Name: Muis Naïve CD4 + T Cell Isolatie en In vitro Differentiatie in T cel subsets (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Leer naïve CD4+ T-cellen isoleren uit muislymfklieren en -milt en differentiëren naar T-helper-subtypen in vitro met magnetische bead-separatie en polariserende cytokines.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag alle leden van de Reynolds lab aan Rosalind Franklin Universiteit van Geneeskunde en Wetenschap, en de Chen Dong lab aan de Universiteit van Texas MD Anderson Cancer Center bedanken voor de optimalisatie van dit protocol. Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​aan JMR van de National Institutes of Health (K22AI104941).

Alle experimentele procedures worden uitgevoerd met behulp van protocollen door het kantoor van milieu, gezondheid en veiligheid op het Rosalind Franklin University of Medicine and Science goedgekeurd. C57BL / 6 muizen (gekocht van NCI) gebruikt voor dit protocol werden gehuisvest onder specifieke pathogeen-vrije omstandigheden, en alle dierlijke experimenten werden uitgevoerd met behulp van protocollen door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) goedgekeurd op de Rosalind Franklin Universiteit van Geneeskunde en wetenschap. 1. Voorbereiding van de instrumenten, Supplies, en reagentia <ol><li> Coat 48 putjes of 24 putjes met anti-CD3 en anti-CD28 (Tabel 1) in steriele PBS, deksel en verpakken in parafilm verdamping en besmetting te voorkomen, en vervolgens geïncubeerd O / N bij 4 ° C de dag voordat T celisolatie. Als alternatief jas putten 1 uur bij 37 o C. Voer Th0, Th1, Th2 en iTreg omstandigheden door bekleding zowel anti-CD3 en anti-CD28 bij 1 ug / ml in 0,5-1 mlTal volume (48-well plaat). Voor Th17, wij doorgaans laag anti-CD3 bij 2 ug / ml en anti-CD28 bij 1 ug / ml. OPMERKING: Wij hebben gevonden dat een lagere anti-CD3 concentratie optimaal voor Th1, Th2 en iTreg, terwijl ze een hogere anti-CD3 concentratie optimaal voor Th17 genereren. Daarom moet anti-CD3 en anti-CD28 concentraties worden getitreerd en geoptimaliseerd voor elk laboratorium (tabel 2). </li><li> Steriliseren een set van dissectie instrumenten (schaar en pincet) door autoclaaf of desinfecterende oplossing. Een buis of een klein bekerglas met 70% ethanol nodig zal zijn voor snelle sterilisatie van instrumenten tussen dissecties. Uiteindelijk zal een spuitfles met 70% ethanol nodig voor het steriliseren van het oppervlak van de muis vóór versnijding. </li><li> Bereid een dissectie oppervlak door het wikkelen van een plat stuk piepschuim of prikbord in aluminiumfolie. Opheldering pinnen of naalden worden gebruikt om het dier vast te zetten. </li><li> Bereiden gerechten of platen voor het verzamelen van tissues. Als het bundelen van weefsels, aparte 60mm gerechten met 3 ml steriele PBS + 1% FBS (PBS +) voor de milt en lymfeklieren weefsels is voldoende. Als het houden van weefsels van individuele muizen scheiden, bereiden een 24-wells plaat met 1 ml PBS + in het gewenste aantal putten. </li><li> Bereid compleet RPMI media voor celkweek en pre-warm voor gebruik (tabel 1). OPMERKING: We routinematig gebruik RPMI maar andere media zoals IMDM en DMEM kunnen even effectief of hoger afhankelijk van het laboratorium en het experiment. </li><li> Cut 2x2 cm vierkantjes van nylon gaas met 120 urn poriegrootte en autoclaaf te steriliseren (tabel 1). </li><li> Optioneel: als u de high-speed magnetische cel sorteersysteem zoals AutoMACS voor CD4 + cel verrijking, pre-warm stromend en spoelen buffers in een 37 o C waterbad om schade aan de machine te voorkomen. </li><li> OPMERKING: verrijking wordt aanbevolen om het sorteren opbrengst verhogen en de sorteertijd. </li><li> Allebereidingsstappen, behalve dissectie, moet worden uitgevoerd in een steriele weefselkweek kap. </li></ol> 2. Isolatie van de lymfeklieren en de milt van Muizen <ol><li> Euthanaseren het gewenste aantal dieren met een institutioneel goedgekeurd techniek. Gebruik C57BL / 6 vrouwelijke muizen, 5-10 weken oud, vanwege hun hoge percentage naïeve T-cellen en minder lichaamsvet in vergelijking met mannen of oudere muizen. OPMERKING: Cellen afkomstig van mannelijke muizen zullen ook optreden in vitro en het protocol stappen blijven dezelfde. Vrouwelijke muizen, 5-10 weken oud, zal typisch opbrengst 3-6 x 10 6 naïeve CD4 + -T-cellen per muis. Echter, kunnen volgens verschillende muizenstammen opbrengst en prestaties beïnvloeden. Bijvoorbeeld, cellen van C57BL / 6 muizen zijn beter voor het genereren van Th1 cellen terwijl cellen van Balb.c muizen zijn beter voor het genereren van Th2 cellen. </li><li> Spreid de poten van het dier en zet ze op hun plaats zoals getoond in figuur 1. Snijd de huid langeitudinally van de anus tot aan de kin, terwijl dat evenwel niet tot diepere weefsel te doorboren. </li><li> Spreid de huid met tang geopend en speld de huid in plaats gemakkelijke toegang tot lymfeklieren mogelijk zoals weergegeven in figuur 1. </li><li> Oogst de toegankelijke lymfeknopen van de in figuur 1 plaatsen. Grijpen de lymfeklier met een pincet terwijl scheiden weefsel met een pincet is gemakkelijk te verwijderen. Plaats het weefsel in de opvangschaaltje. </li><li> Oogst de milt van de in figuur 1 plaats. In dit geval wordt het nauwkeurig snijden in het peritoneum die de bereikbaarheid van de milt te winnen. Plaats het weefsel in een verzameling schotel. </li><li> Herhaal deze procedure als er meer weefsels zal worden geoogst. Anders gaat u verder met de volgende stappen. Op dit moment voert alle overige stappen op ijs tot de beplating van de T-cellen na sortering. </li></ol> 3. Weefsel bewerken en CD4 + Verrijking<ol><li> Verwerk de lymfeklieren en milt verschillende gerechten op het rendement lymfeknoop cel preparaten erytrocyten lysis vereisen, wat kan resulteren in kleine leukocyten dood verhogen. Daarom is de volgende stappen beschrijven een werkwijze voor het verwerken milt en lymfeklieren populaties afzonderlijk gevolgd door het combineren vóór labeling voor het sorteren. </li><li> Verwijder het weefsel (milt of gepoolde lymfeklieren) uit de collectie schaaltje en plaats in een nieuwe 60 mm schotel met 3 ml PBS +. Plaats een vierkant van steriele nylon met een gesteriliseerde pincet gaas over het weefsel. </li><li> Neem de duim zijde van een zuiger (3-10 ml) en voorzichtig smash het weefsel tegen het gaas. Vrijwel alle weefsels moet gaan in suspensie. Als alternatief kunt u het weefsel tussen twee geautoclaveerd mat glijbanen en vermalen tot schorsing. </li><li> Pipet de schorsing op en neer een paar keer te breken van de resterende oplosbare bosjes. Plaats een nieuw vierkant stuk nylon gaas over de opening van een15 ml conische buis en filtreer de suspensie door de resterende vuil te verwijderen. </li><li> Herhaal stap 2-4 voor extra lymfeklieren en milt weefsel. </li><li> Wanneer de opschorting is gefilterd in een 15 ml buis vul de rest van de buis met