Name: Opsporing van de ziekte-geassocieerde α-synucleïne door Enhanced ELISA in de hersenen van transgene muizen door overexpressie van Human A53T Gemuteerde α-synucleïne (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Leer een verbeterde ELISA-methode voor het detecteren van ziekte-geassocieerde α-synucleïne in transgene muizen. Deze techniek kwantificeert eiwitophoping in hersengebieden en ondersteunt onderzoek naar synucleïnopathieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Damien Gaillard bedanken voor inentingen en de follow-up van dierproeven. Dit werk werd ondersteund door ANSES (Franse agentschap voor Voedsel, Milieu en Occupational Health &amp; Safety) en door een subsidie ​​van de Stichting France Parkinson.

Alle procedures en protocollen bij dieren waren in overeenstemming met de EG-richtlijn 86/609 / EEG van de Raad en geratificeerd door komt, de Franse nationale commissie voor de behandeling van de ethiek in dierproeven (protocol 11-0043). De dieren werden gehuisvest en verzorgd in ANSES goedgekeurd experimentele faciliteiten in Lyon (goedkeuring B 69387 0801). 1. Voorbereiding van de Muizen <ol><li> Euthanaseren muizen door intraperitoneale injectie van een dodelijke dosis van natriumpentobarbital. </li><li> Haal de hele hersenen van de muis schedel en plaats deze in een 35 mm plastic petrischaal op ijs tot extractie. </li><li> Pak de cervicale ruggenmerg. OPMERKING: Extract aS hetzij van een van de hersenhelften na sagittale snijden of uit ontleed muis hersenen, beschikbaar na de in tabel 1 genoemde experimenten. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Experiment </td><td> Muizen Inoculum (brain equivalent) </td><td> Survival periode (Dpi) </td><td> Mediaan / maximale survival (Dagen oud) </td><td> aS d detectie met ELISA / WB / IHC </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Geënte muizen </td><td> 441 ± 166 </td><td> 419/736 </td><td> 8/8 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Geïnoculeerde muizen (0,2 mg) </td><td> 150 ± 52 </td><td> 140/241 </td><td> 9/9 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Lijst van experimenten uitgevoerd op M83 muizen. Inentingen werden uitgevoerd op 6 weken voor experiment 2 in de striato-corticale met 20 ul van een hersenhomogenaat van een zieke muis (1% gew / vol in glucose 5%), na anesthesie van 6 weken oude homozygote M83 muizen met 3% isofluraan inademing. dpi: dagen na inoculatie. 2. aS extractie van hersenhelften <ol><li> Sagittally snijd de hersenen om twee helften te verkrijgen. Weeg elke helft in een ribolysis buis met kogels. </li><li> Bereid High Salt (HS) buffer die 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 750 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 1% fosfatase en protease inhibitor cocktail. Naar High Salt buffer de hersenhelften tot 20% (w / v) homogenaten verkrijgen. </li><li> Bereid monsters van de hersenhelften behulp van een mechanische homogenisator bij 6,0 m / s voor 23 sec tweemaal. Na de eerste 23 sec homogenisatie, plaats de buizen met de homogenaten op ijs gedurende 2 minuten vóór de tweede 23-seconden cyclus. </li><li> Centrifugeer de monsters bij 1000 xg gedurende 5 minuten bij ongemalen hersenen fragmenten elimineren. Herstel de supernatanten, verdelen in 200 gl aliquots en bewaar ze bij -80 ° C voor daaropvolgende analyse ELISA. </li></ol> 3. aS Extraction uit ontleed Brain Regio <ol><li> Ontleden eenhele brein in een 35 mm plastic petrischaal op ijs met een laag vermogen vergrootglas (8x vergroting) met behulp van twee forcipes waarvan de uiteinden worden bij elkaar gehouden, behalve wanneer het ontleden van de hippocampus. Niet meer dan 10 minuten om de integriteit hersenen te behouden. Plaats de hersenen goede kant naar boven en de volgende gebieden van de hersenen in deze volgorde op te halen: <ol><li> Afzonderlijke één van beide reukkwabben behulp van een tang geplaatst achter de lamp. Maak het van de hersenen door een neerwaartse beweging. Herhaal deze handeling voor de tweede lamp. </li><li> Voorzichtig wig de tang tussen beide cortex en verplaatsen naar voren om dissociatie van de twee cortex vergemakkelijken. Houd de hersenen plaats met een tang, gebruikt een andere voor de cortex te scheiden van de hippocampus. </li><li> Plaats de tang 2 mm onder de cortex. Handhaaf een zachte druk op de tang tot de bovenkant van de hippocampus zichtbaar. Trek het eerste deel van de cortex, en herhaal met het tweede deel. Gebruik de tang om de twee te scheiden cortexvanaf de hippocampus en beweegt naar de voorzijde van de hersenen. </li><li> Plaats de open tang rond een van de hippocampus. Sluit de tang onder in de hippocampus verwijder voorzichtig, terugwinnen zoveel mogelijk. Herhaal de procedure voor de tweede hippocampus. </li><li> Plaats de geopende tang onder een van de striata en voorzichtig scheiden van de hersenen. Gebruik de tang om alle resterende cortex van het striatum te verwijderen. Herhaal deze procedure voor de tweede striatum. </li><li> Gebruik de tang voorzichtig drukken van 2 mm van de omtrek van het cerebellum om scheiding van het cerebellum van de hersenen te vergemakkelijken. Plaats de tang net achter het cerebellum en verwijder deze door het bewegen van de tang naar voren. </li><li> Gebruik het brede deel van de tang om de