Name: Gebruik van de Teton systeem om te studeren moleculaire mechanismen van zebravis Regeneratie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Leer het TetON-systeem gebruiken voor weefsel-specifieke genexpressie in de regenererende staartvin van Danio rerio. Deze methode maakt induciblele genregulatie mogelijk om moleculaire mechanismen van regeneratie te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Christa Haase, Doris Weber en Brigitte Korte voor technische ondersteuning. Werk in de Weidinger lab wordt ondersteund door subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft WE 4223 / 3-1, WE 4223 / 4-1 en door de Deutsche Gesellschaft für Kardiologie via een Oskar-Lapp-Stipendium en Klaus-Georg-und-Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium.

<ol><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+profiling+of+cardiomyocytes+identifies+an+early+Jak1%2FStat3+injury+response+required+for+zebrafish+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).</li>
<li>Tryon, R. C., Johnson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+kit+ligand+a+functional+expression+reveals+lineage-specific+competence+to+promote+melanocyte+rescue+in+the+mutant+regenerating+caudal+fin%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of kit ligand a functional expression reveals lineage-specific competence to promote melanocyte rescue in the mutant regenerating caudal fin.</a> PloS one. 9 (7), e102317(2014).</li>
<li>Wehner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+defines+organizing+centers+that+orchestrate+growth+and+differentiation+of+the+regenerating+zebrafish+caudal+fin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling defines organizing centers that orchestrate growth and differentiation of the regenerating zebrafish caudal fin.</a> Cell Rep. 6 (3), 467-481 (2014).</li>
<li>Huang, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+a+myocardium-specific+transgene+in+zebrafish+transgenic+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of a myocardium-specific transgene in zebrafish transgenic lines.</a> Dev Dyn. 233 (4), 1294-1303 (2005).</li>
<li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dually+inducible+TetON+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li>
<li>Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+2A+peptides+allow+expression+of+multiple+proteins+from+a+single+ORF+in+transgenic+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos.</a> Genesis. 45 (10), 625-629 (2007).</li>
<li>Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nat Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).</li>
<li>Bussmann, J., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+BAC+selection+for+tol2-mediated+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Rapid BAC selection for tol2-mediated transgenesis in zebrafish.</a> Development. 138 (19), 4327-4332 (2011).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. (27), (2009).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines%2C+zebrafish+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PloS one. 6 (4), e18556(2011).</li>
<li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+journal+%2F+National+Research+Council%2C+Institute+of+Laboratory+Animal+Resources%22%5BJournal%5D)">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (2), 192-204 (2012).</li>
<li>Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+morpholinos+into+the+regenerating+adult+zebrafish+tail+fin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+PCR-ready+genomic+DNA+from+zebrafish+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues.</a> Biotechniques. 43 (5), 610(2007).</li>
<li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li>
<li>Suster, M. L., Kikuta, H., Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+zebrafish+with+the+tol2+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system.</a> Methods Mol Biol. , 56141-56163 (2009).</li>
<li>Grabher, C., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meganuclease+and+transposon+mediated+transgenesis+in+medaka%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Meganuclease and transposon mediated transgenesis in medaka.</a> Genome Biol. 8, Suppl 1S10. (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De volwassen zebravis heeft een verbazingwekkende capaciteit om vele interne organen en appendages succes regenereren. Een goed begrip van de moleculaire en cellulaire mechanismen die betrokken zijn vereist weefselspecifieke analyse van genfuncties en signaalwegen. Towards dit, de Teton systeem biedt een efficiënt hulpmiddel voor spatiotemporeel gecontroleerde genexpressie in embryonale en volwassen zebravissen. De Teton systeem bouwt en methodologie in dit manuscript beschreven zijn met succes gebruikt in een recent on...

