Muis Naïve CD4 + T Cell Isolatie en In vitro Differentiatie in T cel subsets
16 april 2015
Naïve CD4+ T-cellen polariseren naar verschillende subsets, afhankelijk van de omgeving op het moment van activering. De differentiatie van naïve CD4+ T-cellen naar verschillende effector-subsets kan in vitro worden bereikt door de toevoeging van T-celreceptor-stimuli en specifieke cytokine-signalen.
Het algemene doel van de volgende procedure is om naïeve CD vier positieve T-cellen, geïsoleerd uit muizenlymfeklieren en milten, te polariseren in verschillende T-helpersubsets. In vitro wordt dit bereikt door eerst milten en lymfeklieren te verwerken die zijn geoogst uit volwassen wildtype muizen. In de tweede stap wordt de CD vier positieve celpopulatie verrijkt door magnetische kralenscheiding en vervolgens verder gesorteerd op basis van hun naïeve T-celmarkerexpressie.
In de laatste stap worden de cellen behandeld met T-celreceptor activerende factoren en polariserende cytokinen om hun differentiatie in verschillende T-helperlijnen te induceren. Uiteindelijk worden flowcytometrie, Elis A en real-time PCR gebruikt om de efficiëntie van de T-helperceldifferentiatie te beoordelen.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het T-helpercelveld, zoals hoe de expressie van specifieke moleculen of de behandeling met specifieke geneesmiddelen de aard van een T-celrespons beïnvloedt. Begin door de ledematen van een 5 tot 10 weken oude C 57 zwarte zes muis aan het dissectiebord te spelden en snij vervolgens de huid longitudinaal van de anus tot de kin, zorg ervoor dat het onderliggende peritoneale weefsel niet wordt doorboord. Speld vervolgens de huid open en gebruik een paar forceps om de lymfeklieren vast te grijpen en een ander om het weefsel te scheiden van elke locatie die in de afbeelding is aangegeven.
Wanneer elke lymfeklieren wordt geoogst, plaats deze in een verzamelbak met PBS aangevuld met 1%FBS of PBS plus en open vervolgens voorzichtig het peritoneum en verwijder de milt. Plaats de milt ook in de verzamelbak en breng de bak over naar een ijskoude emmer om de CD vier positieve cellen te verrijken. Verdeel de lymfeklieren in de milten in twee afzonderlijke 60 millimeter schalen met elk drie milliliter PBS plus met behulp van steriele forceps.
Plaats vervolgens een vierkant van steriele nylon gaas over de milten en gebruik de duimkant van een spuitkolf om ze voorzichtig tegen het gaas te drukken totdat bijna al het weefsel in suspensie gaat. Pipet de suspensie een paar keer op en neer om de resterende oplosbare klonten te breken en plaats vervolgens een nieuw stuk nylon gaas over de opening van een 15 milliliter conische buis. Filter de suspensie in de buis om eventueel achtergebleven vuil te verwijderen.
Herhaal nu de mechanische dissociatie voor de lymfeklieren en vul beide buizen met gefilterde cellen met PBS plus. Draai vervolgens de buizen een paar keer om en centrifugeer de cellen. Breng het lymfeklierpellet weer op schorten in twee milliliter PBS.
Voeg een milliliter ijskoud, een CK-oplossing per muis toe aan het miltcelpellet. Stop na een minuut de lysis van de rode bloedcellen met 10 milliliter PBS plus. Draai de buis om en centrifugeer de cellen opnieuw.
Resuspendeer vervolgens het miltpellet in 10 ml PBS plus, voeg de lymfekliercellen toe en centrifugeer de gepoolde celsuspensie. Resuspendeer dit keer het pellet in 15 microliter CD vier magnetische kralen verdund in 85 microliter PBS plus per muis gedurende 15 tot 30 minuten bij vier graden Celsius. Verdun vervolgens de cellen in 10 milliliter PBS plus.
Filter de suspensie door een nylon zeef in een nieuwe 15 milliliter buis en centrifugeer de cellen. Resuspendeer het pellet opnieuw in 100 microliter PBS plus per muis en selecteer positief voor de CD vier positieve cellen door magnetische kralenselectie volgens de instructies van de fabrikant. Na het verkrijgen van de CD vier positieve positieve celfractie, spoel de cellen in 10 milliliter PBS plus om de CD vier positieve T-celfractie te sorteren.
