Name: Het meten van oxidatieve stress Weerstand van Caenorhabditis elegans In 96-well microtiterplaten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Leer hoe u oxidatieve stressweerstand meet in Caenorhabditis elegans met een vloeistofassay in 96-well microtiterplaten. Deze methode berekent overlevingspercentages en helpt bij het begrijpen van cellulaire overlevingsmechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij erkennen de Caenorhabditis Genetics Center for C. elegans stammen. De financiering steun werd verstrekt door de Terry Fox Research Institute. We steun verleend aan EP uit de Rolande en Marcel Gosselin Graduate studententijd en de CIHR / FRSQ training subsidie ​​in het kankeronderzoek FRN53888 van de McGill Integrated Cancer Research Training Program erkennen ook.

1. Bereiding van reagentia <ol><li> Voorbereiding van de media voor C. elegans groei (in casu wildtype dieren en flcn-1 (ok975) mutante dieren). <ol><li> Bereid gewijzigd Youngren&#39;s Only Bacto-pepton (MYOB) droge mix met 5,5 g Tris HCl, 2,4 g Tris base, 31 g Bactopetone, 20 g NaCl en 0,08 g cholesterol. Meng goed schudden. OPMERKING: Deze mix is ​​voldoende om 10 L van MYOB medium te bereiden. LET OP: Normaal groeimedium (NGM) platen kunnen worden gebruikt in plaats van MYOB platen 27. Toch moet hetzelfde type platen worden gebruikt voor zinvolle vergelijkingen tussen stammen en tussen onafhankelijke herhalingen. In dit protocol, we alleen gebruikt MYOB platen. </li><li> Bereid 1 L van MYOB medium door het toevoegen van 6 g van MYOB droge mix, 17 g agar en vul aan tot 1 l met H 2 O en autoclaaf gedurende 45 minuten op 122 ° C. Giet platen en laten drogen bij kamertemperatuur gedurende 2 dagen. </li><li> Met behulp van een steriele techniek enten 100 ml culture van de LB-bouillon medium met E. coli OP50 bacteriën en groeien O / N bij 37 ° C. </li><li> Seed MYOB platen met E. coli OP50 bacteriën. Laat het groeien bij kamertemperatuur 48 uur. </li></ol></li><li> Voorbereiding voor gen downregulatie gebruik RNAi <ol><li> Bereid MYOB RNAi-voeding platen. Ga als in de stappen 1.1.1 en 1.1.2. Na autoclaveren laat het medium afkoelen tot ongeveer 55 ° C en voeg 1 ml van 1 M isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) en 1 ml van 100 mM ampicilline. </li><li> Streak E. HT115 coli bacteriën die zijn getransformeerd met een plasmide die ofwel control EV of flcn-1 specifieke RNAi op ampicilline (50 gg / ml) / tetracycline (15 ug / ml) agarplaten expressie. Grow cultuur O / N bij 37 ° C. </li><li> Pick koloniën en enten E. HT115 coli bacteriën die zijn getransformeerd met een plasmide dat expressie instelwielen EV of flcn-1 specifieke RNAi en cultuur groeien in LB / ampicilline (50 ug / ml) medium en O / N bij 37 &amp; #176; C. </li><li> Seed platen met E. coli HT115 EV bacteriën of HT115 flcn-1 RNAi bacteriën. OPMERKING: Houd platen 48 uur bij kamertemperatuur voor gebruik. Als RNAi knock-down door het voeden is in effectieve, andere methoden van de levering van de ds-RNA 28. </li></ol></li><li> Inducerende oxidatieve stress met paraquat (PQ): <ol><li> Bereid M9 buffer door het mengen van 3 g KH 2PO 4, 6 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCl en 0,25 g MgSO4 · 7 H 2 O. Breng tot 1 L met gedestilleerd water. Autoclaaf oplossing gedurende 45 minuten bij 122 ° C en bewaar flessen bij kamertemperatuur. </li><li> Op de dag van de assay, bereid de M9 / PQ-bevattende oplossing. Voor dit protocol gebruiken 100 mM PQ (0,1028 g PQ opgelost in 4 ml van M9 buffer vult een volledige 96 well platen met 40 pl M9 / PQ per putje). LET OP: PQ is een gevaarlijke en zeer giftige stof. Behandel volgens passende richtlijnen. OPMERKING: Bij de eerste draaien van een nieuwe strein of nieuwe