Name: Robotic productie van Cancer Cell sferoïden met een waterige tweefasensysteem voor Drug Testing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Leer de robotische productie van kankercelsferoïden met een waterig tweefasensysteem voor hoogdoorvoer medicijntesten. Deze methode gebruikt een vloeistofverwerkingsrobot voor uniforme druppelafgifte in 96-putjesplaten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen financiering van de National Institutes of Health R21CA182333.

1. Bereiding van polymere waterige tweefasensysteem (ATPS) <ol><li> Weeg 0,5 g polyethyleenglycol (PEG) (MW: 35,000) toevoegen aan 9,5 ml compleet kweekmedium in steriele 15 ml conische voorbereiden 10 ml van 5% (w / v) waterige PEG fase. Opmerking: de helft van het medium toevoegen aan de conische eerste, gevolgd door het toevoegen van het polymeer en daarna het resterende medium minimaliseert hechting van het polymeer aan de kegelvormige wanden en helpt het polymeer op te lossen sneller. </li><li> Weeg 0,128 g dextran (DEX) (MW: 500,000) toevoegen aan 0,872 ml compleet kweekmedium in steriele 1,5 ml microcentrifugebuis te bereiden 1 ml 12,8% (w / v) waterige DEX fase. </li><li> Vortex beide oplossingen gedurende ongeveer 1 min tot de polymeren in het medium oplossen. </li><li> Bewaar beide oplossingen in een waterbad bij 37 ° C gedurende 1 uur om het oplossen en homogene mengsels te waarborgen. Houd de kappen boven het waterniveau om de mogelijkheid van contaminatie van oplossingen uit het bad te vermijdenwater. </li><li> Laad de PEG-fase oplossing in een steriele plastic spuit en deze door een spuitfilter van 0,2 urn poriegrootte onzuiverheden te verwijderen. Let op: Vul de spuit met de PEG-oplossing, plaats deze in de baard van de filter op de top van een conische buis en het gebruik van geweld, duw langzaam de oplossing door het filter. Het is normaal om weerstand ervaren tegen de beweging van de zuiger. Kleine verlies van de polymeeroplossing treedt als sommige van de oplossing in het filter achterblijven, maar de polymeerconcentratie niet veranderen. </li><li> Pipetteer 10 ul van de DEX fase oplossing en verdund in 10 ui medium in een afzonderlijke buis resulteren in 6.4% (w / v) DEX fase oplossing. Zuig 100 pl van het PEG fase oplossing en breng deze in een petrischaal. <ol><li> Verdeel 0.5 ul van 6,4% (w / v) DEX fase oplossing in de PEG-fase oplossing. Bevestig visueel succesvolle ATPS vorming door het observeren van een DEX daling onder een microscoop. De daling van de grensmoet zichtbaar blijven, die op de aanwezigheid van twee stabiele, aparte waterige fasen. </li></ol></li><li> Bewaar de voorraad waterige PEG en DEX fase oplossingen 4 ° C tot gebruik. Opmerking: Het is aanbevolen dat polymeeroplossingen verse voorafgaand aan elk experiment worden bereid en binnen 24 uur van de opslag. </li></ol> 2. Voorbereiding voor het afdrukken van Cancer Cell Sferoïden <ol><li> Groei kankercellen van belang (bijvoorbeeld MDA-MB-157 borstkankercellen) tot 90% -100% confluente monolaag. Bij MDA-MB-157 cellen gebruiken medium bestaande uit DMEM met 10% FBS, 1% glutamine en 1% antibiotica. <ol><li> Oogst cellen met behulp van een celdissociatiebuffer (volgens het protocol van de fabrikant) en laadt de ophanging in een 15 ml conische. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 173,3 xg, verwijder supernatant en resuspendeer cellen in 1 ml compleet kweekmedium. </li></ol></li><li> Load cellen op een hemocytometer en tel zij de vereiste getal tecellen een gewenst sferoïde celdichtheid. Een confluente monolaag van MDA-MB-157-cellen gekweekt in een T75 kolf geeft gewoonlijk ~ 7 x 10 6 cellen. Opmerking:. Vereist celdichtheid een druppelvolume genereren een sferoïde is afhankelijk van het celtype 22 bijvoorbeeld een dichtheid van 1,5 x 10 4 of groter voor MDA-MB-157 cellen wordt aanbevolen in 0,3 pl DEX fase drop zorgen voor de vorming van een enkele spheroïde. </li><li> Centrifugeer cellen voor een tweede keer gedurende 5 minuten bij 173,3 xg en resuspendeer in een geschikte hoeveelheid kweekmedium aan de suspensie geconcentreerd tot een gewenste celdichtheid. Opmerking: Als bijvoorbeeld 7 x 10 6 kankercellen werden geoogst, het totale volume celsuspensie vereist een bolvormige 1,5 x 10 4 celdichtheid in 0,3 pl DEX fase druppelvorm wordt 140 pl. Maar door verdunning met DEX fase oplossing in de volgende stap, alleen 70 pi celkweekmedium om cellen te resuspenderen. </li><li&gt; Naar de resulterende celsuspensie een gelijk volume van 12,8% (w / v) waterige DEX fase bereid in 1.2. Bij het ​​voorbeeld van 1,5 x 10 4 celdichtheid sferoïde, 70 pl van de DEX fase oplossing wordt toegevoegd aan 70 ui celsuspensie. </li><li> Meng de celsuspensie uniforme verdeling van cellen en mengen van DEX oplossing te waarborgen. En neer te pipetteren moet voorzichtig worden uitgevoerd om de vorming van luchtbellen te voorkomen. </li></ol> 3. Voorbereiding voor het afdrukken van Co-gekweekte Sferoïden <ol><li> Groei kankercellen (bijvoorbeeld MDA-MB-157 menselijke borstkankercellen) en steuncellen (bijvoorbeeld humane fibroblasten) tot 90% -100% confluente monolaag. Oogst elk celtype met een celdissociatiebuffer (volgens het protocol van de fabrikant). <ol><li> Plaats elk suspensie in een 15 ml conische, centrifugeer ze gedurende 5 minuten bij 173,3 xg, en zuig supernatant uit elk conisch. Resuspendeer cellen van elk conisch 1 ml compleet gGROEI medium. Opmerking: Fluorescerende kleurstoffen zoals Calcein AM (levende cel kleuring) en nucleaire kleurstoffen (Hoechst) kan worden gebruikt om de twee celtypen te onderscheiden. </li></ol></li><li> Plaats elk celtype afzonderlijk op een hemocytometer en tel ze het vereiste aantal van elk type cel te berekenen voor een gewenste verhouding van kankercellen steuncellen in co-gekweekte sferoïden. Confluente monolagen van MDA-MB-157-cellen en fibroblasten gekweekt in T75 kolven geven meestal ~ 7 x 10 ~ 6 en 6 x 10 6 cellen. </li><li> Voeg de juiste hoeveelheid van de suspensie van steuncellen kankercellen suspensie tot een gewenste verhouding van het aantal van twee celtypen geven. Gebruik bijvoorbeeld een verhouding van 50 kankercellen 1 fibroblast cel. </li><li> Centrifugeer de conische bevattende gemengde celsuspensie gedurende 5 minuten bij 173,3 xg en resuspendeer cellen in een geschikt volume resulteert in uiteindelijke dichtheid omvattende gelijke volumes groeimedium en 12,8% (w / v) waterige DEXfase-oplossing (bereid in 1.2). </li><li> Zachtjes pipet de