PBS + en meerdere malen zwenken. Centrifugeer de cellen bij 475 g gedurende 5 min bij 4 ° C </li><li> Voor de miltcellen, zuig de supernatant na centrifugeren en resuspendeer de celpellet in 1 ml ijskoude 1X ACK oplossing per milt gedurende 1 min erytrocyten te lyseren. Voeg vervolgens 10 ml PBS + bovenop de ACK, draai de buis en centrifugeer 475 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C </li><li> Voor lymfkliercellen, zuig de supernatant en resuspendeer in 2 ml PBS +. Desgewenst kunnen deze worden gecombineerd met de miltcellen na ACK lysis en wasstap. </li><li> Zuig de supernatant na centrifugeren van de splenocyten en resuspendeer in een 10 ml PBS +. Op dit punt kan de lymfeklier schorsing eenT OEGEVOEGDE bovenop de milt suspensie als weefsel pooling vereist voor het sorteren. Centrifugeer de buis opnieuw bij 475 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C </li><li> De celpellet kan nu worden voorbereid CD4 verrijking. Als deze stap niet wordt uitgevoerd, ga dan naar het sorteercentrum voorbereiding stappen. </li><li> Voor CD4 verrijking met behulp van de high-speed magnetische cel sorteersysteem, resuspendeer de cellulaire pellet met CD4 kralen. Typisch 15 gl kralen verdund in 85 pi PBS + wordt gebruikt om de weefsels label van 1 muis. Ramp het volume van de kraal mengsel behoefte, resuspendeer de pellet en incubeer gedurende 15-30 min bij 4 ° C </li><li> Was de cellen met 10 ml PBS +, passeert de suspensie door nylon in een nieuwe buis van 15 ml om vuil en centrifugeer opnieuw bij 475 xg verwijderen gedurende 5 minuten bij 4 ° C </li><li> Resuspendeer de pellet in 100 ul PBS + per muis en ga verder met positieve selectie op de high-speed magnetische cel sorteersysteem. Bij gebruik van een handmatige scheiding systeem, folg de instructies van de fabrikant voor verrijking. Alternatief resuspendeer de monsters in FACS buffer: PBS met 1 mM EDTA (pH = 8) en 1% BSA, steriel-gefiltreerd. </li><li> Verwijder de positieve fractie en was opnieuw met 10 ml PBS +. De verrijkte CD4 + fractie is nu klaar voor het sorteren worden geëtiketteerd. </li></ol> 4. sorteren Naïeve CD4 + T-cellen <ol><li> Label de celpellet met PBS + met fluorescente antilichamen gericht tegen CD62L, CD44, CD25 en CD4. Bij gebruik van de in tabel 1 vermelde antilichamen, worden verdunningen voor elk ontvangen. Voor kleuring wordt een volume van 100 ul van het antilichaam cocktail gebruikt per weefsel van een muis. </li><li> Resuspendeer de pellet in antilichaam cocktail en incubeer gedurende 15-30 min bij 4 ° C in het donker. </li><li> Was de cellen met 10 ml PBS + en centrifugeer 475 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C </li><li> Passeert het mengsel over een ander nylon filter of cel zeefdop opnieuwbewegen overgebleven puin. Pipetteer de gelabelde cellen in een buis die geschikt voor de cel sorter is. Houd cellen op ijs en beschermd tegen het licht tot de soort. </li><li> Bereid verzamelbuizen pipetteren 1-2 ml van volledig RPMI media of FBS onder in buizen geschikt voor het verzamelen van een celsorteerder. </li><li> Sorteer de naïeve CD4 + T-cellen als CD4 + CD25 - CD62L + CD44 - populatie (Figuur 2). Was de verzamelde cellen met volledige RPMI media en centrifugeren zoals boven beschreven. </li><li> Resuspendeer de pellet in volledige RPMI, tellen de naïeve cellen, en de concentratie aan te passen aan 1 x 10 6 cellen / ml. </li></ol> 5. Opstellen van de in vitro differentiatie <ol><li> Zuig de putjes van de anti-CD3 en anti-CD28 beklede platen en wassen elk putje met 1 ml steriele PBS (zonder FBS). Voor 48-well platen, plaat 0,5 x 10 6 cellen / putje in 0,5 ml RPMI. Voor 24-well platen, cultuur 1 x 10 6 cellen / putje in 1,0 ml RPMI. </li><li> Bij het testen van de invloed van een factor zoals een geneesmiddel voeg de stof de geschikte putjes vóór, tijdens of na het differentiatieproces afhankelijk van het experiment. Vervolgens vullen de cultuur media met cytokines en blokkerende antilichamen dienovereenkomstig. Th0: 30 U / ml hIL-2. Th1: 15 ng / ml rmIL-12, 30 U / ml hIL-2, en 5,000 ng / ml 11B11.Th2: 10 ng / ml rmIL-4, 30 U / ml hIL-2, 2000 ng / ml oplosbaar 37,51, en 5000 ng / ml XMG1.2. iTreg: 15 ng / ml hTGFβ, 30 U / ml hIL-2, 5000 ng / ml XMG1.2 en 5000 ng / ml 11B11. Th17: 20 ng / ml rmIL-6, 3 ng / ml hTGFβ, 5000 ng / ml XMG1.2 en 5000 ng / ml 11B11. Opmerking: De hierboven weergegeven omstandigheden werden optimaal gevonden voor het maximaliseren cytokineproductie gemeten aan het einde van de differentiatie experiment (Representatieve resultaten sectie) zijn. Wel moet elke voorwaarde worden geoptimaliseerd voor elk laboratorium (tabel 2 </strong&gt;). Bovendien heeft de toevoeging van oplosbare anti-CD28 in aanvulling op de plaat gebonden anti-CD28 gebleken Th2 cytokine productie verhogen in ons laboratorium, maar heeft geen effect op andere T-cel subsets: </li><li> Incubeer de plaat bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 4-5 dagen voorafgaand aan de analyse van genexpressie en cytokineproductie. Als alternatief, verwijder de cellen van de TCR stimuli na 2 d, aangepast tot 1 x 10 6 cellen / ml met vers medium, en de plaat in nieuwe putten (niet-gecoat) om proliferatie en uiteindelijke opbrengst te verbeteren. In dit geval wordt vers polariserende cytokines en antilichamen niet noodzakelijk maar 10 U / ml IL-2 zou nieuwe media worden toegevoegd Th0, Th1, Th2 en iTreg culturen. </li></ol> 6. Analyse van differentiatie <ol><li> Voor cytokine analyse door flowcytometrie, restimulate elk putje met 10 ng / ml PMA en 1000 ng / ml ionomycine of 1 ug / ml anti-CD3 gedurende 4-6 uur in de aanwezigheid van een golgi remmer zoals Brefeldine A (Tabel1). Voer intracellulaire cytokine kleuring afhankelijk van het experiment (figuur 3). OPMERKING: Stain niet-afstammings-specifieke cytokinen of transcriptiefactoren, zoals IL-4 (niet getoond) en IFNy (Figuur 3) voor Th17 culturen voor elke voorwaarde als negatieve controles en als indicator van differentiatie efficiency. Bovendien kunnen vlekken Foxp3 voor Th17 culturen als de reciproke ontwikkeling van Tregs optreden met de toevoeging van TGFp. </li><li> Voor eiwit kwantificering, verzamel de supernatanten van elk putje en assay van cytokine-specifieke ELISA (figuur 3). Als er bezorgdheid dat de factor geteste proliferatie beïnvloed vergeleken met controlemonsters, kunnen de cellen worden gewassen, geteld, genormaliseerd en vervolgens opnieuw gestimuleerd met 1 ug / ml anti-CD3 gedurende 24 uur voor het verzamelen van supernatanten van ELISA assays. Bij testen IL-4 van Th2 omstandigheden wassen en restimulating moet IL-4 verwijdert die liter wordeneftover vanaf de eerste differentiatie cultuur. </li><li> Voor analyse van genexpressie door real time PCR, oogst cellen na de incubatieperiode, wassen, normaliseren en opnieuw gestimuleerd voor 2-6 uur met 1 ug / ml anti-CD3 voor het oogsten mRNA (figuur 3). </li></ol>

