Concentrische Gel Systeem om de biofysische rol van matrix Microenvironment op 3D-Cell Migratie Bestudeer
3 april 2015
De mechanische eigenschappen en de microstructuur van de extracellulaire matrix sterk beïnvloeden 3D migratie van cellen. Een in vitro werkwijze om de tijdruimtelijk celmigratie gedrag biofysisch variabele omgevingen zowel bevolking en afzonderlijke cel niveaus, gaande beschreven.
Het algemene doel van deze procedure is om de migratiekarakteristieken van cellen in 3D fysiologisch relevante omgevingen te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst cellen te zaaien in een binnenste collageengel die vervolgens wordt omgeven door een celvrije buitenste collageengel met de gewenste matrixeigenschappen. Vervolgens worden de cellen toegestaan om in de buitenste gel te invaderen en migreren, waarbij ze kunnen worden gemonitord en kwantitatief geanalyseerd.
Uiteindelijk wordt deze concentrische gel-assay gebruikt om te laten zien hoe het migratiegedrag van cellen wordt beïnvloed door de biofysische eigenschappen van de extracellulaire matrix. Het grote voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals de transfer-assay of de scratch-assay, is dat de migratie van de cel plaatsvindt in een fysiologisch relevante verdragsomgeving waarvan de structurele en biofysische eigenschappen zeer gemakkelijk te controleren zijn. Visuele demonstratie van deze methode is vrij essentieel omdat de vorming van het concentraat binnenste router gel-systeem vrij delicaat is.
Een goede gel-interface is erg belangrijk voor het succes van dit experiment, wat soms een beetje uitdagend kan zijn om te bereiken. Begin met een cultuur van MD MBA 2 31-cellen klaar om te oogsten uit T 25-kolven bij 80%co fluentie. Probeer eerst de cellen uit met een milliliter oplossing per kolf.
Verzamel vervolgens de cellen als een pellet met behulp van 200 Gs kracht gedurende vier minuten, gooi de snat weg en resuspendeer de cellen in vijf milliliter kweekmedium. Meet nu de celdichtheid met behulp van een hemo cytometer en bepaal het volume dat nodig is voor 100 miljoen cellen per milliliter. Spin vervolgens de cellen neer bij 200 G gedurende vier minuten.
Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet grondig in het vereiste volume serumvrij kweekmedium. Deze suspensie is 10 keer de uiteindelijke zitconcentratie. Om te beginnen verzamel de vereiste stockoplossingen in een ijsemmer, ze omvatten 10 XPBS melkwater en 0,1 molaire natriumhydroxide.
Koel ook verschillende microcentrifugebuisjes onder een kap af, houd steriele techniek aan, verdeel de gewenste hoeveelheid collageen voor 50 microliters van 2,4 milligram per milliliter binnenste geloplossing. Voeg vervolgens langzaam vijf microliters van 10 XPBS toe aan het gemeten collageen. Wieg de buis terwijl de PBS wordt toegevoegd, maar vermijd het maken van bubbels.
Pas vervolgens de pH van het mengsel aan op 7,4 met de basisoplossing. Meestal zullen vijf microliters voldoende zijn. Een probleemoplossingsgids is opgenomen in het tekstprotocol.
Breng tenslotte het volume op tot 45 microliters met serumvrij kweekmedium en laat ruimte over voor de 10 x celsuspensie. Voeg vijf microliters van de 10 x celsuspensie toe aan de collageenoplossing en resuspendeer de cellen grondig in de oplossing zonder luchtbellen te vormen. Voeg nu 20 microliters van de suspensie toe aan het midden van een voorverwarmde glazen bodemplaat.
Vorm een koepelvormige druppel als er snel een bel ontstaat, scheurt deze dan of zuig hem op zonder een puinhoop te maken. Het gieten van de gel op de juiste manier kan erg lastig zijn, vooral met zeer stroperige oplossingen zoals collageen. Probeer zoveel mogelijk geen bubbels te produceren en draai de oplossing niet rond zodra deze klaar is om te polymeriseren, omdat zwelling kunstmatige vezeluitlijning kan veroorzaken.
Breng nu de schaal terug naar de incubator gedurende 45 minuten om de binnenste laag te laten polymeriseren, 15 minuten voordat de incubatie eindigt. Bereid 200 microliters buitenste collageengeloplossing voor op ijs. Verdeel eerst het vereiste volume van stockcollageen.
Vervolgens voegt u langzaam 20 microliters van 10 XPBS toe met voorzichtig wiebelen. Pas vervolgens de pH aan op 7,4 zoals eerder, en breng de oplossing op 200 microliters met Milli Q-water. Verwijder nu de schaal uit de incubator en voeg voorzichtig 180 microliters van de buitenste geloplossing toe bovenop de binnenste gelkoepel.