staat, wordt het aanbevolen om overleving assay in toenemende concentraties van PQ om de beste concentratie te gebruiken om de dieren binnen 7-10 uur doden bepalen. </li></ol></li></ol> 2. Voorbereiding van de Age-gesynchroniseerde L4 Bevolking <ol><li> Transfer 20 gravid volwassen hermafrodieten om een frisse MYOB plaat bezaaid met E. coli OP50 bacteriën. Bereid verschillende platen op basis van het aantal wormen plaatsvinden tijdens de assay. </li><li> Laat ze om eieren te leggen gedurende 6 uur en vervolgens met behulp van een platina draad worm pick verwijderen van de moeders. Controleer de platen onder de microscoop om het aantal gelegde eieren bepalen. </li><li> Laat de eieren uitkomen en groeien bij 20 ° C gedurende 48 uur. Op dit moment, de dieren in een late L4 / jonge volwassen stadium. Extra hetzelfde stadium dieren en plaats het PQ-bevattende putjes. Opmerking: omdat 48 uur incubatie geldt alleen voor mutanten die eveneens uitgroeien tot wildtype dieren, is het belangrijk om te controleren ontwikkelingaantal nieuw geteste mutanten te zorgen zij voldoen aan de wild-type ontwikkelingssnelheid, anders moeten andere tijdlijnen gebruiken. </li><li> Als alternatief gebruik synchronisatie technieken. Genereer gesynchroniseerde populatie L1 larven wormen met hypochloriet oplossing (25 ml water, 125 ml 5,25% natriumhypochloriet, 50 ml 4 M NaOH, wrap fles met aluminiumfolie te isoleren tegen licht). Voor deze test, is het niet raadzaam, omdat intense bleken het gedrag van de dieren beïnvloeden gedurende de test. LET OP: Behandel hypochlorietoplossing volgens de richtlijnen. OPMERKING: Bij het gebruik van RNAi naar beneden reguleren van het gen van belang, te synchroniseren de hermafrodieten, zoals beschreven in hoofdstuk 2, met uitzondering van de overdracht van de moeders om RNAi platen gezaaid met de specifieke RNAi bacteriën. Als de knock-down met de RNAi zwak is, is voeding voor meerdere generaties aan te bevelen. </li></ol> 3. Het uitvoeren van de oxidatieve stress Resistance Assay &lt;/ P&gt; <ol><li> Pipetteer 40 ul van 100 mM PQ-oplossing (vers bereid) elk putje van een 96 putjesplaat. Gebruik minimaal 12 putjes als een replica van elke aandoening (behandeling, mutant, etc.). Met behulp van een platina draad worm pick, transfer 5-8 L4 larven dieren om elke zowel vermelding van de starttijd en de eindtijd. </li><li> Bij het starten van een andere staat, let op de starttijd en de eindtijd. Plaats de plaat bij 20 ° C in de incubatietijd overbrengen tussen de wormen en scoren dode dieren een uur later vanaf de starttijd. </li><li> Met behulp van de microscoop ontleden, tel overleven elk uur. Schud de plaat voordat u begint te tellen. Geef aan wormen die niet bewegen, zelfs na het spotten van een hoge intensiteit licht, zoals dode dieren. Geef ook aan het aantal dieren in leven. OPMERKING: Kijkend naar worm vorm, staarten en beweging van het hoofd bij een hoge vergrotingsfactor, helpen bij het bepalen dode wormen in leven. </li><li> Herhaal deze stap om het uur tot de meeste wormen zijn dood. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Bepaling van Survival Percentage bij Every Time Point <ol><li> Bereken het totale aantal dieren per conditie door toevoeging van het totale aantal dieren overgebracht naar iedere put. Negeer de dieren die zijn beschadigd of gedood bij overdracht. </li><li> Voor elk tijdstip, berekent het totale aantal dode dieren per conditie (som van dode dieren in de 12 putten). Voor elk tijdstip berekenen percentage van de dood (aantal dode dieren gedeeld door het totale aantal dieren en vermenigvuldigd met 100) en het percentage van de overleving (100 minus procent dood). </li><li> Herhaal deze test ten minste 3 onafhankelijke maal. </li></ol>

