Name: Live cell imaging tijdens Mechanical Stretch (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Leer live cell imaging tijdens mechanische rek om celmechanobiologie in realtime te bestuderen met muizenlong-epitheelcellen. Deze methode meet stijfheidsveranderingen en schade door rek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag dat Fedex Instituut voor Technologie van de Universiteit van Memphis bedanken voor hun steun. De auteurs willen graag aan studenten van de senior ontwerp projectgroep in het Mechanical Engineering Department te erkennen aan de Universiteit van Memphis (David Butler, Jackie Carter, Dominick Cleveland, Jacob Shaffer), Daniel Kohn van de afdeling Universiteit van Memphis CTW voor motorbesturing en Dr. Bin Teng en mevrouw Charlean Luellen voor hun hulp in celcultuur. Dit werk werd ondersteund door K01 HL120912 (ER) en R01 HL123540 (CMW).

1. De bouw van de membraan met Well Muren voor Behoud van de Cel Cultuur Media (zie figuur 1D voor het eindproduct) <ol><li> Met behulp van polydimethylsiloxaan (PDMS) platen bekleed met collageen I, snijd de omtrek van het flexibele membraan met een scalpel of een matrijs. </li><li> Plaats elk membraan in een 60 mm petrischaal voor opslag. </li><li> Oprichting van de muren: <ol><li> Meng PDMS bij een 10: 1 gewichtsverhouding van elastomeer A tot elastomeer B (verharder). </li><li> Giet 5 ml volledig gemengde PDMS in 50 ml buizen. </li><li> Plaats 50 ml buizen met uitgeharde PDMS horizontaal in een hybridisatieoven. </li><li> Gebruik de rotor het bekleden van de binnenwanden van de buizen bij 8 rpm gedurende de hardingstijd. Bij KT, wordt de PDMS volledig uitgehard in 2 dagen. </li><li> Verwijder de PDMS uit de buis in een steriele celkweek kap. </li><li> Met behulp van een nieuw scheermesje, partitioneren de cilinder van PDMS in secties 4 mm in de hoogte. </li><li> Plaats de secties, die zal dienen als het membraan walls, in een petrischaal container zonder dat de wanden kreuken te vermijden. </li></ol></li><li> Selecteren en middelste wand van PDMS op een membraan terwijl de twee in de petrischaal. </li><li> Plaats voorzichtig uitgeharde PDMS (10: 1-verhouding) op de buitenomtrek van de wand te gebruiken lijm. Voorkom vorming van spleten tussen de wand en het membraan omdat het er om vloeistof vast te houden. </li><li> Plaats elke petrischaal met de voltooide membraan en bedekt met een oven bij 70 ° C gedurende 24 uur om uit te harden. </li></ol> 2. Correlatie van Motor Rotaties met klem Verplaatsing of Radial Groei voor Calibration (figuur 2) <ol><li> Start de software besturen van de motor. </li><li> Verplaats de klemmen van het apparaat met behulp van de handmatige instelling in de motor software. </li><li> Meet de afstand en noteer de motor telling positie tussen tegenover elkaar liggende klemmen zowel minimum en maximum verplaatsing van de klemmen. </li><li> De procentuele verandering van het distance tussen de klemmen als functie van het aantal motor (~ 0-75k tellingen). Hierdoor wordt de maximum mogelijke belasting verwezenlijkt op het membraan te geven. </li></ol> 3. Toepassing van Stretch op Mouse Lung epitheelcellijn (MLE12) <ol><li> Zaad MLE12 cellen met 2,5 miljoen cellen op het flexibele membraan (stap 1) per putje worden confluent binnen twee dagen. De zaaidichtheid kan variëren voor verschillende celtypen. </li><li> Controleer de mechanische actuator in een volledig ontspannen positie. <ol><li> Verwijder celcultuur media. </li><li> Met 1,5 mm biopt stoten, punch twee gaten in elk van de zes klemmen (zie figuur 1D) tabs van het membraan. De radiale positie van de gaten bepaalt de hoeveelheid voorspanning van het membraan ervaringen oorspronkelijk. Pons de gaten op een straal van 20,5 mm op de tabs membraan indien geen voorspanning wordt gewenst. </li><li> Plaats het membraan op de brancard met de geponste gaten rij met de pennen in de klemmen.Plaats de top klemmen op zijn plaats. Draai de schroeven een voor een afwisselend kanten. </li><li> Voeg 1 ml celcultuur media. </li></ol></li><li> Plaats het apparaat op de microscooptafel centrering het midden van de membraan met de lichtweg. </li><li> Gebruik tape of magneten (indien mogelijk) om het apparaat naar het podium. Eenmaal opgelost, regelen in het vlak (parallel aan het membraan) en verticale (z-richting) van de mechanische inrichting van fase controller van de microscoop. </li><li> Breng traject met de software van de fabrikant door het handmatig regelen van de positie en de snelheid van rotatie van de motor 20. </li></ol> 4. Meting van de mitochondriale reactive oxygen species (ROS) <ol><li> Zodra cellen zijn confluent, voeg 1-2 ml RT DMEM met mitochondriale superoxide indicator (5 uM uiteindelijke concentratie) direct op de cellen. </li><li> Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C. </li><li> Was de cellen voorzichtig drie keer met buffer verwarmd in een waterbad37 ° C. </li><li> Plaats onmiddellijk het flexibele membraan op de brancard (Stap 2.2) reeds in plaats onder een rechtopstaande confocale microscoop. </li><li> Voeg 1 ml van DMEM met fenolrood-vrij medium en 25 mM HEPES. </li><li> Stel excitatie / emissie filters om 510/580 nm. </li><li> Afbeelding meerdere velden elke 15 minuten naar het gewenste tijdsverloop van mitochondriale superoxide productie creëren. </li><li> Van de opgenomen beelden, opnemen fluorescentie-intensiteit histogrammen op elk tijdsinterval met behulp van software in staat te kwantificeren fluorescentie-intensiteit. </li></ol> 5. Toepassing van de Stretch en Atomic Force Microscopy (AFM) OPMERKING: Deze stappen zijn bedoeld voor een bepaalde AFM en optische microscoop combinatie (Figuur 4 en Materials List). <ol><li> Bereid de