resulterende celsuspensie op en neer om de homogeniteit van de suspensie blijft. </li></ol> 4. Afdrukken van bolvormige tumoren in een 96-well plaat <ol><li> Één dag voor experimenten, laag onbehandelde, ronde bodem met 96 putjes met 1% (w / v) Pluronic bij 37 ° C gedurende 24 uur. Deze coating voorkomt cel bevestiging over de kweekperiode. </li><li> Pipetteer 50 ul van de gefiltreerde 5% (w / v) waterige PEG fase in elk putje van een 96-well plaat (Bestemmingsbord). </li><li> Met behulp van een pipet, meng de celsuspensie (bereid in stap 2 of stap 3 voor respectievelijk mono- en co-cultuur) en voeg 20 ul van de opschorting met elk ander goed van de ene kolom van een 384-wells plaat (bron plaatje) . </li><li> Zet de vloeibare handler en &quot;thuis&quot; het pipetteren hoofd om de coördinaten te registreren. Vervolgens stellen een vooraf gedefinieerde protocol (hieronder 4.6) te waarborgen en laboratorium parameters correct gedefinieerdly. Deze &quot;homing&quot; stap kan verschillend zijn voor verschillende vloeibare handlers zijn. Opmerking: De stroom van het protocol aangegeven stap voor stap hieronder 4.6, zal gelijk zijn ongeacht de robot vloeistofhandler gebruikt; echter, de programmeerinterface afwijken door het gebruik van verschillende software. </li><li> Plaats de bronplaat, de bestemming plaat en pipet tips boxen op gedefinieerde posities op het werkstation van de vloeistof handler zie figuur 1. </li><li> Uitvoeren van het protocol dat de volgende stappen omvat: <ol><li> Laad een kolom van vaten uit het pipetteren hoofd van de vloeistof handler mengen pipettips (8 tips) vanaf het werkstation (figuur 1). </li><li> Meng de celsuspensie in putjes van de bronplaat (figuur 1). Selecteer een mengvolume kleiner dan de celsuspensie volume in putten belvorming te voorkomen. </li><li> Uitwerpen tips in een lege afval tips doos (Figuur 1). </li&gt; <li> Laad een kolom van vaten uit het pipetteren kop met 10 ul afgeven pipetpunten (figuur 1). </li><li> Zuig 0.3 ul van de celsuspensie uit de bronplaat (figuur 1) in elke pipetpunt. </li><li> Breng de celsuspensie in putjes van een kolom van de bestemming plaat (Figuur 1). Gebruik afgifte hoogte van 0,5 mm en een afgifte stroomsnelheid van kleiner dan 1 pl / sec. </li><li> Herhaal de stappen 4.6.1 door 4.6.6, totdat de kolom-voor-kolom afdrukken in de gehele bestemming plaatje is compleet. </li></ol></li><li> Verwijder voorzichtig de bestemming plaat van het werkstation oppervlak en plaats deze in een vochtige incubator bij 37 ° C en 5% CO2. Handhaaf de plaat horizontaal wanneer u deze verplaatst naar de incubator te verstoren van DEX fase druppels bevattende cellen te voorkomen. </li><li> Incubeer de plaat voor 24 uur tot aggregatie van cellen mogelijk te maken in een bolvormige binnen de DEX fase druppel. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Drug Treatment of Cancer Cell Sferoïden Merk op dat de volgende protocol is voor een 4-daagse behandeling met geneesmiddelen en omvat een verlenging met verse drug na dag 2. Het kan worden aangepast voor andere periodes behandeling. <ol><li> Bevestig visueel sferoïde vorming in 96-well platen na 24 uur. Indien nodig, beeld putjes van grootte van sferoïden door het gemiddelde van de kleinste en grootste diameter van elke sferoïde. </li><li> Bereid de voorraadoplossing van het gewenste geneesmiddel door te lossen in een oplosmiddel aanbevolen door de fabrikant op een voorafbepaalde concentratie oplosbaarheid. Zo lossen cisplatine in water bij 2 mg / ml. Opmerking: Bescherm de voorraad oplossing van het geneesmiddel uit het licht als het geneesmiddel is lichtgevoelig. </li><li> De seriële verdunning techniek bereiden verdund geneesmiddelconcentraties met celkweekmedium van de voorraadoplossing bereid in de vorige stap. Elke verdunning moet tweemaal de gewenste concentratie worden. Dilution verhoudingen zal variëren afhankelijk van het uitgangsmateriaal voorraad concentratie en gewenste concentraties werken. </li><li> Voeg 50 pl geneesmiddeloplossing bereid in de vorige stap aan elk putje. Dit kan een robot of door handmatige pipetteren worden gedaan. Opmerking: Elke geneesmiddelconcentratie wordt verdund in de helft tot de gewenste concentratie door 50 ui waterige PEG fase reeds in elk putje. <ol><li> Gebruik sferoïden twee kolommen van een 96-well plaat (n = 16) voor elke concentratie. </li><li> In controleputjes, voeg slechts 50 pl vers kweekmedium om de bestaande 50 pl van de waterige fase PEG. </li></ol></li><li> Incubeer sferoïden met het geneesmiddel gedurende 48 uur bij 37 ° C en 5% CO2, beschermd tegen licht. </li><li> Na 48 uur incubatie, vers bereid verdunningen van het geneesmiddel op gewenste concentraties en drug verlengen door toevoeging van 50 pl vers geneesmiddeloplossing aan elk putje. Opmerking: De putjes de gewenste geneesmiddelconcentratie bevatten reeds vanaf de eerste drug tehandeling. Daarom in deze vernieuwing fase elke concentratie wordt bereid in de gewenste concentratie omdat geen verdunning optreedt. </li><li> Incubeer sferoïden met het geneesmiddel nog 48 uur bij 37 ° C en 5% CO2, beschermd tegen licht. </li></ol> 6. Analyse van de cellulaire levensvatbaarheid in Sferoïden <ol><li> Na 48 uur incubatie met hernieuwde geneesmiddel (dwz totale tijd van behandeling van sferoïden met een geneesmiddel 4 dagen), meet de totale hoeveelheid drager in een putje handmatig pipetteren. Opmerking: Typische volume in één goed is ~ 140 ul (een kleine daling optreedt als gevolg van verdamping). </li><li> Bereken het volume van de cel levensvatbaarheid reagens (bijvoorbeeld PrestoBlue) 10% concentratie van het totale wellvolume. Voeg dit volume van cellevensvatbaarheid reagens aan elke well. Opmerking: Bij een bestaande media volume van 140 pl in een put wordt een volume van 15,6 pl vereist om een ​​concentratie van het totaal 10% te goed. Dit wordt berekend doorhet verdelen van de bestaande media volume met 9 (140 pl / 9 = 15,6 pi). </li><li> Incubeer de plaat met de cellevensvatbaarheid reagens aan elk putje toegevoegd gedurende 6 uur bij 37 ° C, beschermd tegen licht. </li><li> Plaats de plaat in een micro-plaat lezer en lees de fluorescentie-signaal bij 560 nm en 590 nm excitatie en emissie golflengtes, respectievelijk. </li><li> Bereken het percentage levensvatbaarheid van de cellen in sferoïden van genormaliseerd fluorescentiesignaal van behandelde putten die controle putjes na het middelen van de waarden van dezelfde behandelingsomstandigheden. </li></ol>

