cyaan), terwijl de hoge drempel constante (255). De lage drempelwaarde varieert tussen 100 en 170, afhankelijk van de fluorescentie-intensiteit (Figuur 4B &lt;/ Strong&gt;). </li><li> Sla deze visie met de rode kanaal alleen zichtbaar (Capture commando) als nieuwe TIF-bestand, het toevoegen van &quot;cellsegm&quot; naar de oorspronkelijke naam (Figuur 4C). Met behulp van een generisch raster grafische editor software, omkeren zijn grijstinten en passen resolutie tot 300 dpi, zoals hierboven, en opnieuw opslaan als RGB (figuur 4D). OPMERKING: Verwijder de mappen (projecten) automatisch door FluoRender, en sla de toegepaste drempel voor toekomstig gebruik. </li></ol></li><li> Microgliale soma segmentatie en morfometrie: <ol><li> Om GFP + cellen somata identificeren stippellijn kwantificering gebruik beeldanalyse software geautomatiseerde intensiteitmetingen en drempelwaarde mogelijkheden en drempelwaarde gebaseerde object tellen en meten. Open het &quot;cellsegm&quot; TIF-bestand en selecteer de herschalen methode (spline) en het rode kanaal (klik rode tab in RGB). Verbeter de visualisatie door de selectie &quot;view channel in kleur&quot; (klik met de rechtermuisknop op de rode RGTab B), en &quot;vullen kleuren&quot; te selecteren (Image / Beeld Aanpassen) aan de grijstinten te keren en bekijk de cellen in grijs / zwart op een witte achtergrond (figuur 4E). </li><li> IJk het beeld om 1,4-1,7 mm, afhankelijk van de leeftijd, door het tekenen van een horizontale lijn over het hele beeld (Calibration, Quick Calibration). </li><li> Segment individuele cel somata door toepassing intensiteit drempelwaarde (figuur 4B). Voor deze, het werk op de rode RGB-kanaal en open het Threshold Intensity functie (Object Graaf; selecteren &quot;count-update&quot; commando) om tweedimensionale parameters voor elk thresholded regio van belang (ROI) bijhouden vertegenwoordigen individuele somata. </li><li> Definieer de intensiteitsdrempel in het histogram, door het selecteren van de laagste 50-60% van de 255 niveaus en verfijnen van de uiteindelijke drempelwaarde door visuele evaluatie van de overlap tussen de drempel kleurenmasker (blauw) en de cel soma perimeter (grijs) in individuele cellen (FIGUUR 4E). </li><li> Schat de juistheid van de cel soma maskers om de Somal dimensies vertegenwoordigen door het meten van het gebied voor en na de segmentatie in 10 cellen en accepteer de geselecteerde drempel bereik als de metingen verschillen minder dan 10% (gebruik de Binary Toolbar en Geannoteerde Metingen). </li><li> Handmatig identificeren Somal ROI die meerdere cellen omvatten en scheiden deze elementen (elimineren of afzonderlijke ROI met behulp van de Binary Toolbar controls, of Object Catalog), terwijl het schakelen aan / uit de binaire direct visualiseren de cellen (Figuur 4F). </li><li> Classificeren microgliacellen als ROI met Somal gebieden groter en kleiner dan 50-60 micrometer 2 naar cel somata discrimineren overeenkomt met geactiveerde microglia en gedeactiveerd microglia respectievelijk door het gebruik van Area Beperking. Opmerking: Elke cel Somal subset geïdentificeerd met een ander pseudocolored binaire laag, en kan verder worden gekarakteriseerd voor andere morfologische parameters (perimeter, circulariteit, etc.), en gekwantificeerd bij discrete retina sectoren (Figuur 4G). Sla de geanalyseerde afbeelding als een ND2 bestand. </li><li> Controleer het proces en de vertakking complexiteit in individuele geactiveerde microglia cellen, door overlappen de Somal masker en de single xy afbeelding -punt (contrast steeg 50%; figuur 4H). Handmatig tellen van de processen die direct uitstrekt vanaf de cel soma of de diameter van de veelhoek omvat het gereedschap (gebruik Binary werkbalk en geannoteerde metingen). OPMERKING: Geactiveerde cellen missen processen of dragen weinig (&lt;4) en korte (&lt;2x Somal diameter) die, in tegenstelling tot niet-geactiveerde celprocessen, die een vertakte en uitgebreide arbor omvatten (&gt; 3-10x Somal diameter) rond hun betrekkelijk kleine soma. </li><li> Handmatig cellen herkennen somata kleiner dan &lt;20 urn 2 en / of GFP expressie onder de detectielimiet, die derhalve door onopgemerkt intensity drempelen. Gebruik de Taxonomie commando in Annotations handmatig geïdentificeerd elementen tellen. </li></ol></li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Live bewaking van microgliale celaantal en morfologische activatie bij een neurodegeneratieve ziekte vereist het gebruik van niet-invasieve beeldvorming methoden dat de gedetailleerde visualisatie van cel functies mogelijk. Na beeldvorming, moet microgliale cellen worden geïsoleerd (gesegmenteerd) voor morfometrische analyse met gebruik van meervoudige drempel stappen Somal grootte en / of complexiteit van het proces als uitlezingen voor microglia activatie beoordelen. In dit protocol beschrijven we methoden voor livebe...

