Name: Toepassing van de DNA-Specific Stain Methyl Groen in de Fluorescent Labeling van embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Leer fluorescente DNA-kleuring met methylgroen voor confocale microscopie van hele embryo's. Deze methode maakt diepe beeldvorming mogelijk dankzij fotobleekresistentie en vereenvoudigt kernvisualisatie in dik biologisch materiaal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Patxi Jaso bedanken voor de productie van de video, PEDECIBA en Agencia Nacional de Investigación e Innovación (ANII) voor de gedeeltelijke financiering.

1. Zuivering van de Dye <ol><li> Bereid een 4% oplossing van methyl green door oplossen van 0,4 g vlek poeder in 10 ml gedestilleerd water. Meng grondig tot volledig op te lossen. </li><li> Onder een rook-kap, meng het met minstens 2 delen van chloroform. Het is belangrijk om vooraf te controleren of de buizen chloroform resistent. </li><li> Meng goed en centrifugeer gedurende 1 min bij 2000 xg om fasescheiding te versnellen. </li><li> Na centrifugeren, een bovenste waterfase met methylgroen en een onderste organische fase met chloroform en de gebruikelijke verontreinigingen kristalviolet worden verkregen. </li><li> Herstellen van de bovenste fase en herhaal deze stap totdat onderste fase lijkt volledig verstoken van kristalviolet. </li><li> Aan het einde is de bovenste fase teruggewonnen en verdund in water tot een eindconcentratie van 2% methylgroen. Deze voorraad oplossing is op de werkbank maanden en niet behoeft te worden beschermd tegen licht. </li></ol><ol><li> Bevestig de embryo overnacht in 4% formaldehyde (van paraformaldehyde) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Opmerking: Dit kan duren van enkele uren tot gedurende de nacht, afhankelijk van de dikte van het embryo. In het voorbeeld, we vast 48 uur na de bevruchting (HPF) zebravis embryo&#39;s &#39;s nachts. </li><li> Was de embryo driemaal in PBS-T (1% Triton X-100 in PBS) gedurende 5 min. De verhoogde concentratie van wasmiddel permeabilizes de cuticula. </li><li> Bereid een 1: 5,000-1: 10,000 oplossing van methyl-groen (van 2% voorraad-oplossing) in PBS-T. De aanwezigheid van detergent tijdens de incubatie bruikbaar voor dikke monsters, zoals zebravis embryo&#39;s en larven. </li><li> Incubeer de embryo&#39;s in de oplossing gedurende tenminste 6 uur bij 4 ° C onder zachtjes wiegen. Ook de dikte van het embryo is de parameter ijken van de lengte van de incubatietijd. </li><li> Was de embryo&#39;s 3 times met PBS gedurende 30 min naar het detergens overmaat te verwijderen. Methyl groene fluorescentie alleen zichtbaar indien gebonden aan DNA, waardoor de achtergrond van het ongebonden moleculen verwaarloosbaar. </li><li> Mount op een opgegraven dia of een zelfgemaakte kamer met montage-oplossing (75% glycerol, 0,1 M Tris-HCl pH 8). Opmerking: Als de nucleaire kleuring wordt uitgevoerd na immunokleuring kan methylgroen worden opgenomen om de bevestiging oplossing vlak werkconcentratie, zonder de noodzaak om het weg te wassen. </li><li> Store gekoeld of onmiddellijk beginnen beeldvorming. Voer beeldvorming met een confocale laser scanning (of andere fluorescentie) microscoop met excitatie bij 633 nm en emissie filters instellen om te registreren bij 650-750 nm rekening houdend met dat methyl groene emissie haar maximum bereikt op 677 nm. LET OP: Wij bieden de gemeten gegevens van de methyl groene emissie profiel, in de acquisitie software worden geladen, als aanvullend materiaal. </li></ol> 3. Fluorescent Nuclear Staining van Whole kippenembryo&#39;s met Methyl Green <ol><li> Incubate bevruchte kippeneieren tot het stadium van belang. Bevestig de embryo overnacht in 4% formaldehyde (van paraformaldehyde) in PBS bij 4 ° C. Was embryo 3 maal in PBS-T gedurende 2 uur. </li><li> Bereid een 1: 5,000-1: 10,000 oplossing van methyl-groen (van 2% voorraad-oplossing) in PBS-T. Incubeer de embryo kleuroplossing overnacht bij 4 ° C. Was de embryo 3 maal in PBS, 1 uur elk. Mount in de kamer met 75% glycerol, 0,1 M Tris, pH 8. </li></ol> 4. Imaging fluorescent gelabelde kernen in Whole-gemonteerde embryo <ol><li> Bereid een imaging kamer door steken verschillende lagen van elektrische tape over een microscoop glijbaan en voorzichtig een gat in het met een scalpel om de embryo&#39;s binnen te plaatsen. Hiermee wordt voorkomen dat embryo&#39;s uit het verpletteren tijdens de beeldvorming. </li><li> Breng voorzichtig de embryo&#39;s naar de beeldvorming kamer en vult de kamer naar de bovenzijde met 75% glycerol, 0,1 M Tris-HCl, pH = 8 met eenleegte belvorming. </li><li> Dek af met een # 0 dekglaasje vermijden of elimineren medium overlopen. Verzegelt het met nagellak. </li><li> Acquire beelden van het monster op een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een 633 excitatiefilter of laser lijn. OPMERKING: Emissie filters moet de maximale uitstoot van 677 methyl groene dekken. </li></ol>

