Live cell imaging tijdens Mechanical Stretch

Het algemene doel van het volgende experiment is om de rol van mechanische rek op de celmechanobiologie in bijna real-time te observeren. Dit wordt bereikt door eerst een systeem te construeren met flexibele membranen waarop cellen worden gekweekt en gerekt. Als tweede stap wordt het membraan gerekt om de motorcounts te kalibreren met de membraanrek.

Vervolgens worden epitheelcellen uit de long van muizen uitgerekt en worden de kernen afgebeeld. Om aan te tonen dat de membraanspanning wordt overgedragen op de cellen, werden de stretchers vervolgens geïntegreerd in de AFM voor nano-indentatie, om de stijfheid van de individuele cellen vóór en na het rekken te meten. De resultaten tonen directe schade aan de cellen als gevolg van de toegepaste rek.

Ook op basis van fluorescentiebeeldvorming wordt aangetoond dat de productie van reactieve zuurstofcomponenten toeneemt bij rek. Deze methode kan belangrijke vragen binnen het vakgebied van de longmechanische biologie beantwoorden, zoals de vraag of epitheelcellen beschadigd kunnen raken door mechanische ventilatie. Deze methode kan inzicht bieden in de mechanische biologie van longcellen en kan ook worden toegepast op andere zachte weefsels, zoals coupes van de lever of de groeischijf.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege de onconventionele combinatie van instrumenten die in deze experimenten worden gebruikt, zoals de atoomkrijtmicroscoop. Begin met het prepareren van een collageen-gecoat PDMS-membraan dat is aangepast voor gebruik in celculturen, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Zaai vervolgens muis-longepitheelcellen in een dichtheid van 2,5 miljoen cellen per well op een steriel, flexibel collageen-gecoat membraan.

Incubeer de cellen gedurende twee dagen bij 37 °C en 5%CO2 totdat de cellen confluent zijn. Gebruik vervolgens een biopsietang van 1,5 mm om in elk van de zes klemtabs twee gaten te ponsen, 20,5 mm vanaf het centrum van het construct indien er geen voorspanning gewenst is. Verwijder daarna het celkweekmedium.

Zorg ervoor dat de mechanische actuator zich in een positie met nulrek bevindt en positioneer het membraan op de rekker, zodat de ponsgaten overeenkomen met de pinnen en de klemmen. Plaats de bovenklemmen en draai vervolgens de schroeven één voor één aan, waarbij u afwisselt tussen de verschillende zijden. Voeg één milliliter celkweekmedium toe voordat u het apparaat op de microscopietafel plaatst.

Centreer het apparaat in het lichtpad. Bevestig vervolgens het apparaat aan de tafel. Stel scherp op het membraan door de horizontale en verticale posities van het mechanische apparaat aan te passen met een tafelcontroller van de microscoop in het bestemmingsingangsblok.

Voer een waarde voor de motorentelling in, die overeenkomt met het gewenste reklevel dat moet worden toegepast. Stel vervolgens de waarde in het invoerblok voor de snelheid in op 10 RPM of minder om hetzelfde veld voor en na de rekwaarneming te kunnen observeren, aangezien het veld kan verschuiven ten opzichte van het microscoopobjectief en het tijdens het rekken mogelijk nodig is om de microscooptafel bij te stellen. Zodra alles is ingesteld, klikt u op go.

Begin met het maken van aanpassingen aan de atoomkrijtmicroscoop. Verhoog de hoogte van de FM-kop naar de maximale positie in de Z-richting. Plaats vervolgens verlengstukken op de poten om het vlak te verhogen waarop een FM-cantilever het monster raakt.

Verwijder vervolgens de scannerplaat van de AFM en het gewenste objectief uit de microscoop. Voeg een afstandhouder toe aan het objectief en monteer dit vervolgens weer op de microscoop. Plaats daarna de scannerplaat terug op de AFM. De hoogte van de afstandhouder is afhankelijk van het objectief en de specifieke AFM-opstelling, maar het gebruik van de afstandhouder is noodzakelijk als optische beeldvorming gewenst is, aangezien het observatievlak in de Z-richting zal verschuiven.

Start vervolgens de AFM-software, de software van de optische microscoop en alle benodigde lichtbronnen, inclusief de lichtbron voor fluorescentiemetingen. Plaats een chip met een cantileverbalk met een stijfheid van 200 pN/nm of minder op de AFM om de elasticiteitsmodulus van levende cellen te meten. Lijn daarna de laser uit, plaats vervolgens een glazen dekglas op het apparaat en gebruik dit om de stijfheid van de cantilever te kalibreren volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Snijd direct voor het bevestigen van het membraan aan het rekanaliseerapparaat de wanden tot een hoogte van ongeveer 1 mm.

Dit vermindert de interferentie tussen de membraanwanden en de loadcell. Verwijder vervolgens het celkweekmedium en monteer het membraan op het mechanische apparaat. Plaats het mechanische apparaat met de adapter op de scanner met behulp van de software.

Rek het membraan uit tot het gewenste niveau van trekspanning voorafgaand aan de nano-indentatie. Voeg 0,5 milliliter of minder medium toe aan de cellen om ze gehydrateerd te houden, maar neem voorzorgsmaatregelen om morsen te voorkomen, aangezien dit de FM-scanner of microscoop kan beschadigen. Breng vervolgens de cantilever-balk in contact met het membraan.

Volg het protocol van het specifieke AFM-apparaat om de gebieden van belang te scannen. Wanneer een rek van 20% werd toegepast op cellen die op het membraan waren gezaaid, verplaatsten de cellen zich met 20% zoals hier aangegeven; de impact van de cellen op de productie van reactieve zuurstofverbindingen werd gemeten in bronchiale epitheelcellen met behulp van een cumulatieve mitochondriale superoxide-sensor, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. In afwezigheid van mechanische rek nam de ROS-productie niet significant toe gedurende 60 minuten wanneer een enkele rek van 17% werd toegepast en gehandhaafd.

Er was een toename van mitochondriale ROS die nog 60 minuten aanhield bij de integratie van de mechanische rekker in de atoomkrachtmicroscoop. De elastische modulus en kaarten van epitheelcellen uit de long van muizen vóór en na 10% trekrek werden verkregen uit de hier omlijnde regio's. Er werden 300 individuele forced deflection-curves geregistreerd over een gebied van 40 bij 40 micrometer, wat een verandering in de lokalisatie van regio's met een hoge modulus liet zien bij het toepassen van rek.

Zodra de techniek onder de knie is, kan het rekken van cellen in 15 minuten worden uitgevoerd. Terwijl een FM-nano-indentatie twee uur in beslag kan nemen om correct te worden uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de cellen voorzichtig maar snel moeten worden behandeld, aangezien de resultaten nadelig kunnen worden beïnvloed door agitatie en langdurige blootstelling aan kamerlucht voordat de gegevens worden gerapporteerd. Vergeet niet dat werken met een FM extreem uitdagend kan zijn.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het weghouden van alle vloeistoffen bij de scanner.