<ol><li>Butcher, E. C., Berg, E. L., Kunkel, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systems biology in drug discovery.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1253-1259 (2004).</li>
<li>Gonzalez-Nicolini, V., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assays+for+anticancer+drug+discovery--a+novel+approach+based+on+engineered+mammalian+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Drugs%22%5BJournal%5D)">In vitro assays for anticancer drug discovery--a novel approach based on engineered mammalian cell lines.</a> Anticancer Drugs. 16, 223-228 (2005).</li>
<li>Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. A., Gidrol, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+microarrays+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Cell microarrays in drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).</li>
<li>Gidrol, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D+cell+microarrays+in+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">2D and 3D cell microarrays in pharmacology.</a> Current Opin. Pharmacol. 9, 664-668 (2009).</li>
<li>LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multicellular+tumor+spheroid+model+for+high-throughput+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery.</a> Expert Opin. Drug Discov. 7, 819-830 (2012).</li>
<li>Ward, D. J., Martino, O. I., Simpson, S., Stevens, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decline+in+new+drug+launches%3A+myth+or+reality%3F+Retrospective+observational+study+using+30+years+of+data+from+the+UK%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ+Open%22%5BJournal%5D)">Decline in new drug launches: myth or reality? Retrospective observational study using 30 years of data from the UK.</a> BMJ Open. 3, (2013).</li>
<li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+An+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).</li>
<li>Ghajar, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+engineering%3A+the+other+face+of+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+A%22%5BJournal%5D)">Tumor engineering: the other face of tissue engineering.</a> Tissue Eng. A. 16, 2153-2156 (2010).</li>
<li>Kenny, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphologies+of+breast+cancer+cell+lines+in+three-dimensional+assays+correlate+with+their+profiles+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression.</a> Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).</li>
<li>Carlsson, J., Yuhas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid-overlay+culture+of+cellular+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Rec.+Results+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Liquid-overlay culture of cellular spheroids.</a> Rec. Results Cancer Res. 95, 1-23 (1984).</li>
<li>Wartenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-induced+angiogenesis+studied+in+confrontation+cultures+of+multicellular+tumor+spheroids+and+embryoid+bodies+grown+from+pluripotent+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Tumor-induced angiogenesis studied in confrontation cultures of multicellular tumor spheroids and embryoid bodies grown from pluripotent embryonic stem cells.</a> FASEB J. 15, 995-1005 (2001).</li>
<li>Tekin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimuli-responsive+microwells+for+formation+and+retrieval+of+cell+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+chip%22%5BJournal%5D)">Stimuli-responsive microwells for formation and retrieval of cell aggregates.</a> Lab chip. 10, 2411-2418 (2010).</li>
<li>Patra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+for+uniform-sized+cell+spheroids+formation%2C+culture%2C+harvesting+and+flow+cytometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device for uniform-sized cell spheroids formation, culture, harvesting and flow cytometry analysis.</a> Biomicrofluidics. 7, 54114(2013).</li>
<li>Frey, O., Misun, P. M., Fluri, D. A., Hengstler, J. G., Hierlemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconfigurable+microfluidic+hanging+drop+network+for+multi-tissue+interaction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Reconfigurable microfluidic hanging drop network for multi-tissue interaction and analysis.</a> Nat. Commun. 5, 4250(2014).</li>
<li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-ring+structures+stabilize+microdroplets+to+enable+long+term+spheroid+culture+in+384+hanging+drop+array+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdev%22%5BJournal%5D)">Micro-ring structures stabilize microdroplets to enable long term spheroid culture in 384 hanging drop array plates.</a> Biomed. Microdev. 14, 313-323 (2012).</li>
<li>Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+for+use+of+tumor+spheroids+as+models+to+test+drug+delivery+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy.</a> J. Control. Release. 164, 192-204 (2012).</li>
<li>Mueller-Klieser, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+cultures%3A+from+molecular+mechanisms+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications.</a> Am. J. Physiol. 273, C1109-C1123 (1997).</li>
<li>Minchinton, A., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+penetration+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drug penetration in solid tumors.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li>
<li>Jeong, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+tension-mediated%2C+concave-microwell+arrays+for+large-scale%2C+simultaneous+production+of+homogeneously+sized+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthc.+Mater%22%5BJournal%5D)">Surface tension-mediated, concave-microwell arrays for large-scale, simultaneous production of homogeneously sized embryoid bodies.</a> Adv. Healthc. Mater. 2, 119-125 (2013).</li>
<li>Cavnar, S. P., Salomonsson, E., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+imaging%2C+and+analysis+plate+for+facile+handling+of+384+hanging+drop+3D+tissue+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22JALA%22%5BJournal%5D)">Transfer imaging, and analysis plate for facile handling of 384 hanging drop 3D tissue spheroids.</a> JALA. 19, 208-214 (2014).</li>