mesencephalon om te verhogen om duidelijk te zien waar het samenkomt met de hersenstam. Maak een verticale incisie op de kruising verwijder vervolgens de hersenstam. </li><li> Plaats de tang achter het mesencephalon, die iks uit vier ronde structuren. Incise verticaal tot het mesencephalon volledig is gescheiden van de resterende hersenen. </li></ol></li><li> Bereid homogenaten van variable% (gewicht / volume) in HS buffer, afhankelijk van de hoeveelheid beschikbare weefsels, dat wil zeggen 5% homogenaat een gewicht tussen 10 en 30 mg, 10% bij een gewicht tussen 30 en 80 mg, en 20% een gewicht boven 80 mg. <ol><li> Voeg een voldoende hoeveelheid HS buffer aan de ontlede hersengebieden de verwachte% homogenaat verkregen. </li><li> Vortex en controleer of de weefsels volledig ondergedompeld in de HS buffer. </li><li> Homogeniseren monsters bereid uit de ontleed hersenen regio&#39;s of de cervicale ruggenmerg met een tissue molen bestaat uit een borosilicaat glazen buis en twee stampers, A en B. </li><li> Giet elk gebied van de hersenen om direct in de buis worden verpletterd. Plaats de stamper Een in de buis en trek het. Herhaal deze beweging ongeveer tien keer om het weefsel te distantiëren. Maak dan gebruik van een stamper B naar Continue malen van het weefsel met een verdere 20 beweging. Breng de homogenaten in een 1,5 ml buis met een 1 ml transferpipet. </li></ol></li><li> Centrifugeer de monsters bij 1000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C geven ongemalen hersenen fragmenten elimineren. Haal de supernatanten, verdeel ze in 200 ul aliquots en bewaar ze bij -80 ° C voor daaropvolgende ELISA analyse. </li></ol> 4. Detectie van aS door ELISA <ol><li> Verdun de coating antilichamen tegen 0,01 ng / ml. Gebruik een anti-aS konijnen polyklonaal of monoklonaal antilichaam kloon 42 in 50 mM Na 2 CO 3 / NaHCO buffer 3 (pH 9,6). </li><li> Coat de 96-well microplaten met 100 gl per putje van deze bekledingsoplossing, uitstappen bij 4 ° CO / N. Gebruik de anti-aS konijn polyklonaal antilichaam in de coating oplossing voor het gebruik van ELISA-detectie van antilichamen syn514, kloon 42, LB509, AS11, 4D6 of 8A5. Met de anti-aS monoklonaal antilichaam kloon 42 als een bekledingsoplossingin combinatie met de anti-pSer129 aS detectieantilichaam. Opmerking: Zo nodig kunnen de platen bij 4 ° C worden gehouden gedurende één week voordat de ELISA wordt uitgevoerd. </li><li> Gebruik een plaatwasser aan de platen vijfmaal wassen met 300 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing met 0,05% Tween 20 (PBST) per putje. Vanaf deze stap verder, incubatie bij KT. </li><li> Voeg 200 ul van T20 PBS blokkerende buffer per putje. Schud gedurende 1 uur bij 150 opm. Was de plaatjes vijfmaal met PBST. </li><li> Verdun het homogenaat (verdunning 1: 100 van de 20% homogenaten, 01:50 10% van de homogenaten en 1:25 van de 5% homogenaten in PBST 1% BSA) en voeg 100 ul aan elk putje. Incubeer daarna gedurende 2 uur onder schudden bij 150 rpm. Was de plaatjes vijfmaal met PBST. </li><li> Voeg de verschillende aS detectie antilichamen in PBST met BSA 1% aan het in de Materials List genoemde verdunningen. Incubeer gedurende 1 uur bij 150 opm. Was de plaatjes vijfmaal met PBST. </li><li> Voeg ofwel anti-mouse of anti-konijn IgG HRP-conjugaten verdund 1: 8000 in PBST, aangevuld met 1% BSA gedurende 1 uur onder schudden bij 150 rpm. Was de plaatjes vijfmaal met PBST. </li><li> Voeg 100 ul van 3,3 &#39;, 5,5&#39;-tetramethylbenzidine (TMB) oplossing aan elk putje en incubeer gedurende 15 minuten in het donker onder schudden bij 150 rpm. </li><li> Stop de reactie door toevoeging van 100 ul 1 N HCl per put meet de absorptie bij 450 nm met de microplaat reader. </li><li> Voor data-analyse, aftrekken van de verkregen in een goed met alle reagentia behalve eventuele muizenhersenen monsters (blanco putje) van de OD-waarden gemeten voor elk van de geanalyseerde monsters OD-waarde. </li></ol> 5. Epitope Mapping <ol><li> Voer epitoopmapping volgens de beschreven Osman 16 werkwijze. Kort spot peptiden van humaan α-synucleïne sequentie die 12 aminozuren aan nitrocellulose met 10 overlappende aminozuren. </li><li> Blok met 50 mM Tris / 150 mM NaCl pH 10 bevattende 0,05% Tween 20 en 5% melkpoeder. Incubeer het antilichaam in blokkerende oplossing bij een concentratie van 2 mg antilichaam per ml bij 2-10 ° CO / N. </li><li> Was het membraan driemaal met gebruikmaking van 50 mM Tris / 150 mM NaCl pH 10 met 0,05% Tween 20. Incubeer met geit anti-muis IgG HRP conjugaat. Was het membraan nog vijf keer met dezelfde buffer dan vlek met behulp van een Western blot TMB vlekken kit. </li></ol> 6. Statistische analyse <ol><li> Gebruik de R software en nlme pakket om mixed-effects regressies uit te voeren om te modelleren OD. Voor elke vergelijking, het uitvoeren van een gemengd effect regressiemodel. Gebruik een fixed effect te onderscheiden symptomatische van asymptomatische groepen. </li><li> Gebruik een willekeurig effect om de variabiliteit herhalingen geven voor een bepaalde muis. Controleer homoscedasticiteit door onderzoek van de residuen en indien nodig de variantie functies om het model van variantiestructuur ze binnen de groep fouten in overeenstemming met Pinheiro en Bates 17. Instellen 0,05 als significantiedrempel P. </li></ol>

