Name: Next Generation Sequencing voor de detectie van beroep Mutaties in vaste en vloeibare Tumoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Leer next-generation sequencing voor de detectie van pathogene mutaties in vaste en vloeibare tumoren. Deze methode identificeert actionable mutations in AML en andere kankers voor gepersonaliseerde behandeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag de hulp van Daniel Wild erkennen voor het lezen van het manuscript en bijstand in de productie.

<ol><li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).</li>
<li>Campbell, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+patterns+and+dynamics+of+genomic+instability+in+metastatic+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The patterns and dynamics of genomic instability in metastatic pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1109-1113 (2010).</li>
<li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+evolution+in+relapsed+acute+myeloid+leukaemia+revealed+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing.</a> Nature. 481 (7382), 506-509 (2012).</li>
<li>Frampton, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+clinical+cancer+genomic+profiling+test+based+on+massively+parallel+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a clinical cancer genomic profiling test based on massively parallel DNA sequencing.</a> Nature Biotechnol. 31 (11), 1023-1031 (2013).</li>
<li>Patel, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+relevance+of+integrated+genetic+profiling+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Prognostic relevance of integrated genetic profiling in acute myeloid leukemia.</a> N Engl J Med. 366 (12), 1079-1089 (2012).</li>
<li>Forbes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COSMIC+%28the+Catalogue+of+Somatic+Mutations+in+Cancer+%29%3A+a+resource+to+investigate+acquired+mutations+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">COSMIC (the Catalogue of Somatic Mutations in Cancer ): a resource to investigate acquired mutations in human cancer.</a> Nucleic Acids Res. 38 (Database Issue), 652-657 (2010).</li>
<li>Shih, A. H., Abdel-wahab, O., Patel, J. P., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mutations+in+epigenetic+regulators+in+myeloid+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The role of mutations in epigenetic regulators in myeloid malignancies.</a> Nat Rev Cancer. 12 (9), 599-612 (2012).</li>
<li>Liersch, R., Müller-Tidow, C., Berdel, W. E., Krug, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+factors+for+acute+myeloid+leukaemia+in+adults+-+biological+significance+and+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Prognostic factors for acute myeloid leukaemia in adults - biological significance and clinical use.</a> Br J Haematol. 165 (1), 17-38 (2014).</li>
<li>Bacher, U., Schnittger, S., Haferlach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics in acute myeloid leukemia.</a> Curr Opin Oncol. 22 (6), 646-655 (2010).</li>
<li>Subramanian, J., Govindan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer+in+%26%2334%3BNever-smokers%26%2334%3B%3A+a+unique+entity%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+%28Williston+Park%29%22%5BJournal%5D)">Lung cancer in &#34;Never-smokers&#34;: a unique entity.</a> Oncology (Williston Park). 24 (1), 29-35 (2010).</li>
<li>Sakashita, S., Sakashita, M., Tsao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+pathology+of+non-small+cell+lung+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Genes and pathology of non-small cell lung carcinoma.</a> Semin Oncol. 41 (1), 28-39 (2014).</li>
<li>Arcila, M. E., Chaft, J. E., Nafa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+clinicopathologic+associations%2C+and+molecular+spectrum+of+ERBB2+%28HER2%29+tyrosine+kinase+mutations+in+lung+adenocarcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Prevalence clinicopathologic associations, and molecular spectrum of ERBB2 (HER2) tyrosine kinase mutations in lung adenocarcinomas.</a> Clin Cancer Res. 18 (18), (2012).</li>
<li>Gandhi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+neratinib+in+combination+with+temsirolimus+in+patients+with+human+epidermal+growth+factor+receptor+2-dependent+and+other+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase I study of neratinib in combination with temsirolimus in patients with human epidermal growth factor receptor 2-dependent and other solid tumors.</a> J Clin Oncol. 32 (2), 68-75 (2014).</li>
<li>Sheikhha, M. H., Awan, A., Tobal, K., Liu Yin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+FLT3+ITD+and+D835+mutations+in+AML+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol+J%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of FLT3 ITD and D835 mutations in AML patients.</a> Hematol J. 4 (1), 41-46 (2003).</li>
<li>Mazières, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer+that+harbors+an+HER2+mutation+epidemiologic+characteristics+and+therapeutic+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Lung cancer that harbors an HER2 mutation epidemiologic characteristics and therapeutic perspectives.</a> J Clin Oncol. 31 (16), 1-8 (2014).</li>
<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Genomics+Viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative Genomics Viewer.</a> Nat Biotechnol. 29 (1), 495-500 (2011).</li>
<li>Forbes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COSMIC%3A+exploring+the+world%27s+knowledge+of+somatic+mutations+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">COSMIC: exploring the world's knowledge of somatic mutations in human cancer.</a> Nucleic Acids Res. 43 (Database issue), D805-D811 (2014).</li>
<li>Daber, R., Sukhadia, S., Morrissette, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+limitations+of+next+generation+sequencing+informatics%2C+an+approach+to+clinical+pipeline+validation+using+artificial+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genetics%22%5BJournal%5D)">Understanding the limitations of next generation sequencing informatics, an approach to clinical pipeline validation using artificial data sets.</a> Cancer Genetics. 206 (12), 441-448 (2013).</li>
<li>Haraksingh, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Mapping+of+Copy+Number+Variation+in+Humans%3A+Comparative+Analysis+of+High+Resolution+Array+Platforms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Mapping of Copy Number Variation in Humans: Comparative Analysis of High Resolution Array Platforms.</a> PLoS ONE. 6 (11), e27859(2011).</li>
<li>de Leeuw, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+Array+Analysis+in+Constitutional+and+Cancer+Genome+Diagnostics+-+Copy+Number+Variants%2C+Genotyping+and+Quality+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">SNP Array Analysis in Constitutional and Cancer Genome Diagnostics - Copy Number Variants, Genotyping and Quality Control.</a> Cytogenet Genome Res. 135 (3-4), 212-221 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