Dit zou de binnenste oplossing volledig moeten bedekken en de put moeten vullen. Roer de oplossing niet en vermijd aanraking van de binnenste geloplossing. Als er een bel ontstaat tijdens het uitdrijven van de buitenste oplossing, wees dan snel om deze te scheuren of terug in de pipet te zuigen.
Een andere belangrijke stap is om ervoor te zorgen dat een goede gel-interface wordt verkregen. De sleutel tot deze stap is om de buitenste geloplossing toe te voegen. Wanneer de binnenste gel nog niet is gecertificeerd.
De gel-kinetica kan variëren met de polymerisatievoorwaarden en het is essentieel om deze voorwaarde vooraf te optimaliseren. Om de buitenste gel te laten polymeriseren, brengt u de schaal gedurende 45 minuten terug naar de incubator. Na 45 minuten zou de gel redelijk vast moeten zijn, maar kan nog steeds voorzichtig worden losgemaakt. Voeg zorgvuldig twee milliliter warm medium toe om de gel volledig te onderdompelen. Dit voltooit de concentrische gelcultuur door elke twee tot drie dagen vers medium te verstrekken.
Binnen enkele dagen beginnen cellen te migreren naar de buitenste matrix om hun migratie te observeren, kleurt u de cellen met een fluorescerende tracker. Vervang de twee milliliter medium door vers medium dat vijf microliters kleurstof bevat en incubeer gedurende 30 minuten. Na de incubatieperiode, wast u de cultuur met één milliliter van PB S3 keer gedurende twee tot drie minuten per wasbeurt. Na de wasbeurten, vult u de schaal opnieuw met normaal medium.
Plaats vervolgens de schaal op een microscoop met omgevingscontrole. Gebruik nu een volume van gebruiksinstelling om de buitenste gelgebieden naast de gel-interface te scannen. Scan doorgaans in 647 micron vierkante weergaven die 100 micron dik zijn, met behulp van vijf micron intervallen op de ZS-stack.
Scan vervolgens de tussenliggende gebieden en scan tenslotte de buitenkant van de gel. Sluit gebieden binnen 50 micron van de onder-, boven-
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een in vitro methode om de migratiekenmerken van cellen in fysiologisch relevante 3D-omgevingen te bestuderen. De methode maakt het mogelijk om het celmigratiegedrag, beïnvloed door de biofysische eigenschappen van de extracellulaire matrix, te monitoren en kwantitatief te analyseren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Celmigratie
- Eigenschappen van de extracellulaire matrix
- 3D-culturesystemen
Achtergrond
- De mechanische eigenschappen van de extracellulaire matrix hebben invloed op celmigratie.
- Het begrijpen van celgedrag in 3D-omgevingen is cruciaal voor biologisch onderzoek.
- Bestaande methoden vertonen beperkingen bij het nabootsen van fysiologische omstandigheden.
- Deze studie introduceert een nieuwe concentrische gel-assay voor een betere controle over de matrixeigenschappen.
Doel van de studie
- Onderzoeken hoe biofysische eigenschappen van de extracellulaire matrix de celmigratie beïnvloeden.
- Een betrouwbare methode bieden voor het bestuderen van celgedrag in een gecontroleerde omgeving.
- Het begrip van celdynamiek in 3D-culturen vergroten.
Gebruikte methoden
- Het uitplaten van cellen in een binnenste collageengel.
- Het omsluiten van de binnenste gel met een celvrije buitenste collageengel.
- Het mogelijk maken dat cellen de buitenste gel binnendringen en erin migreren.
- Het monitoren en kwantitatief analyseren van het migratiegedrag van de cellen.
Belangrijkste resultaten
- De concentrische gel-assay demonstreert effectief celmigratie in een fysiologisch relevante omgeving.
- Het migratiegedrag van cellen varieert aanzienlijk bij veranderingen in de matrixeigenschappen.
- Deze methode biedt voordelen ten opzichte van traditionele assays, zoals de transfer-assay en de scratch-assay.
- Een visuele demonstratie van de methode is cruciaal vanwege de delicate aard van het gelsysteem.
Conclusies
- De concentrische gel-assay is een waardevol instrument voor het bestuderen van celmigratie in 3D-omgevingen.
- Inzicht in de invloed van eigenschappen van de extracellulaire matrix kan therapeutische strategieën informeren.
