Gebruik van de Teton systeem om te studeren moleculaire mechanismen van zebravis Regeneratie

Het algemene doel van deze procedure is het opzetten van een functioneel TED-on systeem in zebravissen om conditionele weefselspecifieke genexpressie te bereiken, zoals gedemonstreerd in de regenererende staartvin in deze video. Dit wordt bereikt door eerst transgene Tet-activatorlijnen te genereren die een tetracycline-induceerbare transcriptionele activator tot expressie brengen, gelabeld met am cyan in het betreffende weefsel, en Tet-responderlijnen die een ype-tag gen van belang bevatten onder controle van Tet-responsieve elementen. Vervolgens worden specifieke combinaties van dubbel transgene Tet-activator Tet-responder vissen vastgesteld.

Vervolgens wordt de weefselspecifieke expressie van het Tet-responder-transgeen geïnduceerd door toediening van doxycycline. Tot slot wordt de expressie van het Tet-responder-transgeen geverifieerd door weefselcoupes te maken van de vinneregeneraten. Uiteindelijk wordt immunofluorescentie gebruikt om de weefselspecifieke expressie van het Tet-responder-transgeen te visualiseren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals hitte-shock-geïnduceerde genexpressie, is dat dit systeem induceerbare en reversibele genexpressie op weefselspecifieke wijze mogelijk maakt. Deze methode kan helpen om een diepgaander inzicht te verkrijgen in de moleculaire signaleringsnetwerken die de vinregeneratie van de zebravis sturen, aangezien het analyse van signaleringspaden en genfuncties in individuele weefsels mogelijk maakt. Hoewel wij deze technologie gebruiken om de vinregeneratie van de zebravis te bestuderen, kan deze ook instrumenteel zijn in veel andere contexten waarin weefselspecifieke manipulatie van de genfunctie vereist is.

Nadat Tet-responder-vislijnen zijn gegenereerd volgens het tekstprotocol, wordt de kiemlijnintegratie en de induceerbaarheid van het transgen beoordeeld door individuele G0-vissen te kruisen met een eerder vastgestelde Tet-activatorlijn. Oogst vervolgens de embryo's en kweek deze tot een stadium waarin de Tet-responder-inductie kan worden beoordeeld. Bereid een 2000x doxycycline-stoomoplossing voor door 50% ethanol te gebruiken om doxycycline op te lossen tot een concentratie van 50 mg/mL.

Bewaar aliquots van docks lichtbeschermd bij -20 °C. Bereid vervolgens E3-embryomedium voor dat docks bevat in een eindconcentratie van 25 µg/ml. Giet daarna het grootste deel van het E3-medium van de embryo's af.

Vervang dit door medium met E3 en breng de embryo's voor minimaal zes uur terug naar 28,5 °C. Gebruik na de incubatie een fluorescente stereomicroscoop om de embryo's te screenen op YFP-fluorescentie. Stel verschillende stabiele transgene Tet-responderlijnen op basis van de zojuist geïdentificeerde founders vast.

Kies lijnen die een sterke inductie vertonen en weinig mosaicisme vertonen binnen het verwachte expressiedomein, evenals weinig variatie tussen individuele embryo's. Zodra de TED-activator- en Tet-responder-vislijnen zijn vastgesteld, kruist u Tet-activator-dragers met Tet-responder-dragers om dubbel transgene vissen te genereren. Selecteer embryo's die het Tet-activator-transgeen dragen door te screenen op am cyan fluorescentie in een stereomicroscoop en kweek am cyan-positieve embryo's op tot volwassen vissen.

Identificeer dubbel transgene volwassen vissen die naast de Tet-activator ook de Tet-responder dragen via PCR-gebaseerde genotypering of via hun vermogen om expressie van de Tet-responder in het betreffende weefsel te induceren om Tail Fin Tation uit te voeren. Anestheseer volwassen zebravissen in een bekerglas gevuld met viswater dat 160 µg/mL tricaine bevat. Wanneer de vis stopt met bewegen, gebruik dan een pincet om deze voorzichtig over te brengen naar een omgekeerde Petrischaal en gebruik een scalpel om een gedeeltelijke amputatie van de staartvin uit te voeren voor behandeling met doxy. Bereid kweekbakken voor met één liter viswater dat 25 µg/mL doxycycline bevat.

Voeg als negatieve controle 250 microliters ethanol toe in plaats van doxycycline aan de kweekbakken met één liter water uit het vissysteem; breng tot 10 dubbel transgene vissen over naar elke kweekbak en plaats de bakken in het donker om stress te verminderen. Anestheseer na minimaal zes uur de behandelde vissen en breng ze over naar een natte, met agar gecoate schaal en gebruik een pincet om de staart uit te spreiden. Screen vervolgens de vissen onder een fluorescentiemicroscoop op de aanwezigheid van Y PET binnen het regenererende weefsel.