<li>Atefi, E., Lemmo, S., Fyffe, D., Luker, G. D., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput%2C+polymeric+aqueous+two-phase+printing+of+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Func.+Mater%22%5BJournal%5D)">High throughput, polymeric aqueous two-phase printing of tumor spheroids.</a> Adv. Func. Mater. 24, 6509-6515 (2014).</li>
<li>Lemmo, S., Atefi, E., Luker, G. D., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+aqueous+biphasic+tumor+spheroid+microtechnology+for+anti-cancer+drug+testing+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Optimization of aqueous biphasic tumor spheroid microtechnology for anti-cancer drug testing in 3D culture.</a> Cell. Mol. Bioeng. 7, 344-354 (2014).</li>
<li>Albertsson, P. -A., Tjerneld, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+diagrams%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzym%22%5BJournal%5D)">Phase diagrams.</a> Methods Enzym. 228, 3-13 (1994).</li>
<li>Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+co-culture+patterning+using+aqueous+two-phase+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems.</a> J. Vis. Exp. (73), (2013).</li>
<li>Frampton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+two-phase+system+patterning+of+detection+antibody+solutions+for+cross-reaction-free+multiplex+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Aqueous two-phase system patterning of detection antibody solutions for cross-reaction-free multiplex ELISA.</a> Sci. Rep. 4, 4878(2014).</li>
<li>Lai, D., Frampton, J. P., Tsuei, M., Kao, A., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+direct+visual+analysis+of+hydrolytic+enzyme+activity+using+aqueous+two-phase+system+droplet+phase+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Label-free direct visual analysis of hydrolytic enzyme activity using aqueous two-phase system droplet phase transitions.</a> Anal. Chem. 86, 4052-4057 (2014).</li>
<li>Petrak, D., Atefi, E., Yin, L., Chilian, W., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+spatio-temporally+controlled+cell+microprinting+with+polymeric+aqueous+biphasic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Automated spatio-temporally controlled cell microprinting with polymeric aqueous biphasic system.</a> Biotech. Bioeng. 11, 404-412 (2014).</li>
<li>Tavana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanolitre+liquid+patterning+in+aqueous+environments+for+spatially+defined+reagent+delivery+to+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells.</a> Nat. Mater. 8, 736-741 (2009).</li>
<li>Tavana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+aqueous+biphasic+system+rehydration+facilitates+high+throughput+cell+exclusion+patterning+for+cell+migration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Func.+Mater%22%5BJournal%5D)">Polymeric aqueous biphasic system rehydration facilitates high throughput cell exclusion patterning for cell migration studies.</a> Adv. Func. Mater. 21, 2920-2926 (2011).</li>
<li>Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+aqueous+biphasic+systems+for+non-contact+cell+printing+on+cells%3A+engineering+heterocellular+embryonic+stem+cell+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches.</a> Adv. Mater. 22, 2628-2631 (2010).</li>
<li>Tavana, H., Mosadegh, B., Zamankhan, P., Grotberg, J. B., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microprinted+feeder+cells+guide+embryonic+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate.</a> Biotechnol. Bioeng. 108, 2509-2516 (2011).</li>
<li>Kalluri, R., Zeisberg, M. Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).</li>
<li>Olsen, C. J., Moreira, J., Lukanidin, E. M., Ambartsumian, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mammary+fibroblasts+stimulate+invasion+of+breast+cancer+cells+in+a+three-dimensional+culture+and+increase+stroma+development+in+mouse+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts.</a> BMC Cancer. 10, 444(2010).</li>
<li>Ozdemir, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+carcinoma-associated+fibroblasts+and+fibrosis+induces+immunosuppression+and+accelerates+pancreas+cancer+with+reduced+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival.</a> Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).</li>
<li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+formation+of+PC-3+prostate+cancer+co-culture+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids.</a> Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).</li>
<li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-based+drug+screen%3A+considerations+and+practical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).</li>
<li>Weigelt, B., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+microenvironmental+influences+on+the+normal+mammary+gland+and+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).</li>
<li>Mueller, M. M., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friends+or+foes+-+bipolar+effects+of+the+tumour+stroma+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cance%22%5BJournal%5D)">Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer.</a> Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).</li>
<li>Bissell, M. J., Radisky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putting+tumours+in+context%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Putting tumours in context.</a> Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Sferoïden presenteren een realistisch model om beter te begrijpen tumor fysiologie en werkzaamheid van het geneesmiddel en een nuttig hulpmiddel voor anti-kanker drug discovery. Dergelijke toepassingen zouden veel baat hebben bij eenvoudige spheroïde generatie en onderhoud technieken die alleen standaard laboratorium, liquid handling gereedschappen en screening apparatuur vereisen. Het gebruik van een waterige tweefasensysteem spontaan aggregaat kankercellen in de onderstaande fase maakt een efficiënte productie en onde...