<html> Aangezien de twee NGS proeven in dit manuscript beschreven klinisch worden aangeboden, de meest belangrijke praktische overweging is kwaliteitscontrole. In het bijzonder moet in de buurt aandacht worden besteed aan de kwaliteit en kwantiteit van geëxtraheerd DNA. Dit is vooral belangrijk voor FFPE monsters vaak zeer afgebroken met variabele DNA opbrengst. Isopropanol precipitatie methode werd ontwikkeld om DNA opbrengst uit FFPE monsters maximaliseren kolommen gebaseerde methoden bleken soms tot DNA afschuiving met beperkte elutievolumes. Daarom meestal wanneer een monster oplevert te lage concentratie of te afgebroken voor de test is waarschijnlijk veroorzaakt door het weefsel grootte, type of fixatie en niet het extractieproces. Voor bloed / beenmerg monsters, als er een extractie mislukking, is het meestal te wijten aan een monster dat hemodilute (dat wil zeggen, niet met voldoende aantal witte bloedcellen of tumorcellen in die draw) of chemo weggenomen. . Nt &#39;&gt; Tijdens de validatie dient cutoffs voor aanvaardbaarheid van DNA kwaliteit en kwantiteit worden vastgesteld De aanbevolen ingang van 100-250 ng wordt vaak gebruikt in de test, maar als de DNA kwaliteit goed is, dan lagere input bedragen kunnen slagen. Bovendien, indien de DNA kwaliteit slecht (dat wil zeggen, de hoeveelheid amplificeerbaar DNA is dan 100-250 ng) dan hogere ingang hoeveelheden kan de kwaliteit van de sequencing resultaten te verbeteren (aangezien de hoeveelheid amplificeerbaar DNA aanbevolen ingang bereikt) . Metrics voor DNA-kwaliteit en kwantiteit in een &quot;grijze zone&quot; (zie figuur 2) moet worden toegepast op elk monster voor het bevorderen van het DNA in de bibliotheek voorbereiding. die monsters moet worden uitgevoerd naar het oordeel van het laboratorium directeur of. Momenteel is de beste manier om te voorspellen of het DNA zal niet goed presteren tijdens sequencing is een qPCR-gebaseerde test die het mogelijk maakt voor de kwantificering en de kwaliteitsbeoordeling van de input DNA voeren. Deze benadering richt de bioavailabiliteit van verschillende grootte fragmenten in het monster door de amplificatie van verschillende grootte fragmenten (bijvoorbeeld, 100 bp, 150 bp, 200 bp en 300 bp) en vergelijking opbrengst. Momenteel bibliotheek bereiding omvat een groot aantal handmatige stappen waarbij een misstep op een van meerdere momenten kan de bibliotheek hetzij beginnen of van slechte kwaliteit zijn. De microfluïdische gel analyse is de enige QC stap naar een bibliotheek prep kwestie te controleren voordat sequencing. Dienovereenkomstig zijn verschillende kritische stappen waarbij extra aandacht de kans op een succesvolle reactie kan verhogen. Het is noodzakelijk om voor de juiste monster en oligonucleotide zwembad worden gebruikt voor elk monster. Zorgen en correct opnemen dat elk monster bevat één van de 96 unieke combinaties van dual-geïndexeerde PCR primerparen verkleint kans op een monster mix. Ook is het belangrijk ervoor te zorgen de filterplaat (FPU) correct afvoert; als het niet op de juiste wijze af te voeren dit de exte kan veroorzakennsion-ligatie stap van de bibliotheek voorbereiding op suboptimaal voeren en leiden tot slechte kwaliteit sequencing data. Na bibliotheek QC, is het essentieel dat de LNB1 korrels volledig geresuspendeerd en de LNB1 / LNA1 oplossing goed gemengd alvorens het aan de monsters de concentratie van dit mengsel wordt gebruikt om de molariteit van de bibliotheek te bepalen. Ten slotte, als de hiel elutiestap leidt tot een suboptimale hoeveelheid bibliotheek geëlueerd uit de korrels zal clustering dichtheid afnemen en hierdoor kan de bibliotheek adequate gemiddelde dekking verkrijgen. Omgekeerd zal een overmaat aan bibliotheek leiden tot slechtere kwaliteit leest. Daarom is het belangrijk dat ten de kraal gebaseerde normalisatiestap optimale bundeling en clustering van de bibliotheken op de sequencer verzekeren. Naast bibliotheek preparaat, is het essentieel om een ​​bioinformatica pijpleiding die nauwkeurige mutatie oproepen van het ruwe, gedemultiplexte fastq bestanden produceren valideren. Het kiezen van eenaangepaste oplossing kan tijdrovend zijn, omdat er veel open source en in de handel verkrijgbare aligners, variant bellers en NGS software pakketten die men zou moeten ziften door. Aangepaste algoritmes zullen moeten worden ontworpen om essentiële prestaties statistieken te halen, te identificeren unieke terugkerende mutaties die meest open source tools ontging, en bepaal aantal kopieën de status van elk der loci. Tijdens de validatie van een bio pijpleiding, is het belangrijk om de rapporteerbare cutoffs voor varianten die goede prestaties zowel een minimale diepte van de dekking na kwaliteit filtering (bijvoorbeeld ten minste 250 gelezen) en een minimale allelfrequentie bepalen (bijvoorbeeld 4 %). Aangezien dit een gemultiplexte-amplicon gebaseerde test, is het belangrijk te bepalen minimale gemiddelde diepte van dekking (bijvoorbeeld 1000x) dat de bibliotheek moet bereiken kunnen de laagst presterende amplicon naar de minimale diepte van de leest. Bovendien, de gemultiplexte aard van de test wel cAGebruik off doel effecten en deze &#39;artifacts&#39; zal moeten worden ontdekt en volledig doorgelicht voor de lancering. Een andere belangrijke beperking van de beschreven test is behoefte aan monsters meer dan 10% tumorcellen bevatten om de gevalideerde minimum allelfrequentie bereiken. De detectie van lage frequentie, 1%, FLT3 inserties aanwijzingen dat handmatige nog wenselijk deze werkwijze. Zelfs met een allel frequentie cut-off &#39;van 5%, een aantal belangrijke mutaties misschien gemist en dus handmatige controle zal van essentieel belang om deze varianten vast te stellen zijn. Voor FLT3-ITD, is visuele inspectie van exon 14 uitgevoerd voor alle AML-patiënten op een laag niveau of een grote inbrengen / doublures te garanderen blijft niet onopgemerkt. Bovendien HER2 exon 20 inserties die doorgaans naast de primersequentie moet handmatig ingrijpen. Ondanks het feit dat een robuuste pijplijn bioinformatica, kon wel wat varianten gaan over het hoofd gezien dat is gewoon de aard van het hebben van een harde cutoff voor de meeste van de statistieken hierboven vermeld. Beter bioinformatica nodig zou zijn om te helpen verlichten dit probleem, net als een betere bibliotheek voorbereiding en / of sequencing methodologieën, want het is het voordeliger om een ​​goede kwaliteit van de gegevens hebben op nog lagere cutoffs dat minder artefacten en valse positieven bevatten. De detectie en interpretatie van allel frequenties problemen wegens de moeilijkheid tumor percentagewegen en amplificatie voorspanning van sommige gebieden van het genoom. Bovendien kunnen allel frequenties boven 50% worden gedetecteerd, zoals waargenomen in case 2. Dit wordt geïnterpreteerd als een verlies van heterozygositeit (LOH) gebeurtenis, hetzij als gevolg van verlies van de normale allel, waardoor de schijnbare toename van mutant leest, een versterking van het mutante allel (bijvoorbeeld 2 mutant en één normale kopie) of andere mechanismen. Deze mechanismen kunnen worden toegelicht door gebruik reeks vergelijkende genomische hybridisatie (aCGH 19) en / of een SNP genotypering array. 20. De huidige doelstelling verrijking methodieken rekenen op full-dag procedures van een inefficiënte hybride vangen of multiplex-PCR-technieken die leiden tot de behoefte aan meer sequencing dekking van een enkel monster en meer af doelwit sequencing leest. Extra aanvragen voor NGS moleculaire oncologie naar verwachting in de nabije toekomst zal het makkelijker bibliotheek bereidingswijzen die volledig automatiseerbare kan zijn en in staat zijn om monsters te verwerken met een zeer lage hoeveelheden van de input DNA bevatten (dat wil zeggen, minder dan 1 ng) als monsters met zeer afgebroken DNA. Om deze uitdagingen aan te pakken, zullen de meeste methoden vermoedelijk PCR-gebaseerde, ofwel dat een meerdere stappen PCR aanpak of een massively-parallel singleplex PCR aanpak. Bovendien heeft moleculaire barcodes individuele amplicons aangetoond dat drastisch verminderen sequencing achtergrond ruis en controle van monsters mogelijk met lagere verhoudingen van tumorcellen lagere allel frequenties te bereiken en de richting vastleggen circulatieing tumorcellen. Detectie van ziekte-geassocieerde mutaties in kanker specimens heeft kwaliteit van de zorg voor decennia. Historisch gezien genen werden vaak getest achtereenvolgens, één gen / exon tegelijk met de identificatie van een mutatie die leidt tot het einde van de testvolgorde. De komst van NGS is toegestaan ​​voor een neutraler benadering sequencing meerdere genen geassocieerd met vele kankers tegelijkertijd leiden tot de identificatie van verschillende mutaties die zijn geassocieerd met neoplasie. De klinische bruikbaarheid van NGS voor de detectie van somatische mutaties in kanker is steeds duidelijker. Inderdaad, NGS-gebaseerde analyse van de tumor monsters vertegenwoordigt een nieuw paradigma dat de traditionele, enkel gen testen uitdaagt, maar de klinische bruikbaarheid is heel duidelijk. Klinische laboratoria vandaag de dag hebben de opwindende kans om een ​​zorgvuldige methode validatie en test interpretatie trouwen met de toepassing van deze krachtige technologie.