Microglia vormen neuroimmune cellen die uitsluitend bevinden in het centrale zenuwstelsel (CNS) sinds de vroege embryonale ontwikkeling en de volwassen leeftijd. Voorzien van een complex repertoire receptoren, microgliale activiteit en regionale heterogeniteit worden geregeld door de bidirectionele interactie met aangrenzende neuronen, glia, bloed-hersenbarrière en infiltrerende cellen neuroinflammatory 1,2. Basale microglia functies bijdragen aan fysiologische onderhoud en reparatie, omdat ze proeven op hun grondgebied voor verstoringen in de homeostase 3,4. Tijdens CNS verwonding of ziekte, microglia zijn de first responders om neuronale signalen die vervolgens leiden tot de overgang naar een reactieve fenotype, aangeduid als &quot;geactiveerde microglia 2,5-7. Microglia-activatie gaat om een ingewikkelde cyclus van gen en eiwit expressie, die gekoppeld zijn aan de cel soma en proces resizen en remodeling 6-9. Microglia activatie, alsook cellen Redistributieclustering kan vergezeld de plaatselijke totale stijging van het aantal cellen (genoemd microgliosis). Dit kan het gevolg zijn van celproliferatie en zelfvernieuwing, al dan niet rekrutering van bloed monocyten 3,4,7,10-14. In een breed scala van leeftijdsafhankelijke, chronische CNS ziekten, aanhoudende microgliose en microglia-activatie parallel progressie van de ziekte 15-19. Hoe microglia invloed neurodegeneratie blijft onduidelijk, vooral omdat ze allebei neurobeschermend en schadelijke rollen die diverse bijdragen aan de ziekte ontstaan ​​en de progressie kan hebben afgespeeld. Live-imaging studies gericht op het begrijpen chronische ziekte CNS hebben microglia gedrag in de beschadigde CNS diermodellen en mensen gecontroleerd en aangetoond dat microglia wijzigingen zijn detecteerbaar begin in de vroege stadia van de ziekte 15-17,19,20. Het is dus essentieel om benaderingen te sporen en te controleren microgliale activering in vivo ontwikkelen. Niet-invasieve detectie van de regionale veranderingen in de hersenen microglia activering werd opgericht als een belangrijke in vivo indicator van neurodegeneratieve progressie van de ziekte, met behulp van moleculaire beeldvorming of bioluminescentie en positron emissie tomografie of magnetische resonantie beeldvorming 18,21,22. Deze zeer kwantitatieve en non-invasieve moleculaire en nucleaire beeldvorming opsporen gliosis regionale oplossing. Als alternatief, twee-foton confocale beeldvorming in CX3CR1 GFP / + muizen kon de observatie van de hersenen microglia met cellulaire resolutie 3,4,9,20,23-28. Deze benadering beperkt langdurige en herhaalde observatie van chronische microgliale veranderingen, daar het gevaar bestaat van hun gedrag verstoren door ten minste minimaal invasieve brain imaging procedures 29. Als alternatief, het netvlies biedt optimale omstandigheden voor directe, in vivo visualisatie en herhaalde controle van microglia in hun intact CNS niche gedurende veroudering, na acuut letsel, eneventueel tijdens chronische neurodegeneratieve aandoeningen. Zo hebben recente onderzoeken de haalbaarheid van een hoge-resolutie beeldvorming van het netvlies microglia die GFP bewezen door het aanpassen van de confocale laser scanning oftalmoscopie (cSLO) naar het live-CX3CR1 GFP / + muizen. Deze is gebruikt om wekelijks veranderingen in GFP + celaantallen in individuele muizen gedurende maximaal 10 weken volgen na acuut geïnduceerd letsel of oculaire hypertensie 30-36. We hebben deze benadering uitgebreid tot langdurige imaging voeren gedurende enkele maanden, en kwantitatief veranderingen in microglia activatie basis van soma size middels morfometrische analyse volgen. Somal grootte werd gedefinieerd als nuttige metriek van microglia activatie in levende imaging studies met behulp van twee-foton confocale microscopie in corticale schijfjes te functioneren in vivo beeldvorming van CX3CR1-GFP + microglia 9. Deze en andere studies toonden ook het verband tussen Somal shape and Iba1 niveaus van eiwitexpressie, which verhoogt ook activatie 9,37. Aldus kan geactiveerde microglia worden geïdentificeerd levende muizen, en hun aantal en verdeling in de tijd gevolgd bij CNS gezondheid en ziekte. Dit protocol beschrijft werkwijzen voor cSLO levende beeldacquisitie en analyse microgliale cel aantallen, distributie en morfologische activatie tijdens retinale ganglioncellen (RGC) degeneratie (figuur 1) bewaken. Aldus is deze studie gebruikt: 1) een muismodel van erfelijke glaucoom (DBA / 2J) die leeftijdsafhankelijke oogzenuw en netvlies neurodegeneratie en ondergaat toont opmerkelijke variatie in ziekteprogressie tussen 5 en 10 maanden 38,39, 2) maandelijkse cSLO in vivo imaging voor langdurige visualisatie van GFP + cellen in de retina en optische zenuw ongemyelineerde heterozygote CX3CR1 GFP / + DBA / 2J muizen 3-5 maanden, 3) levende beeldanalyse door het segmenteren en drempelwaarden naar cel somata en meten isoleren leeftijd deir gebied. Deze strategieën zijn toegepast om de kinetiek van retinale microgliale activatie toestanden beoordelen tijdens de vroege stadia van chronisch glaucoom.