Celgebaseerde proeven een belangrijk instrument voor de ontwikkeling en ontdekking van nieuwe geneesmiddelen tegen kanker. 1,2 Historisch monolayer kweken van kankercellen zijn gebruikt om de werkzaamheid van kandidaat verbindingen tegen specifieke soorten kankercellen te onderzoeken. De onderhoudsvriendelijkheid van monolaagkweken in standaard kweekplaten, de verenigbaarheid van standaard platen met commerciële robotachtige hulpmiddelen voor toevoeging van reagentia en Screening materieel downstream analyse van de cellulaire responsen op chemische verbindingen zijn belangrijke voordelen die 2D culturen render aantrekkelijk instrument voor drug testen. 3 Helaas monolaag cel assays vaak niet de werkzaamheid van de verbindingen in vivo te voorspellen, waardoor ontwikkeling en ontdekking van geneesmiddelen een uiterst kostbaar proces. 4,5 Ondanks aanzienlijke investeringen en inspanningen van farmaceutische bedrijven en academische eenheden slechts ~ 1% van anti-kanker medicijnen in klinische studies werden goedgekeurddoor de FDA in de afgelopen twee decennia. 6 ongelijkheid tussen 2D culturen en complexe 3D omgeving van kankercellen in vivo een belangrijke tekortkoming van monolaag kweeksystemen. 7 Daarom screenen van kandidaatverbindingen tegen tumorcellen in een omgeving die meer lijkt de 3D-tumor-omgeving kan de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen voor chemotherapie te versnellen. 8 Kankercel sferoïden vormen een relevante 3D tumormodel in vitro. 9,10 sferoïden zijn compacte clusters die door spontane of geïnduceerde samenstel van kankercellen op niet-klevende oppervlakken of in suspensie met technieken als spinner kolf, vloeibare bedekking, microfabricated micro- vormen . goed arrays, microfluidics en opknoping druppels 11-16 sferoïden bootsen hoofdkenmerken van solide tumoren zoals geometrie en beperkte transport van zuurstof, voedingsstoffen en geneesmiddelverbindingen in de centrale zone; vandaar, ze nauwer regenereren drug verantse van vaste tumoren ten opzichte van monolayer kweken. 17-19 Desondanks duidelijke voordeel, sferoïden worden niet routinematig gebruikt voor het screenen van chemische verbindingen tegen kankercellen. Moeilijkheid van het produceren van een uniforme en kleinbedrijf bolletjes in een standaard high throughput instelling die compatibel zijn met de handel verkrijgbare robotica en screening / imaging-tools is belemmert integratie van spheroïde cultuur in de ontwikkeling van geneesmiddelen pijplijn. Hoewel de aangepaste materialen en borden onlangs commercieel beschikbaar zijn geraakt aan deze behoefte te voorzien, kostenoverwegingen afschrikken hun wijdverbreide gebruik. Twee belangrijke technieken met het vermogen van de productie consistente en kleinbedrijf sferoiden in high throughput gebruik maken van een nieuwe hangende druppel platform en microfabricated microputjes. 13,16,20 Echter, beide benaderingen vereisen speciale borden en apparaten die duur om te fabriceren en onhandig voor de eindgebruikers zijn in de kern van onderzoekscentra en de farmaceutische industrie, waar de meeste grote efforten voor de ontdekking van nieuwe geneesmiddelen tegen kanker worden gemaakt. Ondanks enkele verbeteringen in de stabiliteit van-cel met druppels met een recente ontwerp van opknoping druppel platen, wordt slechts om de andere gat van de plaat nog steeds gebruikt tijdens de cultuur te verspreiden / samenvoegen van druppels te vermijden. 16 Dit vermindert aanzienlijk experimentele doorzet. Drugsverslaving en vernieuwing is moeilijk met manuele of gerobotiseerde pipetteren en spheroids moet in een standaard plaat voor biochemische analyse over te dragen, omdat deze plaat configuratie is niet gemakkelijk compatibel met conventionele screening apparatuur zoals plaat lezers. 21 Micro-putten vervaardigd met behulp van zachte lithografie ook toestaan ​​gecontroleerde grootte spheroïde productie. 13,20 Echter, onverenigbaarheid van dit platform met standaard pipetteren gereedschap voorkomt het behandelen van individuele bolletjes met verschillende drug verbindingen / concentraties, het blootstellen van alle bolletjes op een enkele behandeling staat. Aldus is deze methode niet geschikt voor highthroughput screening verbinding die gelijktijdig testen van verschillende verbindingen / concentraties vereist. Om deze obstakels te overwinnen, is een nieuwe techniek voor hoge doorvoer productie van gelijkvormige kankercel sferoïden in standaard 96-well platen ontwikkeld. 22,23 De aanpak is gebaseerd op een polymeer waterige tweefasensysteem (ATPS) en polyethyleen glycol ( PEG) en dextran (DEX) als fase-vormende polymeren. 24 ATPSs zijn onlangs gebruikt in een verscheidenheid van nieuwe celbiologische toepassingen cel micropatterning inschakelen en gelokaliseerde aflevering van biologische reagentia aan cellen in zeer waterige media. 25-32 een vorm sferoïde, zijn kankercellen gemengd met de waterige fase DEX en een sub-microliter daling van de resulterende suspensie wordt gepipetteerd in een putje met de onderdompeling waterige PEG-fase oplossing. De druppel blijft mengbare van de onderdompeling fase en beperkt cellen de vorming van een sferoïde vergemakkelijken. Kabouterortantly, de hoogst waterige onderdompeling fase levert voedingsstoffen naar de cellen van de bolvormige en minimaliseert het bekende probleem van media verdamping gemeen andere assays die veranderingen in media osmolaliteit en schommelingen geneesmiddelconcentraties veroorzaakt. Deze techniek maakt bolvormige productie en behandeling met geneesmiddelen alleen gebruikmaking van commercieel verkrijgbare reagentia en pipetteren gereedschappen in standaard 96-well platen. Belangrijk is de analyse van cellulaire reacties van sferoïden in hetzelfde plaat met standaard biochemische assays en plaatlezers. Het gemak van het werken met ATPS en het aanpassingsvermogen van de aanpak van de robot liquid handling maakt high throughput generatie van zowel mono-cultuur en de co-cultuur sferoiden een eenvoudige laboratoriumtechniek. Deze nieuwe aanpak zal een grote stap voorwaarts zijn in de richting van integratie van de kankercel sferoïden in ontwikkeling en ontdekking van geneesmiddelen processen met verbeterde testen doorvoer en kosteneffectiviteit (toename van het aantal geteste verbindingen en reduced reagensverbruik) en efficiëntie (het verminderen van hands-on tijd). Een gedetailleerd protocol voor gerobotiseerde productie van kankercel sferoïden in 96-well platen met de ATPS methode wordt hieronder beschreven. Verder worden bijzonderheden van therapie van verkregen sferoïden en stroomafwaarts analyse van de cellulaire responsen met een commercieel biochemische assay gepresenteerd.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents and Consumables</td></tr><tr><td>Polyethylene glycol, MW: 35,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94646</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, MW: 500,000</td><td>Pharmacosmos</td><td>5510 0500 9007</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Clacein AM</td><td>Life Technologies</td><td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Life Technologies</td><td>33342</td><td></td></tr><tr><td>Cisplatin</td><td>Spectrum Chemicals</td><td>15663-27-1</td><td></td></tr><tr><td>PrestoBlue</td><td>Life Technologies</td><td>A-13261</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-108</td><td>Sigma Aldrich</td><td>542342</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Tips (10 &micro;l)</td><td>Fluotics</td><td>C-P10V11.ST</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Tips (70 &micro;l)</td><td>Fluotics</td><td>C-P70V11.ST</td><td></td></tr><tr><td>Round-bottom 96-well plates</td><td>Nunc</td><td>268200</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Liquid Handler</td><td>Agilent Technologies</td><td>SRT Bravo</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Biotek Instruments</td><td>Synergy H1M</td><td></td></tr></tbody></table>