<ol><li>Klonisch, T., Wark, L., Hombach-Klonisch, S., Mai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+imaging+in+three+dimensions%3A+a+unique+tool+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+anatomy%22%5BJournal%5D)">Nuclear imaging in three dimensions: a unique tool in cancer research.</a> Annals of anatomy. 192 (5), 292-301 (2010).</li>
<li>Kapuscinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAPI%3A+a+DNA-specific+fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic%22%5BJournal%5D)">DAPI: a DNA-specific fluorescent probe.</a> Biotechnic. 70 (5), 220-233 (1995).</li>
<li>Latt, S. A., Stetten, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+studies+on+33258+Hoechst+and+related+bisbenzimidazole+dyes+useful+for+fluorescent+detection+of+deoxyribonucleic+acid+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Spectral studies on 33258 Hoechst and related bisbenzimidazole dyes useful for fluorescent detection of deoxyribonucleic acid synthesis.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry. 24 (1), 24-33 (1976).</li>
<li>Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TO-PRO-3+iodide%3A+a+novel+HeNe+laser-excitable+DNA+stain+as+an+alternative+for+propidium+iodide+in+multiparameter+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">TO-PRO-3 iodide: a novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry.</a> Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).</li>
<li>Beumer, T. L., Veenstra, G. J., Hage, W. J., Destrée, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+immunohistochemistry+on+Xenopus+embryos+using+far-red+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+genetics%22%5BJournal%5D)">Whole-mount immunohistochemistry on Xenopus embryos using far-red fluorescent dyes.</a> Trends in genetics. 11 (1), 9(1995).</li>
<li>Prieto, D., Aparicio, G., Morande, P. E., Zolessi, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast%2C+low+cost%2C+and+highly+efficient+fluorescent+DNA+labeling+method+using+methyl+green%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+cell+biology%22%5BJournal%5D)">A fast, low cost, and highly efficient fluorescent DNA labeling method using methyl green.</a> Histochemistry and cell biology. 142 (3), 335-345 (2014).</li>
<li>Kim, S. K., Nordén, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methyl+green.+A+DNA+major-groove+binding+drug%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Methyl green. A DNA major-groove binding drug.</a> FEBS letters. 315 (1), 61-64 (1993).</li>
<li>Nordén, B., Tjerneld, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+methyl+green+to+deoxyribonucleic+acid+analyzed+by+linear+dichroism%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Binding of methyl green to deoxyribonucleic acid analyzed by linear dichroism.</a> Chemical Physics Letters. 50 (3), 508-512 (1977).</li>
<li>Lyon, H., Jakobsen, P., Andersen, aP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+methyl+green-pyronin+Y+procedures+using+pure+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Histochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Standardized methyl green-pyronin Y procedures using pure dyes.</a> The Histochemical journal. 18 (2-3), 90-94 (1986).</li>
<li>Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+comprehensive+cell+lineage+reconstructions+in+complex+organisms+using+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">Towards comprehensive cell lineage reconstructions in complex organisms using light-sheet microscopy.</a> Development, growth & differentiation. 55 (4), 563-578 (2013).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+for+mapping+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature methods. 10 (6), 508-5013 (2013).</li>
<li>Lenz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+measurement+in+thick+tissue+layers+by+linear+or+nonlinear+long-wavelength+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Applied%22%5BJournal%5D)">Fluorescence measurement in thick tissue layers by linear or nonlinear long-wavelength excitation.</a> Applied. 38 (16), 3662-3669 (1999).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De progressieve ontwikkeling van microscopietechnieken in de afgelopen decennia, met een bijzondere focus op variaties van fluorescente microscopie, hebben geleid tot de mogelijkheid om de dynamica en structuur van intacte weefselmonsters te onderzoeken, inclusief hele embryo's10,11. Een grote beperking is echter geweest de beschikbaarheid van hoogwaardige fluoroforen die kunnen worden gebruikt om subcellulaire structuren direct en snel te kleuren.
De meest gebruikte fluorescente DN...