<table><tbody><tr><td>DBA/2J en CX3CR1-GFP/+ muizen</td><td>The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td><td>000671 en 00582</td><td>Muizen worden in huis gefokt, waarbij elke 3 - 4 generaties nieuwe fokkers worden geïntroduceerd om genetische drift te voorkomen.</td></tr><tr><td>30&frac12; G naald en 1 ml tuberculine slip-tip spuit</td><td>BD, East Rutherford, NJ</td><td>305106 en 309659</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% en fosfaatbufferzouwtabletten</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>T48402, 152463 en P4417</td><td>Avertin-oplossing (pH 7.3, steriel gefilterd) moet vers worden gemaakt of maximaal 1 week bij 4 &deg;C worden bewaard.</td></tr><tr><td>Heat therapy T/Pump</td><td>Gaymar Industries, Orchard Park, NY</td><td>TP-650</td><td></td></tr><tr><td>Wattenstaafjes</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>23-400-100</td><td></td></tr><tr><td>Tropicamide 1%</td><td>Bausch &amp; Lomb, Rochester, NY</td><td>NDC 24208-585-64</td><td></td></tr><tr><td>PMMA contactlenzen, 1.70 base curve, 3.2 mm totale diameter, 0.40 mm dikke centrum</td><td>Cantor &amp; Nissel Ltd., Northamptonshire, UK</td><td>G003709</td><td>Lenzen worden gespoeld met steriel PBS en bewaard in polypropyleendozen.</td></tr><tr><td>HRA/Spectralis confocale scanlaser oogspiegel en Eye Explorer software</td><td>Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA</td><td>Versie 1.7.1.0</td><td></td></tr><tr><td>PowerPoint</td><td>Microsoft, Redmond, WA</td><td>Versie 14.4.3</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe, San Jose, CA</td><td>Versie CS3</td><td></td></tr><tr><td>FluoRender</td><td>Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah</td><td>Versie 2.13</td><td>Freeware. <a href="http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html" target="_blank">http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html</a></td></tr><tr><td>NIS-Elements C</td><td>Nikon, Melville, NY</td><td>Versie 4.30.01</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo dynamiek van retinale microgliale activering tijdens neurodegeneratie: confocal oftalmoscopisch imaging en cell morphometry in mouse glaucoom