<ol><li>Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((100+years+of+Lewy+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">100 years of Lewy pathology.</a> Nat Rev Neurol. 9, 13-24 (2013).</li>
<li>Waxman, E. A., Giasson, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+regulation+of+casein+kinase-mediated+phosphorylation+of+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Specificity and regulation of casein kinase-mediated phosphorylation of alpha-synuclein.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67, 402-416 (2008).</li>
<li>Anderson, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+Ser-129+is+the+dominant+pathological+modification+of+alpha-synuclein+in+familial+and+sporadic+Lewy+body+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease.</a> J Biol Chem. 281, 29739-29752 (2006).</li>
<li>Mougenot, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+acceleration+of+a+synucleinopathy+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model.</a> Neurobiol Aging. 33, 2225-2228 (2012).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebral+inoculation+of+pathological+alpha-synuclein+initiates+a+rapidly+progressive+neurodegenerative+alpha-synucleinopathy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice.</a> J Exp Med. 209, 975-986 (2012).</li>
<li>Giasson, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+alpha-synucleinopathy+with+severe+movement+disorder+in+mice+expressing+A53T+human+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein.</a> Neuron. 34, 521-533 (2002).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+alpha-synuclein+transmission+initiates+Parkinson-like+neurodegeneration+in+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice.</a> Science. 338, 949-953 (2012).</li>
<li>Masuda-Suzukake, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+spreading+of+pathological+alpha-synuclein+in+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+%3A+a+journal+of+neurology%22%5BJournal%5D)">Prion-like spreading of pathological alpha-synuclein in brain.</a> Brain : a journal of neurology. 136, 1128-1138 (2013).</li>
<li>Sacino, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloidogenic+alpha-synuclein+seeds+do+not+invariably+induce+rapid%2C+widespread+pathology+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Amyloidogenic alpha-synuclein seeds do not invariably induce rapid, widespread pathology in mice.</a> Acta neuropathologica. 127, 645-665 (2014).</li>
<li>Recasens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+body+extracts+from+parkinson%27s+disease+brains+trigger+alpha-synuclein+pathology+and+neurodegeneration+in+mice+and+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Lewy body extracts from parkinson's disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys.</a> Ann Neurol. , (2013).</li>
<li>Foulds, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylated+alpha-synuclein+can+be+detected+in+blood+plasma+and+is+potentially+a+useful+biomarker+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Phosphorylated alpha-synuclein can be detected in blood plasma and is potentially a useful biomarker for Parkinson's disease.</a> FASEB J. 25, 4127-4137 (2011).</li>
<li>El-Agnaf, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+oligomeric+forms+of+alpha-synuclein+protein+in+human+plasma+as+a+potential+biomarker+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Detection of oligomeric forms of alpha-synuclein protein in human plasma as a potential biomarker for Parkinson's disease.</a> Faseb J. 20, 419-425 (2006).</li>
<li>Lee, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-linked+immunosorbent+assays+for+alpha-synuclein+with+species+and+multimeric+state+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neruosci+Meth%22%5BJournal%5D)">Enzyme-linked immunosorbent assays for alpha-synuclein with species and multimeric state specificities.</a> J Neruosci Meth. 199, 249-257 (2011).</li>
<li>Unterberger, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+disease-associated+alpha-synuclein+in+the+cerebrospinal+fluid%3A+a+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Detection of disease-associated alpha-synuclein in the cerebrospinal fluid: a feasibility study.</a> Clin Neuropathol. 33, 329-334 (2014).</li>
<li>Betemps, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+spreading+in+M83+mice+brain+revealed+by+detection+of+pathological+alpha-synuclein+by+enhanced+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein spreading in M83 mice brain revealed by detection of pathological alpha-synuclein by enhanced ELISA.</a> Acta Neuropathol. (Berl). 2, 29(2014).</li>
<li>Osman, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monoclonal+antibody+that+recognizes+a+potential+coeliac-toxic+repetitive+pentapeptide+epitope+in+gliadins%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">A monoclonal antibody that recognizes a potential coeliac-toxic repetitive pentapeptide epitope in gliadins).</a> Eur J Gastroenterol Hepatol. 13, 1189-1193 (2001).</li>
<li>Pinheiro, J. C., Bates, D. M. Ch. 5. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPinheiro%2C+JC+%22Mixed-Effects+Models+in+S+and+S-PLUS%22">Mixed-Effects Models in S and S-PLUS</a>. Chambers, J. 5, Springer. 206-225 (2000).</li>
<li>Mougenot, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+monoclonal+antibody%2C+against+human+alpha-synuclein%2C+in+a+subpopulation+of+C57BL%2F6J+mice%2C+presenting+a+deletion+of+the+alpha-synuclein+locus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neruosci+Meth%22%5BJournal%5D)">Production of a monoclonal antibody, against human alpha-synuclein, in a subpopulation of C57BL/6J mice, presenting a deletion of the alpha-synuclein locus.</a> J Neruosci Meth. 192, 268-276 (2010).</li>
<li>Specht, C. G., Schoepfer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+the+alpha-synuclein+locus+in+a+subpopulation+of+C57BL%2F6J+inbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Deletion of the alpha-synuclein locus in a subpopulation of C57BL/6J inbred mice.</a> BMC Neurosci. 2, 11(2001).</li>
<li>Lee, B. R., Matsuo, Y., Cashikar, A. G., Kamitani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Ser129+phosphorylation+of+alpha-synuclein+in+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of Ser129 phosphorylation of alpha-synuclein in melanoma cells.</a> J Cell Sci. 126, 696-704 (2013).</li>
<li>Perrin, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+mapping+and+specificity+of+the+anti-alpha-synuclein+monoclonal+antibody+Syn-1+in+mouse+brain+and+cultured+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Epitope mapping and specificity of the anti-alpha-synuclein monoclonal antibody Syn-1 in mouse brain and cultured cell lines.</a> Neurosci Lett. 349, 133-135 (2003).</li>
<li>Emmanouilidou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+alpha-synuclein+secretion+in+mouse+and+human+brain+parenchyma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Assessment of alpha-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma.</a> PLoS One. 6, e22225(2011).</li>
<li>Mougenot, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+prion+strains+in+a+transgenic+mouse+models+overexpressing+human+A53T+mutated+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Transmission of prion strains in a transgenic mouse models overexpressing human A53T mutated alpha-synuclein.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 70, 377-385 (2011).</li>
<li>Foulds, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+longitudinal+study+on+alpha-synuclein+in+blood+plasma+as+a+biomarker+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A longitudinal study on alpha-synuclein in blood plasma as a biomarker for Parkinson's disease.</a> Sci Rep. 3, 2540(2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Het gebruik van een ELISA werd aangetoond om specifiek te detecteren aS D rechtstreeks van muizenhersenen homogenaat gedurende de ziekte bij de M83 transgeen muismodel. Inderdaad, kan dit ELISA gemakkelijk onderscheiden ziek M83 muizen van gezonde M83 muizen met alleen hele hersenhomogenaten in High Salt buffer. De meest kritische stappen voor succesvolle resultaten met deze ELISA zijn: kunnen ontleden de verschillende gebieden van de muizenhersenen door de nodige handvaardigheid ...

