Opsporing van de ziekte-geassocieerde α-synucleïne door Enhanced ELISA in de hersenen van transgene muizen door overexpressie van Human A53T Gemuteerde α-synucleïne
30 mei 2015
Een ELISA die een nieuwe kwantitatieve aanpak biedt, wordt beschreven. Het detecteert specifiek ziekte-geassocieerd α-synucleïne (αSD) in een transgenisch muismodel (M83) van synucleïnopathie door gebruik te maken van verschillende antilichamen tegen ofwel de Ser129 gefosforyleerde αS-vorm of het C-terminale deel van het eiwit.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de accumulatie van de ziekte geassocieerde alfa-synucleïne in een transgenisch muismodel van de ziekte van Parkinson te monitoren met behulp van een kwantitatieve Eliza-aanpak. Dit wordt bereikt door ongeïnfecteerde muizen normaal te laten verouderen of door muizen intracerabraal te innoculeren met een hersenextract van zieke M 83. Nadat de muizen klinische ziekte hebben ontwikkeld en worden gedood, worden hersengebieden van de muizen gedisseceerd.
Vervolgens worden uit elk hersengebied homogene monsters bereid in hoog zout buffer, en Eliza wordt uitgevoerd op de homogene monsters om de ziekte geassocieerde alfa-synucleïne in elk hersengebied te kwantificeren. De Eliza-resultaten tonen aan dat de ziekte geassocieerde vorm van het alfa-synucleïne-eiwit zich voornamelijk accumuleert in de coddle-hersengebieden, inclusief de mesencephalon en de hersenstam, evenals in de wervelkolommen van de muizen. Het grote voordeel van deze Eliza-techniek in vergelijking met eerder beschikbare methoden zoals western blot of immunohistologie, is dat het een snelle en betrouwbare kwantificering biedt van de ziekte geassocieerde alfa scle.
In dit experimentele model kan deze methode helpen bij het monitoren van de accumulatie en verspreiding van dit eiwit in het centrale zenuwstelsel van deze MA-drie muizen. Dat suggereert de betrokkenheid van een hersen-achtige mechanisme tot de ontwikkeling van de klinische wetenschap. Verdere ontwikkelingen van deze methode zouden in de toekomst kunnen worden overwogen voor de studie van verschillende biologische monsters zoals hersenvocht of bloed die mogelijk ook veranderde alfa-vormen bevatten die deze procedure zullen demonstreren, zal een technicus van ons laboratorium zijn.
Alle procedures en protocollen met dieren waren in overeenstemming met EC-richtlijn 86 6 0 9 EEC, en goedgekeurd door comm ETH, het Franse Nationaal Comité voor Ethiek en Dierproeven. Voor de behandeling van ethiek en dierproeven werden de dieren gehuisvest en verzorgd in A en S'S goedgekeurde experimentele faciliteiten in Leon Young na het euthaniseren van muizen en het verwijderen van de hersenen en ruggenmerg. Volgens het tekstprotocol plaatst u een hele hersenen in een petrischaal op ijs onder lage vergroting.
Begin met het scheiden van een van de twee reukbollen door een pincet net achter de bol te plaatsen. Gebruik een neerwaartse beweging om het los te maken van de hersenen, verwijder vervolgens de tweede bol op een vergelijkbare manier. Terwijl u een pincet gebruikt om de hersenen op hun plaats te houden, plaats u voorzichtig een tweede paar pincetten tussen de linker- en rechtercortex en beweeg ze naar voren om de twee helften te scheiden.
Nu u de hersenen op hun plaats blijft houden. Plaats de tweede pincet twee millimeter achter de cortex en houd de druk naar boven om de cortex van de hippocampus te tillen. Schil vervolgens het eerste deel van de cortex af door te beginnen bij de hippocampus en naar de voorkant van de hersenen te bewegen.
Herhaal dit met de tweede helft. Plaats vervolgens de open pincetten rond een van de hippo campi. Sluit vervolgens voorzichtig de pincetten aan de onderkant van het orgaan en verwijder het voorzichtig.
Herhaal dit met de tweede hippocampus. Plaats de pincetten achter een van de striata en scheid het voorzichtig van de hersenen. Gebruik de pincetten om eventuele resterende cortex uit het striatum te verwijderen voordat u de tweede satu verwijdert om het cerebellum van de rest van de hersenen te scheiden met de pincetten, druk voorzichtig op de omtrek van het cerebellum.