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Microglia, die CNS-resident neuro-cellen zijn, te transformeren van hun morfologie en grootte in reactie op de CNS-letsel, schakelen naar een geactiveerde staat met verschillende functies en genexpressie profielen. De rollen van microgliale activering in gezondheid, verwondingen en ziekten blijven onvolledig begrepen vanwege hun dynamische en complexe regulering in reactie op veranderingen in hun micromilieu. Het is dus essentieel om niet-invasief bewaken en veranderingen in microgliale activering tijd in het intacte organisme te analyseren. In vivo studies van microglia activering zijn vertraagd door technische beperkingen aan het volgen van microglia gedrag zonder dat de CNS milieu. Dit is bijzonder moeilijk geweest tijdens chronische neurodegeneratie, waar de veranderingen op lange termijn moet worden gevolgd. Het netvlies is een CNS orgaan vatbaar is voor non-invasieve beeldvorming levende, een krachtig systeem te visualiseren en de dynamiek van microglia activatie karakteriseren tijdens chronische aandoeningen. in vivo beeldvorming van retinale microglia, via confocale oftalmoscopie (cSLO) en CX3CR1 GFP / + reporter muizen te microglia met cellulaire resolutie te visualiseren. Ook beschrijven we methoden om de maandelijkse veranderingen in cel activatie en dichtheid in grote cel subsets (200-300 cellen per netvlies) te kwantificeren. Wij bevestigen het gebruik van Somal gebied als een nuttige metrische live volgen van microgliale activering in het netvlies door het toepassen van geautomatiseerde-drempel op basis van morfometrische analyse van in vivo afbeeldingen. Wij gebruiken deze live image registratie en verwerking strategieën om de dynamische veranderingen in microgliale activering en microgliose volgen tijdens de vroege stadia van retinale neurodegeneratie in een muizenmodel van chronische glaucoom. Deze benadering is handig voor de bijdragen van microglia neuronale en axonale afname van chronische CNS aandoeningen die de retina en optische zenuw invloed te onderzoeken.

Onze recente in vivo studies gebruikten deze levende beeldacquisitie en analysemethoden te visualiseren en volgen de kinetiek en patronen van ONH en retinale microgliale veranderingen tijdens vroege stadia van chronisch glaucoom en hun relatie tot eind neurodegeneratie 59. Hier tonen we een cSLO beeldacquisitie protocol microgliale cellen te visualiseren over een groot gebied van de centrale retina individuele jonge heterozygote CX3CR1-GFP DBA / 2J retina (Figuur 5). Op basis van de ...

Microglia-activatie en microgliose zijn de belangrijkste reacties op chronische neurodegeneratie. Hier presenteren we werkwijzen voor in vivo visualisatietechnieken retinale CX3CR1-GFP + cellen door microgliale confocale Ophthalmoscopie, en drempel en morfometrische analyses worden geïdentificeerd en gekwantificeerd hun activering. We monitoren microglia veranderingen tijdens de vroege stadia van leeftijdsgebonden glaucoom.

In Vivo Dynamiek van retinale Microgliale Activering Tijdens Neurodegeneratie: Confocal oftalmoscopisch Imaging en Cell Morphometry in Mouse Glaucoom