De meest gebruikte methoden voor het detecteren van ziekte-geassocieerd α-synucleïne (αSD) in experimentele modellen van de ziekte van Parkinson (PD), zoals immunohistochemie of Western blot, zijn tijdrovend en niet kwantitatief. Deze neurodegeneratieve ziekte wordt gekenmerkt door alpha-synucleïne aggregatie voornamelijk in de vorm van inclusies die een geaggregeerde vorm bevatten van het normaal oplosbare presynaptische eiwit αS1,2 (Lewy-lichamen en Lewy-neurieten). Normaal gesproken slechts marginaal gefosforyleerd, wordt αS hypergefosforyleerd op zijn serine 129-residu in deze inclusies3 en kan worden gemonitord door antilichamen die specifiek zijn gericht tegen gefosforyleerd αS op Ser129, waardoor een betrouwbare marker van de pathologie wordt geboden.
Recent onderzoek suggereert dat een "prion-achtige" mechanisme betrokken zou kunnen zijn bij de verspreiding van αS-aggregatie binnen het zenuwstelsel van een getroffen patiënt4,5. Deze studies rapporteerden de versnelling van een synucleïnopathie door het inoculeren van hersenextracten die αSD bevatten in een transgenisch muismodel (M83) dat een A53T-gemuteerde humane αS-eiwit tot expressie brengt die geassocieerd is met een ernstige motorische beperking die optreedt naarmate de muizen ouder worden6. Op dezelfde manier bevestigde intra-cerebrale inoculatie van geaggregeerde recombinante αS in hetzelfde M83-muismodel de versnelling van aggregatie5. De inductie van afzettingen van gefosforyleerd αS is ook gerapporteerd na inoculatie van C57Bl/6 wild-type muizen met ofwel fibrillaire recombinante αS of hersenextracten van menselijke DLB-patiënten7,8. Sacino et al.9 wezen er onlangs op dat na injectie van fibrillaire humane αS, een wijdverspreide en progressieve cerebrale αS-inclusievorming kon worden geïnduceerd in M83-muizen, maar niet in E46K-transgene muizen of niet-transgene muizen waarin geïnduceerde αS-inclusies tijdelijk waren en voornamelijk beperkt waren tot de injectieplaats. Recent onderzoek bij apen bevestigde de verspreiding van αS-aggregaten na inoculatie van PD-afgeleide extracten in diersoorten die dichter bij mensen staan10.
De link tussen αS-alteraties en de ziekte van Parkinson suggereert dat αSD een potentiële biomarker is voor de ziekte van Parkinson11. Een recente studie toonde de detectie van oligomere oplosbare aggregaten van α-synucleïne in menselijk cerebrospinale vloeistof (CSF) en plasma aan als een potentiële biomarker voor de ziekte van Parkinson op basis van een conventioneel sandwich-systeem ELISA met gebruik van dezelfde antilichaam om αS te vangen en detecteren12. Op basis van dezelfde methode werden multimere eiwitten herkend in biologische monsters, inclusief de hersenen, omdat er meerdere kopieën van epitopen aanwezig zijn in de geassembleerde vormen13. Zeer recent werd pathologisch αS in de CSF van patiënten met een bewezen Lewy-body-pathologie gedetecteerd met behulp van zowel een ELISA-kit met een zeer specifiek antilichaam tegen αSD (5G4) als een immunoprecipitatie-assay14. Deze methoden konden patiënten met PD/DLB onderscheiden van andere soorten dementie.
De "prion-achtige" verspreiding van αS-aggregatie werd verder bestudeerd in het transgene muismodel M83 met behulp van een ELISA-benadering die was ontworpen om specifiek αSD te identificeren15. In deze studie rapporteren we het gedetailleerde ELISA-protocol dat werd gebruikt om αSD kwantitatief te detecteren in zieke muizen (of ze nu zijn geïnoculeerd met αSD van zieke M83-muizen of niet) en vooral in de hersengebieden die specifiek worden aangevallen door het pathologische proces in dit transgene M83-muismodel4.