De zebravis is een gevestigde gewervelde modelorganisme diverse aspecten van de ontwikkeling, fysiologie, ziekte en regeneratie te bestuderen. Met de groeiende goedkeuring van de zebravis als model voor post-embryonale biologische processen, experimentele instrumenten voor induceerbare, weefselspecifieke manipulatie van genexpressie of signaalwegen zijn steeds belangrijker geworden. Vooral studies naar orgel en aanhangsel regeneratie bij volwassen zebravis hebben geleden onder een gebrek aan tools voor dissectie van de ruimte-tijd eisen van signaalroutes tijdens deze regeneratieve processen. Momenteel zijn drie verschillende systemen gebruikt om conditionele, weefselspecifieke genexpressie in regenereren organen van volwassen zebravissen bereiken: het Cre-lox-systeem, mozaïek expressie van heat-shock induceerbare transgenen middels transposon gemedieerde somatische transgenese en de Teton systeem 1 -3. TETON verwijst naar een variant van een tetracycline-contgerolde transcriptionele activeringssysteem, waarbij expressie wordt geactiveerd in aanwezigheid van het antibioticum tetracycline of een derivaat, bijvoorbeeld doxycycline. De Cre-lox-systeem, zoals dat tot nu toe gebruikt bij volwassen vis, gebaseerd op een Tamoxifen-gecontroleerde Cre recombinase (CreERT2), waarvan de expressie ruimtelijk beperkt weefselspecifieke regulerende elementen. Cre aangedreven verwijdering van een STOP cassette vergemakkelijkt expressie van het gen van belang aangestuurd door een promoter die actief is in alle celtypes 1 moet zijn. Transposon gemedieerde creëren van mosaically expressie somatische transgenen verschaft een systeem voor induceerbare transgenexpressie in afzonderlijke cellijnen. Injectie van zebravisembryo&#39;s met een Tol2 transposon die een gen van belang onder de transcriptionele controle van een heat shock promoter resulteert in chimere individuen kenmerkend die het transgen slechts in discrete cellijnen van een regenererende orgaan 2. Hoewel beide systemen zorgen voor voorwaardelijke tissue-spefieke genexpressie, het Cre-lox systeem is niet omkeerbaar en de strategie met transposon gebaseerde klonen etikettering lijdt zijn stochastische natuur. Zo hebben wij en anderen recent aangepast transgeen Teton voor toepassing in de zebravis, waarbij tijd en ruimte-gestuurde genexpressie die bovendien instelbaar en omkeerbaar 3-5 vergemakkelijken. De Teton systeem hier gebruikt omvat een transgene driver lijn (TetActivator) waarin een Doxycycline (DOX) -induceerbare transcriptie activator (verbeterde omgekeerde tetracycline transactivator, irtTA, korte TETA) is onder controle van de weefsel-specifieke genomische regulatoire sequenties. Ten tweede vereist een transgene lijn responder (TetResponder) dat een gen van belang onder transcriptionele controle van de tetracycline operator herbergt (Tet responselement, Tetre) (figuur 1A). Zo is het gebruik van specifieke combinaties van TetActivator en TetResponder lijnen maakt voorwaardelijke weefsel-specific manipulatie van genexpressie. We hebben onlangs gebruik gemaakt van de Teton systeem om sonde voor weefsel-specifieke functies van Wnt / beta-catenine signalering in de volwassen regenereren zebravis staartvin 3. In het protocol hier geschetste beschrijven we een workflow voor de set-up en het gebruik van de Teton systeem in de zebravis, met name voor studies fin regeneratie. Deze bevat gedetailleerde instructies over hoe stabiele transgene TetActivator en TetResponder lijnen te genereren en een protocol voor transgene inductie bij embryo&#39;s en volwassen zebravissen. Verder beschrijven we technieken voor de controle van weefselspecifieke genexpressie in de vin regenereren, omvattende een protocol voor de bereiding van cryosecties van volwassen zebravis vinnen. Daarnaast bespreken we overwegingen voor het ontwerp van de TetActivator transgen, de keuze van een transgenese methode en detectie van TetResponder expressie. Vandaar dat het algemene doel van dit protocol is om te dienen als een blauwdrukvoor het opzetten van een functioneel Teton systeem zebravis voorwaardelijke weefselspecifieke genexpressie, die kunnen worden toegepast om een ​​weefsel van belang te bereiken. We hebben een TetActivator vector waardoor I-SceI of Tol2-bemiddelde generatie van stabiele TetActivator lijnen met behulp van korte genomische regulerende sequenties gemaakt (enhancer fragmenten; Weidinger lab plasmide databank geen 1247;. Figuur 1B). Dit construct bevat een TetActivator cassette bestaande uit het M2 mutant variant van de reverse Tet-repressor gefuseerd met het herpes simplex virus VP16 transactivatiedomein-derivaat 3F [irtTAM2 (3F)]. Expressie van het TetActivator (TETA) eenvoudig worden gecontroleerd omdat het gecoëxpresseerde de fluorofoor AmCyan van het open leesraam daarvan; Een P2A peptide medieert ribosomale skipping, wat moet leiden tot de productie van TETA en AmCyan als afzonderlijke eiwitten in een 1: 1 verhouding van 5,6. Het construct bevat ook een poylinker 5 &#39;van het TetActivator cassette genomische insertie van regulerende sequenties van belang onder toepassing van gebruikelijke werkwijzen klonering vergemakkelijken. Die kan worden gerecombineerd in een bacterieel kunstmatig chromosoom (BAC) die een grote genomische regio (; Daarnaast hebben we een construct bestaande uit de bovenbeschreven TetActivator cassette plus een kanamycine selectiecassette (. Figuur 1C Weidinger lab plasmide gegevensbestand geen 1180) gecreëerd gewoonlijk in de startcodon van een gen waarvan de expressie patroon moet worden nagebootst door het transgen). Beide constructies zijn verkrijgbaar bij de Weidinger lab op verzoek.