Fluorescent kleuring van DNA wordt veel en routinematig gebruikt, zowel in biologisch onderzoek als in klinische diagnostiek, hetzij voor de gedetailleerde studie van nucleaire en chromosomaal structuur, voor het tegenstempelen van weefsels en cellen, of voor het bestuderen van celcyclusparameters1. Hoewel er verschillende DNA-kleuringen beschikbaar zijn, zijn de meest gebruikte die opgewonden worden door UV-licht en blauw uitstralen, die passen in de gebruikelijke drie-filtersystemen die worden gebruikt in de meeste conventionele epifluorescentiemicroscopen wanneer gecombineerd met groen en oranje-rood uitstralende fluoroforen, zoals fluorescerende eiwitten of kleine moleculen die aan antilichamen zijn bevestigd. Onder deze blauw uitstralende DNA-kleuringen zijn DAPI en Hoechst minor groove-binding agents2,3 de meest voorkomende. Desondanks heeft de integratie van een breed scala aan laser emissielijnen en spectrale detectie in laserscanmicroscopen onderzoekers de mogelijkheid gegeven om te kiezen voor het gebruik van verre-rood uitstralende nucleaire kleuringen zoals propidiumjodide (PI) of TO-PRO 34. Een voordeel van deze kleuringen is dat ze het probleem van autofluorescentie overwinnen dat in veel cellen en weefsels wordt aangetroffen, met name in embryo's5, maar veel van hen hebben andere problemen zoals brede emissieprofielen of erg gevoelig zijn voor fotobleken6.
De Zwitserse onderzoeker Friedrich Miescher ontdekte DNA in 1869, waarbij hij het uit witte bloedcellen in pus extraheerde. Hij noemde het nucleine en toonde een paar jaar later aan dat het neerslagen vormde met de relatief nieuwe kleuring methylgroen. Methylgroen bestaat uit drie aniline ringen, met verschillende graden van methylering, en heeft twee positieve ladingen die het toelaten zich sterk te binden aan de grote groef van DNA7,8. DNA kleuring door methylgroen werd al vroeg als specifiek getoond, wat leidde tot de ontwikkeling door Unna en Pappenheim van een gecombineerde kleuring met pyronine, die specifiek RNA labelt. Methylgroen-pyronine is sindsdien uitgebreid gebruikt in routinematige histologische technieken9.
Tot voor kort was er heel weinig bekend over de fluorescente eigenschappen van methylgroen. Ons eerder werk heeft echter enkele van de spectrale voordelen van methylgroen onthuld6 zoals zijn excitatie bij 633 nm, een handige Stokes-shift, zijn emissie op het nabije-infraroodgedeelte van het elektromagnetische spectrum, hogere fotostabiliteit dan commercieel verkrijgbare DNA-kleuringen met vergelijkbare spectrale eigenschappen en tegen een zeer lage prijs. Dit is de reden waarom we besloten het te testen voor gebruik als een zeer hoog affiniteit en specifiek fluorescerend label voor DNA op embryonale weefsels en in hele embryo's. Bovendien werd methylgroen nucleaire kleuring tot nu toe uitgevoerd bij lage pH, waardoor het moeilijk was te combineren met antilichaamkleuring. Het doel van de hier gedetailleerde methode is om een protocol te hebben voor fluorescente nucleaire DNA-kleuring die het bovengenoemde ongemak overwint door de kleuringsprocedure uit te voeren bij fysiologische pH, waardoor het een geschikte tegenstempel voor immunolabeling op secties en hele weefsels wordt.