<ol><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Curr Biol. 24, R453-R462 (2014).</li>
<li>Alfadda, A. A., Sallam, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species in health and disease.</a> J Biomed Biotechnol. 2012, 936486(2012).</li>
<li>Finkel, T., Holbrook, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidants%2C+oxidative+stress+and+the+biology+of+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing.</a> Nature. 408, 239-247 (2000).</li>
<li>Di Carlo, M., Giacomazza, D., Picone, P., Nuzzo, D., San Biagio, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+the+key+players+in+the+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Res%22%5BJournal%5D)">Are oxidative stress and mitochondrial dysfunction the key players in the neurodegenerative diseases.</a> Free Radic Res. 46, 1327-1338 (2012).</li>
<li>Gandhi, S., Abramov, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+oxidative+stress+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid+Med+Cell+Longev%22%5BJournal%5D)">Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration.</a> Oxid Med Cell Longev. 2012, 428010(2012).</li>
<li>Trushina, E., McMurray, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases.</a> Neuroscience. 145, 1233-1248 (2007).</li>
<li>Touyz, R. M., Briones, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+and+vascular+biology%3A+implications+in+human+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertens+Res%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species and vascular biology: implications in human hypertension.</a> Hypertens Res. 34, 5-14 (2011).</li>
<li>Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+oxidative+stress+as+an+anticancer+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 931-947 (2013).</li>
<li>Sosa, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+cancer%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+research+reviews%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and cancer: an overview.</a> Ageing research reviews. 12, 376-390 (2013).</li>
<li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Oxygen+Species+and+Aging+in+Caenorhabditis+elegans%3A+Causal+or+Casual+Relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship.</a> Antioxid Redox Signal. 13, 1911-1953 (2010).</li>
<li>Baumeister, R., Schaffitzel, E., Hertweck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+signaling+in+Caenorhabditis+elegans+controls+stress+response+and+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Endocrine signaling in Caenorhabditis elegans controls stress response and longevity.</a> J Endocrinol. 190, 191-202 (2006).</li>
<li>Markaki, M., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+diseases+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans.</a> Biotechnol J. 5, 1261-1276 (2010).</li>
<li>Rodriguez, M., Snoek, L. B., De Bono, M., Kammenga, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worms+under+stress%3A+C.+elegans+stress+response+and+its+relevance+to+complex+human+disease+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Worms under stress: C. elegans stress response and its relevance to complex human disease and aging.</a> Trends Genet. 29, 367-374 (2013).</li>
<li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHope%2C+IA+%22Practical+approach+series%22">Practical approach series</a>. , Oxford University Press. 282(1999).</li>
<li>C. elegans Sequencing Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans%3A+a+platform+for+investigating+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282, 2012-2018 (1998).</li>
<li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turn+to+the+worm%21%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+genetics+%26+development%22%5BJournal%5D)">Turn to the worm!</a> Current opinion in genetics & development. 7, 410-415 (1997).</li>
<li>Wheelan, S. J., Boguski, M. S., Duret, L., Makalowski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+nematode+orthologs--lessons+from+the+analysis+of+1800+human+genes+and+the+proteome+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Human and nematode orthologs--lessons from the analysis of 1800 human genes and the proteome of Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 238, 163-170 (1999).</li>
<li>Culetto, E., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Caenorhabditis+elegans+in+understanding+the+function+and+interactions+of+human+disease+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes.</a> Hum Mol Genet. 9, 869-877 (2000).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+approaches+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional genomic approaches in C. elegans.</a> Methods Mol Biol. 351, 127-138 (2006).</li>
<li>Poulin, G., Nandakumar, R., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screens+in+Caenorhabditis+elegans%3A+impact+on+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screens in Caenorhabditis elegans: impact on cancer research.</a> Oncogene. 23, 8340-8345 (2004).</li>
<li>Moreno-Arriola, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans%3A+A+Useful+Model+for+Studying+Metabolic+Disorders+in+Which+Oxidative+Stress+Is+a+Contributing+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid+Med+Cell+Longev%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans: A Useful Model for Studying Metabolic Disorders in Which Oxidative Stress Is a Contributing Factor.</a> Oxid Med Cell Longev. , 705253(2014).</li>
<li>Possik, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folliculin+regulates+ampk-dependent+autophagy+and+metabolic+stress+survival%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Folliculin regulates ampk-dependent autophagy and metabolic stress survival.</a> PLoS Genet. 10, e1004273(2014).</li>