<table><tbody><tr><td>Breeding boxes</td><td>Aqua Schwarz</td><td>AquaBox 1</td><td></td></tr><tr><td>Compound fluorescent microscope</td><td>bijv. Leica, Zeiss</td><td>varieert per fabrikant</td><td>om fluorescente weefselsecties te beeld</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>bijv. Leica, Zeiss</td><td>varieert per fabrikant</td><td>om fluorescente weefselsecties te beeld</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>bijv. Leica, Thermo-Scientific</td><td>varieert per fabrikant</td><td>voor cryosectioning</td></tr><tr><td>4&rsquo;, 6- diamidino-2-phenylinodole (Dapi)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>gebruik 1/5.000 in PBS voor visualisatie van kernen</td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>bereid voorraden in 50% EtOH op 50 mg/ml (97 mM) voor TetResponder inductie</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>4% (w/v) paraformaldehyde in PBS, pH 7.5 voor fixatie</td></tr><tr><td>1x Fosfaat-buffer zoutoplossing (PBS)</td><td></td><td></td><td>1,7 mM KH2PO4, 5,2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7,5</td></tr><tr><td>1x Fosfaat-buffer zoutoplossing + Tween 20 (PBT)</td><td></td><td></td><td>1x PBS met 0,1% Tween 20</td></tr><tr><td>Superfrost Ultra Plus adhesie microscoopglaasjes</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>1014356190</td><td>voor het verzamelen van weefselsecties</td></tr><tr><td>Stereo fluorescent microscope</td><td>bijv. Leica, Zeiss</td><td>varieert per fabrikant</td><td>voor fluorescentie-gebaseerde genotypering</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>bijv. Biorad, Applied Biosystems</td><td>varieert per fabrikant</td><td>voor PCR-gebaseerde genotypering</td></tr><tr><td>Weefselvriesmedium (TFM)</td><td>Triangel Biomedical Sciences</td><td>TFM-C</td><td>voor inbedding van weefselmonsters</td></tr><tr><td>Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzoaat-methaan sulfonaat/MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>voor anesthesie gebruik bij 1 mg/ml in E3 embryo medium</td></tr></tbody></table>

gebruik van de teton systeem om te studeren moleculaire mechanismen van zebravis regeneratie