robotic productie van cancer cell sferoïden met een waterige tweefasensysteem voor drug testing

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Kankercel-sferoïden vormen een relevant in vitro model van avasculaire tumoren voor toepassingen bij het testen van anti-kanker medicijnen. In dit werk wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor het produceren van zowel mono-cultuur als co-cultuur sferoïd in een high throughput 96-well plate formaat. Deze aanpak maakt gebruik van een waterige twee-fasen systeem om cellen te beperken tot een druppel van de dichtere waterige fase ondergedompeld in de tweede waterige fase. De druppel rust op het oppervlak van de well en houdt cellen in nauwe nabijheid om een enkele sferoïd te vormen. Deze technologie is aangepast aan een robotische vloeistofhandler om grootte-gecontroleerde sferoïd te produceren en het proces van sferoïd productie voor compound screening toepassingen te versnellen. Sferoïden behandeld met een klinisch gebruikt medicijn vertonen verminderde celviabiliteit met toename van de medicijn dosis. Het gebruik van een standaard micro-well plate voor sferoïd generatie maakt het eenvoudig om de levensvatbaarheid van kankercellen van medicijn-behandelde sferoïd te analyseren met een micro-plate reader. Deze technologie is eenvoudig te implementeren, zowel robotisch als met andere vloeistofverwerkingshulpmiddelen zoals handmatige pipetten.

Het werkstation van de robot vloeistof handler wordt getoond in figuur 1. De pipetteren kop en alle stations die in de robot drukken van sferoïden in paragraaf 4.6 zijn voorzien. De afbeelding toont het gebruik van twee verschillende stations voor tip dozen (één set tips voor het mengen en de tweede set voor het opzuigen / doseren van celsuspensie-waterige DEX fase mengsel). De gehele opstelling is gehuisvest in een standaard bioveiligheidskast om steriliteit te behouden. Figuur 2 toont...

Er wordt een protocol gepresenteerd voor robotisch afdrukken van kankercelsferoïden in een 96-wellsplaatformaat met hoge doorvoer met behulp van een waterig tweefasensysteem.