<li>Fukushima, T., Tanaka, K., Lim, H., Moriyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+cytotoxicity+of+paraquat%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Prev+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanism of cytotoxicity of paraquat.</a> Environ Health Prev Med. 7, 89-94 (2002).</li>
<li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+dismutase+is+dispensable+for+normal+animal+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Superoxide dismutase is dispensable for normal animal lifespan.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 5785-5790 (2012).</li>
<li>Schulz, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+restriction+extends+Caenorhabditis+elegans+life+span+by+inducing+mitochondrial+respiration+and+increasing+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress.</a> Cell Metab. 6, 280-293 (2007).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Timmons, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+methods+for+RNA+interference+in%5BTitle%5D)+AND+%22C.+elegans.+Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Delivery methods for RNA interference in.</a> C. elegans. Methods Mol Biol. 351, 119-125 (2006).</li>
<li>Wang, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+Eyes+Absent+Ortholog+EYA-1+Is+Required+for+Stress+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+%28Mosc%29%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans Eyes Absent Ortholog EYA-1 Is Required for Stress Resistance.</a> Biochemistry (Mosc). 79, 653-662 (2014).</li>
<li>Paz-Gomez, D., Villanueva-Chimal, E., Navarro, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEAD+Box+RNA+helicase+VBH-1+is+a+new+player+in+the+stress+response+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The DEAD Box RNA helicase VBH-1 is a new player in the stress response in C. elegans.</a> PLoS One. 9, 97924(2014).</li>
<li>Ward, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defects+in+the+C.+elegans+acyl-CoA+synthase%2C+acs-3%2C+and+nuclear+hormone+receptor%2C+nhr-25%2C+cause+sensitivity+to+distinct%2C+but+overlapping+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Defects in the C. elegans acyl-CoA synthase, acs-3, and nuclear hormone receptor, nhr-25, cause sensitivity to distinct, but overlapping stresses.</a> PLoS One. 9, 92552(2014).</li>
<li>Staab, T. A., Evgrafov, O., Knowles, J. A., Sieburth, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+synaptic+nlg-1%2Fneuroligin+abundance+by+the+skn-1%2FNrf+stress+response+pathway+protects+against+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of synaptic nlg-1/neuroligin abundance by the skn-1/Nrf stress response pathway protects against oxidative stress.</a> PLoS Genet. 10, e1004100(2014).</li>
<li>Greer, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+AMPK-FOXO+pathway+mediates+longevity+induced+by+a+novel+method+of+dietary+restriction+in%5BTitle%5D)+AND+%22C.+elegans.+Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in.</a> C. elegans. Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).</li>
<li>Allen, E., Walters, I. B., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brivanib%2C+a+dual+FGF%2FVEGF+inhibitor%2C+is+active+both+first+and+second+line+against+mouse+pancreatic+neuroendocrine+tumors+developing+adaptive%2Fevasive+resistance+to+VEGF+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Brivanib, a dual FGF/VEGF inhibitor, is active both first and second line against mouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance to VEGF inhibition.</a> Clin Cancer Res. 17, 5299-5310 (2011).</li>
<li>Apfeld, J., O'Connor, G., McDonagh, T., DiStefano, P. S., Curtis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AMP-activated+protein+kinase+AAK-2+links+energy+levels+and+insulin-like+signals+to+lifespan+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The AMP-activated protein kinase AAK-2 links energy levels and insulin-like signals to lifespan in C. elegans.</a> Genes Dev. 18, 3004-3009 (2004).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+AMP-activated+protein+kinase+AAK-2+is+phosphorylated+by+LKB1+and+is+required+for+resistance+to+oxidative+stress+and+for+normal+motility+and+foraging+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans AMP-activated protein kinase AAK-2 is phosphorylated by LKB1 and is required for resistance to oxidative stress and for normal motility and foraging behavior.</a> J Biol Chem. 283, 14988-14993 (2008).</li>
<li>Honda, Y., Honda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+daf-2+gene+network+for+longevity+regulates+oxidative+stress+resistance+and+Mn-superoxide+dismutase+gene+expression+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The daf-2 gene network for longevity regulates oxidative stress resistance and Mn-superoxide dismutase gene expression in Caenorhabditis elegans.</a> FASEB J. 13, 1385-1393 (1999).</li>
<li>Restif, C., Metaxas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+swimming+motions+of+C.+elegans+worms+with+applications+in+aging+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Image+Comput+Comput+Assist+Interv%22%5BJournal%5D)">Tracking the swimming motions of C. elegans worms with applications in aging studies.</a> Med Image Comput Comput Assist Interv. 11, 35-42 (2008).</li>
<li>Buckingham, S. D., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+automated+measurement+of+nematode+swimming+%28thrashing%29+without+morphometry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast, automated measurement of nematode swimming (thrashing) without morphometry.</a> BMC Neurosci. 10, 84(2009).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