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de microgliadynamiek in een muismodel van chronisch glaucoom te karakteriseren middels in vivo confocale beeldvorming van het netvlies. Dit wordt bereikt door niet-invasieve maandelijkse confocale oftalmoscopie of CSLO om de fluorescerende microglia op het netvlies en de papil van de oogzenuw te visualiseren. Live-beeldanalyse met behulp van drempelwaarde-gebaseerde segmentatie van het cellichaam (SOMA) en morpho kwantificeert veranderingen in het aantal microgliacellen en de activatie.De resultaten tonen aan dat maandelijkse CSLO-beeldvorming in levende muizen kan worden gebruikt om de kinetiek van de distributie van de microgliaceldichtheid en de morfologische activatie te monitoren tijdens de vroege progressie van chronische neurodegeneratie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals tweefoton confocale beeldvorming van GFP-positieve microglia in het muizenbrein, is dat CSLO-beeldvorming van het netvlies directe observatie en monitoring van microgliacellen mogelijk maakt gedurende de progressie van neurodegeneratieve aandoeningen door veroudering in het intacte organisme. Ik kreeg voor het eerst het idee voor deze methode nadat we ex vivo hadden aangetoond dat microglia een intense activatie en clustering vertoonden in het centrale deel van jonge DBA/2J-muizen op leeftijden die voorafgingen aan detecteerbare neurodegeneratie.Om vast te stellen of deze vroege aangeboren immuunveranderingen die voorafgingen aan detecteerbaar glaucoom de neurodegeneratie veroorzaakten, moesten we een in vivo-aanpak ontwikkelen om microglia-veranderingen te volgen. Caesar Romero, een technicus in mijn laboratorium, zal de procedure voor live-beeldacquisitie demonstreren. Start ter voorbereiding het CSLO-systeem en voer de sessie-informatie in. Bereid vervolgens de beeldvorming veilig voor.Bevestig een schone 55 graden groothoekobjectieflens. Plaats twee minuten na toediening van het anestheticum een muis op het beeldplatform en verwijd beide pupillen met mydriatische druppels. Bevestig vijf minuten later of de muis is geanestheseerd.Bedek vervolgens elk oog met contactlenzen door minimale druk uit te oefenen. Positioneer de muis zodanig dat het rechteroog het objectief raakt en de oogkas parallel aan de lens staat. Het dier hoeft niet gefixeerd te worden, maar moet op een constante afstand van het objectief worden gehouden.Terwijl het oog gedurende de volgende 10 tot 15 minuten is uitgelijnd, zal de muis niet bewegen of knipperen terwijl de oogbewegingen worden gevolgd door het CSLO live-imaging-systeem. Start de imaging-sessie door een fundusbeeld van het binnenste netvlies te verzamelen. Hiervoor.Selecteer de infraroodmodus, die overeenkomt met een excitatiegolflengte van 820 nanometer. Stel vervolgens het laservermogen in op 100% en de gevoeligheid op een waarde tussen 40 en 60%. Lokaliseer daarna, door snel te werken, het oog met behulp van de joystick om de oftalmoscoop te oriënteren en bereid u voor om een fundusbeeld van de optische schijf en de retinaire vasculatuur vast te leggen. Inspecteer het hoornvlies en de lens op letsel of troebeling.Sluit ogen uit van de studie die defecten of letsels vertonen die de beeldverwerving kunnen beïnvloeden. Breng nu het objectief dichter bij het oog om het gebied van de papil te lokaliseren, wat het oppervlak van de kop van de oogzenuw of ONH is. Centreer vervolgens het beeld op de ONH.Het correct positioneren van de ONH is essentieel voor het verkrijgen van een gelijkmatige focus en emissie over het gehele beeld. De volgende stap is het visualiseren van de binnenste lagen van het netvlies, evenals de ONH. Gebruik voor een referentiebrandvlak de grote bloedvaten die zich op het vitreale oppervlak van het netvlies bevinden, wat overeenkomt met 59 en 60 dioptrieën, of zelfs dieper bij 55 dioptrieën in uitgeholde gebieden van de oogzenuwschijf.Pas vervolgens de verzadiging van het beeld aan met de knop op het touchpaneel, totdat een witte