Robotic productie van Cancer Cell sferoïden met een waterige tweefasensysteem voor Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Het algemene doel van deze procedure is om kankercel-pH te vormen in een standaard high-throughput-formaat om deze te kunnen gebruiken bij het testen van antikankermedicijnen. Dit wordt bereikt door eerst twee polymeren, polyethyleenglycol en dextraan, op te lossen in celkweekmedium bij vooraf bepaalde concentraties om een succesvol aqueous two-phase-systeem te vormen. De tweede stap is het voorbereiden van de betreffende cellen bij een tweemaal zo hoge celdichtheid als gewenst en het mengen van de celsuspensie met een gelijk volume van de waterige dextraanfase.Vul vervolgens een 96-wells plaat met de waterige polyethyleenglycolfase en doseer met een liquid handling robot sub-microliter druppels van de celbevattende dextranfase in de wells. De volgende stap is het bevestigen van de sferoïdvorming in de 96-wells platen na 24 uur incubatie en het direct toevoegen van de betreffende anticancermiddelen aan de wells. Tot slot wordt een standaard plate reader-compatibele viabiliteitsassay gebruikt om het percentage levensvatbaarheid van de met medicijnen behandelde sferoïden aan te tonen, genormaliseerd ten opzichte van niet-behandelde controlesferen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de hangende druppelmethode of de aanpak met gefabriceerde microweltjes, is dat er geen aangepaste platen of apparaten nodig zijn en dat het een hoge doorvoersnelheid mogelijk maakt voor de vorming van sferoïden en het testen van geneesmiddelen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen in het kankeronderzoek en de ontdekking van anti-kankerchemotherapeutica versnellen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van kanker, omdat het high-throughput screening van chemische verbindingen met relevantere tumormodellen mogelijk maakt om nieuwe anti-kankermedicijnen te identificeren.Personen die nieuw zijn met deze methode kunnen eenvoudig steroiden van kankercellen en microwelplaten vormen en zullen met gemak drugbehandelingsexperimenten uitvoeren met behulp van standaard laboratoriummateriaal en robotinstrumenten. Begin met het afwegen van 0,5 gram polyethyleenglycol en voeg dit toe aan 9,5 milliliter compleet groeimedium in een steriele 15 milliliter conische buis. Vortex het mengsel gedurende één minuut om 10 milliliter van een 5% gewicht per volume waterige polyethyleenglycolfase te bereiden. Weeg vervolgens 0,128 gram dextraan af en voeg dit toe aan 0,87.Vortex twee milliliter compleet groeimedium in een steriele 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Meng dit mengsel gedurende één minuut om één milliliter van een 12,8% gewicht per volume waterige dextranfase te bereiden. Plaats zowel de polyethyleenglycol- als de dextranoplossingen gedurende één uur in een waterbad van 37 °C.Om volledige oplossingen te bevorderen. Zorg ervoor dat de doppen boven het waterniveau blijven om mogelijke contaminatie na één uur te voorkomen. Verwijder de polyethyleenglycol-gezichtsolutie en vul deze in een steriele plastic spuit van vijf milliliter.Filter de oplossing door een spuitfilter met een poriegrootte van 0,2 micron om onzuiverheden te verwijderen. Bewaar zowel de polyethyleenglycol- als de dextraanfaselösungen bij vier graden Celsius tot maximaal 24 uur voor gebruik. Kweek de gewenste kankercellen, zoals de M-D-A-M-B 1 57 borstkankercellijn, tot ze voor 90 tot 100% confluent zijn.Oogst vervolgens de cellen met standaardtechnieken en bepaal de opbrengst met een hemocytometer. Resuspendeer het pellet tot een concentratie van 50 miljoen cellen per milliliter in een mengsel van de helft groeimedium en de helft strand-oplossing. Dit waarborgt een dichtheid van ongeveer 15.000 cellen per druppel van 0,3 µL. Dispenseer 50 µL van de gefilterde 5% waterige polyethyleenglycolfase in elke put van een niet-adherente 96-wells plaat die vooraf is gecoat met onic, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. De toevoeging van polyethyleenglycol kan handmatig met een multichannelpipet of robotisch met een liquid handler worden uitgevoerd. Meng de celsuspensie door voorzichtig met een pipet op en neer te pipetteren om te resuspenderen.Resuspendeer alle cellen die na verloop van tijd zijn neergeslagen. Voeg 20 µL van de suspensie toe aan om en om een putje van één kolom van een 384-wells plaat. Zet vervolgens de liquid handler aan en home de pipetteerkop.Om de coördinaten te registreren, plaatst u de bronplaat, de doelplaat en de pipetpuntendoosjes op gedefinieerde posities op het werkstation van de vloeistofhandler. Selecteer met de geautomatiseerde vloeistofhandler een mengvolume, ongeveer een derde van het volume van de celsuspensie, en laad één kolom van de pipetteerkop van de vloeistofhandler met mengpipetpunten van het werkstation. Gebruik de vloeistofhandler om de celsuspensie in de 384-well bronplaat te mengen.Werp vervolgens de tips in een lege afvalbak voor tips. Laad daarna één kolom barrels van de pipetteerkop met dispenser-pipetpuntjes van 10 µL. Gebruik de liquid handler om 0,3 µL van de cel-suspensie uit de bronplaat in elke pipetpunt te aspireren.Dispenseer vervolgens de celsuspensie in de wells van één kolom van de doelplaat die 50 µL van de 5% polyethyleenglycolfase bevat. Gebruik een dispenseerhoogte van 0,5 mm en dispenseer de druppel met een stroomsnelheid van 1 µL per seconde of langzamer. Herhaal dit proces totdat alle kolommen in de doelplaat voorzien zijn van cellen. Verwijder na voltooiing voorzichtig de doelplaat uit het werkstation en incubeer de cellen in een bevochtigde omgeving bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 24 uur voorafgaand aan elke medicijnbehandeling.Bevestigt visueel de steroïdformatie in elke put van de 96-putjesplaat na 24 uur kweek. Gebruik seriële verdunning om een middel van belang, zoals cisplatin, voor te bereiden voor testen. Verdun de stockoplossing van het middel in kweekmedium, zodat elke verdunning twee keer de uiteindelijke gewenste concentratie bedraagt.Tot vijf verschillende concentraties kunnen per 96-wells plaat worden getest. Voeg 50 µL van de drugsolutie toe aan de polyethyleenglycolfase van elke well. Gebruik twee kolommen van acht wells per behandelingsgroep, inclusief een controlegroep waarbij enkel medium wordt toegevoegd.Incubeer de steroïden met het geneesmiddel gedurende 48 uur bij 37 °C en 5% carbon dioxide, beschermd tegen licht. Bereid na 48 uur verse verdunningen van het geneesmiddel en vernieuw het geneesmiddel door nog eens 50 µL medium toe te voegen dat vers geneesmiddel in de gewenste concentratie bevat. Incubeer de PHE nog eens 48 uur bij 37 °C en 5% carbon dioxide, beschermd tegen licht.Voeg vervolgens aan elke put een reagens voor celviabiliteit toe, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol, en incubeer de plaat gedurende zes uur bij 37 °C en 5% carbon dioxide, beschermd tegen licht. Wanneer de assay is voltooid, plaatst u de plaat in een microplaatlezer en meet u het fluorescentiesignaal bij respectievelijk 560 en 590 nanometers excitatie- en emissiegolflengte. High-throughput screening van anti-kankermiddelen vereist een reproduceerbare methode om honderden uniformt grote sferoïden te vormen.De hier getoonde grafiek benadrukt de reproduceerbaarheid van deze methode voor het vormen van sferoïden. In een standaard 96-wells plaat bedroeg de gemiddelde diameter 332 microns met een standaarddeviatie van minder dan 10%. De variaties in de diameters van de sferoïden bleken typerend voor een normale verdeling. Wanneer de sferoïden gedurende vier dagen werden blootgesteld aan variërende concentraties cisplatin, een klinisch chemotherapeutisch middel, vertoonden zij een dosisafhankelijke respons op de behandelingen.De resulterende 50% letale dosis drugconcentratie bleek 4,67 Micromolar te zijn; behandeling met het geneesmiddel bij letale concentraties leidde tot desintegratie van kankercel-sps. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in ongeveer twee uur worden voltooid. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om voorafgaand aan de experimenten met steroidprinting snel te controleren op de vorming van een waterige tweefase. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals cryosectie van steroid immunohistochemische kleuring van monsters en andere biologische assays, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over moleculaire doelwitten van geneesmiddelen in kankercelsteroiden.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u op een handige manier 3D-kankercelculturen kunt vormen en hoe u medicijnonderzoek in een high-throughput-manier kunt uitvoeren met behulp van standaardplaten en apparatuur.