<table><tbody><tr><td>LB509</td><td>Abcam</td><td>ab27766</td><td>Detectieantilichaam 1/2.000</td></tr><tr><td>AS11</td><td>Geproduceerd bij Anses</td><td></td><td>Detectieantilichaam 1/1.000</td></tr><tr><td>4D6</td><td>Abcam</td><td>ab1903</td><td>Detectieantilichaam 1/2.000</td></tr><tr><td>PSer129</td><td>Abcam</td><td>ab59264</td><td>Detectieantilichaam 1/3.000</td></tr><tr><td>PSer129&nbsp;EP1536Y</td><td>Abcam</td><td>ab51253</td><td>Detectieantilichaam 1/1.000</td></tr><tr><td>syn514</td><td>Abcam</td><td>ab24717</td><td>Detectieantilichaam 1/500</td></tr><tr><td>clone 42</td><td>BD Biosciences</td><td>610787</td><td>Bekledings- en detectieantilichaam (1/2.000)</td></tr><tr><td>8A5</td><td>Verstrekt door Dr. Anderson</td><td></td><td>Detectieantilichaam 1/2.000</td></tr><tr><td>polyclonal anti-&alpha;syn antilichaam</td><td>Millipore</td><td>AB5038P</td><td>Bekledingsantilichaam</td></tr><tr><td>Anti-muis IgG HRP-conjugaat</td><td>Southern Biotech</td><td>1010-05</td><td></td></tr><tr><td>Anti-konijn IgG HRP-conjugaat</td><td>Southern Biotech</td><td>4010-05</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-muis IgG HRP-conjugaat</td><td>Dianova</td><td>115-035-164</td><td></td></tr><tr><td>HS-buffer</td><td></td><td></td><td>Aanpassen op pH 7,5 en bewaren bij 4 &#176;C</td></tr><tr><td><ul>
<li>Tris-HCl 50&nbsp;mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>26-128-3094-B</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>NaCl 750 mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>1112-A</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>EDTA 5 mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>EU0007-B</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>DTT 1 mM </li>
</ul></td><td>Sigma</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>Aanpassen op pH 7,5</td></tr><tr><td><ul>
<li>Na2HPO4 1&nbsp;mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>1309</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>KH2PO4 1.5&nbsp;mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>2018</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>NaCl&nbsp; 137 mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>1112-A</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>KCl 2.7 mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>P017</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Euromedex</td><td>2001-C</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>DTT 1 mM</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>Voorraadoplossing 100 mM, giftig</td></tr><tr><td>1% fosfatase cocktail</td><td>Pierce</td><td>78428</td><td></td></tr><tr><td>1% protease remmer cocktail</td><td>Roche</td><td>04&nbsp;693&nbsp;132&nbsp;001</td><td>50x geconcentreerd</td></tr><tr><td>Microplate MaxiSorpTM</td><td>Thermo Scientific</td><td>442404</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tampon carbonaat 50 mM pH 9,6</td></tr><tr><td><ul>
<li>Na2CO3, 10H2O </li>
</ul></td><td>Sigma</td><td>71360</td><td>2,86 g/L</td></tr><tr><td><ul>
<li>NaHCO3 </li>
</ul></td><td>Merk</td><td>6329</td><td>3,36 g/L, pH&nbsp;9,6</td></tr><tr><td>Superblock T20 PBS-blokkeringsbuffer</td><td>Pierce</td><td>E6423H</td><td>10x geconcentreerd</td></tr><tr><td>TMB</td><td>Sigma</td><td>T0440</td><td>Gebruikt voor ELISA</td></tr><tr><td>TMB</td><td>Analytik Jena AG</td><td>847-0104200302</td><td>Gebruikt voor epitope mapping</td></tr><tr><td>HCl 1&nbsp;N</td><td>Chimie plus</td><td>40030</td><td></td></tr><tr><td>Ribolyser</td><td>Thermo</td><td>Fast prep FP120</td><td>bewaar op ijs bij deze stap</td></tr><tr><td>Slijpbuizen</td><td>Biorad</td><td>355-1197</td><td></td></tr><tr><td>Plaatwasser</td><td>Tecan</td><td>Columbus Pro</td><td></td></tr><tr><td>Plaatlezer</td><td>Biorad</td><td>Model 680</td><td></td></tr><tr><td>Krachtvergroter met lage vergroting&nbsp;</td><td>VWR</td><td>630-1062</td><td>8x vergroting</td></tr><tr><td>Forceps Dumont#7</td><td>WPI</td><td>14097</td><td>Voor dissectiestappen</td></tr><tr><td>Transferpipet 1ml Samso</td><td>Samso</td><td>043231</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml buisjes</td><td>Dutscher</td><td>033290</td><td></td></tr></tbody></table>

opsporing van de ziekte-geassocieerde α-synucleïne door enhanced elisa in de hersenen van transgene muizen door overexpressie van human a53t gemuteerde α-synucleïne

