Isolatie van neurale stamcellen / stamcellen uit de periventriculaire regio van de volwassen rat en Human Spinal Cord

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van neurale stamcellen uit de paraventriculaire regio van het ruggenmerg van een volwassen rat of mens. Dit wordt bereikt door eerst het ruggenmerg te winnen via een laminectomie. De tweede stap is om het ruggenmerg transversaal in segmenten van één centimeter te snijden en de paraventriculaire regio uit elk segment van het ruggenmerg te dissekeren.

Vervolgens wordt het fijngehakte weefsel in stukjes van één millimeter gesneden en daarna enzymatisch gedissocieerd. De laatste stap is het scheiden van intacte cellen door centrifugatie via een discontinu dichtheidsgradiënt en het uitplaten van de celsuspensie. Uiteindelijk kunnen de vorming van neurosferen en de groei van neurale stamcellen worden geëvalueerd met behulp van immunofluorescentiemicroscopie.

Vandaag ga ik demonstreren hoe neurale stamcellen kunnen worden geïsoleerd uit de paraventriculaire regio van het ruggenmerg van de volwassen rat. Deze cellen kunnen vervolgens worden gebruikt om cruciale vragen binnen het vakgebied van neurale stamcellen te beantwoorden, zoals welke exogene factoren lijnbeperking bevorderen of hoe deze cellen reageren op verschillende stimuli of stress. Begin met het voorbereiden van de kweek, de media en de dissectiebuffers zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.

Steriliseer vervolgens de huid van de rat na een overdosis anestheticum en gebruik een grote dissectieschaar om het dorsale oppervlak te verwijderen, zodat de wervelkolom bloot komt te liggen. Houd de dissectieschaar loodrecht en dwars op het dorsale oppervlak. Snijd de wervelkolom boven de achterpoten door.

Gebruik vervolgens een kleinere schaar om de dorsale spier boven de wervelkolom in rostrale richting longitudinaal door te snijden om de doornuitsteeksels bloot te leggen, beginnend bij het blootgestelde uiteinde van de coddle. Voer een klein, stomp botknipinstrument extraoraal in in het laterale aspect van het spinale kanaal, in de ruimte tussen het ruggenmerg en de wervelkolom. Plaats het blad ondiep en parallel aan het ruggenmerg.

Maak vervolgens kleine sneetjes in de lamina en pel de lamina voorzichtig af om het ruggenmerg bloot te leggen. Deze hoek voorkomt beschadiging van het onderliggende ruggenmerg. Ga verder met het verwijderen van de lamina in rostrale richting.

Om het thoracale en cervicale ruggenmerg bloot te leggen, tilt u het ruggenmerg voorzichtig met stompe weefselpincetten op uit de wervelkolom en knipt u de wortels door met microschaaren. Om het merg vrij te maken, plaatst u het uitgenomen ruggenmerg in een petrischaal met ijskoude, steriele dissectiebuffer voor ratten. Spoel het weefsel met de ijskoude dissectiebuffer en gebruik een schaar om het ruggenmerg transversaal in segmenten van één centimeter te knippen. Houd voor elk weefselsegment het weefsel met één hand vast met een fijne pincet en verwijder met de andere hand voorzichtig de witte stof en het grootste deel van de grijze stof met microscharen, zodat alleen de periventriculaire regio van het ruggenmerg overblijft.

Plaats het gedissecteerde periventriculaire weefsel in een steriele Petrischaal van 10 centimeter met ijskoud rat-dissectiebuffer. Om te beginnen met de isolatie van neurale stamcellen van ratten, wordt het gedissecteerde periventriculaire weefsel met microscharen fijngehakt in stukjes van één kubieke millimeter. Bereid vervolgens de enzymatische dissociatiebuffer door eerst vijf milliliter Earl's balanced salt solution toe te voegen aan een vial papaine uit een papaine-dissociatiekit.

Plaats het vial 10 minuten lang op 37 °C, zodat de papaine volledig is opgelost en de oplossing helder is. Voeg vervolgens 500 µL Earl's balanced salt solution toe aan het vial met DNA's uit de dissociatiekit. Meng voorzichtig en voeg 250 µL van de DNA-oplossing toe aan het vial met papaine en meng voorzichtig.

Voeg vervolgens ongeveer 0,2 gram van het fijngehakte weefsel toe aan het flacon en plaats het flacon op een schudplateau bij 37 °C gedurende 45 minuten tot één uur. Tritureer het mengsel na incubatie met een 10 milliliter pipette om eventuele resterende weefselstukjes te dissociëren, zodat er een troebele celsuspensie ontstaat. Overbreng de celsuspensie naar een steriele 15 milliliter conische buis en centrifugeer bij 300 G gedurende vijf minuten.

Bereid bij kamertemperatuur tijdens het centrifugeren de OVO moid-oplossing door 2,7 milliliters Earl's balance salt solution te mengen met 300 microliters van de gereconstitueerde albumine OVO MOID-remmingsoplossing. Voeg in een conische buis van 15 milliliter 150 microliters van de eerder bereide DNA-oplossing toe aan de oval moid-oplossing en meng door de buis om te keren, verwijder het supernatant van de gepelletteerde cellen en resuspendeer het celpellet onmiddellijk in het verdunde DNA-albumine-remmingsmengsel. Bereid vervolgens een discontinue dichtheidsgradiënt door vijf milliliters albumine-remmingsoplossing aan een buis van 15 milliliter toe te voegen en gebruik een pipette van vijf milliliter om de celsuspensie voorzichtig en langzaam bovenop de albumine-remmingsoplossing te layeren.

Centrifugeer het monster bij 70 g gedurende zes minuten bij kamertemperatuur. Verwijder na afloop het supernatant en resuspendeer de celpellet in één milliliter voorverwarmd rat EFH-medium, bereid zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Bepaal de dichtheid van de levende cellen met een hemocytometer en zaai de cellen uit in een T 25-kweekfles bij een dichtheid van 10 cellen per µL in EFH.

Incubeer de kolven bij 37 °C in 5% koolstofdioxide en laat de culturen gedurende één week ongestoord groeien om aggregatie van sferen te voorkomen. Hier wordt een dwarsdoorsnede van het ruggenmerg van een rat getoond die is gekleurd met luxal fast blue, evenals hematine en eosine om de grenzen van de witte en grijze stof aan te geven. De gestippelde omtrek geeft het gedissekeerde resterende periventriculaire weefsel aan dat in dit protocol uit deze regio is geïsoleerd.

Neurosferen, zoals hier getoond, groeien vrij zwevend in suspensiecultuur bij hoge vergroting. Er zijn microscopische uitlopers zichtbaar die uit de neurosferen steken. Neurosferen prolifereren, zoals aangetoond door KI 67-positieve kleuring waarbij de neurosferen werden gedissocieerd en uitgeplaat in met matrigel gecoate wells. Daarnaast zullen ze primair nestin tot expressie brengen, wat een marker is voor neurale precursorcellen.

Na deze procedure kunnen exogene factoren aan de gekweekte cellen worden toegevoegd om differentiatie te bevorderen. De adulte neurale stamcellen of hun nakomelingen kunnen ook worden getransplanteerd in verschillende diermodellen om hun vermogen tot regeneratieve herstel te beoordelen. Ik hoop dat u deze video nuttig vindt, en veel succes met uw experimenten.