Label vervolgens de cellen met de juiste fluorescente antilichamen gedurende 15 tot 30 minuten bij vier graden Celsius in het donker na wassen. Filter de gelabelde cellen om eventueel vuil te verwijderen en breng ze over in een faxbuis op ijs en bescherm deze tegen licht. Sorteer de CD vier positieve, CD 25 negatieve CD 62 L positieve CD 44 negatieve populatie in compleet RPMI-medium. Wanneer alle cellen zijn verzameld.
Was de naïeve T-cellen in vers, compleet medium. Resuspendeer vervolgens het pellet en het complete RPMI tel de naïeve T-cellen en pas de concentratie aan tot een keer 10 tot zes cellen per milliliter om in vitro T-helpersubsetdifferentiatie te induceren. Was vervolgens elke put van celcultuurplaten die eerder zijn gecoat met anti CD drie en anti CD 28 in een milliliter steriele FBS-vrije PBS en plateer.
De cellen suppleren ten slotte het kweekmedium met de juiste cytokinen en blokkerende antilichamen zoals beschreven in de tabel en incuberen de cellen bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide gedurende vier tot vijf dagen na vier tot vijf dagen in cultuur. Intracellulaire cytokinekleuring van de CD vier positieve T-cellen uit de in vitro gedifferentieerde TH een, TH twee inductibele treg en TH 17 culturen kan worden uitgevoerd. Om te bevestigen dat elke T-celsubset het verwachte cytokineprofiel vertoont.
Inderdaad, na 24 uur re-stimulatie met anti CD drie EISs, toont A aan dat de subsets ook de corresponderende extracellulaire productie van de intracellulair tot expressie gebrachte cytokine-eiwitten vertonen. Real-time PCR voor lijnspecifieke transcriptiefactoren verifieert verder de juiste transcriptiefactorprofielen van de in vitro gedifferentieerde CD vier positieve T-celsubsets. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u naïeve CD vier positieve T-helpercellen kunt isoleren en verwerken om lymfeklieren en miltcellen te verkrijgen.
Bovendien kunt u deze T-cellen differentiëren in TH een, TH twee TH 17 of ireg cellen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een procedure om naïeve CD4 + T-cellen te polariseren tot verschillende T-helper-subsets met behulp van in vitro-technieken. Het proces omvat het isoleren van cellen uit lymfeklieren en milten van muizen, het verrijken van de CD4 + T-celpopulatie en het behandelen ervan met specifieke stimuli en cytokinen.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Immunologie
- Celbiologie
- Neurowetenschap
Achtergrond
- Naïve CD4 + T-cellen kunnen differentiëren in diverse effector-subsets.
- Het differentiatieproces wordt beïnvloed door omgevingsfactoren tijdens de activatie.
- In vitro methoden maken een gecontroleerde studie van T-celpolarisatie mogelijk.
- Flowcytometrie en PCR worden gebruikt om de differentiatie-efficiëntie te beoordelen.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode vast te stellen voor de polarisatie van naïeve CD4 + T-cellen.
- Om de effecten van T-celreceptorstimuli en cytokinen op differentiatie te onderzoeken.
- Om een kader te bieden voor het bestuderen van T-helpercel-lijnen.
Gebruikte methoden
- Isolatie van naïeve CD4 + T-cellen uit lymfeklieren en milten van muizen.
- Magnetische bead-separatie om de CD4 + T-celpopulatie te verrijken.
- Sortering op basis van de expressie van naïeve T-celmarkers.
- Behandeling met T-celreceptor-activerende factoren en polariserende cytokinen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle polarisatie van naïeve CD4 + T-cellen tot verschillende T-helper-subsets.
- Flowcytometrie en real-time PCR bevestigden de differentiatie-efficiëntie.
- De impact van specifieke cytokines op het lot van T-cellen werd aangetoond.
- Inzichten in de biologie van T-cellen en potentiële therapeutische toepassingen werden geboden.
Conclusies
- De methode polariseert naïeve CD4 + T-cellen in vitro op effectieve wijze.