Next-generation sequencing (NGS) van de klinische oncologie specimens heeft op grotere schaal beschikbaar in de afgelopen jaren uitgegroeid tot de toenemende wetenschappelijke literatuur wijst op het belang van het identificeren van richtbare genetische veranderingen en predictieve / prognostische moleculaire merkers. Multi-gen panel analyses en exoom sequencing studies in zowel epitheliale 1,2 en 3 hematologische maligniteiten hebben het concept van de tumor heterogeniteit en klonale evolutie gestold als de ziekte vordert en recidieven. Bovendien, anders dan concurrerende technologieën, zoals polymerasekettingreactie (PCR) of Sanger sequentiebepaling, kan NGS detecteren meest genomische veranderingen in alle klinisch relevante kankergenen in een enkele test 4. Het Center for Personalized Diagnostics in eerste instantie gelanceerd met twee klinische NGS panelen, een aangepaste Hematologisch Panel (Heem-NGS Panel) en een off-the-shelf Cancer Panel voor FFPE specimens (Solid-NGS Panel) (zie <strong&gt; Figuur 1). Deze panelen dekken klinisch relevant of hoge rente regio&#39;s van de geselecteerde genen; niet alle genen of exons zijn volledig gedekt. Amplicons gegenereerd door probe hybridisatie gevolgd door verlenging en ligatie. De beoogde gebieden worden verder geamplificeerd met behulp van PCR met een universele dual-geïndexeerde primers, waardoor tot 96 monsters worden samengevoegd voor sequentiebepaling. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52758/52758fig1.jpg" /> Figuur 1:. Lijst van genen Gehuld in de Panels voorbereiding Library wordt uitgevoerd met behulp van de aangepaste Hematological Panel (Heem-NGS panel) van 33 genen of de off-the-shelf Amplicon Cancer Panel (Solid-NGS) van 47 genen. Niet alle van de genen of exons zijn bedekt met volle, zoals sommige amplicons kunnen alleen betrekking hebben op bepaalde hotspots. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/52758fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien. &lt;</a>/ A&gt; De inhoud van het heem-NGS panel is afkomstig uit verschillende bronnen, maar draait om 16 genen gemuteerd in acute myeloïde leukemie (AML) die eerder beschreven als blijk van een hoge mate van klinische bruikbaarheid 5. De Solid-NGS paneel wordt commercieel geproduceerd met de beoogde regio gebaseerd op gezamenlijk gemuteerde genen bij kanker zoals vermeld in de catalogus van somatische mutaties in Cancer (COSMIC) gegevensbank 6. Een aantal belangrijke stappen te karakteriseren de algehele workflow voor klinische NGS. Nadat de arts bestelt de test, een patholoog bepaalt de toereikendheid van het specimen volgende analyse voor tumor percentage en sample volume. In onze instelling, hebben wij ten minste 10% tumor danken aan de sequencing foutenpercentage ( &quot;ruis&quot;) van de techniek en de doelmatigheid van de gerichte benadering. Als het weefsel voldoende te testen, wordt genomisch DNA geëxtraheerd. Dit DNA wordt vervolgens onderworpen aan een combinatie kwaliteitscontrole (QC) stappen. Als het DNA geeft QC wordt een amplicon bibliotheek gegenereerd en gesequentieerd. De resulterende gegevens worden geanalyseerd door een in-house bioinformatica pijpleiding. Naar aanleiding van bioinformatica analyse worden varianten handmatig beoordeeld en geïnterpreteerd voor pathogeniciteit vóór opname in een klinisch rapport. Hieronder beschrijven we twee zaken die ging door dit strenge workflow en uiteindelijk geleid tot veranderingen in klinische behandeling. Case 1 - Acute myeloïde leukemie Een beenmergpunctie van patiënt A was diagnostisch voor AML, zonder rijping. Cytogenetische studies werden op het beenmerg monster en toonde een normale vrouwelijke karyotype. Er waren 95% circulerende ontploffing aanwezig, dus een perifeer bloedmonster werd gestuurd voor gepersonaliseerde diagnostische tests op het heem-NGS Panel. Acute myeloïde leukemie (AML) is een hematologische maligniteit van de myeloïde witte bloedcellen. de detectievan genmutaties bij AML steeds belangrijk voor prognose en behandeling geworden met recidiverende genmutaties die belangrijk blijken de pathogenese en prognose 7. Mutaties in NPM1 en CEBPA zijn geassocieerd met een gunstig prognostisch risico, terwijl interne tandem duplicatie (ITD) in FLT3 zijn geassocieerd met een minder gunstig verloop 8. Een groeiende hoeveelheid bewijs ondersteunt een pathogene rol van deze en andere mutaties in AML 9. Case 2 - Lung Darmkanker Een biopsie van een linker supraclaviculaire massa van patiënt B toonde pulmonale adenocarcinoom. Biopsiemateriaal van het formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) lymfklier massa liet genomische testen (Solid-NGS Panel) als rollen / krullen met meer dan 50% tumor te bepalen of een mutatie aanwezig voor gerichte therapeutische interventie. Lung Cancer is de belangrijkste oorzaak van kanker-gerelateerde sterfte in de Verenigde Staten en is verdeeld in twee hoofdtypen, niet-kleincellig longcarcinoom (NSCLC) en kleincellige longkanker (SCLC). NSCLC kan verder worden gedefinieerd als adenocarcinoom of plaveiselcelcarcinoom, gebaseerd op de histologie van de laesie. Longadenocarcinoom is het meest voorkomende subtype van longkanker, gezien in zowel rokers en niet-rokers, en is de meest voorkomende vorm van longkanker voor niet-rokers 10. Moleculaire studies van longadenocarcinomen geïdentificeerde mutatie in meerdere oncogenen 11. De meest voorkomende bestuurder mutaties geïdentificeerd in rokers zijn mutaties in KRAS en BRAF. De meest voorkomende mutaties in niet-rokers zijn mutaties in EGFR en herschikkingen waarbij de genen ALK, RET en ROS1. Longtumoren zijn beschreven met een in-raam insertie in exon 20 van het gen ERBB2 (HER2 / neu). De meest voorkomende abnormaliteit in HER2 / neu is een amplificatie van deze locus in borstkanker waarvoor gerichte therapie beschikbaar (trastuzumab: een gehumaniseerd monoklonaal antilichaam tegen HER2 / neu). Het HER2 / neu exon 20 insertie die wordt waargenomen bij 2-4% van long adenocarcimomas 12 is gedeeltelijk antwoord op combinatietherapie met HER2 / neu en mTOR remmers getoond (neratinib en temsirolimus respectievelijk) 13.