C. elegans is een aantrekkelijk modelorganisme te bestuderen genetisch oxidatieve stress resistentie in vivo aangezien het gemakkelijk kunnen worden gekweekt, en snel leidt tot een groot aantal genetisch identieke nakomelingen. Meerdere methodes oxidatieve stress weerstandsmeting zijn eerder beschreven en worden gebaseerd op de aanvulling van kweekplaten met verschillende ROS bronnen zoals PQ, rotenon, H 2 O 2 en juglone 25,26,29-32. Hier beschrijven we een protocol dat...

A reference was corrected in the publication of <a href="http://www.jove.com/video/52746">Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates</a>. There was an error with reference 34 in the Citations section. It has been updated from:
Allen, E., Walters, I.B., Hanahan, D. Brivanib a dual FGF/VEGF inhibitor,is active both first and second line againstmouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance toVEGF inhibition. Clin Cancer Res. 17, (16) 5299-310 (2011).
to:
Allen, A. T., Maher, K. N., Wani, K. A., Betts, K. E., &#38; Chase, D. L. Coexpressed D1- and D2-like dopamine receptors antagonistically modulate acetylcholine release in Caenorhabditis elegans. Genetics. 188, 579-590 (2011).

Erratum: Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

In eukaryoten, oxidatieve fosforylering plaatsvindt in het elektron transport keten van de mitochondriën is de belangrijkste motor van de productie van energie in de vorm van ATP. Reactieve zuurstof species (ROS) is een natuurlijk bijproduct van dit proces. Ondanks hun belangrijke rol als signaalmoleculen, kan overmatige ROS leiden tot DNA-schade, eiwit carbonylering en lipide oxidatie. Een onbalans tussen productie van ROS en ontgifting oxidatieve stress veroorzaakt, wat leidt tot energiedepletie, celbeschadiging en celdood veroorzaakt 1,2. Oxidatieve stress draagt ​​bij aan veroudering en de ontwikkeling van vele levensbedreigende ziekten zoals kanker, diabetes, cardiovasculaire en neurodegeneratieve ziekten 3-9. Cellen zijn enzymatische en niet-enzymatische defensiestrategieën ontwikkeld om juiste ROS handhaven en hun bestanddelen te beschermen tegen oxidatieve schade 1,2. Superoxide dismutase (SOD) enzymen eerste handelen om convert superoxide H 2 O 2, die later wordt omgezet in water met catalase en peroxidase enzymen. Niet-enzymatische defensiestrategieën bevatten meestal moleculen die sneller ROS reageert vergeleken met cellulaire macromoleculen, bescherming van essentiële celcomponenten. Ondanks de beschermende rol van ROS ontgiftingsenzymen, sommige ROS moleculen ontsnappen aan de antioxidant afweermechanismen en leiden tot oxidatieve schade. Detectie, reparatie, en afbraak van de beschadigde cellulaire componenten zijn essentieel verdediging strategieën tijdens oxidatieve stress 1,2. Signaalwegen betrokken bij de weerstand tegen stress en specifiek oxidatieve stress zijn sterk evolutionair geconserveerd 10,11. In tegenstelling tot de celcultuur experimenten waarbij organismale omstandigheden slechts gedeeltelijk worden gereproduceerd, de studie van oxidatieve stress in model organismen 12,13 heeft grote betekenis. C. elegans is een vrijlevende aaltjes die gemakkelijk en goedkoop kan worden culvaardigd op een bacteriële grasveld op agar media. Het is klein in omvang (ongeveer 1 mm in lengte) en normaal groeit als een self-bemesting hermafrodiet, welke genetische manipulaties vergemakkelijkt. Het heeft een snelle levenscyclus en een hoge reproductieve capaciteit, produceert ongeveer 300 nakomelingen per generatie, waardoor het een krachtig hulpmiddel om grootschalige genetische screens 14 uit te voeren. De C. elegans genoom volledig gesequenced en 40-50% van de genen voorspeld homologen van humaan geassocieerde genen 15-18 zijn. De knock-down van genen van belang het gebruik van RNAi is snel en eenvoudig in C. elegans. Gene beneden regelgeving kan worden bereikt door het voederen van dieren de E. coli bacteriën die een plasmide dat het dubbelstrengs RNA dat de mRNA plaats 19 richt haven. Daarom is de bepaling van gen-functie met behulp van grootschalige RNAi schermen heeft grote invloed op het