<table><tbody><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Methyl green</td><td>Dr. G. Grübler</td><td></td><td>Ook getest Sigma-Aldrich 323829, die vrij is van kristalviolet</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Laser scanning confocal microscopy Leica TCS-SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin&ndash;Tetramethylrhodamine B isothiocyanate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td> P1951&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>372978</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810 R</td><td>eppendorf</td><td>5811 000.010&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>microscope slides</td><td>Deltalab</td><td>D100004</td><td></td></tr><tr><td>cover slips</td><td>Esco optics</td><td>R525025</td><td></td></tr></tbody></table>

toepassing van de dna-specific stain methyl groen in de fluorescent labeling van embryo&#39;s

Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos

Methylgroen is al lang bekend als een histologische kleurstof met een specifieke affiniteit voor DNA, hoewel zijn fluorescerende eigenschappen tot voor kort onontdekt zijn gebleven. In dit artikel illustreren we de methode voor het bereiden van een methylgroen waterige stockoplossing, die wanneer verdund, kan worden gebruikt als een zeer handige fluorescente nucleaire marker voor gefixeerde cellen en weefsels. Eenvoudige procedures om hele zebravis en kikembryo's te labelen worden gedetailleerd beschreven, en voorbeelden van verkregen afbeeldingen worden getoond. Methylgroen wordt maximaal geëxciteerd door rood licht, op 633 nm, en zendt uit met een relatief scherp spectrum dat piekt bij 677 nm. Het is zeer goedkoop, niet-toxisch, zeer stabiel in oplossing en zeer resistent tegen fotobleking wanneer het aan DNA is gebonden. De rode emissie ervan maakt ongewijzigde hoog resolutie scannende confocale beeldvorming van kernen in dikke specimen mogelijk. Ten slotte is dit methylgroen kleuringsprotocol compatibel met andere celkleuringsprocedures, zoals antilichaammarkering, of actinofilamen markering met fluorofoor-geconjugeerd faloidine.

Nucleaire kleuring van dikke monsters. De hierin beschreven protocol maakt het bereiken van homogene kleuring van dieptestructuren gehele embryo. Ontwikkeling lens kernen vorm 48 HPF zebravis embryo homogeen aangeduid (figuur 1). Methylgroen DNA kleuring maakt onderscheid van celcyclus afhankelijke morfologische verschillen zoals de identificatie van mitotische figuren of apoptotische nuclei (figuur 2A). Subnucleaire structuren met een hoge resolutie zijn oo...

Een methode voor fluorescente kleuring van gefixeerd biologisch materiaal met het specifieke DNA-label methylgroen wordt beschreven. Methylgroen wordt gebruikt in een verdunde waterige oplossing en is zeer resistent tegen fotobleking. De verre-rode emissie ervan maakt diepe beeldvorming van monsters mogelijk, waardoor het bijzonder geschikt is voor hele embryo's.

Toepassing van de DNA-Specific Stain Methyl Groen in de Fluorescent Labeling van embryo&#39;s

Methyl green has long been known as a histological stain with a specific affinity for DNA, although its fluorescent properties have remained unexplored ...