<ol><li>Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+types+of+murine+helper+T+cell+clone.+I.+Definition+according+to+profiles+of+lymphokine+activities+and+secreted+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins.</a> J Immunol. 136 (7), 2348-2357 (1986).</li>
<li>Dong, C., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fate+decision%3A+T-helper+1+and+2+subsets+in+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res%22%5BJournal%5D)">Cell fate decision: T-helper 1 and 2 subsets in immune responses.</a> Arthritis Res. 2 (3), 179-188 (2000).</li>
<li>Hsieh, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+TH1+CD4%2B+T+cells+through+IL-12+produced+by+Listeria-induced+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeria-induced macrophages.</a> Science. 260 (5107), 547-549 (1993).</li>
<li>Seder, R. A., Gazzinelli, R., Sher, A., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+12+acts+directly+on+CD4%2B+T+cells+to+enhance+priming+for+interferon+gamma+production+and+diminishes+interleukin+4+inhibition+of+such+priming%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interleukin 12 acts directly on CD4+ T cells to enhance priming for interferon gamma production and diminishes interleukin 4 inhibition of such priming.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (21), 10188-10192 (1993).</li>
<li>Szabo, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+transcription+factor%2C+T-bet%2C+directs+Th1+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment.</a> Cell. 100 (6), 655-669 (2000).</li>
<li>Afkarian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-bet+is+a+STAT1-induced+regulator+of+IL-12R+expression+in+naive+CD4%5BTitle%5D)+AND+%22T+cells.+Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">T-bet is a STAT1-induced regulator of IL-12R expression in naive CD4.</a> T cells. Nat Immunol. 3 (6), 549-557 (2002).</li>
<li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+T-bet+is+induced+by+multiple+pathways+and+prevents+an+endogenous+Th2+cell+program+during+Th1+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcription factor T-bet is induced by multiple pathways and prevents an endogenous Th2 cell program during Th1 cell responses.</a> Immunity. 37 (4), 660-673 (2012).</li>
<li>Le Gros, G., Ben-Sasson, S. Z., Seder, R., Finkelman, F. D., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+interleukin+4+%28IL-4%29-producing+cells+in+vivo+and+in+vitro%3A+IL-2+and+IL-4+are+required+for+in+vitro+generation+of+IL-4-producing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of interleukin 4 (IL-4)-producing cells in vivo and in vitro: IL-2 and IL-4 are required for in vitro generation of IL-4-producing cells.</a> J Exp Med. 172 (3), 921-929 (1990).</li>
<li>Swain, S. L., Weinberg, A. D., English, M., Huston, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-4+directs+the+development+of+Th2-like+helper+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-4 directs the development of Th2-like helper effectors.</a> J Immunol. 145 (11), 3796-3806 (1990).</li>
<li>Zhang, D. H., Cohn, L., Ray, P., Bottomly, K., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+GATA-3+is+differentially+expressed+in+murine+Th1+and+Th2+cells+and+controls+Th2-specific+expression+of+the+interleukin-5+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Transcription factor GATA-3 is differentially expressed in murine Th1 and Th2 cells and controls Th2-specific expression of the interleukin-5 gene.</a> J Biol Chem. 272 (34), 21597-21603 (1997).</li>
<li>Zheng, W., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+GATA-3+is+necessary+and+sufficient+for+Th2+cytokine+gene+expression+in+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The transcription factor GATA-3 is necessary and sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells.</a> Cell. 89 (4), 587-596 (1997).</li>
<li>Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TH17+cells+in+development%3A+an+updated+view+of+their+molecular+identity+and+genetic+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming.</a> Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).</li>
<li>Jiang, S., Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+issue+on+CD4%28%2B%29+T-cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">A complex issue on CD4(+) T-cell subsets.</a> Immunol Rev. 252 (1), 5-11 (2013).</li>
<li>Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+and+Foxp3%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells and Foxp3.</a> Immunol Rev. 241 (1), 260-268 (2011).</li>
<li>Sakaguchi, S., Yamaguchi, T., Nomura, T., Ono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+and+immune+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells and immune tolerance.</a> Cell. 133 (5), 775-787 (2008).</li>
<li>Barzaghi, F., Passerini, L., Bacchetta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+dysregulation%2C+polyendocrinopathy%2C+enteropathy%2C+x-linked+syndrome%3A+a+paradigm+of+immunodeficiency+with+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, x-linked syndrome: a paradigm of immunodeficiency with autoimmunity.</a> Front Immunol. 3, 211(2012).</li>
<li>Shea, J. J., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+lineage+commitment+and+plasticity+of+helper+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4 T cells.</a> Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).</li>
<li>Zhou, L., Chong, M. M., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+CD4%2B+T+cell+lineage+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Plasticity of CD4+ T cell lineage differentiation.</a> Immunity. 30 (5), 646-655 (2009).</li>
<li>Harrington, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+17-producing+CD4%2B+effector+T+cells+develop+via+a+lineage+distinct+from+the+T+helper+type+1+and+2+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages.</a> Nat Immunol. 6 (11), 1123-1132 (2005).</li>
<li>Langrish, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-23+drives+a+pathogenic+T+cell+population+that+induces+autoimmune+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation.</a> J Exp Med. 201 (2), 233-240 (2005).</li>
<li>Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+lineage+of+CD4+T+cells+regulates+tissue+inflammation+by+producing+interleukin+17%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17.</a> Nat Immunol. 6 (11), 1133-1141 (2005).</li>
<li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+nuclear+receptor+RORgammat+directs+the+differentiation+program+of+proinflammatory+IL-17%2B+T+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells.</a> Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).</li>
<li>Chung, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+regulation+of+early+Th17+cell+differentiation+by+interleukin-1+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Critical regulation of early Th17 cell differentiation by interleukin-1 signaling.</a> Immunity. 30 (4), 576-587 (2009).</li>
<li>Reynolds, J. M., Martinez, G. J., Chung, Y., Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+4+signaling+in+T+cells+promotes+autoimmune+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 4 signaling in T cells promotes autoimmune inflammation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13064-13069 (2012).</li>
<li>Reynolds, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+2+signaling+in+CD4%28%2B%29+T+lymphocytes+promotes+T+helper+17+responses+and+regulates+the+pathogenesis+of+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 2 signaling in CD4(+) T lymphocytes promotes T helper 17 responses and regulates the pathogenesis of autoimmune disease.</a> Immunity. 32 (5), 692-702 (2010).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pathogenic+TH17+cells+by+inducible+salt-sensing+kinase+SGK1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of pathogenic TH17 cells by inducible salt-sensing kinase SGK1.</a> Nature. 496 (7446), 513-517 (2013).</li>
<li>Ghoreschi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+pathogenic+T%28H%2917+cells+in+the+absence+of+TGF-beta+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-beta signalling.</a> Nature. 467 (7318), 967-971 (2010).</li>
<li>Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+in+the+context+of+an+inflammatory+cytokine+milieu+supports+de+novo+differentiation+of+IL-17-producing+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells.</a> Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).</li>
<li>Avni, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T%28H%29+cell+differentiation+is+accompanied+by+dynamic+changes+in+histone+acetylation+of+cytokine+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">T(H) cell differentiation is accompanied by dynamic changes in histone acetylation of cytokine genes.</a> Nat Immunol. 3 (7), 643-651 (2002).</li>
<li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CD4%2B+T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. (9), (2007).</li>
<li>Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+th17+differentiation+of+naive+CD4+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and th17 differentiation of naive CD4 T lymphocytes.</a> J Vis Exp. (79), e50765(2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Terwijl de milt bevat naïeve Th-cellen, het aandeel van deze populatie in lymfeklieren veel hoger. Niet lymfeklieren goed te identificeren en verwijderen dit protocol zal resulteren in een slechte opbrengst van naïeve cellen. Dit kan in oudere muizen of mannelijke muizen die meer vetweefsel bijzonder moeilijk. Zoals getoond in figuur 1, stevige bevestiging en pinning van de ledematen en dierlijke huid zal gemakkelijker visualisatie van de buitenzijde toegankelijke lymfeknopen. Zodra lymfeklieren en milt...