begrijpen van de menselijke ziekten, waaronder kanker 20,21. Studies oxidative stressbestendigheid in C. elegans heeft geleid tot de identificatie van geconserveerde mechanismen van resistentie tegen oxidatieve stress 13,22. Sommige routes bij gemeenschappelijk pathways die duurzaamheid en weerstand moduleren andere belastingen en zoals hypoxie, warmte en osmotische stress. Deze paden zijn de insuline signalering, TOR signalering en autofagie. Andere belangrijke trajecten betrekken ontgifting van ROS zoals superoxide dismutase enzymen en catalase enzymen, of in schadeherstel, zoals heat shock en chaperone eiwitten 11,13,22. Dit protocol beschrijft hoe de weerstand tegen oxidatieve stress van C. bepalen elegans in vloeistof. We gebruikten flcn-1 (ok975) en wild-type dieren om het protocol aan te tonen, omdat we eerder hebben laten zien een verhoogde weerstand tegen oxidatieve stress bij het ​​verlies van flcn-1 (ok975) in C. 23 elegans. We hebben ook aangetoond dat deze verhoogde weerstand afhangtop AMPK en autofagie, een signalering as die cellulaire bio-energetica verbetert en bevordert stressbestendigheid 23. PQ is een oxidatieve stressor dat interfereert met het elektron transport keten reactive oxygen species 24 te produceren. Dezelfde assay kan worden aangepast en andere ROS bronnen of ROS vrijmakende verbindingen kunnen worden gebruikt zoals H 2 O 2 en rotenon. Vergelijkbare assays ontwikkeld op platen waar lage concentraties pq 25,26. Het voordeel van deze test is dat het zeer snel en de resultaten kunnen worden verkregen in één dag. Bovendien is het totale volume vloeistof gebruikt om de oxidatieve stressresistentie assay uit te voeren in 96 putjesplaten is laag in vergelijking met het volume gebruikt PQ-bevattende petrischaal. Daarom is de hoeveelheid PQ gebruikt in de vloeibare test is laag, wat de assay maakt goedkope en beperkt de productie van toxische afvalstoffen. Echter, beperkingen van deze assay ten opzichte van de plaat assays omvatten de lack van voedsel in de vloeistof assay en de lagere zuurstofconcentratie in vloeibare vergelijking met lucht. Dit zijn belangrijke factoren die in sommige gevallen kan het resultaat beïnvloeden. Daarom bevestigt reproduceerbaarheid andere methoden van oxidatieve stress resistentie raden resultaten verkregen in dit assay te ondersteunen.

<table><tbody><tr><td>Agar bacteriologisch kwaliteit</td><td>Multicell</td><td>800-010-LG</td><td></td></tr><tr><td>Bacteriologisch pepton</td><td>Oxoid</td><td>LP0037</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride biotechnologie kwaliteit</td><td>Bioshop</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C8503-25G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure tris hydrochloride</td><td>Invitrogen</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>Tris aminomethaan</td><td>Bio Basic Canada Inc</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202185A</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Bioshop</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Gistextract</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>8013-01-2</td><td></td></tr><tr><td>Methyl viologen dichloride hydraat</td><td>Aldrich chemistry</td><td>856177-1G</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal 60 x15 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Pipet 10 ml</td><td>Fisher</td><td>1367520</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat monobasic</td><td>G-Biosciences</td><td>RC-084</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat heptahydraat</td><td>Sigma</td><td>M-5921</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfosfaat dibasic</td><td>Bioshop</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Discovery v8 stereo zeiss microscoop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 wel duidelijke microtiterplaat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>flcn-1 RNAi bron</td><td>Ahringer Library</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

het meten van oxidatieve stress weerstand van<em&gt; caenorhabditis elegans</em&gt; in 96-well microtiterplaten