Daarna kunnen de vissen worden gebruikt voor verdere behandelingen of kunnen ze terugkeren naar het visbehuizingssysteem om de inductie van het responder-transgen te beëindigen na gedeeltelijke vinnamputatie en docs-behandeling. Amputeer de vinuitscheidingen opnieuw op ongeveer vier tot vijf benige segmenten proximaal ten opzichte van het initiële amputatievlak en op een tijdstip dat afhankelijk is van uw experimentele opstelling, zoals eerder in deze video beschreven. Leg de weefselregeneraten met een pincet, waarbij u alleen het stompgedeelte van het weefsel aanraakt, voorzichtig plat neer in een kleine Petrischaal met 4% gewicht/volume PFA in PBS en fixeer deze gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Gebruik de volgende dag PBS om de regeneraten twee keer te wassen voordat u ze overbrengt naar 0,5 molar E-D-T-A-P-B-S om de botmatrix gedurende de nacht bij vier graden Celsius te decalcificeren. Incubeer de regeneraten vervolgens in een sucrose-PBS-serie bij kamertemperatuur gedurende telkens 30 minuten en ten slotte in gelijke delen 30% sucrose-PBS en weefselvriesmedium voor nog eens 30 minuten.

Overbreng de vinnen naar weefselvriesmedium en incubeer deze gedurende ten minste twee uur bij vier graden Celsius. Plaats vervolgens cryovormpjes op een microscoopglaasje en vul deze met weefselvriesmedium. Plaats de regeneraten in de cryovormpjes en oriënteer het weefsel om longitudinale of transversale secties te verkrijgen.

Zorg ervoor dat het regeneraat recht staat om het doorsnijden te vergemakkelijken. Verplaats de cryovormen samen met de microscoopglaasjes naar een metalen rek op een bed van droogijs om het vriesproces te starten. Wanneer het medium gestold is, brengt u de cryovormen terug naar kamertemperatuur zodat het medium bij de interface met het plastic kan ontdooien.

Duw vervolgens met een instrument, zoals een pen, het bevroren blok uit de cryovorm en bewaar dit bij -80 °C tot aan het doorsnijden met een cryomicrotoom. Neem coupes van 10 tot 14 µm af op adhesie-microscopieglasjes en bewaar de glaasjes bij -20 °C tot ze nodig zijn. Om de expressie van de Tet-responder op vinnedelen te karakteriseren, worden de coupes 30 minuten behandeld met 100% MEOH, gekoeld tot -20 °C.

Verwijder de vloeistof voorzichtig met een papieren handdoek. Was de coupes vervolgens twee keer met PBT en één keer met PBS gedurende vijf minuten per keer. Incubeer de coupes 10 minuten in dappy en was ze daarna twee keer gedurende 10 minuten met PBS.

Gebruik vervolgens Antifa monteermiddel en een dekglas om de monsters te monteren voordat u confocale of wide-field fluorescentiemicroscopie gebruikt om beelden te maken van de monsters, nadat een functioneel TET-on systeem in zebravis is vastgesteld. Dit systeem kan worden gebruikt om de functie van genen of signaleringspaden in individuele weefsels te testen. Zoals hier wordt getoond, induceert de door de HER 4.3-promotor aangestuurde tet-activator TET-responder-expressie slechts in een subset van weefsels van het regeneraat; YFP-fluorescentie wordt gedetecteerd in de proliferatieve proximale blastema, terwijl de distale blastema en de epidermis geen expressie vertonen.

Expressie van de WNT bèta-catenine antagonist axine 1 in het HER 4.3-domein, dat de prolifererende cellen van het blastema bevat, heeft verrassend genoeg geen effect op de regeneratieve celproliferatie. Dit suggereert dat WNT-bèta-catenine signalering in het prolifererende proximale blastema geen essentiële rol speelt in de regulatie van de celproliferatie in het blastema. In tegenstelling hiermee interfereert het gebruik van de door de ubiquitinepromotor aangestuurde Tet-activatorlijn om axine 1-expressie in alle weefsels van het vinneregeneraat te induceren, sterk met de regeneratieve celproliferatie.

Daarnaast interfereert de expressie van axon een in het HER 4.3-domein, dat geen osteoblasten bevat, sterk met de botvorming in het regeneraat. Hiermee onthult weefselspecifieke interferentie met wind-signalering via het TE on-systeem onverwachte indirecte functies van wind-signalering bij de regulatie van celproliferatie en botregeneratie. Eenmaal beheerst, kan deze techniek worden gebruikt voor induceerbare, gerichte genexpressie in elk weefsel van belang.

We hebben deze methode succesvol toegepast om de weefselspecifieke functies van nicotine-signalering in de regenererende staartvin van de S-vis te onderzoeken. Het gebruik van deze methode zal helpen om een uitgebreider begrip te krijgen van de moleculaire determinanten die weefselregeneratie reguleren.