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

De zebravis is een zeer belangrijk modelorganisme geworden voor het bestuderen van ontwikkeling, fysiologie, ziekte en weefselregeneratie bij gewervelde dieren. Een grondig begrip van de betrokken moleculaire en cellulaire mechanismen vereist experimentele tools die induceerbare, weefselspecifieke manipulatie van genexpressie of signaalroutes mogelijk maken. Daarom hebben wij en anderen onlangs het TetON-systeem aangepast voor gebruik bij zebravissen. Het TetON-systeem faciliteert tijdelijk en ruimtelijk gecontroleerde genexpressie en we hebben dit hulpmiddel onlangs gebruikt om te onderzoeken naar weefselspecifieke functies van Wnt/beta–catenine-signalering tijdens regeneratie van de staartvin van de zebravis. Hier beschrijven we de workflow voor het gebruik van het TetON-systeem om induceerbare, weefselspecifieke genexpressie te bereiken in de regenererende staartvin van de volwassen zebravis. Dit omvat de generatie van stabiele transgene TetActivator- en TetResponder-lijnen, transgen-inductie en technieken voor verificatie van weefselspecifieke genexpressie in de vinnenregenerate. Dus, dit protocol dient als blauwdruk voor het opzetten van een functioneel TetON-systeem in zebravissen en het daaropvolgende gebruik ervan, in het bijzonder voor het bestuderen van vinnenregeneratie.

Een functioneel Teton voor induceerbare weefselspecifieke genexpressie, transgene TetActivator en TetResponder lijnen vast te worden gegenereerd (Figuur 1A). Dit wordt bereikt door microinjecting TetActivator (Figuur 1B - C) of TetResponder (figuur 1E) constructen in vroege zebravisembryo&#39;s en daaropvolgende kiemlijn integratie. Functionele TetActivator constructen kunnen ofwel worden gegenereerd door klonering van korte regulerende sequenties (enha...

Hier schetsen we de workflow voor het gebruik van het TetON-systeem om weefselspecifieke genregulatie te bereiken in de regenererende staartvin van een volwassen zebravis.

Gebruik van de Teton systeem om te studeren moleculaire mechanismen van zebravis Regeneratie