<table><tbody><tr><td>Genomic DNA ScreenTape</td><td>Agilent Technology</td><td>5067-5365</td><td></td></tr><tr><td>Genomic DNA Reagents</td><td>Agilent Technology</td><td>5067-5366</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technology</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity D1000 Reagents</td><td>Agilent Technology</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation 2200</td><td>Agilent Technology</td><td>G2965A</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation Analysis Software</td><td>Agilent Technology</td><td>A.01.04 of hoger</td><td></td></tr><tr><td>96-well Tube Storage Racks</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15/50 ml Tube Rack</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well Plate Rack</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette, single-channel, 0.5&ndash;2.5 &mu;l</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette, single-channel, 1&ndash;10 &mu;l</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette, single-channel, 2&ndash;20 &mu;l</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette, single-channel, 10&ndash;100 &mu;l</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette, single-channel, 20&ndash;200 &mu;l</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette, single-channel, 100&ndash;1,000 &mu;l</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serological Pipettor</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IJsemmer</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge (voor buisjes en stripbuisjes)</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vriezer, -20 &deg;C</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg;C Koelkast</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water- of parelbad</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator (37 &deg;C)</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serologische pipetten, 1&nbsp;ml</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serologische pipetten, 5&nbsp;ml</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serologische pipetten, 10&nbsp;ml</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serologische pipetten, 25&nbsp;ml</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Handschoenen</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vakmessen/schaafmesjes</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml conische buis</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml conische buis</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papierhanddoeken</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 proof Ethanol</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td>Bewaar in ontvlambare kast</td></tr><tr><td>2-Propanol (Isopropanol)</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td>Bewaar in ontvlambare kast</td></tr><tr><td>25 ml reservoirs</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 N NaOH</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette, 8-kanaals, 1 &ndash; 10 &mu;l</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette, 8-kanaals, 10 &ndash; 100 &mu;l</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette, 8-kanaals, 20 &ndash; 300 &mu;l</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IJsemmer</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waterspuitfles</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcoholspuitfles</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lensreinigingspapier</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plates, 96-well PCR, Semi-Skirted</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube strips, 8-well, 0.2&nbsp;ml</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>BioShake IQ of 3000-T elm</td><td>Bulldog Bio/Q.Instruments</td><td>1808-0506/ 1808-0517</td><td></td></tr><tr><td>DropPlate96 S - LabChipDS</td><td>Caliper</td><td>128876</td><td></td></tr><tr><td>DropPlate96 D - LabChipDS</td><td>Caliper</td><td>132848</td><td></td></tr><tr><td>DropSense96</td><td>Caliper (Trinean)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DropQuant Software</td><td>Caliper (Trinean)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plate Sealing Film</td><td>Denville</td><td>B1212-5S</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum Seal Foil</td><td>Denville</td><td>B1212-6S</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free, Pure Water System</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5424 centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>22621408</td><td></td></tr><tr><td>5804R centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>22623508</td><td>Beide 15 ml buisjes en platenrotators, bij voorkeur een centrifuge die tot 2.500 x g kan gaan.</td></tr><tr><td>Safe-Lock Tube 1.5 ml, Natural</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Tube, DNA LoBind Tube</td><td>Eppendorf</td><td>30108310</td><td></td></tr><tr><td>5430R Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>022620645</td><td>Elke platenrotator centrifuge werkt</td></tr><tr><td>Hybex Microsample Incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>1057-30-0</td><td></td></tr><tr><td>Hybex 0.2 ml Tube Block</td><td>Fisher Scientific</td><td>1057-31-0</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Amplicon &ndash; Cancer Panel</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1008</td><td>96 reacties</td></tr><tr><td>TruSeq Custom Amplicon</td><td>Illumina</td><td>PE-940-1011</td><td>96 reacties</td></tr><tr><td>TruSeq Custom Amplicon Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1003</td><td>96 indices, 384 monsters</td></tr><tr><td>MiSeq Reagent Kit v3, 500 Cycles</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3003</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reagent Kit v2, 300 Cycles</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2002</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reagent Kit v2, 500 Cycles</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>Experiment Manager</td><td>Illumina</td><td>1.3 of hoger</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reporter</td><td>Illumina</td><td>2.0 of hoger</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing Analysis Viewer</td><td>Illumina</td><td>1.8 of hoger</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Index Plate Fixture and Collar Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1

next generation sequencing voor de detectie van beroep mutaties in vaste en vloeibare tumoren