Het concept van de verschillende geslachten of subsets van CD4 + T-helper (Th) cellen is al sinds de tweede helft van de 20 e eeuw 1 geweest. Erkenning van verwant antigeen in de aanwezigheid van co-stimulerende signalen resulteert in verschillende rondes van cellulaire proliferatie en de uiteindelijke differentiatie naar effector Th cellen. Het type van de cel die tijdens dit proces is afhankelijk van het cytokine milieu aanwezig tijdens activering 2. Aanvankelijk werden naïeve Th-cellen vermoedelijk polariseren in 2 verschillende lineages na T cel receptor (TCR) activatie costimulatoire CD28 ligatie, en cytokine signalering. Type 1 helpercellen (Th1) worden gekenmerkt door hun effector productie van het cytokine IFNy en hun behoefte aan IL-12 signalering tijdens het differentiatieproces 3,4. Uiteindelijk werd ontdekt dat gedifferentieerde Th1 cellen een genetisch profiel meest kenmerkend wordt gekarakteriseerd by de expressie van het T-box familie transcriptiefactor Tbx21 (T-bet), die als de regulering van het Th1 genetische programma 5. Bovendien, IL-12 en IFNy kan bevorderen T-bet-expressie 6,7. In de immuunrespons, Th1 cellen zijn belangrijk voor de afweer tegen intracellulaire pathogenen en sterke promoters van auto-ontsteking. Daarentegen type 2 helper cellen (Th2) vereist IL-4 voor hun ontwikkeling en effector cytokinen, zoals IL-4, IL-5 en IL-13, zijn belangrijk voor het besturen B-cel responsen en pathogeen allergie 8, 9. Vergelijkbaar met Th1-cellen, werden Th2-cellen gevonden om hun eigen meester transcriptionele regulator te uiten, genoemd GATA-3 10,11. Interessant is dat de aanwezigheid van polariserende cytokinen en het genereren van een specifieke Th lijn zijn antagonistisch voor de ontwikkeling van andere 2,12 suggereert dat slechts een bepaald Th subgroep dominant kan worden tijdens een immuunrespons rerespons. Aangezien de selectie van de Th1 en Th2 lineages, verder werk nog unieker subsets van T-helpercellen, waaronder folliculaire helper (TFH), IL-9-producerende (Th9) en IL-22-producerende (Th22) (onlangs aangetoond beoordeeld in 13). Voor de in vitro differentiatie experimenten dit protocol alleen richten op twee extra Th subsets, zogenaamde regulatoire T-cellen (Treg) en IL-17 producerende CD4 + T-cellen (Th17). CD25 + regulerende T-cellen kan natuurlijk (nTreg) in de thymus voorkomt; naïeve Th-cellen kunnen worden geïnduceerd (iTreg) de regelgeving in de periferie (beoordeeld in 14,15) worden. Beide Tregs drukken een karakteristiek transcriptiefactor, genaamd forkhead box P3 (Foxp3), die essentieel is voor de onderdrukking effector mechanismen oplosbare anti-inflammatoire mediator productie, IL-2 consumptie en cel contact-afhankelijke mechanismen 14,15 omvatten. Het gebrek aan foxp3 de expressie leidt tot een ernstige meerdere organen autoimmuun afwijking genoemd immuun ontregeling, polyendocrinopathy, enteropathie, X-gebonden syndroom (IPEX), waaruit de kritische rol van deze Th subset oplossen ontsteking en reguleren perifere tolerantie voor zelf-antigenen 16. In vitro naïeve CD4 + T-helpercellen up-reguleren Foxp3 en worden toegewijd aan het Treg programma bij stimulatie met IL-2 en TGF-β 14,15. Er kan matig aanzienlijke plasticiteit in CD4 + T-cellijnen zijn vooral voor de bespreking slechts cytokineproductie (beoordeeld in 17,18). Voor de toepassing van in vitro differentiatie protocollen zullen we bespreken elke subset als uniek afstamming. Onlangs is een subset van Th17 cellen die de IL-17 cytokine productie werd geïdentificeerd als een unieke lijn met pro-inflammatoire functies die bijzonder pathogene auto-inflammatie tijdens 19-21. Th17 cellen brengen een unieke transcriptiefactor, genaamd-retinoid gerelateerde weesreceptor gamma t (RORγt) dat de Th17 genetische programma 22 coördineert. TGFp is belangrijk voor het genereren van Th17 lijn door de inductie van RORγt. Echter, het effect van TGFP signalering aangenomen alleen Th17 engagement induceren bij synergizing met IL-6 (besproken in 12). Verdere studies hebben aangetoond dat een verscheidenheid van andere signalen die positief kan regelen Th17 engagement, waaronder IL-1β, verhoogde natrium- en TLR signalering 23-26. Andere rapporten hebben gesuggereerd dat de pathogene Th17 cellen in vivo zijn degenen die daadwerkelijk omzeilen TGFp signalering en erop te vertrouwen een combinatie van IL-1, IL-6 en IL-23 voor hun differentiatie 27. Aldus kan Th17 cellen afgeleid van een verscheidenheid van signaaltransductiewegen; voor de toepassing van dit protocol, de algemeen gebruikte (TGF en IL-6) route voor Th17 lineage inzetzal worden gepresenteerd. De differentiatie protocollen hieronder beschreven voor effector lineages voert vaste antilichaam stimuli voor de TCR en CD28 gedurende het gehele verloop van het experiment. Echter, hebben anderen aangetoond dat TCR activering met antigeen presenterende cellen 28 of verknoping anti-CD3 en anti-CD28 antilichamen met hamster antilichaam gedurende 2 dagen 29 zijn ook zeer effectief middel induceren van de productie van verschillende subsets Th. De hier gepresenteerde protocol gebaseerd op eerder gerapporteerde methoden voor het isoleren van muizen-CD4 + T-cellen van secundaire lymfoïde organen 30 en het genereren Th17 cellen 31. Een belangrijk verschil is dat dit protocol gebaseerd op het gebruik van een cell sorter om naïeve CD4 + T-cellen geïsoleerd uit lymfoïde weefsels. Veel bedrijven bieden nu snelle scheiding kits die kunnen verrijken naïeve CD4 + T-cellen, die in staat zijn om de vereiste f omzeilenof sorteren afhankelijk van het experiment. De methoden en reagentia die in dit protocol zijn wat we routinematig gebruiken en vind het meest effectief te zijn. Echter, in gedachten houden dat alternatieve reagentia en methodologieën bestaan ​​voor veel van de stappen die hieronder gepresenteerd en het is aan de individuele lab om te bepalen wat het beste werkt voor hun doeleinden.