AFM het experiment. <ol><li> Vergroot de hoogte van de AFM kop tot de maximale positie in de z-richting. </li><li> Zet extenders op de benen van de AFMTil het vliegtuig waarin AFM cantilever contacten het monster. Het monster en de AFM printkop moet worden opgetild tot de hoogte van de mechanische koppelstuk. </li></ol></li><li> Bereid de optische microscoop (indien beschikbaar). <ol><li> Verwijder de AFM scanner plaat. Verwijder het gewenste doel. </li><li> Voeg een afstandhouder aan de doelstelling. De hoogte van de afstandhouder zal afhangen van het doel en de specifieke AFM opzet, maar het is noodzakelijk als optische beeldvorming gewenst aangezien waarnemingsvlak verschuiving in de z-richting met een bedrag gelijk aan de brancard en de hoogte van de adaptor (figuur wordt 5A). Merk op dat de AFM biedt meestal lage vergroting beeldvorming van een optisch pad boven het apparaat. </li><li> Monteer de gewenste doel weer op zijn plaats. Plaats de scanner terug naar de AFM. </li><li> Start de AFM software. Start alle benodigde lichtbronnen inclusief de lichtbron voor fluorescentie metingen. </li><li> Monteer een chip met een vrijdragende balkgeschikt is voor de gewenste metingen. 200 pN / nm of minder stijfheid heeft de voorkeur bij het meten van de elastische modulus van levende cellen. </li><li> Lijn de laser en kalibreren van de cantilever stijfheid volgens de suggesties van de fabrikant op een glazen dekglaasje gemonteerd op het apparaat. </li></ol></li><li> Bereid een membraan als in stap 1, maar met de volgende modificaties. <ol><li> Onmiddellijk voor het monteren van de membraan naar de spaninrichting, snijd de wanden ongeveer 1 mm in hoogte. Dit voorkomt de ondervonden interferentie tussen de membraanwanden en de meetcel. </li><li> Monteer het membraan op de mechanische apparaat zoals beschreven 3.2.1-3.2.3. </li><li> Celkweek media verwijderen om beschadiging van de AFM scanner bij een lekkage te voorkomen. </li><li> Koppel het apparaat met een adapter (Figuur 5A). Plaats het mechanische apparaat met de adapter op de scanner. </li><li> Trek de membraan naar de gewenste trekspanning level. </li></ol></li><li&gt; Nano-inspringen van uitgerekt cellen. <ol><li> Voeg een beperkt (&lt;0,5 ml) volume van de media op de cellen naar AFM scanner of microscoop schade te voorkomen als gevolg van een lekkage. </li><li> Schakel de cantilever met het membraan. </li><li> Volg het protocol van de bijzondere AFM apparaat om gebieden van belang te scannen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Tschumperlin, D. J., Boudreault, F., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+and+new+opportunities+in+lung+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Recent advances and new opportunities in lung mechanobiology.</a> J Biomech. 43, 99-107 (2010).</li>
<li>Waters, C. M., Roan, E., Navajas, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWaters%2C+CM+%22Comprehensive+Physiology%22">Comprehensive Physiology</a>. , John Wiley, & Sons, Inc. (2011).</li>
<li>Majkut, S., Dingal, P. C. D. P., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+Sensitivity+and+Mechanotransduction+during+Heart+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Stress Sensitivity and Mechanotransduction during Heart Development.</a> Current Biology. 24, R495-R501 (2014).</li>
<li>Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+molecular+processes+mediate+cellular+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction.</a> Nature. 475, 316-323 (2011).</li>
<li>Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+across+the+cell-surface+and+through+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction across the cell-surface and through the cytoskeleton.</a> Science. 260, 1124-1127 (1993).</li>
<li>Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+force-induced+signal+transduction+in+lung+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanical force-induced signal transduction in lung cells.</a> Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).</li>
<li>Janmey, P. A., McCulloch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics%3A+integrating+cell+responses+to+mechanical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli.</a> Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).</li>
<li>Waters, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+in+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species in mechanotransduction.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L484-L485 (2004).</li>
<li>Chapman, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+mechanical+strain+increases+reactive+oxygen+species+production+in+pulmonary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).</li>
<li>Chu, E. K., Whitehead, T., Slutsky, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cyclic+opening+and+closing+at+low-+and+high-volume+ventilation+on+bronchoalveolar+lavage+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Car+Med%22%5BJournal%5D)">Effects of cyclic opening and closing at low- and high-volume ventilation on bronchoalveolar lavage cytokines.</a> Crit Car Med. 32, 168-174 (2004).</li>
<li>Tschumperlin, D., Margulies, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equibiaxial+deformation-induced+injury+of+alveolar+epithelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro.</a> Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).</li>
<li>Vlahakis, N. E., Hubmayr, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+stress+failure+in+ventilator-injured+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Cellular stress failure in ventilator-injured lungs.</a> Am J Respir Crit Care Med. 171, 1328-1342 (2005).</li>
