Next Generation Sequencing voor de detectie van beroep Mutaties in vaste en vloeibare Tumoren

Het algemene doel van deze volgende generatie sequencing gerichte Amplicon Assay is om pathogene mutaties in tumoren van patiënten te detecteren voor therapeutisch gebruik, inclusief diagnostisch, prognostisch en respons op gerichte therapie. Deze methode beantwoordt belangrijke vragen, zoals of een patiënt een mutatie heeft in een gen dat kan profiteren van een gerichte of alternatieve therapie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat actionable mutaties, zowel algemeen als zeldzaam, over vele genen kunnen worden gedetecteerd in elk tumorweefsel met behulp van een enkele assay.

Omdat de technieken en de technologie zo complex zijn en de stappen zo moeilijk te leren zijn, is het van cruciaal belang om deze methode visueel te demonstreren. Dit is een bepalend moment in de vooruitgang van de Medische Oncologie. Met de adoptie van next generation sequencing in de kliniek zullen we meer en betere kankerbehandelingen hebben voor onze patiënten.

Onze CPD Technologists, Barentt Li, Patrick Candrea, Karthik Ganapathy en Joe Grubb zullen deze procedure demonstreren. Ik zal ook helpen bij dit proces om de meer complexe delen van de assay te laten zien. Na het extraheren van genomisch DNA volgens het tekstprotocol, het volgen van het protocol van de fabrikant, draai je twee microliter van het geëxtraheerde DNA op een fluorometer om de werkconcentratie van het monster te verkrijgen.

Om een Amplicon Bibliotheek te maken, voeg in een semi-omzoomde 96-well plaat genaamd de Hyb Plaat, het noodzakelijke volume van lage EDTA TE toe, vijf mircoliters van de Oligo Tube van het paneel, voeg 100 tot 250 nanogram genomisch DNA toe aan elke overeenkomstige put. Dit is de meest vitale stap, aangezien elke mix-up hier ernstige gevolgen zal hebben. Na de toevoeging van de Oligo Hybridisatie voor Sequencing Reagens 1, en het draaien volgens het tekstprotocol, incubeer de Hyb Plaat in de voorverwarmde hybridisatie-incubator op 95 graden Celsius gedurende één minuut.

Nadat de incubator langzaam is afgekoeld tot 40 graden Celsius, verwijder je de plaat uit de incubator en breng je het volledige volume van elk monster van de Hyb Plaat over naar het centrum van de eerder voorbereide overeenkomstige, voorgewassen filterplaat unit, of FPU. Bedek de FPU, en centrifugeer bij 2, 250 keer G en 20 graden Celsius gedurende drie minuten. Voeg vervolgens 45 microliter van SW1 toe en centrifugeer opnieuw.

Na een tweede wassing met SW1 en een wassing met UB1, voeg je 45 microliter van Extension Ligatie Mix 3 toe aan elke monsterput en pipet het drie keer op en neer om te mengen. Gebruik kleefbare aluminiumfolie om de plaat te verzegelen en incubeer de hele FPU-assemblage in een voorverwarmde 37 graden Celsius incubator gedurende 45 minuten. Om de PCR-amplificatie te indexeren, rangschik je de primers in de Index Amplificatie Plaat, of IAP Fixture, en verdeel je de indexen die worden gebruikt in de overeenkomstige putten in de plaat, voeg dan 22 microliter van de PCR Master Mix, 2E12, toe en pipet het drie keer op en neer.

Vervolgens, na het draaien van de 45 minuten Extension Ligatie Reactie volgens het tekstprotocol, voeg je 25 microliter van 50 millimolar natriumhydroxide toe aan elke monsterput van de FPU en pipet het op en neer ten minste zes keer, ervoor zorgen dat de pipettip in contact komt met de membraan. Dan, met de plaat iets gekanteld en een multi-kanaals pipet ingesteld op 20 microliter, pipet je het natriumhydroxide in de FPU plaat op en neer ten minste zes keer. Breng de elutie van de FPU over naar de overeenkomstige kolom van de IAP.

Pipet voorzichtig op en neer om het DNA grondig te combineren met de PCR Master Mix voordat je het PCR-programma uitvoert dat in het tekstprotocol is beschreven. Na het verifiëren van de bibliotheekopbrengst en het incuberen van de monsters met Magnetische Zuiveringskralen volgens het tekstprotocol, voeg je 30 microliter EBT toe aan elke put van de gewassen kralen. Pipet een paar keer op en neer om ervoor te zorgen dat de kralen van de zijkant van de buis komen.

Zodra de plaat is geïncubeerd met en vervolgens zonder te schudden, plaats je de plaat op de magnetische standaard en breng je 20 microliter van het supernatant over naar een helemaal nieuwe plaat genaamd de Bibliotheek Normalisatie Plaat, of LNP. Volg de bereiding van de normalisatiemix, met intermitterende inversie en vortexing van de oplossing, voeg je 45 microliter toe aan elk monster van de LNP. Gebruik vervolgens heldere kleeffilm om de plaat te verzegelen en schud je bij 1.800 RPM gedurende 30 minuten.

Na het wassen van de kralen, verwijder je de LNP van de magnetische standaard en om het monster te elueren, voeg je 30 microliter verse 0,1 normale natriumhydroxide toe aan elke put. Schud vervolgens de LNP bij 1.800 RMP gedurende vijf minuten. Plaats de LNP terug op de magnetische standaard en breng na het helder worden van het supernatant 30 microliter van de elutie over naar eerder voorbereide Bibliotheek Normalisatie Opslag Buffer 1 in de Opslag Plaat.

Buig de plaat naar beneden en voeg vervolgens vijf microliter van elk monster dat gesequenced zal worden toe aan een gelabelde Gepoolde Amplicon Bibliotheek, of PAL, 1,5 milliliter buis. Afhankelijk van welke sequencing chemie wordt gebruikt, voeg je vier tot 10 microliter van de PAL toe aan 590 tot 596 microliter Buffer HT1. Reinig en laad de Flow Cell.

Laad de reagentia. En volg de prompts op het scherm om de sequencing run te starten. Nadat de sequencing run is voltooid, voer je de Bioinformatica Pijplijn uit.

Analyseer de runstatistieken om ervoor te zorgen dat de gesequencede bibliotheek de door het lab vastgestelde kwaliteitscontrolemetrieken heeft doorstaan. Controleer ten slotte in een Genomische Gegevens Viewer handmatig elke variant door de BAM-bestanden te bekijken. Dit is een samenvatting van de belangrijkste runstatistieken, niet inclusief de gemiddelde dekking, die wordt gebruikt om te bepalen of een bibliotheek voorbereidingsmonster QC heeft doorstaan. Zoals hier te zien is voor Geval Een, heeft Bioinformatica vier rapporteerbare AML-geassocieerde mutaties gedetecteerd.

Een missense mutatie in