<table><tbody><tr><td>Complete RPMI:</td><td></td><td></td><td>Verwarm in een 37 oC waterbad voor gebruik</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Life Technologies</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>10 % FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>1000X 2-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>100X Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>100X L-glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>120 micron nylon gaas</td><td>Amazon</td><td>CMN-0120-10YD</td><td>Snijd in 2 cm2 vierkantjes en autoclaveer</td></tr><tr><td>Alternatief: 100 micron celzeefjes</td><td>Fisher</td><td>08-771-19</td><td>Alternatief voor het snijden van nylon gaas</td></tr><tr><td>autoMACS-buffer</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-221</td><td>Verwarm in een 37 oC waterbad voor gebruik</td></tr><tr><td>autoMACS-spoelvloeistof</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-222</td><td>Verwarm in een 37 oC waterbad voor gebruik</td></tr><tr><td>CD4 kralen</td><td>Miltenyi</td><td>130-049-201</td><td></td></tr><tr><td>ACK lysis buffer</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>Cytokinen:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human (h) IL-2</td><td>Peprotech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant mouse (rm) IL-4</td><td>Peprotech</td><td>214-14</td><td></td></tr><tr><td>rmIL-6</td><td>R &amp; D Systems</td><td>406-ML-025</td><td></td></tr><tr><td>rmIL-12</td><td>Peprotech</td><td>210-12</td><td></td></tr><tr><td>hTGFb</td><td>R &amp; D Systems</td><td>240-B-010</td><td></td></tr><tr><td>Antilichamen:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2C11 (anti-CD3)</td><td>BioXcell</td><td>BE0001-1</td><td></td></tr><tr><td>37.51 (anti-CD28)</td><td>BioXcell</td><td>BE0015-1</td><td></td></tr><tr><td>11B11 (anti-IL-4)</td><td>BioXcell</td><td>BE0045</td><td></td></tr><tr><td>XMG1.2 (anti-IFNg)</td><td>BioXcell</td><td>BE0055</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD62L-FITC</td><td>BioLegend</td><td>104406</td><td>Gebruik bij 1:100</td></tr><tr><td>anti-CD25-PE</td><td>BioLegend</td><td>102008</td><td>Gebruik bij 1:400</td></tr><tr><td>anti-CD4-PerCP</td><td>BioLegend</td><td>100434</td><td>Gebruik bij 1:1000</td></tr><tr><td>anti-CD44-APC</td><td>BioLegend</td><td>103012</td><td>Gebruik bij 1:500</td></tr><tr><td>Phorbol&nbsp; 12-myristaat 13 acetaat (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8139</td><td>Bereid een voorraad bij 0,1 mg/ml in DMSO en vries aliquots in bij -20 oC</td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-0634</td><td>Bereid een voorraad bij 0,5 mg/ml in DMSO en vries aliquots in bij -20 oC</td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>eBioscience</td><td>00-4506-51</td><td>Gebruik bij 1:1000</td></tr></tbody></table>