<li>Roan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperoxia+alters+the+mechanical+properties+of+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L1235-L1241 (2012).</li>
<li>Gamerdinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+load+and+mechanical+integrity+of+lung+cells+-+Experimental+mechanostimulation+of+epithelial+cell-+and+fibroblast-monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mech+Behav+Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Mechanical load and mechanical integrity of lung cells - Experimental mechanostimulation of epithelial cell- and fibroblast-monolayers.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 4, 201-209 (2014).</li>
<li>Hayashi, K., Naiki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+and+remodeling+of+vascular+wall%3B+biomechanical+response+to+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mech+Behav+Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Adaptation and remodeling of vascular wall; biomechanical response to hypertension.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 2, 3-19 (2009).</li>
<li>Villemure, I., Stokes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+plate+mechanics+and+mechanobiology.+A+survey+of+present+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Growth plate mechanics and mechanobiology. A survey of present understanding.</a> J Biomech. 42, 1793-1803 (2009).</li>
<li>Waters, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+to+impose+prescribed+homogenous+strains+on+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">A system to impose prescribed homogenous strains on cultured cells.</a> J Appl Physiol (1985). 91, 1600-1610 (2001).</li>
<li>Gerstmair, A., Fois, G., Innerbichler, S., Dietl, P., Felder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+device+for+simultaneous+live+cell+imaging+during+uni-axial+mechanical+strain+or+compression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">A device for simultaneous live cell imaging during uni-axial mechanical strain or compression.</a> J Appl Physiol (1985). 107, 613-620 (1985).</li>
<li>Dassow, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+measure+mechanical+properties+of+pulmonary+epithelial+cell+layers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+Part+B+Appl.+Biomater%22%5BJournal%5D)">A method to measure mechanical properties of pulmonary epithelial cell layers.</a> J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 101, 1164-1171 (2013).</li>
<li>SmartMotor User's Guide v523. , Animatics Corporation. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.animatics.com/download/publication/UsersGuide%20v523.pdf ">http://www.animatics.com/download/publication/UsersGuide%20v523.pdf </a> (2011).</li>
<li>Chapman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+mechanical+strain+increases+reactive+oxygen+species+production+in+pulmonary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).</li>
<li>Birukov, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+stretch%2C+reactive+oxygen+species%2C+and+vascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Cyclic stretch, reactive oxygen species, and vascular remodeling.</a> Antioxid Redox Signal. 11, 1651-1667 (2009).</li>
<li>Turrens, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+formation+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial formation of reactive oxygen species.</a> J Physiol. 552, 335-344 (2003).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+flashes+in+single+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Superoxide flashes in single mitochondria.</a> Cell. 134, 279-290 (2008).</li>
<li>Pouvreau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+flashes+in+mouse+skeletal+muscle+are+produced+by+discrete+arrays+of+active+mitochondria+operating+coherently%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Superoxide flashes in mouse skeletal muscle are produced by discrete arrays of active mitochondria operating coherently.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Yalcin, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+cytoskeletal+structure+and+mechanics+on+epithelial+cell+injury+during+cyclic+airway+reopening%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Influence of cytoskeletal structure and mechanics on epithelial cell injury during cyclic airway reopening.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297, L881-L891 (2009).</li>
<li>Jacob, A. M., Gaver, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atelectrauma+disrupts+pulmonary+epithelial+barrier+integrity+and+alters+the+distribution+of+tight+junction+proteins+ZO-1+and+claudin+4%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and claudin 4.</a> J Appl Physiol. 113, 1377-1387 (2012).</li>
<li>DiPaolo, B. C., Lenormand, G., Fredberg, J. J., Margulies, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+magnitude+and+frequency-dependent+actin+cytoskeleton+remodeling+in+alveolar+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stretch magnitude and frequency-dependent actin cytoskeleton remodeling in alveolar epithelia.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 299, C345-C353 (2010).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Een uniek apparaat voor live-cell imaging tijdens mechanische stretch is ontwikkeld; en dit apparaat werd gebruikt in een protocol om long epitheelcellen Mechanobiology bestuderen. In voorlopige studies werd gevonden dat een enkele plaats rek stimuleerde de productie van mitochondriale superoxide in bronchiale epitheelcellen. Bovendien werd aangetoond dat verhoogde mechanische belasting veroorzaakt directe schade aan de integriteit van een monolaag van alveolaire epitheelcellen. Om deze voor...