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

Naast gevestigde werkwijzen zoals Western blot, zijn nieuwe methoden nodig om snel en gemakkelijk te kwantificeren ziektegeassocieerde α-synucleïne (aS D) in experimentele modellen van synucleopathies. Een transgene muis lijn (M83) overexpressie menselijke A53T aS spontaan ontwikkelen van een dramatische klinische fenotype acht tot 22 maanden oud, gekenmerkt door symptomen zoals gewichtsverlies, uitputting en ernstige motorische beschadiging, werd gebruikt in deze studie. Voor moleculaire analyses van aS D (ziekte-geassocieerde aS) in deze muizen, werd een ELISA ontworpen om specifiek te kwantificeren aS D in zieke muizen. Analyse van het centrale zenuwstelsel in dit muismodel toonde de aanwezigheid van aS D voornamelijk in de caudale hersenen en het ruggenmerg. Er waren geen verschillen in aS D verdeling over de verschillende experimentele omstandigheden die leiden tot klinische ziekte, dat wil zeggen in uninoculated en normaal veroudering transgene muizen en in muizen geënt met hersenen extracten van zieke muizen. De specifieke detectie van aS D immunoreactiviteit met behulp van een antilichaam tegen gefosforyleerd Ser129 aS door ELISA hoofdzaak gecorreleerd met die welke wordt verkregen door middel van Western blot en immunohistochemie. Onverwacht werden vergelijkbare resultaten waargenomen met diverse andere antilichamen tegen het C-terminale deel van aS. De voortplanting van aS D, wat een rol van een &quot;prion-achtige&quot; -mechanisme, kunnen dus gemakkelijk worden gecontroleerd en gekwantificeerd in dit muizenmodel met gebruik van een ELISA benadering.

In deze studie, de ELISA gebruikte welbepaalde ziektegeassocieerde aS (aS D) in hersen- homogenaten bereid in een buffer met hoog zoutgehalte van zieke muizen M83. Met behulp van een antilichaam specifiek herkent pSer129 aS (p = 0,0074), de ELISA onderscheidt gemakkelijk oude, zieke muizen (&gt; 8 maanden oud) uit jonge (2-5 maanden oud), gezonde M83 muizen (figuur 1). Verscheidene andere antilichamen toonde vergelijkbaar hoog signalen (&gt; 0,6 OD) alleen in hersenhomogenaten van zieke muize...

Een ELISA die een nieuwe kwantitatieve aanpak biedt, wordt beschreven. Het detecteert specifiek ziekte-geassocieerd α-synucleïne (αSD) in een transgenisch muismodel (M83) van synucleïnopathie door gebruik te maken van verschillende antilichamen tegen ofwel de Ser129 gefosforyleerde αS-vorm of het C-terminale deel van het eiwit.

Opsporing van de ziekte-geassocieerde α-synucleïne door Enhanced ELISA in de hersenen van transgene muizen door overexpressie van Human A53T Gemuteerde α-synucleïne