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Het algemene doel van deze procedure is het opzetten van een functioneel TED-on systeem in zebravissen om conditionele weefselspecifieke genexpressie te bereiken, zoals gedemonstreerd in de regenererende staartvin in deze video. Dit wordt bereikt door eerst transgene Tet-activatorlijnen te genereren die een tetracycline-induceerbare transcriptionele activator tot expressie brengen, gelabeld met am cyan in het betreffende weefsel, en Tet-responderlijnen die een ype-tag gen van belang bevatten onder controle van Tet-responsieve elementen. Vervolgens worden specifieke combinaties van dubbel transgene Tet-activator Tet-responder vissen vastgesteld.Vervolgens wordt de weefselspecifieke expressie van het Tet-responder-transgeen geïnduceerd door toediening van doxycycline. Tot slot wordt de expressie van het Tet-responder-transgeen geverifieerd door weefselcoupes te maken van de vinneregeneraten. Uiteindelijk wordt immunofluorescentie gebruikt om de weefselspecifieke expressie van het Tet-responder-transgeen te visualiseren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals hitte-shock-geïnduceerde genexpressie, is dat dit systeem induceerbare en reversibele genexpressie op weefselspecifieke wijze mogelijk maakt. Deze methode kan helpen om een diepgaander inzicht te verkrijgen in de moleculaire signaleringsnetwerken die de vinregeneratie van de zebravis sturen, aangezien het analyse van signaleringspaden en genfuncties in individuele weefsels mogelijk maakt. Hoewel wij deze technologie gebruiken om de vinregeneratie van de zebravis te bestuderen, kan deze ook instrumenteel zijn in veel andere contexten waarin weefselspecifieke manipulatie van de genfunctie vereist is.Nadat Tet-responder-vislijnen zijn gegenereerd volgens het tekstprotocol, wordt de kiemlijnintegratie en de induceerbaarheid van het transgen beoordeeld door individuele G0-vissen te kruisen met een eerder vastgestelde Tet-activatorlijn. Oogst vervolgens de embryo's en kweek deze tot een stadium waarin de Tet-responder-inductie kan worden beoordeeld. Bereid een 2000x doxycycline-stoomoplossing voor door 50% ethanol te gebruiken om doxycycline op te lossen tot een concentratie van 50 mg/mL.Bewaar aliquots van docks lichtbeschermd bij -20 °C. Bereid vervolgens E3-embryomedium voor dat docks bevat in een eindconcentratie van 25 µg/ml. Giet daarna het grootste deel van het E3-medium van de embryo's af.Vervang dit door medium met E3 en breng de embryo's voor minimaal zes uur terug naar 28,5 °C. Gebruik na de incubatie een fluorescente stereomicroscoop om de embryo's te screenen op YFP-fluorescentie. Stel verschillende stabiele transgene Tet-responderlijnen op basis van de zojuist geïdentificeerde founders vast.Kies lijnen die een sterke inductie vertonen en weinig mosaicisme vertonen binnen het verwachte expressiedomein, evenals weinig variatie tussen individuele embryo's. Zodra de TED-activator- en Tet-responder-vislijnen zijn vastgesteld, kruist u Tet-activator-dragers met Tet-responder-dragers om dubbel transgene vissen te genereren. Selecteer embryo's die het Tet-activator-transgeen dragen door te screenen op am cyan fluorescentie in een stereomicroscoop en kweek am cyan-positieve embryo's op tot volwassen vissen.Identificeer dubbel transgene volwassen vissen die naast de Tet-activator ook de Tet-responder dragen via PCR-gebaseerde genotypering of via hun vermogen om expressie van de Tet-responder in het betreffende weefsel te induceren om Tail Fin Tation uit te voeren. Anestheseer volwassen zebravissen in een bekerglas gevuld met viswater dat 160 µg/mL tricaine bevat. Wanneer de vis stopt met bewegen, gebruik dan een pincet om deze voorzichtig over te brengen naar een omgekeerde Petrischaal en gebruik een scalpel om een gedeeltelijke amputatie van de staartvin uit te voeren voor behandeling met doxy. Bereid kweekbakken voor met één liter viswater dat 25 µg/mL doxycycline bevat.Voeg als negatieve controle 250 microliters ethanol toe in plaats van doxycycline aan de kweekbakken met één liter water uit het vissysteem; breng tot 10 dubbel transgene vissen over naar elke kweekbak en plaats de bakken in het donker om stress te verminderen. Anestheseer na minimaal zes uur de behandelde vissen en breng ze over naar een natte, met agar gecoate schaal en gebruik een pincet om de staart uit te spreiden. Screen vervolgens de vissen onder een fluorescentiemicroscoop op de aanwezigheid van Y PET binnen het regenererende weefsel.Daarna kunnen de vissen worden gebruikt voor verdere behandelingen of kunnen ze terugkeren naar het visbehuizingssysteem om de inductie van het responder-transgen te beëindigen na gedeeltelijke vinnamputatie en docs-behandeling. Amputeer de vinuitscheidingen opnieuw op ongeveer vier tot vijf benige segmenten proximaal ten opzichte van het initiële amputatievlak en op een tijdstip dat afhankelijk is van uw experimentele opstelling, zoals eerder in deze video beschreven. Leg de weefselregeneraten met een pincet, waarbij u alleen het stompgedeelte van het weefsel aanraakt, voorzichtig plat neer in een kleine Petrischaal met 4% gewicht/volume PFA in PBS en fixeer deze gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Gebruik de volgende dag PBS om de regeneraten twee keer te wassen voordat u ze overbrengt naar 0,5 molar E-D-T-A-P-B-S om de botmatrix gedurende de nacht bij vier graden Celsius te decalcificeren. Incubeer de regeneraten vervolgens in een sucrose-PBS-serie bij kamertemperatuur gedurende telkens 30 minuten en ten slotte in gelijke delen 30% sucrose-PBS en weefselvriesmedium voor nog eens 30 minuten.Overbreng de vinnen naar weefselvriesmedium en incubeer deze gedurende ten minste twee uur bij vier graden Celsius. Plaats vervolgens cryovormpjes op een microscoopglaasje en vul deze met weefselvriesmedium. Plaats de regeneraten in de cryovormpjes en oriënteer het weefsel om longitudinale of transversale secties te verkrijgen.Zorg ervoor dat het regeneraat recht staat om het doorsnijden te vergemakkelijken. Verplaats de cryovormen samen met de microscoopglaasjes naar een metalen rek op een bed van droogijs om het vriesproces te starten. Wanneer het medium gestold is, brengt u de cryovormen terug naar kamertemperatuur zodat het medium bij de interface met het plastic kan ontdooien.Duw vervolgens met een instrument, zoals een pen, het bevroren blok uit de cryovorm en bewaar dit bij -80 °C tot aan het doorsnijden met een cryomicrotoom. Neem coupes van 10 tot 14 µm af op adhesie-microscopieglasjes en bewaar de glaasjes bij -20 °C tot ze nodig zijn. Om de expressie van de Tet-responder op vinnedelen te karakteriseren, worden de coupes 30 minuten behandeld met 100% MEOH, gekoeld tot -20 °C.Verwijder de vloeistof voorzichtig met een papieren handdoek. Was de coupes vervolgens twee keer met PBT en één keer met PBS gedurende vijf minuten per keer. Incubeer de coupes 10 minuten in dappy en was ze daarna twee keer gedurende 10 minuten met PBS.Gebruik vervolgens Antifa monteermiddel en een dekglas om de monsters te monteren voordat u confocale of wide-field fluorescentiemicroscopie gebruikt om beelden te maken van de monsters, nadat een functioneel TET-on systeem in zebravis is vastgesteld. Dit systeem kan worden gebruikt om de functie van genen of signaleringspaden in individuele weefsels te testen. Zoals hier wordt getoond, induceert de door de HER 4.3-promotor aangestuurde tet-activator TET-responder-expressie slechts in een subset van weefsels van het regeneraat; YFP-fluorescentie wordt gedetecteerd in de proliferatieve proximale blastema, terwijl de distale blastema en de epidermis geen expressie vertonen.Expressie van de WNT bèta-catenine antagonist axine 1 in het HER 4.3-domein, dat de prolifererende cellen van het blastema bevat, heeft verrassend genoeg geen effect op de regeneratieve celproliferatie. Dit suggereert dat WNT-bèta-catenine signalering in het prolifererende proximale blastema geen essentiële rol speelt in de regulatie van de celproliferatie in het blastema. In tegenstelling hiermee interfereert het gebruik van de door de ubiquitinepromotor aangestuurde Tet-activatorlijn om axine 1-expressie in alle weefsels van het vinneregeneraat te induceren, sterk met de regeneratieve celproliferatie.Daarnaast interfereert de expressie van axon een in het HER 4.3-domein, dat geen osteoblasten bevat, sterk met de botvorming in het regeneraat. Hiermee onthult weefselspecifieke interferentie met wind-signalering via het TE on-systeem onverwachte indirecte functies van wind-signalering bij de regulatie van celproliferatie en botregeneratie. Eenmaal beheerst, kan deze techniek worden gebruikt voor induceerbare, gerichte genexpressie in elk weefsel van belang.We hebben deze methode succesvol toegepast om de weefselspecifieke functies van nicotine-signalering in de regenererende staartvin van de S-vis te onderzoeken. Het gebruik van deze methode zal helpen om een uitgebreider begrip te krijgen van de moleculaire determinanten die weefselregeneratie reguleren.