De cellen worden onderworpen aan mechanische belasting in veel weefsels, en deze mechanische stimulatie is aangetoond dat veranderingen in de patronen van genexpressie, afgifte van groeifactoren, cytokinen, of verbouwen van de extracellulaire matrix te bevorderen cytoskelet 1-4. De intracellulaire signalen getransduceerd door deze mechanische stimuli optreden door het proces van mechanotransductie 5-7. In het ademhalingssysteem, vloeit uit mechanotransduction de toename van reactieve zuurstof species (ROS) 8,9 en pro-inflammatoire cytokinen 10 in pulmonaire epitheelcellen in aanwezigheid van cyclische trekbelasting. Sterk bewijs suggereert ook dat overmatige trekbelasting leidt tot directe schade aan het alveolaire epitheel, naast de biochemische reacties van cellen 11-14. Hoewel de nadruk ligt hier vooral op de reactie van longcellen aan mechanische vervorming, paden veroorzaakt door mechanotransductie spelen een belangrijke rol in de basic functie van vele weefsels in het menselijk lichaam, waaronder de regulering van de vasculaire tonus en de 15 ontwikkeling van de groeiplaat 16. De toenemende belangstelling mechanotransduction heeft geleid tot de ontwikkeling van talrijke inrichtingen voor de toepassing van fysiologisch relevante mechanische belastingen op gekweekte cellen en weefsels. Met name inrichtingen aanbrengen van een trekspanning, die een gebruikelijke vorm van mechanische belasting ervaren door weefsel, populair 11,17-19. Veel van de beschikbare inrichtingen zijn ofwel uitgevoerd als een bioreactor voor weefselregeneratie toepassingen of niet bevorderlijk real time imaging met stretch. Als zodanig is er behoefte aan middelen en methoden om cellen en weefsels kunnen visualiseren spanning het onderzoek trajecten van mechanotransduction vergemakkelijken. Hierin werd een in-plane mechanische spaninrichting ontworpen en protocollen werden ontwikkeld om m passenultiple vormen van stam aan weefsels en cellen terwijl beeldvorming van de biochemische en mechanische reacties in real time (Figuur 1A-D). De inrichting maakt gebruik van zes regelmatig verdeelde klemmen omtrek aangebracht op een flexibel membraan begrijpen en toepassen van een in-vlak radiale uitzetting tot ongeveer 20% (Figuur 1B). De bedieningsinrichting kan in een celkweek incubator geplaatst gedurende een langere tijd, terwijl de motor (figuur 1C) gepositioneerd buiten de incubator en gecontroleerd door proprietaire software die door de motor leverancier. De motor is verbonden met een lineaire driver, die een interne nok roteert, drijven de zes stretcher klemmen gelijkmatig in spanning en ontspanning. Naast de mechanische inrichting zijn aangepast flexibele membranen gemaakt van commercieel verkrijgbare celkweek bereid membranen voor gebruik in het mechanische systeem. Dan cirkelvormige wanden (met een diameter van ongeveer28 mm) werden gemaakt en vastgemaakt aan het flexibele membraan zodat cellen kunnen worden gekweekt alleen in dit gebied goed beschreven soort profiel. Om te bepalen of de positie van deze membranen in de aandrijfinrichting uniform en isotroop rek zou voorzien in het midden van het flexibele membraan, werd eindige elementen analyse uitgevoerd met behulp van commercieel verkrijgbare software (Figuur 1E-F). Het flexibele membraan werd gemodelleerd met symmetrische randvoorwaarden en gebruik van alle vierhoekige elementen van de maas. De concentrische ringen gezien in de contourgrafiek van maximum hoofdrek figuur 1F geven de isotrope verdeling van de spanning. De rek ervaren door het membraan werd gemeten door beelden markeringen doorladen (figuur 2). Figuur 2D laat zien dat de gemiddelde membraan rek gemeten in radiale en axiale richting ongeveer lineairmet betrekking tot de toegepaste motor telt maximaal lineaire rek van 20%. Er was geen significant verschil tussen de rekniveaus gemeten tijdens uitzetting vergeleken met die gemeten tijdens het terugtrekken terug naar de rustpositie. Vervolgens wordt de verplaatsing van humane bronchiale epitheelcellen (16HBE) en hun kernen gekweekt op de aangepaste flexibel membraan werden gemeten. Fluorescent gelabelde (DAPI) kernen van de 16HBE cellen werden afgebeeld met behulp van een 20X objectief onder een confocale microscoop, terwijl hele cel verplaatsing werd gemeten met fase contrast beelden die zijn opgenomen met een digitale microscoop. Zoals blijkt uit figuur 3, de spanning gemeten door verplaatsing van kernen was vergelijkbaar met die gemeten door verplaatsing van markeringen op het membraan, tot ~ 20% lineair rek. Dit bevestigt dat de spanning uitgeoefend op de membranen van de hechtende cellen werd overgebracht. De protocollen die het gebruik van de aangepaste inrichting op een traditionele microscoop en een atomic force microscope worden in de volgende stappen.