Plaats vervolgens de pincetten achter het cerebellum en beweeg de pincetten naar voren om het te verwijderen met behulp van het brede gedeelte van de pincetten, verhoog ze als cephalon, die bestaat uit vier ronde structuren om duidelijk te zien waar een verbinding met de hersenstam. Maak vervolgens een verticale insnijding op de verbinding voordat u de hersenstam verwijdert, plaats de pincetten achter de mesencephalon en in grootte verticaal om het volledig te scheiden van de rest van de hersenen. Om hersenhomogeen voor te bereiden, voegt u een voldoende volume HS-buffer toe aan de gedissecteerde hersengebieden om een verwacht percentage homogenaat te bereiken, zoals weergegeven in de onderstaande tabel.
Gebruik een weefselmolen die bestaat uit een siliciumglasbuis en buispesten A en B, giet een hersengebied dat moet worden vermalen in de buis. Homogeniseer vervolgens met pestel a het weefsel 10 keer om het te scheiden. Schakel vervolgens over naar pestel B en homogeniseer nog eens 20 keer.
Gebruik een overdrachtpipet om het homogenaat over te brengen naar een buis van 1,5 milliliter, herhaal de homogenisatie met de resterende hersenmonsters. Centrifugeer de monsters gedurende vijf minuten bij 1000 G bij vier graden Celsius en verzamel vervolgens de snat en verdeel ze in 200 microliter Ali Watts. Bewaar bij min 80 graden Celsius voor verdere Eliza-analyse om Eliza uit te voeren op hersenhomogeen.
Begin met het verdunnen van de coating anti-alfa-synucleïne, konijnenpolyklonaal of monoklonaal clone 42-antilichaam met 0,01 nanogram per milliliter met 100 microliters van de antilichaamcoatingoplossing met 50 micromolair carbonaatbuffer om de putjes van 96 te coaten. Well microplate en incubeer bij vier graden Celsius een nacht. Voeg de volgende dag 300 microliters PBST toe aan de putjes en gebruik een plaatwasser om de platen vijf keer te wassen terwijl u bij kamertemperatuur werkt.
Vooruitgaande, voeg 200 microliters T 20 PBS-blokkeerbuffer toe aan elk putje en schud de platen gedurende een uur bij 150 RPM voordat u PBST gebruikt om de platen vijf keer te wassen met PBST 1% BSA. Verdun het hersenhomogeen volgens de hier vermelde richtlijnen en voeg 100 microliters toe aan elk. Well, incubeer vervolgens bij kamertemperatuur en 150 RPM gedurende twee uur voordat u PBST gebruikt om de platen te wassen. Vijf keer na de laatste wassing, voegt u de nodige alfa-synucleïne detectie-antilichamen toe, verdund in PBS BST en 1% BSA zoals vermeld in tabel twee van
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe kwantitatieve ELISA-methode voor het detecteren van ziekte-geassocieerd α-synucleïne in een transgeen muismodel voor synucleïnopathie. De techniek maakt het mogelijk om de accumulatie van α-synucleïne in verschillende hersenregio's te monitoren tijdens de progressie van de ziekte.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Biochemie
- Transgene modellen
Achtergrond
- α-synucleïne is betrokken bij synucleïnopathieën zoals de ziekte van Parkinson.
- Traditionele methoden zoals western blotting en immunohistochemie hebben beperkingen wat betreft kwantificatie.
- ELISA biedt een snel en betrouwbaar alternatief voor eiwitkwantificatie.
- Het M83 transgene muismodel wordt gebruikt om de progressie van de ziekte te bestuderen.
Doel van de studie
- Om de accumulatie van ziekte-geassocieerd α-synucleïne in specifieke hersengebieden te kwantificeren.
- Om de effectiviteit van ELISA te vergelijken met traditionele methoden.
- Om het begrip van de distributie van α-synucleïne bij synucleinopathie te vergroten.
Gebruikte methoden
- Transgene muizen bleven ofwel niet-geïnoculeerd of werden geïnoculeerd met hersenextracten.
- De muizen kregen de tijd om ouder te worden of om klinische ziekte te ontwikkelen vóór de offerdatum.
- Hersenregio's werden gedisseceerd en gehomogeniseerd in een hoog-zoutbuffer.
- Er werd een ELISA uitgevoerd om de α-synucleïne-niveaus in de monsters te kwantificeren.
Belangrijkste resultaten
- Er werd een significante ophoping van ziekte-geassocieerd α-synucleïne waargenomen in de caudale hersenregio's.
- Hoge niveaus werden gedetecteerd in het mesencefalon, de hersenstam en het ruggenmerg.
- ELISA zorgde voor een snelle en betrouwbare kwantificering in vergelijking met traditionele methoden.