use-teton-system-to-study-molecular-mechanisms-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We beschrijven een methode om de expressie van een doeleiwit voorwaardelijk knockdown op volwassen zebravissen fin regeneratie. Deze techniek micro-injectie en electroporating antisense oligonucleotide morpholinos in fin weefsel, zodat het testen van het eiwit rol in verschillende stadia van fin regeneratie onder wondgenezing blastema vorming en regeneratieve uitgroei.

In vivo Elektroporatie van Morpholinos in het regenereren van Adult Zebravissen Tail Fin

De werkwijze omvat de hier gepresenteerde precieze schade van levende zebravis embryo's met hoge energie laserpulsen en de analyse van deze letsels en hun herstel met de tijd. We laten ook zien hoe genetisch enkel label of groepen van skeletspiercellen kunnen worden gevolgd tijdens en na de laser-licht veroorzaakte schade.

Laser toegebrachte schade van zebravis Embryonale skeletspier

Na spinale doorsnijding, volwassen zebravissen hebben functioneel herstel van zes weken na het letsel. Om te profiteren van larvale transparantie en sneller herstel nemen, presenteren we een methode voor het doorsnijden van de larvale ruggenmerg. Na doorsnijding, zien we zintuiglijke herstel vanaf 2 dagen na het letsel, en C-bocht beweging door 3 dagen na het letsel.