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de accumulatie van de ziekte geassocieerde alfa-synucleïne in een transgenisch muismodel van de ziekte van Parkinson te monitoren met behulp van een kwantitatieve Eliza-aanpak. Dit wordt bereikt door ongeïnfecteerde muizen normaal te laten verouderen of door muizen intracerabraal te innoculeren met een hersenextract van zieke M 83. Nadat de muizen klinische ziekte hebben ontwikkeld en worden gedood, worden hersengebieden van de muizen gedisseceerd.Vervolgens worden uit elk hersengebied homogene monsters bereid in hoog zout buffer, en Eliza wordt uitgevoerd op de homogene monsters om de ziekte geassocieerde alfa-synucleïne in elk hersengebied te kwantificeren. De Eliza-resultaten tonen aan dat de ziekte geassocieerde vorm van het alfa-synucleïne-eiwit zich voornamelijk accumuleert in de coddle-hersengebieden, inclusief de mesencephalon en de hersenstam, evenals in de wervelkolommen van de muizen. Het grote voordeel van deze Eliza-techniek in vergelijking met eerder beschikbare methoden zoals western blot of immunohistologie, is dat het een snelle en betrouwbare kwantificering biedt van de ziekte geassocieerde alfa scle.In dit experimentele model kan deze methode helpen bij het monitoren van de accumulatie en verspreiding van dit eiwit in het centrale zenuwstelsel van deze MA-drie muizen. Dat suggereert de betrokkenheid van een hersen-achtige mechanisme tot de ontwikkeling van de klinische wetenschap. Verdere ontwikkelingen van deze methode zouden in de toekomst kunnen worden overwogen voor de studie van verschillende biologische monsters zoals hersenvocht of bloed die mogelijk ook veranderde alfa-vormen bevatten die deze procedure zullen demonstreren, zal een technicus van ons laboratorium zijn.Alle procedures en protocollen met dieren waren in overeenstemming met EC-richtlijn 86 6 0 9 EEC, en goedgekeurd door comm ETH, het Franse Nationaal Comité voor Ethiek en Dierproeven. Voor de behandeling van ethiek en dierproeven werden de dieren gehuisvest en verzorgd in A en S'S goedgekeurde experimentele faciliteiten in Leon Young na het euthaniseren van muizen en het verwijderen van de hersenen en ruggenmerg. Volgens het tekstprotocol plaatst u een hele hersenen in een petrischaal op ijs onder lage vergroting.Begin met het scheiden van een van de twee reukbollen door een pincet net achter de bol te plaatsen. Gebruik een neerwaartse beweging om het los te maken van de hersenen, verwijder vervolgens de tweede bol op een vergelijkbare manier. Terwijl u een pincet gebruikt om de hersenen op hun plaats te houden, plaats u voorzichtig een tweede paar pincetten tussen de linker- en rechtercortex en beweeg ze naar voren om de twee helften te scheiden.Nu u de hersenen op hun plaats blijft houden. Plaats de tweede pincet twee millimeter achter de cortex en houd de druk naar boven om de cortex van de hippocampus te tillen. Schil vervolgens het eerste deel van de cortex af door te beginnen bij de hippocampus en naar de voorkant van de hersenen te bewegen.Herhaal dit met de tweede helft. Plaats vervolgens de open pincetten rond een van de hippo campi. Sluit vervolgens voorzichtig de pincetten aan de onderkant van het orgaan en verwijder het voorzichtig.Herhaal dit met de tweede hippocampus. Plaats de pincetten achter een van de striata en scheid het voorzichtig van de hersenen. Gebruik de pincetten om eventuele resterende cortex uit het striatum te verwijderen voordat u de tweede satu verwijdert om het cerebellum van de rest van de hersenen te scheiden met de pincetten, druk voorzichtig op de omtrek van het cerebellum.Plaats vervolgens de pincetten achter het cerebellum en beweeg de pincetten naar voren om het te verwijderen met behulp van het brede gedeelte van de pincetten, verhoog ze als cephalon, die bestaat uit vier ronde structuren om duidelijk te zien waar een verbinding met de hersenstam. Maak vervolgens een verticale insnijding op de verbinding voordat u de hersenstam verwijdert, plaats de pincetten achter de mesencephalon en in grootte verticaal om het volledig te scheiden van de rest van de hersenen. Om hersenhomogeen voor te bereiden, voegt u een voldoende volume HS-buffer toe aan de gedissecteerde hersengebieden om een verwacht percentage homogenaat te bereiken, zoals weergegeven in de onderstaande tabel.Gebruik een weefselmolen die bestaat uit een siliciumglasbuis en buispesten A en B, giet een hersengebied dat moet worden vermalen in de buis. Homogeniseer vervolgens met pestel a het weefsel 10 keer om het te scheiden. Schakel vervolgens over naar pestel B en homogeniseer nog eens 20 keer.Gebruik een overdrachtpipet om het homogenaat over te brengen naar een buis van 1,5 milliliter, herhaal de homogenisatie met de resterende hersenmonsters. Centrifugeer de monsters gedurende vijf minuten bij 1000 G bij vier graden Celsius en verzamel vervolgens de snat en verdeel ze in 200 microliter Ali Watts. Bewaar bij min 80 graden Celsius voor verdere Eliza-analyse om Eliza uit te voeren op hersenhomogeen.Begin met het verdunnen van de coating anti-alfa-synucleïne, konijnenpolyklonaal of monoklonaal clone 42-antilichaam met 0,01 nanogram per milliliter met 100 microliters van de antilichaamcoatingoplossing met 50 micromolair carbonaatbuffer om de putjes van 96 te coaten. Well microplate en incubeer bij vier graden Celsius een nacht. Voeg de volgende dag 300 microliters PBST toe aan de putjes en gebruik een plaatwasser om de platen vijf keer te wassen terwijl u bij kamertemperatuur werkt.Vooruitgaande, voeg 200 microliters T 20 PBS-blokkeerbuffer toe aan elk putje en schud de platen gedurende een uur bij 150 RPM voordat u PBST gebruikt om de platen vijf keer te wassen met PBST 1% BSA. Verdun het hersenhomogeen volgens de hier vermelde richtlijnen en voeg 100 microliters toe aan elk. Well, incubeer vervolgens bij kamertemperatuur en 150 RPM gedurende twee uur voordat u PBST gebruikt om de platen te wassen. Vijf keer na de laatste wassing, voegt u de nodige alfa-synucleïne detectie-antilichamen toe, verdund in PBS BST en 1% BSA zoals vermeld in tabel twee van

detection-disease-associated-synuclein-enhanced-elisa-brain

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Incubate with a proteolytic enzyme to digest the normal prions, leaving the resistant aggregates intact.

Detection of Misfolded Prion Protein Aggregates in Mouse Brain Tissue Using Western Blotting

Source: Bétemps, D., et al.,  Detection of Disease-associated α-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated α-synuclein. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the procedure to detect neurodegenerative disease-associated protein α-synuclein in brain tissue from transgenic mice using ELISA. The steps include tissue homogenization, centrifugation, and ELISA detection of α-synuclein protein to quantify its disease-associated forms.