In deze video laten we zien hoe de veelgebruikte histologische kleurstof methylgreen kan worden gebruikt als een uiterst handige kernlabeling bij fluorescentiemicroscopie, met specifieke toepassingen in laserconfocale microscopie van dikke biologische monsters, zoals volledige embryo's. Na een korte introductie van methylgreen als DNA-specifieke kleurstof, beschrijven we de methode voor het bereiden van stam- en werkoplossingen voor fluorescentiekleuring. Vervolgens tonen we de experimentele procedure om kernkleuring te bereiken en laten we verschillende visembryo's en voorbeelden van de verkregen confocale beelden zien.Ten slotte zullen de uitstekende fysisch-chemische eigenschappen van methylgroen worden gedemonstreerd en besproken. Freddy Misha ontdekte DNA in 1869 en toonde enkele jaren later aan dat het neerslagen vormde met een relatief nieuwe kleurstof, methylgroen. Methylgroen heeft twee positieve ladingen waardoor het sterk kan interageren met DNA in de grote groef, waarbij het bij voorkeur bindt aan AT-rijke regio's.Het meest uitgebreid gebruik van methylgroen was de combinatie in een nasale oplossing met RNA-kleurstof perine, een methylontwikkeling door UNA en Poppen Heim aan het begin van de 20e eeuw. Er is echter zeer weinig geanalyseerd over de fluorescentie-eigenschappen van methylgroen, en daarom hebben we besloten te testen of het gebruikt kan worden als een zeer specifiek fluorescent label met een hoge affiniteit voor DNA in cellen.Methylgroen is een methaan kleurstof met zeven methylgroepen. Deze zevende groep gaat gemakkelijk verloren, waardoor het terugkeert naar kristalviolet. Om deze reden wordt er een kleine hoeveelheid kristalviolet gemengd met methylgroen om kristalvorming te voorkomen.Een violette methylgroene oplossing kan worden gewassen met chloroform om kristalviolet te extraheren. Hiervoor bereiden we, zoals we direct zullen laten zien, een 4%ACU-oplossing in een zuurkast. We mengen deze met ten minste twee delen chloroform en centrifugeren het mengsel om de fasescheiding te versnellen.Na centrifugatie verkrijgen we een waterige fase met methylgroen en een onderste organische fase met chloroform en kristalviolet. We hebben de bovenste fase opgevangen en dit herhaald totdat de onderste fase helder oogt. Ten slotte wordt de bovenste fase opgevangen en verdund.Deze oplossing is maandenlang stabiel op de werkbank. Nu laten we zien hoe men verder gaat om de volledige MO in embryonale lagen te labelen met methyleengroen. Voor confocale microscopie gebruiken we de visembryo's met een hoge transplantatiegraad.Als voorbeeld: Verkrijg zebravisembryo's en was het residu weg met een zeef. Incubeer ze tot het gewenste stadium in aquariumwater of embryo-medium. Verwijder het corium met een fijne pincet en fixeer de embryo's gedurende enkele uren of een nacht in 4% formaldehyde.Was daarna de embryo's meerdere keren in PBST. Bereid een werkoplossing van methylgreen voor door de stamoplossing vijf tot 10.000 keer te verdunnen in PBST. Incubeer de embryo's in de oplossing gedurende ten minste drie uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 °C.In dit voorbeeld worden confocale beelden verkregen met een confocale microscoop uitgerust met spectrale detectoren. Maximale excitatie wordt bereikt met een laser van 633 nanometer en de detector is ingesteld op een breed bereik in het rode deel van het zichtbare spectrum.De emissie van methylgroen-rood maakt het mogelijk om kwalitatieve beeldvorming van kernen te verkrijgen, zelfs bij diepe monsters zoals hele embryo's, met een minimaal signaalverlies. Deze eerste reeks toont een retina van een zebravis waarvan de kernen zijn gekleurd met een gevestigde DNA-kleuring om pro three. Na één minuut zoomen we uit.Een ABL-scanregio wordt duidelijk wanneer we hetzelfde experiment uitvoeren met methylgroen, waarbij geen evidente bleaching wordt waargenomen. In de volgende serie tonen we representatieve resultaten van wat kan worden behaald met het hier beschreven protocol: een mitotische cel uit de epidermis van een zebravis waarin mitotische figuren kunnen worden waargenomen, en een IIC-kern uit hetzelfde specimen waarin de nucleaire architectuur te zien is.3D-reconstructie van een deel van een epidermale cel van een zebravislarve gelabeld met methylgroen amalin; een panoramisch overzicht van verschillende kernvormen binnen een retina van een 48 uur postfertilisatie zebravis. We hebben hier een eenvoudige manier getoond voor het bereiden van een uiterst goedkope fluorescerende DNA-kleuring die kan worden gebruikt voor kernlabeling. Hoewel we dit slechts als voorbeeld tonen, zijn er verschillende mogelijkheden. Deze techniek kan worden toegepast op embryo's of weefsels, zowel via whole mount als in coupes.Het kan ook worden gebruikt voor DNA-kleuring in gelen en voor DNA-bepaling in oplossing met behulp van fotometrie.

application-dna-specific-stain-methyl-green-fluorescent-labeling

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Met behulp van Whole Mount In situ Hybridisatie aan Moleculaire Biologie en organismale Link

We een techniek voor etikettering enkele neuronen in het centrale zenuwstelsel (CNS)...