halo van verlichting het grootste deel van het fundus rond de optische disc beslaat. Selecteer daarna de lagere verzadiging die een uniforme halo oplevert, wat duidt op een optimaal contrast voor dat oog. Het kan nodig zijn om de camera opnieuw uit te lijnen als er donkere gebieden blijven bestaan.Veramel nu een fundusbeeld met hoge resolutie van het centrale netvlies door 30 in real-time opgenomen frames te middelen om de signaal-ruisverhouding te verbeteren. Dit komt overeen met 4,7 frames per seconde, onmiddellijk genormaliseerd en op dezelfde positie voorbereid om een fluorescentiebeeld van de GFP-positieve cellen vast te leggen. Schakel op het touchscreenpaneel over naar de fluorescentiebeeldvormingsmodus, waarmee de blauwe laser met 488 nanometer laser-excitatie en een barrièrefilterset van 460 tot 490 nanometer wordt geselecteerd, en stel de acquisitie in op 100% laservermogen en 100 tot 125% gevoeligheid.Maak nu een enkel tweedimensionaal fluorescentiebeeld van het XY-punt van de ONH door 100 x scans te middelen. Leg vervolgens een meerpuntig beeld van het netvlies rond de ONH vast; selecteer 'composite' in het bedieningspaneel en pan vervolgens met de oftalmoscoop over de nasaal-temporale as. De software middelt automatisch de nieuw gescande gebieden en voegt deze in real-time samen.Als de beeldkwaliteit van delen van het netvlies onvoldoende is om middeling toe te staan, wordt de groene cirkel die het gescande gebied identificeert rood. Het resulterende samengestelde beeld beslaat een gebied tot 1,7 bij vier millimeter. Tijdens de acquisitie van het samengestelde beeld dient men voorzichtig te zijn.Beelden met een hoge resolutie kunnen verloren gaan wanneer het objectief te snel wordt bewogen voordat het middelen van de scan en het samenvoegen van de beelden (image stitching) zijn voltooid. Wanneer de anesthesie begint uit te werken, moet de beeldsessie worden beëindigd omdat de muis zwaar begint te ademen en beeldvorming onuitvoerbaar wordt. Begin met het sequentieel uitlijnen van de fundusbeelden voor een tijdreeks, waarbij de vasculatuur en de optische schijf als oriëntatiepunten worden gebruikt.Lijn met behulp van conventionele beeldbewerkingssoftware alle afbeeldingen uit totdat hun O hs overlappen. De bovenste afbeelding wordt semi-transparant weergegeven tijdens het slepen. Roteer vervolgens elke afbeelding in de sequentie totdat de belangrijkste bloedvaten overlappen met de vasculatuur op de vorige afbeelding en sla de opstelling op voor toekomstig gebruik.Noteer de gecorrigeerde hoek voor elke afbeelding en pas deze toe op de corresponderende enkelvoudige XY-punt fluorescentieafbeelding. Het is nu mogelijk om individuele GFP-positieve microgliacellen in de centrale retina te identificeren door de uitgelijnde TIFF-bestanden te openen in Fluor render. Om alle cellen te visualiseren, vult u het scherm met de afbeelding en stelt u de renderweergave in op 'composite orthogonal' en 'interpolated'.Definieer vervolgens de eigenschappen 0,58 gamma, 255 verzadigingspunt, 255 luminantie en 195 alpha bij 1,00 schaduwing. Voltooi de selecties door beide RG-kanalen als zichtbaar te markeren. Verberg het B-kanaal door erop dubbel te klikken in het werkveld om individuele cellen te segmenteren.Selecteer het rode kanaal en pas drempelwaarde-segmentatie toe door de lage drempelwaarde te verhogen totdat de meeste cellen zijn gemaskeerd met minimale overlap en celuitlopers zijn uitgesloten, terwijl de hoge drempelwaarde constant wordt gehouden. Sla ten slotte het bestand met de gemaskeerde cellen op met het capture-commando. Open de afbeelding met de gemaskeerde cellen vervolgens in de rastergrafische editor.Inverteer de grijswaarden voor directe observatie en stel de resolutie in op 300 DPI of hoger. De RGB-afbeelding wordt opgeslagen als een TIF-bestand. De volgende stap van de live-beeldanalyse betreft de microglia, waarbij segmentatie en morpho worden gebruikt om SATA te identificeren voor area-kwantificatie.Gebruik software die