muis naïve cd4<sup&gt; +</sup&gt; t cell isolatie en<em&gt; in vitro</em&gt; differentiatie in t cel subsets

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigeen-inexperienced (naïve) CD4+ T-cellen ondergaan expansie en differentiatie naar effector-subsets op het moment van herkenning van cognitief antigeen door de T-celreceptor (TCR) dat wordt gepresenteerd op MHC klasse II. De cytokine-signalen die aanwezig zijn in de omgeving op het moment van TCR-activering zijn een belangrijke factor bij het bepalen van het effector-lot van een naïve CD4+ T-cel. Hoewel de cytokine-omgeving tijdens de activering van naïve T-cellen complex kan zijn en zowel redundante als tegengestelde signalen in vivo kan omvatten, kan de toevoeging van verschillende cytokine-combinaties tijdens de activering van naïve CD4+ T-cellen in vitro gemakkelijk de totstandkoming van effector T-helper lijnen bevorderen met kenmerkende cytokine- en transcriptiefactorexpressie. Dergelijke differentiatie-experimenten worden vaak gebruikt als een eerste stap voor de evaluatie van doelen die worden geacht de ontwikkeling van bepaalde CD4+ T-helper-subsets te bevorderen of te remmen. De toevoeging van mediatoren, zoals signaalagonisten, antagonisten of andere cytokinen, tijdens het differentiatieproces kan ook worden gebruikt om de invloed van een specifiek doel op T-celdifferentiatie te bestuderen. Hier beschrijven we een basisprotocol voor de isolatie van naïve T-cellen uit muizen en de daaropvolgende stappen die nodig zijn voor het polariseren van naïve cellen naar verschillende T-helper effector-lijnen in vitro.