- De bevindingen ondersteunen het gebruik van ELISA voor het bestuderen van α-synucleïne bij synucleïnopathieën.
Conclusies
- De nieuwe ELISA-methode is effectief voor het kwantificeren van α-synucleïne in transgene modellen.
- Deze benadering kan verder onderzoek naar synucleïnopathieën faciliteren.
- Toekomstige studies kunnen therapeutische interventies onderzoeken die gericht zijn op de accumulatie van α-synucleïne.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Kwantitatieve detectie van ziekte-geassocieerd α-synucleïne is essentieel voor het verminderen van risico's bij de validatie van targets in de geneesmiddelenontwikkeling voor synucleinopathieën. Een ELISA-gebaseerde benadering maakt een snelle, betrouwbare kwantificering over verschillende hersengebieden mogelijk, wat go/no-go-beslissingen in preklinische programma's ondersteunt. Deze methode vergroot het voorspellende vertrouwen door schaalbare, reproduceerbare resultaten te leveren voor mechanistische studies en het volgen van therapeutische interventies.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de α-synucleïne-pathologie te onderzoeken als therapeutisch doelwit in modellen van de ziekte van Parkinson.
- Operationele waarde: Biedt kwantitatieve, antilichaamspecifieke resultaten om target-engagement en pathway-modulatie te verduidelijken.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door moleculaire accumulatie te correleren met de fenotypische progressie van de ziekte.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert gestandaardiseerde, high-throughput compatibele kwantificering van ziekte-geassocieerde α-synucleïne.
- Operationele waarde: Vereist slechts 10 μg hersenequivalenten voor detectie, wat de efficiëntie van de assay verbetert ten opzichte van Western blot.
- Reproduceerbaarheidswaarde: Toont consistente resultaten over verschillende inoculatie- en verouderingscondities, waardoor betrouwbare longitudinale tracking mogelijk is.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Vergemakkelijkt de monitoring van prion-achtige propagatie in het CZS, wat bijdraagt aan mechanistische modellen van ziekteverspreiding.
- Operationele waarde: Detecteert accumulatie in caudale hersenregio's en het ruggenmerg, wat overeenkomt met de klinische pathologie.
- Translationele waarde: Ondersteunt inspanningen voor de kwalificatie van biomarkers door kwantificeerbare, ziektegerelateerde eiwitread-outs te verschaffen.
Integratie van pipeline en workflow
De ELISA-methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot preklinisch efficiëntieonderzoek, waardoor iteratieve beoordeling van α-synucleïne-modulerende verbindingen mogelijk wordt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing met betrekking tot α-synucleïne-aggregatie en neurotoxiciteit in transgene modellen.
- Screening: Maakt assay-ready biologische systemen mogelijk met kwantitatieve outputs voor de evaluatie van compound-bibliotheken.
- Analytics: Biedt op absorbentie gebaseerde read-outs bij 450 nm, wat statistische vergelijking van behandelingseffecten over verschillende hersenregio's mogelijk maakt.
- Translationeel onderzoek: Verbindt moleculaire detectie met fenotypische uitkomsten, ter ondersteuning van risico-gecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling.
- Enterprise Reuse: Vestigt een gestandaardiseerd platform voor α-synucleïne-kwantificering dat toepasbaar is op meerdere ziektemodellen en therapeutische modaliteiten.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van het target via specifieke, kwantitatieve detectie van ziekte-geassocieerd α-synucleïne.
- Operationele waarde: Biedt snelle resultaten (binnen enkele uren) vergeleken met dagen voor Western blot, wat de projectplanning versnelt.
- Strategische waarde: Vermindert het risico op falen in een laat stadium door vroege, op het mechanisme gebaseerde go/no-go beslissingen mogelijk te maken.
- Impact op de portfolio: Verbetert de kapitaalefficiëntie door prioriteit te geven aan verbindingen met aantoonbare target engagement in vivo.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in ELISA-optimalisatie, antilichaamvalidatie en homogenisatie van hersenweefsel.
- Afhankelijk van de bereiding van hoog-zoutbuffers en toegang tot een microplatenlezer voor absorptiemetingen.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor een consistente monsterverwerking en incubatieprotocollen.
- Aanpassing aan andere modelsystemen kan validatie van de antilichaamspecificiteit en epitopen-toegankelijkheid vereisen.
- Praktische beperking: Signaaldetectie is afhankelijk van voldoende accumulatie van ziekte-geassocieerd α-synuclein, wat kan variëren per model en leeftijd.