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidatieve stress is het gevolg van een onbalans tussen productie en detoxificatie van reactieve zuurstofspecies, een belangrijke bijdrage aan chronische menselijke ziekten, waaronder hart- en neurodegeneratieve ziekten, diabetes, veroudering en kanker. Daarom is het belangrijk om oxidatieve stress te onderzoeken niet alleen in celsystemen maar ook met gebruikmaking hele organismen. C. elegans is een aantrekkelijke modelorganisme om de genetica van oxidatieve stress signaaloverdracht, die zijn sterk evolutionair geconserveerd bestuderen. Hier bieden we een protocol om oxidatieve stress weerstand in C. meten elegans in vloeistof. In het kort, ROS-inducerende reagentia zoals paraquat (PQ) en H 2 O 2 opgelost in M9 buffer en oplossingen hoeveelheden verdeeld in de putjes van een microtiterplaat met 96 putjes. Gesynchroniseerde L4 / jong volwassen C. elegans dieren overgebracht in de putjes (5-8 dieren / putje) en overleving wordt gemetenelk uur tot de meeste wormen zijn dood. Bij het uitvoeren van een oxidatieve stress resistentietest met een lage concentratie aan stressoren in platen, veroudering kan het gedrag van de dieren op oxidatieve stress, wat kan leiden tot een verkeerde interpretatie van de gegevens beïnvloeden. In de hierin beschreven assay is dit probleem onwaarschijnlijk aangezien slechts L4 / jonge volwassen dieren worden gebruikt. Bovendien is dit protocol is goedkoop en resultaten worden verkregen in één dag, waarbij deze techniek aantrekkelijk voor genetische screens maakt. Over het algemeen, zal dit helpen om oxidatieve stress signaaltransductieroutes, die kunnen worden vertaald in een betere karakterisering van oxidatieve stress in verband menselijke aandoeningen te begrijpen.

Het vergelijken van wild-type C. elegans te flcn-1 (ok975) mutant dieren Hier gebruiken we 100 mM PQ om de weerstand van wild-type C. bepalen elegans dieren vergeleken met flcn-1 (ok975) waarvan is aangetoond dat oxidatieve stress, warmte en anoxie 23 weerstaan. Na 4 uur van behandeling 48,3% wildtype overleefden, vergeleken met 77,8% overleving bij flcn-1 (ok975) dieren. Zoals verwacht, flcn-1 (ok975) mutante dieren w...

C. elegans is een aantrekkelijk modelorganisme om signaaltransductieroutes te bestuderen die betrokken zijn bij oxidatieve stressresistentie. Hier bieden we een protocol om oxidatieve stressresistentie van C. elegans dieren in vloeibare fase te meten, met behulp van verschillende oxiderende agentia in 96-wells platen.

Het meten van oxidatieve stress Weerstand van<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In 96-well microtiterplaten

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Het algemene doel van deze procedure is om oxidatieve stress en de resistentie van C. elegans-nematoden in vloeistof te meten. Dit wordt bereikt door eerst ROS-inducerende middelen, zoals paraquat, op te lossen in M9-buffer en de oplossing in een 96-well microtiterplaat te aliquoteren. De tweede stap is om vijf tot acht gesynchroniseerde nematode in het late L4-stadium naar elke well te overbrengen, waarbij ten minste 12 wells per conditie worden gebruikt.Vervolgens wordt met behulp van een dissectiemicroscoop elk uur het aantal levende en dode dieren bepaald, totdat de meeste dieren dood zijn. De laatste stap is het berekenen van het percentage dieren dat op elk tijdstip voor elke conditie overleefde, ten minste zes dagen voordat de assay voor resistentie tegen oxidatieve stress wordt uitgevoerd. Bereid de aangepaste young grins only bact PEPIN of MYOB droge mix voor het maken van het MYOB-medium door deze goed te mengen door te schudden.Om één liter MYOB-medium te bereiden, mengt u zes gram van de MYOB-droge mix met 17 gram agar en vul aan tot één liter met H2O; autoclaveer gedurende 45 minuten bij 122 graden Celsius. Giet het MYOB-medium in platen en laat de platen twee dagen bi

measuring-oxidative-stress-resistance-caenorhabditis-elegans-96-well

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In dit protocol presenteren we een methode om te...

Het meten van Caenorhabditis elegans Levensduur in 96 Well microtiterplaten

Deze video introduceert een overlevingstest op korte termijn die een behandeling op acute toxiciteit test of een genetische stam test op resistentie tegen een toxische aandoening.  Het voorbeeldprotocol toont een voorbeeld overlevingstest waarbij wormen worden getest op hun vermogen om oxidatieve stress veroorzaakt door paraquat (PQ) te weerstaan.