De tijd voor de analyse van differentiatie kan variëren naargelang de Th aandoening en getest als de sterkte van T-cel receptor activatie. Na 2-3 dagen van differentiatie, kunnen cellen worden gevisualiseerd door lichtmicroscopie om de mate van T-celproliferatie. Wells vertonen uitgebreide proliferatie en klontering van cellen zal waarschijnlijk klaar voor analyse op dag 4. Differentiation voorwaarden beroep op de toevoeging van exogeen IL-2, zoals Th1 en Th2, de media waarschijnlijk uitgeput na 4 dagen in kweek. Cytoki...

Naïve CD4+ T-cellen polariseren naar verschillende subsets, afhankelijk van de omgeving op het moment van activering. De differentiatie van naïve CD4+ T-cellen naar verschillende effector-subsets kan in vitro worden bereikt door de toevoeging van T-celreceptor-stimuli en specifieke cytokine-signalen.

Muis Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolatie en<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiatie in T cel subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Het algemene doel van de volgende procedure is om naïeve CD4-positieve T-cellen, geïsoleerd uit milten en lymfeklieren van muizen, te polariseren tot verschillende T-helper-subsets. In vitro wordt dit bereikt door eerst milten en lymfeklieren te verwerken die zijn geoogst van volwassen wild-type muizen. In de tweede stap wordt de CD4-positieve celpopulatie verrijkt door middel van magnetische bead-separatie en vervolgens verder gesorteerd op basis van de expressie van hun naïeve T-celmarker.In de laatste stap worden de cellen behandeld met T-celreceptor-activerende factoren en polariserende cytokinen om hun differentiatie naar verschillende T-helperlijnen te induceren. Uiteindelijk worden flowcytometrie, ELISA en real-time PCR gebruikt om de efficiëntie van de T-helperceldifferentiatie te beoordelen.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van T-helpercellen, zoals de vraag hoe de expressie van specifieke moleculen of de behandeling met specifieke geneesmiddelen de aard van een T-celrespons beïnvloedt. Begin met het vastpinnen van de ledematen van een C 57 black six muis van vijf tot 10 weken oud op het dissectiebord, en snijd vervolgens de huid in de lengte open van de anus tot aan de kin, waarbij u er goed op let dat het onderliggende peritoneale weefsel niet wordt doorboord. Pin daarna de huid open en gebruik één pincet om de lymfeknoop vast te pakken en een andere om het weefsel te scheiden van elk van de in de afbeelding aangegeven locaties.Plaats elke geoogste lymfeknoop in een opvangschaal met PBS aangevuld met 1% FBS of PBS plus, open vervolgens voorzichtig het peritoneum en verwijder de milt. Plaats ook de milt in de opvangschaal en verplaats de schaal naar een ijsbad om de CD4-positieve cellen te verrijken. Verdeel de lymfeklieren en de milten met steriele pincetten over twee aparte schalen van 60 millimeter die elk drie milliliter PBS plus bevatten.Plaats vervolgens een vierkantje steriel nylon gaas over de milten en gebruik de duimzijde van een spuitzuiger om ze voorzichtig tegen het gaas te pletten totdat bijna al het weefsel in suspensie is gegaan. Pipetteer de suspensie een paar keer op en neer om de resterende oplosbare klonten te verbreken en plaats daarna een nieuw stuk nylon gaas over de opening van een conische buis van 15 milliliter. Filtreer de suspensie in de buis om eventuele resterende resten te verwijderen.Herhaal nu de mechanische dissociatie voor de lymfeklieren en vul beide buisjes met gefilterde cellen aan met PBS plus. Keer de buisjes vervolgens enkele keren om en centrifugeer de cellen. Resuspendeer het pellet van de lymfeklieren in twee milliliters PBS.Voeg één milliliter ijskoude ACK-oplossing per muis toe aan het miltcelpellet. Stop de lysis van de rode bloedcellen na één minuut met 10 milliliter PBS plus. Keer de buis om en centrifugeer de cellen opnieuw.Resuspendeer vervolgens de miltpellet in nog eens 10 milliliter PBS plus, voeg de lymfeknoopcellen toe en centrifugeer de samengevoegde celсусpensie. Resuspendeer de pellet deze keer per muis in 15 microliters CD four magnetische beads verdund in 85 microliters PBS plus gedurende 15 tot 30 minuten bij vier graden Celsius. Verdun de cellen vervolgens in 10 milliliter PBS plus.Filter de suspensie door een nylon zeef in een nieuwe buis van 15 milliliter en centrifugeer de cellen. Centrifugeer het pellet vervolgens opnieuw in 100 microliters PBS plus per muis en selecteer positief voor de CD four positieve cellen via magnetische bead-selectie volgens de instructies van de fabrikant. Nadat de CD four positieve cellenfractie is verkregen, worden de cellen gewassen in 10 milliliter PBS plus om de CD four positieve T-cel fractie te sorteren.Label vervolgens de cellen gedurende 15 tot 30 minuten bij vier graden Celsius in het donker met de juiste fluorescerende antilichamen na het wassen. Filtreer de gelabelde cellen om eventueel debris te verwijderen en breng ze over in een fax-buis op ijs, waarbij deze tegen licht moet worden beschermd; sorteer de CD4-positieve, CD25-negatieve, CD62L-positieve, CD44-negatieve populatie in volledig RPMI-medium. Wanneer alle cellen zijn verzameld.Was de naïeve T-cellen in vers, compleet medium. Resuspendeer vervolgens het pellet in compleet RPMI, tel de naïeve T-cellen en pas de concentratie aan naar 1 × 10⁶ cellen per milliliter om in vitro differentiatie van T-helper-subsets te induceren. Was daarna elke put van de celkweekplaten, die eerder zijn gecoat met anti-CD3 en anti-CD28, met 1 milliliter steriele FBS-vrije PBS en plateer de cellen.Voeg tot slot de juiste cytokinen en blokkerende antilichamen toe aan het kweekmedium, zoals beschreven in de tabel, en incubeer de cellen gedurende vier tot vijf dagen bij 37 °C met 5% koolstofdioxide. Na vier tot vijf dagen in kweek kan intracellulaire cytokinenkleuring van de CD4-positieve T-cellen uit de in vitro gedifferentieerde TH1-, TH2-, induceerbare treg- en TH17-culturen worden uitgevoerd om te bevestigen dat elk T-celsubset het verwachte cytokinenprofiel vertoont.Inderdaad, na 24 uur restimulatie met anti CD three EISs, laat A zien dat de subsets ook de corresponderende extracellulaire productie vertonen van de intracellulair tot expressie gebrachte cytokinenproteïnen. Real-time PCR voor lineage-specifieke transcriptiefactoren bevestigt verder de juiste transcriptiefactorprofielen van de in vitro gedifferentieerde CD four positieve T-celsubsets. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u cellen uit spiegelende lymfeklieren en milt isoleert en verwerkt om naïeve CD four positieve T-helpercellen te verkrijgen.Bovendien kunt u deze T-cellen differentiëren tot TH1-, TH2-, TH17- of iTreg-cellen.