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

Naarmate ons begrip van de drivermutaties die nodig zijn voor het initiëren en de progressie van kanker verbetert, verkrijgen we cruciale informatie over hoe specifieke moleculaire profielen van een tumor kunnen voorspellen hoe goed ze reageren op therapeutische middelen of kennis geven over de prognose. In onze instelling werd een tumorgenotyperingsprogramma opgezet als onderdeel van de routinematige klinische zorg, waarbij zowel hematologische als solide tumoren werden gescreend op een breed spectrum van mutaties met behulp van twee next-generation sequencing (NGS) panelen: een aangepast, 33-gen hematologisch maligniteiten paneel voor gebruik met perifeer bloed en beenmerg, en een commercieel geproduceerd solide tumorpaneel voor gebruik met formaline-gefixeerd paraffine-ingebed weefsel dat 47 genen target die vaak muteren bij kanker. Onze workflow omvat een patholoog-review van de biopsie om ervoor te zorgen dat er voldoende tumor is voor de test, gevolgd door een aangepaste DNA-extractie die op het specimen wordt uitgevoerd. Kwaliteitscontrole van het specimen omvat stappen voor kwantiteit, kwaliteit en integriteit en pas nadat het geëxtraheerde DNA deze metrics heeft doorstaan, wordt er een ampliconbibliotheek gegenereerd en gesequenced. De resulterende gegevens worden geanalyseerd via een in-house bioinformaticapijplijn en de varianten worden beoordeeld en geïnterpreteerd op pathogeniteit. Hier bieden we een momentopname van het nut van elk paneel met behulp van twee klinische gevallen om inzicht te geven in hoe een goed ontworpen NGS-workflow kan bijdragen aan het optimaliseren van klinische uitkomsten.

Case 1 - Heem-NGS Panel De DNA geëxtraheerd uit leukemische perifere bloed was van voldoende kwaliteit en kwantiteit (176 ng / ul) voor het heem-NGS Panel. De totale gemiddelde diepte van de dekking was 4,933x (boven de minimale gemiddelde diepte van de dekking van de 1000x). Extra run statistieken in tabel 3. Van de 8 regio&#39;s hieronder 250x dekking, 3 waren als gevolg van verkeerde trimmen van de primers (dat wil zeggen, werd de primersequentie niet goed verwijderd vanwege sequencing fouten), 1 was een bekende artefact van de test, en de andere 4 waren deelgebieden van exons van verschillende genen zonder rapporteerbare varianten. Hoewel onze klinische protocol alleen omvat rapportage varianten onder ten minste 250 leest, leest alle data met ten minste 100 worden ingevoerd in de databank voor herziening. Dataverwerking from de bioinformatica pijplijn ontdekt drie te rapporteren, ziekte-geassocieerde mutaties; een missense mutatie in FLT3, een missense mutatie in IDH2 en een leesraamverschuiving in NPM1. De exon-varianten met hun allel frequenties worden in tabel 4. Een gemeenschappelijke mutatie in FLT3 is de FLT3 -interne tandem duplicatie (ITD) die niet automatisch wordt opgeroepen door onze pipeline en vereist een visuele inspectie van exon 14. Visuele inspectie van exon 14 van FLT3 toonde geen insertie of duplicatie in de ingediende monster. De FLT3 I836del was op 1% allel frequentie en is niet opgenomen in het definitieve verslag, omdat het gedaald tot onder de gevalideerde minimum allel frequentie van 5%. Deze mutatie is niet op hetzelfde DNA-molecuul als de FLT3 D835Y verandering (dat wil zeggen die in dezelfde amplicon gebied, maar niet in &quot;cis&quot; één van sequentiebepaling leest) en werd alleen waargenomen door handmatige controle van de .bam files bij de controle van de p.D835Y verandering. De lagere allel frequenties van de twee FLT3 mutaties suggereert deze mutaties kunnen heterogeniteit en / of klonale evolutie vertegenwoordigt; echter kan het verschil te wijten aan assayprestaties daarvoor amplicon of een enkele nucleotide polymorfisme (SNP) bij of overlapt primersequentie die de amplificatie van dit allel beïnvloed. Het heem-NGS Panel resultaten voor Case 1 met AML geïdentificeerde mutaties in FLT3, IDH2 en NPM1, drie veel gemuteerde genen in AML. Mutaties in FLT3 worden waargenomen in ~ 25% van de volwassen patiënten met AML (COSMIC database-17) en zijn ofwel interne tandem duplicaties (ITD) of missense mutaties in de tyrosine kinase domein. De FLT3-ITD zijn de meest voorkomende mutatie en zijn geassocieerd met een slechte respons op standaard chemotherapie, terwijl de prognostische betekenis van FLT3 kinase domain puntmutaties, zoals in deze AML patiënt heeft een duidelijk effect op de prognose 14. Isocitraatdehydrogenase 2 (NADP +), mitochondriale (IDH2) is een gen dat een epigenetisch modifier die vaak wordt gemuteerd in AML codeert. Mutaties in epigenetische modifiers zijn relatief vaak voor bij AML, met mutaties in IDH1 en DNMT3A van andere mutaties in deze klasse van genen die leiden tot gen ontregeling. Mutaties in het gen voor nucleofosmine (NPM1) zijn een van de meest voorkomende verworven mutaties in AML en wordt algemeen beschouwd als een goede prognostische factor (bij afwezigheid van een FLT3 - ITD). Co-mutaties van NPM1 en de IDH2 zijn beschreven in de literatuur als gunstige prognostische factor 5, met een 3-jaars overleving van 89%. Dit vertegenwoordigt een aanzienlijke overleving in vergelijking met het totale 3-jaars overleving vanwild type NPM1 en IDH2 van 31%. Bijvoorbeeld, standaard van zorg praktijk omvat mutatie-analyse voor NPM 1 en FLT3-ITD mutaties. In dit scenario zou de detectie van slechts een NPM1 mutatie niet adequaat stratify patiënt risico, zoals de secundaire mutaties gunstig kan zijn (bijvoorbeeld IDH2) of ongunstig (bijv TET2), het verminderen van het vertrouwen voor het verlichten van een beenmergtransplantatie. Case 2 - Solid-NGS Panel DNA geëxtraheerd uit de FFPE weefsels was van voldoende kwaliteit en hoeveelheid van de Solid-NGS paneel, met een concentratie van 252 ng / ul en slechts 4% van het DNA onder 1000 baseparen (bp). Na de data-analyse van de gemiddelde diepte van de dekking was 9167 leest (ruim boven onze minimale diepte cutoff van 1000 gelezen) zonder regio&#39;s onder 250 read diepte. Extra QC statistieken zijn shown in Tabel 3. Gegevens verwerkt via de bioinformatica pipeline twee gedetecteerde ziekte geassocieerde mutaties: een in-frame insertie in exon 20 van ErbB2 (HER2 / neu) en een missense mutatie in TP53. Alle exon varianten met hun allele frequenties worden weergegeven in Tabel 5. De insertie in ERBB2 vertegenwoordigt eigenlijk een tandem gedupliceerde (Her2 / neu) sequentie, zoals blijkt uit de nomenclatuur. Identificatie en bevestiging van de in-frame inbrengen vereist handmatige controle van het sequencing leest door de IGV. De detectie van mutatie frequenties van meer dan 50%, zoals gezien zowel de TP53 en de Her2 / neu mutaties suggereert een verlies van heterozygositeit (LOH) gebeurtenis (zie bespreking). De Solid-NGS Panel resultaten voor Case 2 met longadenocarcinoom gedetecteerde mutaties in ERBB2 (HER2 / neu) en TP53, twee genen niet vaak getest in het kader van de huidige standaard van zorg voor longkankerpatiënten. HER2 / neu codeert een tyrosine kinase receptor vergelijkbaar met een ander algemeen gemuteerde gen bij longkanker, EGFR . Activeren HER2 / neu exon 20 inserties waargenomen bij 2-4% van de long adenocarcinomen, verantwoordelijk voor het merendeel van de HER2 / neu mutaties waargenomen bij longkanker en worden typisch waargenomen in tumoren zonder mutaties in andere bestuurder genen zoals EGFR en ALK 12 . Er zijn verschillende lijnen van bewijs potentieel voor diverse behandelingen voor patiënten met activerende HER2 / neu inserties, waaronder gedeeltelijke respons op de combinatietherapie met HER2 / neu en mTOR remmers 13 en significante ziektebestrijding met het monoklonale antilichaam Trastuzumab in combinatie met chemotherapie 15. Het ontdekken van een TP53 verandering is niet uncoMmon bij kanker, maar op dit moment zijn er geen bruikbare therapieën. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Zaak 1 </td><td> Case 2 </td></tr><tr><td> Totaal Starten Leest </td><td> 2.215.926 </td><td> 2.129.110 </td></tr><tr><td> Percentage van Reads Mapping </td><td> 98,42% </td><td> 98,29% </td></tr><tr><td> Percentage van Reads op Target </td><td> 99.01% </td><td> 97,29% </td></tr><tr><td> Percentage van Reads op Target Na Filter </td><td> 97,60% </td><td> 95,45% </td></tr><tr><td> Percentage Bruikbare Leest </td><td> 94,87% </td><td> 91,79% </td></tr><tr><td> Percentage van Bases boven 250x Coverage </td><td> 98,40% </td><td> 100% </td></tr><tr><td> Percentage van de basen Above 1000x Coverage </td><td> 95.90% </td><td> 99,70% </td></tr><tr><td> Dekking Onder 250x - Amplicon Number </td><td> 8 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table> Tabel 3:. Sequencing Run QC Metrics Dit is een samenvatting van de belangrijkste statistieken run, met uitzondering van de gemiddelde dekking, die gebruikt worden voor data bekijken om te bepalen of een bibliotheek prep steekproef QC is verstreken. Het hele proces is succesvol als alle percentages boven 90%, maar het is mogelijk, met overdracht van SW1 of UB1 in de FPU wasstap of primer overspraak, lagere &quot;Procent op Target &#39;in het bereik van 80 - 90%. Als de &quot;Percentage toegewezen&quot; is te laag, zou dat een besmetting van bacteriën of andere DNA aanwijzen aangezien alle monsters moeten afstemmen tot mens. Wanneer een van deze specificaties zijn onder de 80%, wordt het monster gemarkeerd voor verder onderzoek om te bepalen hoe om te proceed en verbetering van het proces. <img alt="tabel 4" src="/files/ftp_upload/52758/52758tbl4.jpg" /> Tabel 4:.. Case 1 Resultaten gedetecteerd pathogene, ziekte geassocieerd, variant van onbekende betekenis (VUS), en waarschijnlijk goedaardige exon varianten boven de rapportage criteria van 5% allel frequentie worden vermeld <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/JoVE_Table_4.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a> <img alt="tabel 5" src="/files/ftp_upload/52758/52758tbl5.jpg" /> Tabel 5:.. Case 2 Resultaten gedetecteerd pathogene, ziekte geassocieerd, variant van onbekende betekenis (VUS), en waarschijnlijk goedaardige exon varianten boven de rapportage criteria van 5% allel frequentie worden vermeld <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/JoVE_Table_5.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden</a>. Bijkomende Figuur 1: Een voorbeeld van een amplicon-gebaseerde SampleSheet.csv. Dit blad overdraagt ​​aan de sequencer wat chemie werking (in casu Amplicon), welke workflow (bijvoorbeeld GenerateFastq), welke toepassing en Assay (bijvoorbeeld FastqOnly), hoeveel basen (of gelezen) sequentie (in dit geval 186 bp x 186 bp), en tenslotte welke monsters houden bepaalde indexen (hier dubbele indexering). De onderdelen die zijn gemarkeerd in het geel kan worden aangepast aan wat de onderzoeker wil, maar in dit geval het lab gebruikt deze parameters. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/SupplementaryFigure1.pdf" target="_blank">Klik hier om dit cijfer te downloaden.</a>