Detecting Neurodegenerative Disease-Associated Protein α-Synuclein Using ELISA

We presenteren een snelle en goedkope screening methode voor het identificeren van transcriptiefactoren met behulp van high-throughput robotachtige transfecties en een zelfgemaakte dual-gloed luciferasetest. Dit protocol snel genereert direct naast elkaar functionele data voor duizenden genen en is gemakkelijk aanpasbaar aan een gen van belang te richten.

High-throughput Functionele Screening met behulp van een zelfgemaakte Dual-gloed Luciferase Assay

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van steeds onoplosbaarder/geaggregeerd alfa-synucleïne (α-syn) uit post-mortem menselijk hersenweefsel. Door het gebruik van buffers met toenemende detergentsterkte en hoogsnelheids ultracentrifugeringstechnieken, kunnen de variabele eigenschappen van α-syn-aggregatie in zieke en niet-zieke weefsel worden onderzocht.

Sequentiële extractie van oplosbare en onoplosbare Alpha-Synuclein van Parkinson Brains

Dit manuscript beschrijft hoe virale vector-gemedieerde lokale gen-levering een aantrekkelijke manier biedt om transgenen in het centrale zenuwstelsel tot expressie te brengen. Het protocol schetst alle cruciale stappen om een injectie met een virologisch vector uit te voeren in de substantia nigra van de rat om een op een virologisch vector gebaseerd diermodel voor de ziekte van Parkinson te ontwikkelen.

Ontwikkeling van een Alpha-synucleïne Based ratmodel van de ziekte van Parkinson via stereotactische injectie van een recombinant adeno-geassocieerde virale vector

Perifere injectie van alfa-synucleine fibrillen in het peritoneum of de tong van Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen, die humaan alfa-synucleine met familiaire A53T mutatie en vuurvlieg luciferase tot expressie brengen, kunnen neuropathologie induceren, waaronder neuroinflammatie in het centrale zenuwstelsel.

Bioluminescentie beeldvorming van ontstekingsprocessen in transgene muizen Na Perifere Enten van alfa-synucleine fibrillen

Het doel van dit protocol is bedoeld als een cel-gebaseerd systeem dat wordt uitgevoerd, de vorming van alpha-synuclein repliceert aggregaten in vivo. Alpha-synuclein intracellulaire insluitsels worden overgeënt in primaire neuronen door de internalisering en verspreiding van exogene toegediend aggregaten van inheemse microsomes-geassocieerde alpha-synuclein geïsoleerd van zieke alpha-synuclein transgene muizen.

Exogene toediening van Alpha-synuclein Microsomes-geassocieerde aggregaten te primaire neuronen als een krachtige cel Model van de vorming van fibrillen

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om neuronale α-synucleinaccumulatie in primaire muis dopamine neuronen te bestuderen. Fosforyleerde α-synuclein aggregaten in neuronen worden geïnduceerd met voorgevormde α-synucleinfibrils. Geautomatiseerde beeldvorming van immunofluorescently gelabelde cellen en onbevooroordeelde beeldanalyse maken dit robuuste protocol geschikt voor medium-to-high doorvoerscreening van geneesmiddelen die α-synucleinaccumulatie remmen.

Het bestuderen van voorgevormde Fibril Geïnduceerde α-Synuclein Accumulatie in primaire embryonale muis Midbrain Dopamine Neuronen

Dit werk analyseert de vectordosis en blootstellingstijd die nodig is om neuro-inflammatie, neurodegeneratie en motorische stoornissen te induceren in dit preklinische model van de ziekte van Parkinson. Deze vectoren die coderen voor de menselijke α-synucleïne worden afgeleverd in de substantia nigra om de synucleïnepathologie geassocieerd met de ziekte van Parkinson samen te vatten.

Analyse van het muismodel van de ziekte van Parkinson geïnduceerd door Adeno-geassocieerde virale vectoren die coderen voor menselijk α-synucleïne

Een handige zwaartekracht-gevoede perfusiemethode voor histologische analyse van het centrale zenuwstelsel van de muis wordt gepresenteerd. Immunofluorescentie detectie van gefosforyleerd α-synucleïne wordt aangetoond in een muismodel van de ziekte van Parkinson. Dit werk beschrijft ook uitgebreid de transcardiale perfusie, dissectie, weefselbevriezing / inbedding en bevroren sectiestappen.

Een zwaartekracht-gevoede transcardiale perfusiemethode voor histologische analyse van het centrale zenuwstelsel van de muis

Een in vivo fysiologisch model van α-synucleïne is nodig om de pathogenese van de ziekte van Parkinson te bestuderen en te begrijpen. We beschrijven een methode om de cytotoxiciteit en geaggregeerde vorming van α-synucleïne te monitoren met behulp van een gehumaniseerd gistmodel.

Een methode om α-synucleïnetoxiciteit en -aggregatie te bestuderen met behulp van een gehumaniseerd gistmodel

Leer een verbeterde ELISA-methode voor het detecteren van ziekte-geassocieerde α-synucleïne in transgene muizen. Deze techniek kwantificeert eiwitophoping in hersengebieden en ondersteunt onderzoek naar synucleïnopathieën.

Opsporing van de ziekte-geassocieerde α-synucleïne door Enhanced ELISA in de hersenen van transgene muizen door overexpressie van Human A53T Gemuteerde α-synucleïne (Video) | JoVE Journal

Opsporing van de ziekte-geassocieerde α-synucleïne door Enhanced ELISA in de hersenen van transgene muizen door overexpressie van Human A53T Gemuteerde α-synucleïne

Meer video's verkennen