C. elegans Overlevingstest: een toxiciteitstest op korte termijn

This video demonstrates a spot plate assay tailored to assess the oxidative stress responses of bacterial strains. Some strains produce pyomelanin, an antioxidant pigment. Conversely, strains treated with a test agent, leading to reduced pyomelanin production, exhibit increased susceptibility to oxidative stress, resulting in decreased cell viability compared to pyomelanin-producing strains.

A Spot Plate Assay for Evaluating Oxidative Stress Responses in Bacterial Strains

Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor het snel produceren van honderden nematode groei media agar, 96-Wells cultuur platen met een consistent aantal Caenorhhabditis elegans per putje. Deze culturen zijn nuttig voor de fenotypische screening van hele organismen. Hier richten we ons op met behulp van deze culturen op scherm chemicaliën voor Pro-levensduur effecten.

Een eenvoudige methode voor High Throughput chemische Screening in Caenorhabditis Elegans

Dit protocol beschrijft een methode voor de grootschalige teelt van Caenorhabditis elegans op solide media. Als alternatief voor vloeibare cultuur kunnen dit protocol verkrijgen van parameters voor verschillende schalen onder plaat gebaseerde teelt. Dit verhoogt de vergelijkbaarheid van de resultaten door het weglaten van de morfologische en metabole verschillen tussen vloeibare en vaste mediacultuur.

Plaat gebaseerde grootschalige teelt van Caenorhabditis elegans: bereiding van de monsters voor de studie van de metabole veranderingen bij Diabetes

Mitochondriale ademhaling is van cruciaal belang voor de overleving van het organisch; Daarom is zuurstof verbruik tarief is een uitstekende indicator voor mitochondriale gezondheid. In dit protocol, beschrijven we het gebruik van een commercieel beschikbare respirometer voor het meten van basale en maximale zuurstof verbruik in leven, intact, en vrij-sporenvormende Caenorhabditis elegans.

Meting van zuurstof verbruik in Intact Caenorhabditis elegans

De nematode Caenorhabditis elegans is een uitstekend model te ontleden gastheer-pathogeen interacties. Hier beschreven is een protocol te infecteren de worm met leden van de mitis groep streptokokken en activering van de oxidatieve stressrespons tegen H2O2 geproduceerd door deze groep van organismen te bepalen.

Studeren oxidatieve Stress veroorzaakt door de streptokokken groep Mitis in Caenorhabditis elegans

Hier karakteriseren we cellulaire proteotoxische stressreacties in de nematode C. elegans door het meten van de activering van fluorescerende transcriptieverslaggevers en assaying gevoeligheid voor fysiologische stress.

Metingen van fysiologische stressreacties in C. Elegans

Hier worden gestandaardiseerde protocollen gepresenteerd om de inductie van de warmteschokrespons (HSR) in Caenorhabditis elegans te beoordelen met behulp van RT-qPCR op moleculair niveau, tl-verslaggevers op cellulair niveau en thermorecovery op organism niveau.

Gestandaardiseerde methoden voor het meten van inductie van de heat shock response in Caenorhabditis elegans

Darmmicroben kunnen de gezondheid van hun gastheer positief of negatief beïnvloeden via specifieke of geconserveerde mechanismen. Caenorhabditis elegans is een handig platform om te screenen op dergelijke microben. Het huidige protocol beschrijft high-throughput screening van 48 bacteriële isolaten op impact op nematodenstressresistentie, gebruikt als proxy voor de gezondheid van wormen.

High-Throughput screening van microbiële isolaten met impact op caenorhabditis elegans gezondheid

Caenorhabditis elegans dienen als een uitstekend modelsysteem met robuuste en goedkope methoden voor het onderzoeken van de gezondheid, levensduur en veerkracht tegen stress.

Onderzoek naar goedkope methoden om levensduur en gezondheid te meten in Caenorhabditis elegans

Leer hoe u oxidatieve stressweerstand meet in Caenorhabditis elegans met een vloeistofassay in 96-well microtiterplaten. Deze methode berekent overlevingspercentages en helpt bij het begrijpen van cellulaire overlevingsmechanismen.

Het meten van oxidatieve stress Weerstand van

Meer video's verkennen