- De bevindingen verbeteren het begrip van de mechanismen van T-celdifferentiatie.
- Potentiële implicaties voor immunotherapie en de ontwikkeling van vaccins.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Het isoleren en differentiëren van naïeve CD4+ T-cellen van muizen maakt mechanistische analyse mogelijk van cytokinesignaleringspaden die de commitment van T-helper-subsets aansturen. Deze aanpak ondersteunt targetvalidatie bij de ontdekking van immunomodulerende geneesmiddelen door moleculaire perturbaties te koppelen aan functionele immuunfenotypen. De methode biedt een schaalbaar, reproduceerbaar systeem voor het verminderen van risico's bij biologicals of kleine moleculen die bedoeld zijn om de adaptieve immuniteit te moduleren.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt hypothesetests mogelijk over hoe specifieke moleculen of geneesmiddelen de differentiatie van T-cellen beïnvloeden.
- Operationele waarde: Biedt een gecontroleerd in vitro systeem om variabelen te isoleren die de commitment aan de Th1-, Th2-, Th17- of Treg-lijn beïnvloeden.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door targetmodulatie te koppelen aan lijn-specifieke cytokine- en transcriptiefactoroutputs.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Genereert gedifferentieerde T-helper-subsets met kwantificeerbare cytokine- en transcriptiefactor-readouts.
- Reproduceerbaarheid: Een gestandaardiseerde isolatie- en polarisatieworkflow maakt consistente screening van verbindingen over verschillende experimenten mogelijk.
- Schaalbaarheid: Verrijking met magnetische beads en FACS-sortering maken de verwerking van voldoende celaantallen mogelijk voor multi-well assay-formaten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Modelleert cytokine-gestuurde T-helperpathologieën die relevant zijn voor auto-immuunziekten, ontstekingsziekten en infectieziekten.
- Translationele continuïteit: Gedifferentieerde subsets kunnen opnieuw worden gestimuleerd en worden geanalyseerd op functionele cytokineproductie, waardoor in vitro bevindingen worden verbonden met ex vivo validatie.
- Afstemming op biomarkers: Lijnage-specifieke transcriptiefactoren (bijv. T-bet, GATA3, RORγt, FoxP3) dienen als mechanistische biomarkers voor target engagement.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot preklinische mechanistische studies, wat een iteratief ontwerp van immunomodulatoren mogelijk maakt.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt het onderzoek naar TCR-signalering en de effecten van het cytokinemilieu op beslissingen over het lot van T-cellen.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, gepolariseerde T-celpopulaties voor het beoordelen van de invloed van verbindingen op subsetdifferentiatie.
- Analytica: Flowcytometrie en real-time PCR bieden kwantitatieve, multiparametrische read-outs voor lineage-commitment en signaleringsefficiëntie.
- Translationeel onderzoek: Maakt beoordeling van de functionaliteit van gedifferentieerde subsets mogelijk via cytokinestimulatie, ter ondersteuning van preklinische validatie.
- Hergebruik binnen de organisatie: De kernworkflow voor isolatie en differentiatie kan worden aangepast voor meerdere doelwitklassen en cytokinesecondities.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Mechanisch inzicht in de effecten van targets op de specificatie van de T-helper-lijn en immuunpolarisatie.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde celisolatie, differentiatie en analytische readouts verbeteren de reproduceerbaarheid van de assay.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door targetmodulatie in een vroeg stadium van de discovery-fase te koppelen aan functionele immuunresultaten.
- Impact op portfolio: Faciliteert de prioritering van immunomodulerende kandidaten op basis van voorspellende T-celdifferentiatieprofielen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de verwerking van muisweefsel, magnetische bead-separatie en fluorescence-activated cell sorting.
- Afhankelijk van een steriele celkweekinfrastructuur, cytokine-reagentia en flowcytometrie- of qPCR-apparatuur.
- Vereist standaardisatie tussen operators voor een consistente isolatie van naïeve T-cellen en subset-polarisatie.
- Aanpassing aan alternatieve muizenstammen of ziekte modellen kan optimalisatie van de cytokine-condities vereisen.
- Beperkingen omvatten donorvariabiliteit en de noodzaak om te valideren of in vitro bevindingen de in vivo biologie weerspiegelen.