Dit manuscript beschrijft klinische protocollen voor twee next-generation sequencing panelen. Het ene paneel onderzoekt hematologische maligniteiten, terwijl het andere paneel zich richt op genen die vaak gemutaeerd zijn in solide tumoren. Moleculaire classificatie van drivermutaties in humane maligniteiten biedt waardevolle prognostische en voorspellende informatie.

Next Generation Sequencing voor de detectie van beroep Mutaties in vaste en vloeibare Tumoren

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

Het algemene doel van deze targeted Amplicon Assay voor next-generation sequencing is het detecteren van pathogene mutaties in tumoren van patiënten voor therapeutisch gebruik, waaronder diagnostiek, prognostiek en het bepalen van de respons op gerichte therapie. Deze methode beantwoordt cruciale vragen, zoals of een patiënt een mutatie heeft in een gen dat baat kan hebben bij een gerichte of alternatieve therapie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat actievere mutaties, zowel veelvoorkomend als zeldzaam, over vele genen heen gedetecteerd kunnen worden in elk tumorweefsel met behulp van één enkele assay.Omdat de technieken en de technologie zo complex zijn en de stappen zo moeilijk om aan te leren, is het cruciaal om deze methode visueel te demonstreren. Dit is een bepalend moment in de vooruitgang van de medische oncologie. Met de implementatie van next generation sequencing in de klinische praktijk zullen we over meer en betere kankerbehandelingen voor onze patiënten beschikken.Onze CPD-technologen, Barentt Li, Patrick Candrea, Karthik Ganapathy en Joe Grubb, zullen deze procedure demonstreren. Ik zal ook bij dit proces helpen om de complexere delen van de assay toe te lichten. Nadat het genomische DNA is geëxtraheerd volgens het tekstprotocol en het protocol van de fabrikant, worden twee µL van het geëxtraheerde DNA op een fluorometer geanalyseerd om de werkconcentratie van het monster te bepalen.Om een ampliconbibliotheek te maken, voegt u in een semi-skirted 96-well plaat, genaamd de Hyb Plate, het benodigde volume low EDTA TE en vijf microliter van de Oligo Tube van het panel toe; voeg vervolgens 100 tot 250 nanogram genomisch DNA toe aan elke overeenkomstige well. Dit is de meest cruciale stap, aangezien elke verwisseling hier ernstige gevolgen zal hebben. Na toevoeging van Heterogeneous Hybridization for Sequencing Reagent 1 en het centrifugeren volgens het tekstprotocol, incubeert u de Hyb Plate in de voorverwarmde hybridisatie-incubator bij 95 °C gedurende één minuut.Nadat de incubator langzaam is afgekoeld tot 40 °C, wordt de plaat uit de incubator gehaald en wordt het volledige volume van elk monster van de Hyb Plate overgebracht naar het midden van de vooraf voorbereide, voorgewassen corresponderende filterplaatunit (FPU). Dek de FPU af en centrifugeer 3 minuten lang bij 2.250 ×g en 20 °C. Voeg vervolgens 45 µL SW1 toe en centrifugeer opnieuw.Na een tweede wasbeurt met SW1 en een wasbeurt met UB1, voegt u 45 µL Extension Ligation Mix 3 toe aan elke monsterput en pipetteert u dit drie keer op en neer om te mengen. Gebruik adhesieve aluminiumfolie om de plaat af te sluiten en incubeer de gehele FPU-assemblage gedurende 45 minuten in een voorverwarmde incubator op 37 °C. Om de PCR-amplificatie te indexeren, schikt u de primers in de Index Amplification Plate (IAP-houder) en doseert u de gebruikte indexen in de overeenkomstige putten van de plaat; voeg vervolgens 22 µL van de PCR Master Mix, 2E12, toe en pipetteer dit drie keer op en neer.Nadat de 45 minuten durende extensie-ligatiereactie volgens het tekstprotocol is gecentrifugeerd, voegt u 25 µL 50 mM natriumhydroxide toe aan elke monsterput van de FPU en pipetteert u dit minstens zes keer op en neer, waarbij u ervoor zorgt dat de pipetpunt het membraan raakt. Pipetteer vervolgens met de plaat licht gekanteld en een meerkanaalpipet ingesteld op 20 µL het natriumhydroxide in de FPU-plaat minstens zes keer op en neer. Draag het eluaat van de FPU over naar de overeenkomstige kolom van de IAP.Pipette voorzichtig op en neer om het DNA grondig te mengen met de PCR Master Mix voordat het PCR-programma uit het tekstprotocol wordt uitgevoerd. Na het verifiëren van de bibliotheekopbrengst en het incuberen van de monsters met magnetische zuiveringsbeads volgens het tekstprotocol, voegt u 30 µL EBT toe aan elke put met gewassen beads. Pipette een paar keer op en neer om ervoor te zorgen dat de beads van de wand van de buis loskomen.Nadat de plaat is geïncubeerd met en vervolgens zonder schudden, plaatst u de plaat op het magnetische rek en brengt u 20 µL van het supernatant over naar een volledig nieuwe plaat, genaamd de Library Normalization Plate, of LNP. Na het bereiden van het normalisatiemengsel, met tussentijdse omkeerbewegingen en het vortexen van de oplossing, voegt u 45 µL toe aan elk monster van de LNP. Sluit de plaat vervolgens af met transparante plakfolie en schud deze 30 minuten lang bij 1.800 RPM.Verwijder na het wassen van de beads de LNP van het magnetische rek en voeg, om het monster te elueren, 30 µL verse 0,1 normale natriumhydroxide toe aan elke well. Schud vervolgens de LNP vijf minuten lang bij 1.800 RPM. Plaats de LNP terug op het magnetische rek en breng, zodra de supernatant is geklaard, 30 µL van het eluaat over naar de eerder bereide Library Normalization Storage Buffer 1 in de Storage Plate.Buig de plaat naar beneden en voeg vervolgens vijf µL van elk te sequensen monster toe aan een gelabelde 1,5 mL buis voor de samengevoegde ampliconbibliotheek (Pooled Amplicon Library, PAL). Afhankelijk van de gebruikte sequencingchemie voegt u vier tot 10 µL van de PAL toe aan 590 tot 596 µL Buffer HT1. Reinig en laad de Flow Cell.Laad de reagentia. Volg vervolgens de aanwijzingen op het scherm om de sequencing-run te starten. Nadat de sequencing-run is voltooid, voert u de bio-informatica-pipeline uit.Analyseer de run-statistieken om te bevestigen dat de gesequenteerde bibliotheek voldoet aan de door het laboratorium vastgestelde kwaliteitscontrolemetrieken. Beoordeel tenslotte elke variant handmatig in een Genomic Data Viewer door de BAM-bestanden te bekijken. Dit is een overzicht van de belangrijkste run-statistieken, exclusief de gemiddelde dekking, die worden gebruikt om te bepalen of een library prep-monster door de kwaliteitscontrole is gekomen. Zoals hier te zien is voor Case One, heeft de bio-informatica vier rapporteerbare AML-geassocieerde mutaties gedetecteerd.Een missense-mutatie in FLT3, een missense-mutatie in IDH2 en een frameshift-mutatie in NPM1. Mutaties in FLT3 worden waargenomen bij ongeveer 25% van volwassen patiënten met AML. De prognostische betekenis van FLT3 Kinase Domain Point Mutations, zoals gezien bij deze AML-patiënt, heeft een onduidelijke impact op de prognose.Isocitraatdehydrogenase 2, of IDH2, codeert voor een epigenetische modifier die vaak gemuteerd is bij AML. Mutaties in het gen voor Nucleofosmine, of NPM1, behoren tot de meest voorkomende verworven mutaties bij AML. Deze tabel vermeldt alle exonische varianten voor Casus Twee.Er werden twee ziekte-geassocieerde mutaties gedetecteerd: een in-frame insertie in exon 20 van ERBB2 en een missense-mutatie in TP53. HER2/neu, of ERBB2, codeert voor een tyrosinekinasereceptor.Activerende HER2/neu exon 20-inserties worden waargenomen in twee tot 4% van de longadenocarcinomen en vormen de meerderheid van de waargenomen HER2/neu-mutaties bij longkanker. TP53-veranderingen komen ook veelvuldig voor bij kanker. Het is noodzakelijk om nauwgezetten aandacht te besteden aan de kwaliteit en hoeveelheid van het geëxtraheerde DNA.Dit is vooral belangrijk voor FFPE-monsters. Deze zijn vaak sterk gedegradeerd met een variabele DNA-opbrengst. Tijdens het validatieproces van de klinische assay moeten meetwaarden voor de DNA-kwaliteit en -kwantiteit voor elk monster worden vastgesteld voordat het DNA wordt doorgezet naar de library-preparatie.Naast de bibliotheekpreparatie is het essentieel om een bio-informaticaschema te valideren door afkapwaarden voor de sequencingrun, kwaliteitscontrolestatistieken, statistieken van de bibliotheekpreparatie, de dekkingdiepte van een amplicon en de minimale rapporteerbare allelfrequentie te bepalen. Zodra de methode onder knie is, kan de bibliotheekpreparatie binnen één werkdag worden uitgevoerd. De totale workflow van de analyse vereist echter meer tijd voor DNA-extractie, sequencing, gegevensverwerking en variantbeoordeling.Deze procedure is uitsluitend ontworpen om genomische DNA-mutaties in bepaalde belangrijke hot spots te analyseren. Andere analyses die RNA gebruiken, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de differentiële expressie van genen, het associëren van tumorrisico's en structurele herschikkingen. Belangrijke vorderingen zijn in zicht.De adoptie van automatisering en de integratie van unieke moleculaire barcoding stellen laboratoria in staat om de doorlooptijd te verkorten, minder sample-input te gebruiken en varianten met een zeer lage allelfrequentie te detecteren. De detectie van ziekte-geassocieerde mutaties in kankerbiopten is al decennia de standaardzorg. NGS is een minder bevooroordeelde benadering om meerdere genen die geassocieerd zijn met vele soorten kanker parallel te sequensen, wat leidt tot de identificatie van meerdere mutaties en betere behandelingen voor patiënten.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