in staat is tot intensiteitsmetingen en objecttelling op basis van een drempelwaarde. Open het TIFF-bestand met gesegmenteerde cellen en selecteer spline-rescaling voor maximale resolutie en het rode kanaal als zwart-wit voor een betere visualisatie. Kalibreer vervolgens de afbeelding door de horizontale diameter te definiëren als 1,4 tot 1,7 millimeter, afhankelijk van de leeftijd, om individuele cellen te segmenteren.Pas vervolgens intensiteitsdrempeling toe op het rode kanaal. Open de functie voor drempelintensiteit onder het commando voor objecttelling en accountbijwerking. Gebruik deze functie om tweedimensionale parameters bij te houden voor elke drempelwaarde van het regio van interesse die een individu vertegenwoordigt.Definieer vervolgens de intensiteitsdrempel in het intensiteitshistogram. Selecteer de laagste 50 tot 60% van de 255 niveaus en verfijn de uiteindelijke drempelwaarde van de individuele cellen. Beoordeel visueel de overlap tussen het blauwe drempelkleurmasker en de grijze omtrek van het cellichaam met behulp van de bedieningselementen in de binaire werkbalk of de objectcatalogus.Identificeer handmatig somale regio's van belang met meerdere cellen. Scheid deze elementen door de regio's van belang te isoleren. Gebruik hierbij de schakelaar om de cellen nu direct te visualiseren door middel van gebiedsbeperking.Classificeer microgliacellen als geactiveerd als hun soma-oppervlakken groter zijn dan 50 tot 60 vierkante micron. Classificeer de microglia als gedeactiveerd als ze kleinere soma hebben.Verifieer ten slotte het proces en controleer de vertakkingscomplexiteit in elke geactiveerde microgliacel door het somatische masker en de enkele XY-puntafbeelding over elkaar heen te leggen met een contrastverhoging van 50%. Het beschreven protocol werd gebruikt om microgliacellen over een groot gebied van de centrale retina te visualiseren. Bij jonge DBA 2J-muizen die heterozygoot CX3CR1-GFP tot expressie brengen, maakte de hoge celresolutie in combinatie met live-image drempelwaardeinstelling en morfometrische analyse de automatische segmentatie van individuele GFP-positieve cellen mogelijk, waardoor de cellen op basis van oppervlakte konden worden onderscheiden. DBA 2J-muizen modelleren chronisch glaucoom en werden maandelijks afgebeeld om de ontwikkeling van lokale microgliose en microglia-activatie te monitoren op leeftijden voorafgaand aan detecteerbare neurodegeneratie, in overeenstemming met de variabele progressie van neurodegeneratie in individuele ogen. Deze analyse onthulde veranderingen in de activatie van retinale microglia en microgliose in de loop van de tijd.De analyse detecteerde ook dynamische veranderingen in de dichtheid van totale en geactiveerde microglia binnen individuele retina's. De populatiedichtheid van de microglia was niet gekoppeld aan veranderingen in de dichtheid van GFP-expresserende cellen, wat consistent is met andere bevindingen. Hierdoor zou CSLO-analyse kunnen worden gebruikt als een indicator voor vroege ziekteprogressie.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de verzadigingsniveaus van het fluorescentiebeeld van GFP-positieve microglia, gelokaliseerd in het binnenste netvlies, zorgvuldig moeten worden geoptimaliseerd; de reproduceerbaarheid van de CSLO-beelden van het centrale netvlies, evenals het consistente cellulaire detail dat in het centrale netvlies wordt gedetecteerd, hangen na de ontwikkeling kritisch af van deze stap. Dit live-imagingprotocol wordt in ons laboratorium toegepast om de potentiële link te onderzoeken tussen vroege veranderingen in microglia van het netvlies en de oogzenuwkop, en de latere progressie van glaucoom in DBA/2J en in andere modellen van chronische retinale degeneratie. Deze live-imagingstrategie kan mogelijk ook leiden tot vroege detectie van andere chronische pathologieën die eveneens gericht zijn op degeneratie van het netvlies en de oogzenuw, zoals multiple sclerose, de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson.