mouse-nave-cd4-t-cell-isolation-vitro-differentiation-into-t-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Isolatie van lymfocyten met behulp van de Miltenyi MAC-kit is een betrouwbare manier om cellen van hele lymfeweefsel homogenaten te zuiveren. Cellen gezuiverd met behulp van de Miltenyi systeem zijn meestal ≥ 96% zuiver. Hier tonen we de stappen die zijn genomen om CD4 + T-cellen, een van de vele kits worden aangeboden door Miltenyi isoleren.

Isolatie van CD4 + T-cellen van de muis lymfeknopen Met behulp van Miltenyi MACS Zuivering

We presenteren een protocol om antigeen-specifieke muis T-cellen te produceren met behulp van retrovirale...

Retrovirale Transductie van T-cel-receptoren in Mouse T-cellen

This video demonstrates the in vitro differentiation of granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor or GM-CSF-producing T helper cells (THGM). Isolated naïve T cells are stimulated for differentiation into THGM, which is confirmed by detecting high intracellular GM-CSF production and a low expression of other T helper cell-specific cytokines.

An In Vitro Technique to Differentiate GM-CSF Producing T Helper Cells from Na&iuml;ve T Cells

Muis embryonale stamcellen kunnen in vitro worden gedifferentieerd tot T-cellen met behulp van het OP9-DL1 co-cultuursysteem. Succes bij deze procedure vereist zorgvuldige aandacht voor reagens/celonderhoud en belangrijke techniekgevoelige stappen. Hier bespreken we deze kritieke parameters en bieden we een gedetailleerd protocol om de adoptie van deze technologie te stimuleren.

Afleiding van T cellen In Vitro Van muis embryonale stamcellen

Dit artikel beschrijft in vivo en in vitro methodologie om de thymische vestigingsprogenitors te karakteriseren door de analyse van de kinetiek van generatie, fenotype en aantallen van hun T-cel nakomelingen.

Karakterisering van Thymic Settling voorouders in de Mouse Embryo behulp<em&gt; In Vivo</em&gt; En<em&gt; In Vitro</em&gt; Testen

Hier presenteren we een protocol te differentiëren lymfkliertest granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T-helper (THGM) cellen van naïef CD4 + T-cellen, met inbegrip van isolatie van naïeve CD4 + T cellen, differentiatie van THGM, en analyse van gedifferentieerde THGM cellen. Deze methode kan worden toegepast op de studies van de verordening en de functie van THGM cellen.

In Vitro Differentiatie van muis granulocyt-macrofaag-kolonie-stimulerende Factor (GM-CSF)-produceren van T-Helper (THGM) cellen

Hier presenteren we een protocol voor de in vivo bepaling van naïeve CD4 T cel (T-cel) activering, proliferatie en differentiatie van de Th1 geïnduceerd door GM-CSF beenmerg (BM)-afgeleide dendritische cellen (DC's). Dit protocol beschrijft Daarnaast BM en T-cel isolatie, DC generatie en DC en T-cel adoptief overdracht.

Een muismodel In Vivo maatregel naïef CD4 T-cel activatie, proliferatie en differentiatie van de Th1 geïnduceerd door het beenmerg-afgeleide dendritische cellen

Dit protocol beschrijft de differentiatie van naïeve CD4+ T-cellen tot pathogene Th17-cellen in vitro. In combinatie met een op flowcytometrie gebaseerde benadering met meerdere parameters kan met behulp van deze differentiatiemethode een zuiverheid van 90% van pathogene Th17-cellen worden verkregen uit naïeve CD4+ T-cellen.

In vitro differentiatie van naïeve CD4+ T-cellen tot pathogene Th17-cellen in muizen

De huidige studie toont protocollen voor het beoordelen van de vroege lotsverbintenis van virusspecifieke TFH-cellen en het manipuleren van genexpressie in deze cellen.

Toegang tot vroege differentiatie van virusspecifieke folliculaire helper CD4+ T-cel in acute LCMV-geïnfecteerde muizen

Hier bieden we een uitgebreid protocol om initiële lokale Ca2+- signalen, bekend als Ca2+- microdomeinen, in primaire muizen- en menselijke T-cellen op te lossen met behulp van fluorescentiemicroscopie. Dit protocol dient als een waardevolle bron voor onderzoekers die Ca2+- signaleringsroutes in immuuncellen onderzoeken en hun functie verder ontrafelen.

Beeldvorming van initiële Ca2+ microdomeinen in primaire T-cellen

Leer naïve CD4+ T-cellen isoleren uit muislymfklieren en -milt en differentiëren naar T-helper-subtypen in vitro met magnetische bead-separatie en polariserende cytokines.

Muis Naïve CD4

Meer video's verkennen