Live cell imaging tijdens Mechanical Stretch

Het algemene doel van het volgende experiment is om de rol van mechanische spanning op celmechanobiologie in bijna real-time te observeren. Dit wordt bereikt door eerst een systeem te construeren met flexibele membranen waarop cellen worden gekweekt en gestrekt. Als tweede stap rek de membraan uit om motortellingen met membraanspanning te kalibreren.

Vervolgens worden muislong-epitheelcellen gestrekt en worden de kernen geïmageert. Om te laten zien dat de membraanspanning wordt overgebracht naar cellen, worden de stretchers vervolgens geïntegreerd in de A FM voor nano-indentatie om de stijfheid van de individuele cellen vóór en na het strekken te meten. De resultaten tonen directe schade aan de cellen als gevolg van toegepaste rek.

Ook op basis van fluorescentiebeeldvorming wordt aangetoond dat de productie van reactieve zuurstofsoorten toeneemt met het strekken. Welnu, deze methode kan sleutelvragen in het veld van long mechanische biologie beantwoorden, zoals of de epitheelcellen kunnen worden beschadigd door mechanische beademing. Deze methode kan inzicht geven in longcel-, mechanische biologie en kan ook worden toegepast op ander zacht weefsel zoals lever of groeiplaksnijdingen.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen vanwege de onconventionele combinatie van gereedschappen die in deze experimenten worden gebruikt, zoals de atoomkrachtmicroscoop. Om te beginnen, bereid een met collageen gecoate PDMS-membraan voor die is aangepast voor gebruik in celkweek zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Zaai vervolgens muislong-epitheelcellen bij 2,5 miljoen cellen per put op een steriele, flexibele met collageen gecoate membraan.

Incubeer de cellen gedurende twee dagen op 37 graden Celsius en 5% CO2 tot de cellen confluïteit bereiken. Gebruik vervolgens een 1,5 millimeter biopsie-punch om twee gaten in elk van de zes klemtaban te ponsen, 20,5 millimeter vanaf het centrum van de constructie als er geen voorspanning gewenst is. En verwijder het celkweekmedium.

Zorg ervoor dat de mechanische actuator zich in een nulspanningpositie bevindt en plaats de membraan op de stretcher zodat de ponsgaten in lijn komen met de pinnen en de klemmen. Plaats de bovenste klemmen op hun plaats en draai vervolgens de schroeven een voor een vast, afwisselend verschillende kanten. Voeg een milliliter celkweekmedium toe voordat u het apparaat op de microscooptafel plaatst.

Centreer het apparaat op de lichtpad. Bevestig vervolgens het apparaat op de tafel. Focus op de membraan door de in-plane en verticale posities van het mechanische apparaat aan te passen met een stapcontroller van de microscoop in het bestemmingsinputblok.

Voer een motortellingswaarde in die overeenkomt met de gewenste spanningsniveau die moet worden toegepast. Stel vervolgens de waarde in het snelheidsinputblok in op 10 RPM of minder om hetzelfde veld vóór en na het strekken te observeren, aangezien het veld mogelijk verschuift ten opzichte van het microscoopobjectief en het mogelijk is noodzakelijk om de microscooptafel tijdens het strekken aan te passen. Zodra alles is ingesteld, klikt u op gaan.

Begin met het aanpassen van de atoomkrachtmicroscoop. Verhoog de hoogte van de a FM-kop tot zijn maximale positie in de Z-richting. Plaats vervolgens extenders op de poten om het vlak waarop a FM-kantelever contact maakt met het monster te verhogen.

Verwijder vervolgens de A FM-scannerplaat en het gewenste objectief uit de microscoop. Voeg een spacer toe aan het objectief en monteer het vervolgens terug op de microscoop. Plaats vervolgens de scannerplaat terug op de A FM. De hoogte van de spacer hangt af van het objectief en specifieke a FM-setup, maar het is noodzakelijk om de spacer te gebruiken als optische beeldvorming gewenst is, aangezien het observatieplan in de Z-richting zal verschuiven.

Start vervolgens de A FM-software, de optische microscoopsoftware en alle noodzakelijke lichtbronnen, inclusief de lichtbron voor fluorescentiemetingen. Monteer een chip met een cantileverbalk met een stijfheid van 200 pico newton per nanometer of minder voor het meten van de elastische modulus van levende cellen op de A FM. Richt vervolgens de laser uit en monteer een glazen deksel op het apparaat en gebruik dit om de cantileverstijfheid te kalibreren volgens de suggesties van de fabrikant. Snijd direct voordat u de membraan op het rekapparaat monteert, de wanden af tot ongeveer een millimeter hoog.

Dit vermindert de interferentie die wordt ervaren tussen de membraanwanden en de belastingscel. Verwijder vervolgens het celkweekmedium en monteer het membraan op het mechanische apparaat. Plaats het mechanische apparaat met de adapter op de scanner met behulp van de software.

Strek de membraan uit tot het gewenste trekspanningsniveau vóór nano-indentatie. Voeg 0,5 milliliter of minder medium toe aan de cellen om ze gehydrateerd te houden, maar pas op om een lekkage te voorkomen die de a FM-scanner of microscoop kan beschadigen. Bevestig vervolgens de cantileverbalk met de membraan.

Volg het protocol van het specifieke A FM-apparaat om gebieden van belang te scannen. Toen een 20%spanning werd toegepast op cellen die op de membraan waren gezaaid, verplaatsten de cellen zich 20% zoals hier aangegeven, de impact van cellen op de productie van reactieve zuurstofsoorten werd gemeten in bronchiale epitheelcellen met behulp van een cumulatieve mitochondriale superoxide sensor zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Bij afwezigheid van mechanische rek werd de ROS-productie gedurende 60 minuten niet significant verhoogd toen een enkele 17%-rek werd toegepast en gehandhaafd.

Er was een toename van mitochondriale ROS die 60 minuten aanhield met de integratie van de mechanische stretcher in de atoomkrachtmicroscoop. Elastische modulus, kaarten van muislong-epitheelcellen vóór en na 10%trekspanning werden verkregen uit de hier omlijnde gebieden. 300 individuele gedwongen uitwijkingscurven werden geregistreerd over een gebied van 40 bij 40 micrometer, wat een verandering in de lokalisatie van gebieden met hoge modulus toonde met de toepassing van spanning.

Eenmaal onder de knie kan celstrekken in 15 minuten worden gedaan. Terwijl a FM nano