- Deze methode verbetert de mogelijkheid om experimentele condities in celmigratiestudies te beheersen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Het begrijpen van hoe de biofysische eigenschappen van de extracellulaire matrix de 3D-celmigratie beïnvloeden, is essentieel voor het verminderen van risico's bij hypothesen over targets voor oncologie en wondgenezing. Deze concentrische gel-assay maakt een kwantitatieve, reproduceerbare beoordeling van migratiedynamiek in fysiologisch relevante micro-omgevingen mogelijk, wat het voorspellend vertrouwen in target-validatie en fenotypische screeningsworkflows ondersteunt. Door matrix-afhankelijke variabelen te isoleren, helpt deze methode bij het mechanistische risicobeheer en de prioritering van portfolio's voor mechanotransductiepaden.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door matrixmechanica te koppelen aan celmigratie-fenotypes, wat functionele targetvalidatie in ziekte-relevante 3D-systemen mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Biedt gestandaardiseerde, kwantitatieve read-outs van invasiedynamiek die bijdragen aan biologische risicoreductie en hypothese-gestuurde targetselectie.
- Voorspellende waarde: Genereert metrieken voor persistentie en snelheid die go/no-go-beslissingen informeren door matrix-afhankelijke migratiegedragingen vroeg in de ontdekkingsfase te onthullen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert spatiotemporeel opgeloste migratiegegevens via live-cell imaging, wat standaardisatie van assays over verschillende collagendichtheden en ECM-samenstellingen mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Ondersteunt de ontwikkeling van een schaalbaar en reproduceerbaar platform voor compoundscreening waarbij matrixeigenschappen gecontroleerde variabelen zijn.
- Assay-gereedheid: Produceert kwantitatieve traject-datasets die geschikt zijn voor high-content analyse en hit-bevestiging in migatiegerichte campagnes.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen observaties uit fundamenteel onderzoek en preklinische modellen door fysiologisch relevante 3D-micro-omgevingen te behouden die in vivo stromale interacties nabootsen.
- Mechanistische risicoreductie: Isoleert biofysische variabelen om te verduidelijken of waargenomen migratie-effecten doelspecifiek of matrix-gemedieerd zijn, waardoor het aantal fout-positieven bij de identificatie van lead-verbindingen wordt verminderd.
- Voorspellende betrouwbaarheid: Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk door in vitro migratiepatronen te correleren met het bekende metastatische potentieel in modellen zoals MDA-MB-231.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van target-hypotheses tot de identificatie van lead-compounds, en biedt mechanistische inzichten die relevant zijn voor de fasen van assayontwikkeling en preklinische validatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door te kwantificeren hoe biofysische matrixparameters migratiephenotypes beïnvloeden, waardoor de betrokkenheid van signaalpaden bij invasieprocessen wordt verduidelijkt.
- Screening: Maakt assays gereed voor gebruik via gestandaardiseerde gelvorming en kwantitatieve imagingprotocollen die reproduceerbare migratiemetrieken opleveren over verschillende condities.
- Analytics: Levert spatiotemporele datasets op, inclusief trajectanalyse, persistentieratio's en berekeningen van de gemiddelde snelheid, waarmee een vergelijkende evaluatie van condities mogelijk is.
- Translationeel onderzoek: Behoudt de relevantie voor ziektebeelden door het gebruik van metastatische borstkankercellen in instelbare 3D-matrices, wat de continuïteit naar preklinische metastasismodellen ondersteunt.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar platform voor het bestuderen van matrixafhankelijke phenotypes over meerdere projecten heen, waardoor redundante assayontwikkeling wordt verminderd.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in migratiephenotypes te verminderen via gecontroleerde matrixvariabelen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie via gedefinieerde gelpolymerisatieprotocollen en kwantitatieve beeldparameters.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege identificatie van matrixafhankelijke artefacten mogelijk te maken, waardoor het risico op falen in een laat stadium van oncologieprogramma's wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door echte target-gemedieerde effecten te onderscheiden van migratieveranderingen die door de micro-omgeving worden aangestuurd.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in 3D-celkweek, live-cell imaging en software voor beeldanalyse voor oppervlakte-tracking en objectclassificatie.
- Is afhankelijk van nauwkeurige controle van de collageenconcentratie, pH-aanpassing en gel-laagvorming om belvorming te voorkomen en een correcte interfacevorming te garanderen.
- Maakt standaardisatie van zaaidichtheid, incubatietijd en protocollen voor mediumverversing tussen gebruikers en locaties noodzakelijk.
- Vereist aanpassing van de samenstelling van de buitenste gel bij het bestuderen van niet-collageenmatrices, met validatie van de gelatiekinetiek en interfacestabiliteit.
- Wordt beperkt door de noodzaak van zorgvuldig handmatig gieten van de gel om artefacten te voorkomen, in het bijzonder bij viskeuze oplossingen, en de uitsluiting van randgevoelige regio's tijdens de analyse.