<table><tbody><tr><td>SmartMotor NEMA 34: 3400 Series</td><td>MOOG Animatics</td><td>SM3416D</td><td>Geïntegreerde motor, controller, versterker, encoder en communicatiebus</td></tr><tr><td>Flexcell Membrane (Collagen I coated)</td><td>Flexcell International Corp</td><td>SM2-1010C</td><td>3.5"&nbsp;x&nbsp;5.25"&nbsp;x&nbsp;0.020"</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td>10:1</td></tr><tr><td>Hoechst 33342&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1399</td><td>DAPI-kleurstof</td></tr><tr><td>MitoSOX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>Tiron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7389&nbsp;</td><td>mitochondrial superoxide label</td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td>superoxide inhibitor</td></tr><tr><td>FBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-19</td><td>Elke centrifugebuis kan worden gebruikt om een gebied voor beeldvorming te creëren.</td></tr><tr><td>Hybridization oven</td><td>Bellco Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MLE12 Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2110</td><td>Mouse Lung Epithelial Cells&nbsp;</td></tr><tr><td>16HBE cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2741</td><td>Human Bronchial Epithelial Cells</td></tr><tr><td colspan="4">AFM Indentation Experiments</td></tr><tr><td>Cantilever Beams for Nano-indentation</td><td>Budget Sensors</td><td>Si-Ni30</td><td></td></tr><tr><td>AFM&nbsp;</td><td>Asylum Research</td><td>MFP3D</td><td></td></tr><tr><td>Olympus microscope</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td>Omgekeerde microscoop met 20X en 40X objectieven.</td></tr><tr><td>AFM Leg Extenders</td><td>Asylum Research</td><td>Not available</td><td>AFM microscoop</td></tr><tr><td colspan="4">Finite Element Analyses</td></tr><tr><td>ABAQUS</td><td>Simulia</td><td>6.12</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Microscopes</td></tr><tr><td>Digital microscope</td><td>Life Technologies</td><td>EVOS XL Core</td><td>Aanvankelijk een zelfstandig bedrijf, nu eigendom van Life Technologies.</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710</td><td>2-foton rechtopstaande microscoop</td></tr></tbody></table>