in-vivo-dynamics-retinal-microglial-activation-during

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Source: Bosco, A., et al. In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma. J. Vis. Exp. (2015) This video demonstrates in vivo imaging of retinal microglia in a mouse model of glaucoma. A transgenic mouse with fluorescent protein-expressing retinal microglia is positioned under an ophthalmoscope. Infrared illumination is used to locate the optic nerve head (ONH), and the focal plane is...

In Vivo Imaging of Retinal Microglia in a Mouse Model of Glaucoma

Chronische oculaire hypertensie wordt opgewekt met behulp van laserfotocoagulatie van de trabekelnetwerk in muis ogen. De intraoculaire druk (IOP) wordt verhoogd tot verscheidene maanden na laserbehandeling. De daling van de gezichtsscherpte en contrastgevoeligheid proefdieren worden gecontroleerd met behulp van de optomotor-test.

Een laser-induced Mouse Model van chronische oculaire hypertensie aan Visual Gebreken karakteriseren

Deze video illustreert een methode, met behulp van een klinische 3 T scanner, voor contrast-versterkte MRI van de naïeve muis visuele projectie en voor herhaalde en longitudinale in vivo studies van de oogzenuw degeneratie geassocieerd met acute oogzenuw verpletteren letsel en chronische oogzenuw degeneratie in knock-out muizen (p50 KO).

In vivo beeldvorming van Optic Nerve Fiber Integrity by-Contrast Enhanced MRI in Muizen

Hier presenteren we een protocol om intraoculaire drukverhoging te induceren in het muizen oog dat resulteert in het verlies van retinale ganglioncellen zoals waargenomen in glaucoom. Magnetische microkralen worden geïnjecteerd in de voorste kamer en aangetrokken door de iridocorneale hoek met een magneet om de uitstroom van waterige humor te blokkeren.

Een Magnetic Microbead occlusie Model voor het induceren van oculaire hypertensie-Dependent Glaucoom in Muizen

Dit protocol beschrijft hoe hoge resolutie beeldvormende technieken zoals spectrale domein optische coherentie tomografie en scannen van laser ophthalmoscopy kan worden gebruikt in kleine knaagdieren, met behulp van een oogheelkundige imaging platform systeem, om informatie te verkrijgen over netvlies dikte en microglial cel distributie, respectievelijk.

In Vivo Beeldvorming van Cx3cr1gfp/gfp Reporter muizen met spectrale domein optische coherentie tomografie en scannen Laser Ophthalmoscopy

In vivo beeldvorming is een krachtig hulpmiddel voor de studie van biologie in gezondheid en ziekte. Dit protocol beschrijft transpupillaire beeldvorming van het netvlies van de muis met een standaard microscoop met twee fotonen. Het demonstreert ook verschillende in vivoimaging-methoden om fluorescerend meerdere cellulaire cohorten van het netvlies te labelen.

Transpupillaire twee-fotonen in vivo beeldvorming van het netvlies van de muis

Hier beschrijven we een protocol dat adeno-geassocieerde virusinjectie combineert met craniale raamimplantatie voor gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamiek en neuronale activiteit bij wakkere muizen.

Gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamica en neuronale activiteit bij wakkere muizen

Het huidige protocol schetst de stappen voor het in vivo uitlijnen van optische coherentietomografie-vezelgrafiebeelden (vis-OCTF) in vivo met ex vivo confocale beelden van hetzelfde netvlies van muizen met het oog op het verifiëren van de waargenomen morfologie van de axonbundel van retinale ganglioncellen in de in vivo beelden.

Uitlijning van optische coherentietomografievezelgrammen in zichtbaar licht met confocale beelden van hetzelfde netvlies van de muis

Dit artikel demonstreert een methode om microglia-motiliteit en contact met postsynaptische puncta in het netvlies te visualiseren en te kwantificeren met behulp van spinning disk confocale microscopie.

Live beeldvorming en karakterisering van microglia-dynamica en interacties met synapsen in een zieke muisnetvlies

Hier bieden we een gedetailleerde methodologie voor het isoleren van het netvlies van het oog van de muis voor uitgebreide ex vivo experimenten. Dit protocol benadrukt het toegankelijk maken van deze technisch veeleisende benadering voor onderzoekers die willen profiteren van de onderzoeksmogelijkheden die worden geboden door retinale glia in situ te houden in levend weefsel.

Een ex vivo explantatiemodel voor het bestuderen van gliale interacties in het netvlies van de muis

Leer de dynamiek van microglia in een muismodel van chronisch glaucoom met behulp van in vivo confocale ophthalmoscopie. Deze methode maakt niet-invasieve monitoring van celactivatie en morfologie mogelijk.

In Vivo Dynamiek van retinale Microgliale Activering Tijdens Neurodegeneratie: Confocal oftalmoscopisch Imaging en Cell Morphometry in Mouse Glaucoom (Video) | JoVE Journal

In Vivo Dynamiek van retinale Microgliale Activering Tijdens Neurodegeneratie: Confocal oftalmoscopisch Imaging en Cell Morphometry in Mouse Glaucoom

Meer video's verkennen