Spinal Cord doorsnijding in het larvale zebravis

Een flexibel omgekeerde genetische methode voor zebravis over gen-functie te beoordelen tijdens de latere stadia van ontwikkeling en fysiologische homeostase zoals weefselregeneratie behulp intraventriculaire injecties van gen-specifieke morpholinos.

Reverse Genetische Morfolino benadering met behulp van de cardiale ventriculaire Injection naar meerdere Moeilijk-to-target weefsels in de zebravis Larve Transfecteren

Om licht te werpen op de cellulaire en moleculaire mechanismen van neurogenese en regeneratie bij volwassen zebravissen, ontwikkelden we een protocol voor invasieve chirurgie dat mechanische verwondingen veroorzaakt in het volwassen telencephalon van de zebravis en daaropvolgend bewaken van veranderingen in de 'gestoken' hemisfeer door middel van immunohistochemie of in situ hybridisatie.

Steekwond Letsel van de zebravis Adult Telencephalon: Een methode om Onderzoek gewervelde Brain Neurogenese and Regeneration

Hier presenteren we een betrouwbare methode om regeneratie van volwassen nieren te bestuderen door acute nierbeschadiging te induceren door gentamicine-injectie. We tonen aan dat de schade afhankelijk is van de gentamicine-dosering en de omgevingstemperatuur door middel van in situ hybridisatie om lhx1a+ zich ontwikkelende nieuwe nephronen te labelen.

Nier Regeneratie in Adult zebravis door Gentamicin geïnduceerd letsel

We presenteren een protocol voor het vastleggen van de dynamica van regeneratie van de staartvin van zebravislarven op een volledige weefselschaal met behulp van stereomicroscopie op basis van helder veld. Deze techniek maakt het mogelijk om de regeneratiedynamica met een enkele celresolutie vast te leggen. Deze methodologie kan worden aangepast aan elke stereomicroscoop uitgerust met een CCD-camera en time-lapse software.

Vastleggen van Tissue Repair in zebravis Larven met Time-lapse Helderveld stereomicroscopie

Skeletspierregeneratie wordt aangedreven door weefsel ingezeten spierstamcellen, die bij veel spierziekten zoals spierdystrofie worden aangetast, en dit resulteert in het onvermogen van spieren om te regenereren. Hier beschrijven we een protocol dat het mogelijk maakt om spierregeneratie te onderzoeken in zebravismodellen van spierziekte.

Het onderzoeken van Spierregeneratie in Zebrafish Modellen van Spierziekte

Een mechanisch hersenletselmodel bij de volwassen zebravis wordt beschreven om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die hun hoge regeneratieve capaciteit reguleren. De methode legt uit om een steekwondletsel te creëren in het optische tectum van meerdere soorten kleine vissen om de regeneratieve reacties te evalueren met behulp van fluorescerende immunostaining.

Steekwondletselmodel van het volwassen optische tectum met behulp van zebravissen en medaka voor de vergelijkende analyse van regeneratieve capaciteit

Het huidige protocol beschrijft een methode om weefselspecifieke en zeer reproduceerbare verwondingen bij zebravislarven te induceren met behulp van een laserlaesiesysteem in combinatie met een geautomatiseerd microfluïdisch platform voor het hanteren van larven.

Gecontroleerde semi-geautomatiseerde lasergeïnduceerde verwondingen voor het bestuderen van spinale regeneratie bij zebravislarven

Hier presenteren we een protocol voor het transplanteren van cellen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie in zebravisembryo's en -larven in elk stadium tussen ten minste 1 en 7 dagen na de bevruchting.

Celtransplantatie met hoge resolutie bij embryonale en larvale zebravissen

Leer het TetON-systeem gebruiken voor weefsel-specifieke genexpressie in de regenererende staartvin van Danio rerio. Deze methode maakt induciblele genregulatie mogelijk om moleculaire mechanismen van regeneratie te bestuderen.

Gebruik van de Teton systeem om te studeren moleculaire mechanismen van zebravis Regeneratie

Meer video's verkennen