live cell imaging tijdens mechanical stretch

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

Er is momenteel veel belangstelling voor het begrijpen hoe cellen en weefsels reageren op mechanische prikkels, maar de huidige benaderingen zijn beperkt in hun vermogen om reacties in realtime in levende cellen of viabel weefsel te meten. Er werd een protocol ontwikkeld met behulp van een celactuator om levende cellen die op of weefsels die aan een elastisch substraat zijn gegroeid uit te rekken terwijl ze worden geïmager met confocale en atomaire krachtmicroscopie (AFM). Voorlopige studies tonen aan dat tonisch uitrekken van menselijke bronchiale epitheelcellen een significante toename veroorzaakte in de productie van mitochondriale superoxide. Bovendien werden, met behulp van dit protocol, alveolaire epitheelcellen uitgerekt en geïmager, wat directe schade aan de epitheelcellen toonde door overdistensie, wat een vorm van longbeschadiging in vitro simuleert. Er is ook een protocol opgenomen om AFM nano-indentaties uit te voeren op uitgerekte cellen.

Reactive oxygen species en vervorming Eerdere studies toonden verhogingen reactive oxygen species (ROS) in de luchtwegen en alveolaire epitheelcellen in respons op cyclische rek 21. Reactieve zuurstofspecies omvatten moleculen en vrije radicalen afgeleid van moleculaire zuurstof met een hoge reactiviteit met lipiden, eiwitten, polysachariden, en nucleïnezuren 22-24. ROS als gemeenschappelijke intracellulair signaal ionkanaalfunctie reguleren, proteïne kinase / ...

Er werd een nieuw beeldvormingsprotocol ontwikkeld met behulp van een op maat gemaakte motorgestuurde mechanische actuator om de meting van realtime-responsen op mechanische spanning in levende cellen mogelijk te maken. Relevant voor mechanobiologie, kan het systeem spanningen tot 20% toepassen terwijl het realtime beeldvorming met confocale of atomaire krachtmicroscopie mogelijk maakt.