robotic-production-cancer-cell-spheroids-with-an-aqueous-two-phase

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We introduceren een protocol voor het aanleggen van grote aantallen (duizenden tot honderdduizenden) van gelijke grootte-en-samenstelling gecontroleerde bolvormige tumoren, met behulp van in de handel verkrijgbare microputjesplaten.

De productie van grote aantallen grote gecontroleerde bolvormige tumoren met behulp microputjesplaten

Hier beschrijven we een snel en flexibel protocol voor de vorming van 3D-celsferoïden door celaggregatie. Dit is gemakkelijk aanpasbaar voor meerdere celtypen en is geschikt voor gebruik in een verscheidenheid aan toepassingen, waaronder celmigratie, invasie of anoikis-assays, en voor het visualiseren en kwantificeren van cel-matrix interacties.

Een efficiënt en flexibel Cel aggregatie voor 3D Sferoïde Production

We beschrijven de evolutie van een sferoïde gebaseerde, driedimensionale in vitro model waarmee we kunnen testen van de huidige standaard voor experimentele therapie regimes voor hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom op cellijnen, die gericht zijn op het evalueren van therapie gevoeligheid en weerstand op primaire cellen van menselijke specimens in de toekomst.

Therapie testen in een sferoïde gebaseerde 3D cel cultuur Model voor hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom

Over een breed scala van indicaties van de ziekte, meer fysiologisch relevante modellen worden ontwikkeld en uitgevoerd in drug discovery-programma's. Het nieuwe modelsysteem hier beschreven demonstreert hoe driedimensionale tumor spheroïden kunnen worden gekweekt en vertoond in een high-throughput 1536-well plaat-gebaseerd systeem om te zoeken naar nieuwe oncologie drugs.

Generatie van High-Throughput driedimensionale Tumor spheroïden voor Drug Screening

Dit protocol is ontworpen voor het beoordelen van de immunotherapeutische omgeleide T-cel (auto T-cel) cytotoxiciteit tegen 3D gestructureerde kankercellen (spheroïden) in real-time.

Een sferoïde doden Assay door auto T cellen

Dit protocol beschrijft het genereren van door patiënten afgeleide spheroïden en downstreamanalyses, waaronder de kwantificering van proliferatie, cytotoxiciteits testen, Flowcytometrie, immunofluorescentie kleuring en confocale beeldvorming, om de geneesmiddelen te beoordelen potentiële kandidaten als anti-neoplastische Therapeutics. Dit protocol ondersteunt precisie geneeskunde met identificatie van specifieke geneesmiddelen voor elke patiënt en stadium van de ziekte.

Fysiologisch patiënt afgeleide 3D-Spheroids voor anti-neoplastische geneesmiddelen screening om kanker stamcellen te targeten

Dit protocol beschrijft een methode voor de productie van drie verschillende soorten sferoïden op een manier die ze geschikt maakt voor grootschalige screening en analyse met een hoog gehalte. Daarnaast worden voorbeelden gepresenteerd die laten zien hoe ze kunnen worden geanalyseerd op sferoïde en individuele celniveaus.

Een robuuste methode voor de grootschalige productie van sferoïden voor screening- en analysetoepassingen met een hoog gehalte

Het huidige protocol beschrijft het genereren van 3D-tumorcultuurmodellen van primaire kankercellen en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen met behulp van cel-levensvatbaarheidstests en microscopische onderzoeken.

Het vaststellen van 3-dimensionale sferoïden uit van de patiënt afgeleide tumormonsters en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen

We presenteren een protocol voor het kweken van hoogreproduceerbare sferoïden en hun fenotypische karakterisering met behulp van beeldopname en proteomics.

Semi-geautomatiseerde fenotypische analyse van functionele 3D-sferoïde celculturen

Dit artikel demonstreert een gestandaardiseerde methode voor het construeren van driedimensionale tumorsferoïden. Een strategie voor sferoïde observatie en beeldgebaseerde deep-learning analyse met behulp van een geautomatiseerd beeldvormingssysteem wordt ook beschreven.

Generatie van 3D-tumorsferoïden voor geneesmiddelenevaluatiestudies

Hier beschrijven we verschillende methoden voor de vorming van meercellige sferoïden om follow-up multi-parameter live celmicroscopie uit te voeren. Met behulp van fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM), cellulaire autofluorescentie, kleuringskleurstoffen en nanodeeltjes wordt de benadering voor analyse van celmetabolisme, hypoxie en celdood in levende driedimensionale (3D) kanker en van stamcellen afgeleide sferoïden gedemonstreerd.

Productie en multi-parameter live cell fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM) van meercellige sferoïden

Leer de robotische productie van kankercelsferoïden met een waterig tweefasensysteem voor hoogdoorvoer medicijntesten. Deze methode gebruikt een vloeistofverwerkingsrobot voor uniforme druppelafgifte in 96-putjesplaten.

Robotic productie van Cancer Cell sferoïden met een waterige tweefasensysteem voor Drug Testing

Meer video's verkennen