next-generation-sequencing-for-detection-actionable-mutations-solid

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

We beschrijven de bereiding van barcode DNA-bibliotheken en daaropvolgende hybridisatie gebaseerde exon vastleggen voor de detectie van de belangrijkste kanker-geassocieerde mutaties in klinische monsters tumor door massaal parallelle "next generation" sequencing. Gerichte exon sequentie biedt de voordelen van hoge doorvoer, lage kosten en diepe sequentie dekking, hetgeen aldus hoge gevoeligheid voor het detecteren van lage frequentie mutaties.

Detecteren Somatische genetische veranderingen in tumorspecimens door Exon Capture en Massively Parallel Sequencing

Er wordt een geïntegreerd systeem beschreven voor gerichte next-generation sequencing van oncologische monsters. Dit cross-platform systeem is geoptimaliseerd voor tumorbiopsies van lage kwaliteit en lage hoeveelheid, past zich aan lage DNA-inputs aan, omvat goed gekarakteriseerde multi-variant controles en beschikt over een nieuwe variant caller die wordt geïnformeerd door kwantitatieve pre-analytische kwaliteitscontrolemaatregelen.

Integratie van Nat en droog Bench Processen Optimaliseert Gerichte next-generation sequencing van lage kwaliteit en lage hoeveelheid tumorbiopten

Dit manuscript beschrijft een techniek voor het opsporen van mutaties van lage frequentie in ctDNA, ER-Seq. Deze methode is onderscheiden zich door het unieke gebruik van twee-directionele foutcorrectie, een speciale achtergrond filter en efficiënte moleculaire verwerving.

Detectie van zeldzame mutaties in CtDNA met behulp van de volgende generatie Sequencing

Het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige genomic DNA van tumor weefsels is een essentiële eerste stap voor het analyseren van de genetische veranderingen met behulp van de volgende generatie sequencing. In dit artikel presenteren we een eenvoudige en snelle methode om tumorcellen te verrijken en te verkrijgen intact DNA touch Impressum cytologie specimens.

Eenvoudige en snelle methode om kwalitatief hoogwaardige Tumor DNA uit klinisch-pathologische monsters met behulp van Touch Impressum cytologie

Detectie van circulerende RNA acid (cRNA) van bloed is een unmet behoefte in klinische diagnostiek. Hier beschrijven we methoden die kenmerkend zijn voor cRNA van niet-kleincellige longkanker kankerpatiënten met behulp van gevoelige en specifieke digitale polymerase-kettingreactie. De tests voldoen aan ontwerp te detecteren fusion varianten binnen 72 uur.

Een bloed-gebaseerd testen voor de detectie van ROS1 en RET Fusion Transcripts from circulerende RNA zuur met behulp van digitale Polymerase-kettingreactie

Hier presenteren we een protocol voor het opsporen van tumor somatische mutaties in het Circulerend DNA dat aanwezig is in patiënt biologische vloeistoffen (biovloeistoffen). Onze druppel digitale polymerase kettingreactie (dpcr)-gebaseerde methode maakt kwantificering van de tumor mutatie allel Frequency (MAF) mogelijk, waardoor een minimaal invasieve aanvulling op de diagnose en temporele monitoring van de tumorrespons wordt vergemakkelijkt.

Detectie en monitoring van tumor geassocieerd Circulerend DNA bij patiënt biovloeistoffen

Dit artikel beschrijft een methode voor het identificeren van klonale en subclonale veranderingen tussen verschillende specimens van een bepaalde patiënt. Hoewel de hier beschreven experimenten gericht zijn op een specifiek tumor type, is de aanpak algemeen toepasbaar op andere vaste tumoren.

Vergelijkende laesies analyse door middel van een gerichte sequentie benadering

Dit artikeldetails het gebruik van een verankerde multiplex polymerase keten reactie gebaseerde bibliotheek Voorbereidingspakket gevolgd door de volgende generatie sequencing om te beoordelen voor oncogene gen fusies in klinische solide tumormonsters. Zowel de natte bank als de gegevensanalyse stappen worden beschreven.

Oncogene Genfusie detectie met behulp van verankerde multiplex polymerase kettingreactie gevolgd door sequenties van de volgende generatie

In dit artikel presenteren we een gedetailleerd protocol voor niet-invasieve vloeibare biopsietechniek, waaronder bloedafname, plasma- en buffy coatscheiding, cfDNA- en kiembaan-DNA-extractie, kwantificering van cfDNA of kiembaan-DNA en cfDNA-fragmentverrijkingsanalyse.

Detectie van celvrij DNA in bloedplasmamonsters van kankerpatiënten

De toename van moleculaire biomarkers die moeten worden getest voor niet-plaveiselcelcarcinoom niet-kleincellige longkanker (NS-NSCLC) zorgmanagement heeft geleid tot de ontwikkeling van snelle en betrouwbare moleculaire detectiemethoden. We beschrijven een workflow voor de beoordeling van genomische veranderingen voor NS-NSCLC-patiënten met behulp van een ultrasnelle next generation sequencing (NGS)-benadering.

Ultrasnelle amplicon-gebaseerde sequencing van de volgende generatie bij niet-plaveiselcelkanker

Dit protocol beschrijft een geautomatiseerde, door de ISO15189 geaccrediteerde sequencing-workflow van de volgende generatie voor het detecteren van doelgerichte genomische veranderingen in niet-kleincellige longkanker (NSCLC) in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde weefsels.

Detectie van doelgerichte veranderingen bij niet-kleincellige longkanker met behulp van sequencing van de volgende generatie

Leer next-generation sequencing voor de detectie van pathogene mutaties in vaste en vloeibare tumoren. Deze methode identificeert actionable mutations in AML en andere kankers voor gepersonaliseerde behandeling.

Next Generation Sequencing voor de detectie van beroep Mutaties in vaste en vloeibare Tumoren

Meer video's verkennen