Live cell imaging tijdens Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de rol van mechanische rek op de celmechanobiologie in bijna real-time te observeren. Dit wordt bereikt door eerst een systeem te construeren met flexibele membranen waarop cellen worden gekweekt en gerekt. Als tweede stap wordt het membraan gerekt om de motorcounts te kalibreren met de membraanrek.Vervolgens worden epitheelcellen uit de long van muizen uitgerekt en worden de kernen afgebeeld. Om aan te tonen dat de membraanspanning wordt overgedragen op de cellen, werden de stretchers vervolgens geïntegreerd in de AFM voor nano-indentatie, om de stijfheid van de individuele cellen vóór en na het rekken te meten. De resultaten tonen directe schade aan de cellen als gevolg van de toegepaste rek.Ook op basis van fluorescentiebeeldvorming wordt aangetoond dat de productie van reactieve zuurstofcomponenten toeneemt bij rek. Deze methode kan belangrijke vragen binnen het vakgebied van de longmechanische biologie beantwoorden, zoals de vraag of epitheelcellen beschadigd kunnen raken door mechanische ventilatie. Deze methode kan inzicht bieden in de mechanische biologie van longcellen en kan ook worden toegepast op andere zachte weefsels, zoals coupes van de lever of de groeischijf.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege de onconventionele combinatie van instrumenten die in deze experimenten worden gebruikt, zoals de atoomkrijtmicroscoop. Begin met het prepareren van een collageen-gecoat PDMS-membraan dat is aangepast voor gebruik in celculturen, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Zaai vervolgens muis-longepitheelcellen in een dichtheid van 2,5 miljoen cellen per well op een steriel, flexibel collageen-gecoat membraan.Incubeer de cellen gedurende twee dagen bij 37 °C en 5%CO2 totdat de cellen confluent zijn. Gebruik vervolgens een biopsietang van 1,5 mm om in elk van de zes klemtabs twee gaten te ponsen, 20,5 mm vanaf het centrum van het construct indien er geen voorspanning gewenst is. Verwijder daarna het celkweekmedium.Zorg ervoor dat de mechanische actuator zich in een positie met nulrek bevindt en positioneer het membraan op de rekker, zodat de ponsgaten overeenkomen met de pinnen en de klemmen. Plaats de bovenklemmen en draai vervolgens de schroeven één voor één aan, waarbij u afwisselt tussen de verschillende zijden. Voeg één milliliter celkweekmedium toe voordat u het apparaat op de microscopietafel plaatst.Centreer het apparaat in het lichtpad. Bevestig vervolgens het apparaat aan de tafel. Stel scherp op het membraan door de horizontale en verticale posities van het mechanische apparaat aan te passen met een tafelcontroller van de microscoop in het bestemmingsingangsblok.Voer een waarde voor de motorentelling in, die overeenkomt met het gewenste reklevel dat moet worden toegepast. Stel vervolgens de waarde in het invoerblok voor de snelheid in op 10 RPM of minder om hetzelfde veld voor en na de rekwaarneming te kunnen observeren, aangezien het veld kan verschuiven ten opzichte van het microscoopobjectief en het tijdens het rekken mogelijk nodig is om de microscooptafel bij te stellen. Zodra alles is ingesteld, klikt u op go.Begin met het maken van aanpassingen aan de atoomkrijtmicroscoop. Verhoog de hoogte van de FM-kop naar de maximale positie in de Z-richting. Plaats vervolgens verlengstukken op de poten om het vlak te verhogen waarop een FM-cantilever het monster raakt.Verwijder vervolgens de scannerplaat van de AFM en het gewenste objectief uit de microscoop. Voeg een afstandhouder toe aan het objectief en monteer dit vervolgens weer op de microscoop. Plaats daarna de scannerplaat terug op de AFM. De hoogte van de afstandhouder is afhankelijk van het objectief en de specifieke AFM-opstelling, maar het gebruik van de afstandhouder is noodzakelijk als optische beeldvorming gewenst is, aangezien het observatievlak in de Z-richting zal verschuiven.Start vervolgens de AFM-software, de software van de optische microscoop en alle benodigde lichtbronnen, inclusief de lichtbron voor fluorescentiemetingen. Plaats een chip met een cantileverbalk met een stijfheid van 200 pN/nm of minder op de AFM om de elasticiteitsmodulus van levende cellen te meten. Lijn daarna de laser uit, plaats vervolgens een glazen dekglas op het apparaat en gebruik dit om de stijfheid van de cantilever te kalibreren volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Snijd direct voor het bevestigen van het membraan aan het rekanaliseerapparaat de wanden tot een hoogte van ongeveer 1 mm.Dit vermindert de interferentie tussen de membraanwanden en de loadcell. Verwijder vervolgens het celkweekmedium en monteer het membraan op het mechanische apparaat. Plaats het mechanische apparaat met de adapter op de scanner met behulp van de software.Rek het membraan uit tot het gewenste niveau van trekspanning voorafgaand aan de nano-indentatie. Voeg 0,5 milliliter of minder medium toe aan de cellen om ze gehydrateerd te houden, maar neem voorzorgsmaatregelen om morsen te voorkomen, aangezien dit de FM-scanner of microscoop kan beschadigen. Breng vervolgens de cantilever-balk in contact met het membraan.Volg het protocol van het specifieke AFM-apparaat om de gebieden van belang te scannen. Wanneer een rek van 20% werd toegepast op cellen die op het membraan waren gezaaid, verplaatsten de cellen zich met 20% zoals hier aangegeven; de impact van de cellen op de productie van reactieve zuurstofverbindingen werd gemeten in bronchiale epitheelcellen met behulp van een cumulatieve mitochondriale superoxide-sensor, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. In afwezigheid van mechanische rek nam de ROS-productie niet significant toe gedurende 60 minuten wanneer een enkele rek van 17% werd toegepast en gehandhaafd.Er was een toename van mitochondriale ROS die nog 60 minuten aanhield bij de integratie van de mechanische rekker in de atoomkrachtmicroscoop. De elastische modulus en kaarten van epitheelcellen uit de long van muizen vóór en na 10% trekrek werden verkregen uit de hier omlijnde regio's. Er werden 300 individuele forced deflection-curves geregistreerd over een gebied van 40 bij 40 micrometer, wat een verandering in de lokalisatie van regio's met een hoge modulus liet zien bij het toepassen van rek.Zodra de techniek onder de knie is, kan het rekken van cellen in 15 minuten worden uitgevoerd. Terwijl een FM-nano-indentatie twee uur in beslag kan nemen om correct te worden uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de cellen voorzichtig maar snel moeten worden behandeld, aangezien de resultaten nadelig kunnen worden beïnvloed door agitatie en langdurige blootstelling aan kamerlucht voordat de gegevens worden gerapporteerd. Vergeet niet dat werken met een FM extreem uitdagend kan zijn.Tijdens het uitvoeren van deze procedure moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het weghouden van alle vloeistoffen bij de scanner.

live-cell-imaging-during-mechanical-stretch

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Het is algemeen bekend dat mechanische krachten in het lichaam kan cel differentiatie en proliferatie beïnvloeden. Hier presenteren wij een video-protocol demonstreren het gebruik van een custom-built bioreactor voor het leveren van uniaxiale cyclische rek aan cellen gekweekt op flexibele substraten micropatterned steel.