Labeling van afzonderlijke cellen in het centrale zenuwstelsel van<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We beschrijven een aantal methoden om kleurstoffen injecteren van DNA vectoren, virussen en cellen om zowel cellot en fenotype van endogene en geënte cellen uit embryonale of pluripotente cellen in muizenembryo's op embryonale dag (E) 9,5 en latere stadia bewaken ontwikkeling.

Cell Labeling en Injectie in ontwikkelingslanden Embryonale Mouse Hearts

Het Xenopus laevis-embryo blijft uiterst nuttig in de studie van vroege ontwikkeling vanwege zijn grote omvang en gemakkelijke manipulatie.   Er wordt een vereenvoudigd protocol voor volledige montage in situ hybridisatie gegeven dat kan worden gebruikt bij de identificatie van specifieke organen in dit modelsysteem.

Inzicht in de vroege organogenese Met behulp van een vereenvoudigd<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie Protocol in<em&gt; Xenopus</em

Introductie van kleine moleculen de ontwikkeling Drosophila embryo grote mogelijkheden voor het karakteriseren van biologische activiteit van nieuwe verbindingen, geneesmiddelen en toxinen en het tasten fundamentele ontwikkelingspaden. Werkwijzen hierin beschreven schetsen stappen natuurlijke barrières deze benadering overwonnen, het uitbreiden van de bruikbaarheid van de Drosophila embryo model.

Een methode van permeabilisatie van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s voor Testen van Small Molecule Activiteit

Wij rapporteren hier de robuuste en efficiënte expressie van fluorescerende eiwitten na mRNA injectie in onbevruchte eicellen van Branchiostoma lanceolatum. De ontwikkeling van de micro-injectie techniek in deze basale chordate zal de weg voor vergaande technische innovaties in deze opkomende model systeem, met inbegrip van in vivo beeldvorming en gen-specifieke manipulaties effenen.

Expressie van fluorescerende eiwitten in Branchiostoma lanceolatum Door mRNA Injectie in onbevruchte eicellen

We beschrijven een multi-target chromogene whole-mount in situ hybridisatie (MC-WISH) procedure in intacte Drosophila embryo's toestaan ​​gelijktijdige en specifieke detectie van drie verschillende mRNA distributie patronen door contrasterende kleur neerslagen.

Multi-target Chromogene Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie voor het vergelijken van genexpressie Domeinen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo

Afbeelden van de morfogenese van insecten embryo met licht-sheet based fluorescentiemicroscopie is state of the art worden. Dit protocol beschrijft en vergelijkt drie montagetechnieken geschikt voor Tribolium castaneum embryo, worden twee nieuwe op maat gemaakte transgene lijnen geschikt voor levende imaging bespreekt essentiële kwaliteitscontroles en geeft de huidige experimentele beperkingen.

Light-Sheet gebaseerd fluorescentiemicroscopie van de levens- of gefixeerd en gekleurd<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embryo&#39;s

Het protocol beschrijft specifieke etikettering van mitochondriale nucleoïden met een commercieel verkrijgbare DNA-gel vlek, verwerving van time lapse-serie van live gelabelde cellen door super-resolutie gestructureerde verlichting microscopie (SR-SIM), en automatische tracking van nucleoïde beweging.

Specifieke etikettering van Mitochondriale nucleoïden voor time-lapse Structured Illumination Microscopie

In het vroege Drosophila-embryo zijn veel organellen beweeglijk. In principe kunnen ze live worden afgebeeld via specifieke fluorescerende sondes, maar de eierschaal voorkomt directe toepassing op het embryo. Dit protocol beschrijft hoe dergelijke sondes via micro-injectie kunnen worden geïntroduceerd en vervolgens bulk organelbeweging kan worden geanalyseerd via deeltjesbeeld velocimetrie.

Visualisatie van cytoskeletafhankelijke handel in lipidenbevattende organellen in drosophila-embryo's

We beschrijven methoden om beginnende transcriptie te visualiseren tijdens de activatie van het zygotische genoom in individuele cellen tijdens de vroege embryogenese.

Visualisering van activatie van het zygotische genoom in individuele cellen van vroege embryo's

Leer fluorescente DNA-kleuring met methylgroen voor confocale microscopie van hele embryo's. Deze methode maakt diepe beeldvorming mogelijk dankzij fotobleekresistentie en vereenvoudigt kernvisualisatie in dik biologisch materiaal.

Toepassing van de DNA-Specific Stain Methyl Groen in de Fluorescent Labeling van embryo's

Meer video's verkennen