Mechanische stimulatie van stamcellen Met behulp van Cyclische uniaxiale Strain

Dit document heeft tot doel de lezer in de exploitatie van een geïntegreerde atomic force-microscoop optische beeldvorming instrueren voor de mechanische stimulatie van levende cellen in cultuur. Een stap-voor-stap protocol wordt gepresenteerd. Een representatieve dataset die levende cellen als reactie op mechanische stimulatie shows gepresenteerd.

Live-cel respons op mechanische stimulatie onderzocht door Integrated Optical en Atomic Force Microscopy

Mechanische krachten spelen een belangrijke rol in de longen de ontwikkeling en longschade. Hier wordt beschrijven een werkwijze voor knaagdier foetale long type II epitheelcellen en fibroblasten te isoleren en blootstellen aan mechanische stimulatie met...

Een experimenteel systeem om Mechanotransductie in foetale long cellen te bestuderen

Dit manuscript presenteert een techniek om de krachten te passen of release op hechtende cellen of weefsels met behulp van unidirectionele stretching.

Stretching micropatterned Cellen op een PDMS membraan

We presenteren in dit artikel een nieuw strekken platform dat kan worden gebruikt om cel responsen op complexe anisotrope biaxiale mechanische vervorming onderzoeken en kwantificeren van de mechanische eigenschappen van biologisch weefsel.

A Novel Stretching platform voor toepassingen in de Cel en Weefsel Mechanobiology

Met behulp van een eerder ontworpen apparaat om mechanische belasting toe te passen op aanhangende cellen, dit document beschrijft een vernieuwde substratum geometrie en een aangepaste apparaat voor hoge-resolutie single-cell beeldvorming van gespannen cellen met een 100x olie onderdompeling doelstelling.

Hoge-resolutie beeldvorming van kern dynamiek in levende cellen onder Éénassige trekspanning

Mechanische krachten zijn belangrijk voor het beheersen van de Celmigratie. Dit protocol demonstreert het gebruik van elastische hydrogels die kunnen worden vervormd met behulp van een glazen micro pipet en een micro manipulator om cellen te stimuleren met een lokale stijfheids gradiënt om veranderingen in celstructuur en migratie teweeg te brengen.

Enkelvoudige cel Duro Taxis assay voor de beoordeling van de mechanische controle van cellulaire beweging en gerelateerde signalering van gebeurtenissen

De gepresenteerde methode omvat het uniaxiaal uitrekken van 3D zachte hydrogels ingebed in siliconenrubber terwijl live confocale microscopie mogelijk is. Karakterisering van de externe en interne hydrogelstammen en vezeluitlijning worden gedemonstreerd. Het ontwikkelde apparaat en protocol kunnen de reactie van cellen op verschillende stamregimes beoordelen.

Gecontroleerde stam van 3D-hydrogels onder live microscopiebeeldvorming

We beschrijven een protocol om menselijke venaeuze veneuze endotheelcellen (hSVECs) te isoleren en te kweken. We bieden ook gedetailleerde methoden om schuifspanning en rek te produceren om mechanische spanning in hSVECs te bestuderen.

Isolatie van menselijke sapheneuze ader-endotheelcellen en blootstelling aan gecontroleerde niveaus van schuifspanning en rek

Hier presenteren we een veelzijdig equibiaxiaal rekapparaat dat pneumatisch wordt bediend en compatibel is met microscopie met hoge resolutie.

Equibiaxiaal rekapparaat voor sterk vergrote live-cell confocale fluorescentiemicroscopie

Hier presenteren we een nieuw apparaat dat isotrope en uniaxiale spanningsgolfvormen op cellen toepast, terwijl het cultuur ondersteunt op substraten met instelbare stijfheid en aanpasbare eiwitmatrices. Dit eenvoudige, economische platform stelt onderzoekers in staat te onderzoeken hoe mechanische signalen de cellulaire functie reguleren in zowel fundamentele studies als ziektegerelateerde contexten.

Een nieuw platform voor in vitro cellulaire stretching en beeldvorming

Leer live cell imaging tijdens mechanische rek om celmechanobiologie in realtime te bestuderen met muizenlong-epitheelcellen. Deze methode meet stijfheidsveranderingen en schade door rek.

Live cell imaging tijdens Mechanical Stretch

Meer video's verkennen