Toepassing van de DNA-Specific Stain Methyl Groen in de Fluorescent Labeling van embryo's
2 mei 2015
Een methode voor fluorescente kleuring van gefixeerd biologisch materiaal met het specifieke DNA-label methylgroen wordt beschreven. Methylgroen wordt gebruikt in een verdunde waterige oplossing en is zeer resistent tegen fotobleking. De verre-rode emissie ervan maakt diepe beeldvorming van monsters mogelijk, waardoor het bijzonder geschikt is voor hele embryo's.
In deze video zullen we laten zien hoe de zeer gebruikelijke histologische kleurstof methylgroen kan worden gebruikt als een uiterst handige nucleaire label in fluorescentiemicroscopie met speciale toepassingen in laser confocale microscopie van dikke biologische specimens zoals hele embryo's. Na een korte introductie van methylgroen als een DNA-specifieke kleurstof, zullen we de methode beschrijven voor het bereiden van stock- en werkoplossingen voor fluorescentiekleuring. Vervolgens zullen we de experimentele procedure tonen om nucleaire kleuring te bereiken en houden verschillende vis-embryo's en voorbeelden van confocale beelden die zijn verkregen.
Ten slotte zullen de uitstekende fysisch-chemische eigenschappen van methylgroen worden gedemonstreerd en besproken. Freddy Misha ontdekte DNA in 1869 en toonde enkele jaren later aan dat het neerslagen vormde met een relatief nieuwe annal en kleurstof methylgroen. Methylgroen heeft twee positieve ladingen die het mogelijk maken om sterk te interageren met DNA op zijn belangrijkste groep, waarbij het bij voorkeur bindt aan regio's met hoge dichtheid.
Het meest uitgebreide gebruik van methylgroen is geweest in combinatie in een nasaal oplossing met RNA-kleurstof perine, een methyl ontwikkeld door UNA en Poppen Heim aan het begin van de 20e eeuw. Er is echter heel weinig geanalyseerd over de fluorescentie-eigenschappen van methylgroen, en dit is de reden waarom we besloten om te testen op de mogelijkheid dat het zou kunnen worden gebruikt als een zeer hoog affiniteits- en specifiek fluorescentielabel. Voor DNA op cellen.
Methylgroen is een al methaan-kleurstof met zeven methylwortels. Deze zevende groep gaat gemakkelijk verloren en het di-keer terug naar kristalviolet. Om deze reden is er een aanwezige hoeveelheid kristalviolet gemengd met methylgroen om kristal te verwijderen.
Violent methylgroen oplossing kan worden gewassen met chloroform om kristalviolet te extraheren. Zoals we onmiddellijk zullen laten zien voor dit doel, bereiden we 4% ACU-oplossing voor onder een afzuigkap. We mengen het met ten minste twee delen chloroform en centrifugeren om fasescheiding te versnellen.
Na centrifugatie verkrijgen we een waterige fase met methylgroen en een lagere organische fase met chloroform en kristalviolet. We herstellen de bovenste fase en herhalen dit totdat de onderste fase helder lijkt. Aan het eind wordt de bovenste fase hersteld en verdund.
Deze oplossing is stabiel op de werkbank voor maanden. Nu zullen we laten zien hoe te procederen om hele MO in embryo's laag met meth groen te kleuren. Voor confocale microscopie zullen we het hoge transplantaten vis-embryo gebruiken.
Als voorbeeld, verkrijg zebravis-embryo's en was het puin weg met een zeef. Incubeer ze tot het gewenste stadium in vistankwater of embryomedium. Verwijder het corium met fijne pincetten, fixeer de embryo's in 4% formaldehyde voor een paar uur of een nacht.
Was vervolgens de embryo's in PBST meerdere keren. Bereid een werkoplossing van methylgroen door de stockoplossing vijf tot 10.000 keer te verdunnen in PBST. Incubeer de embryo's in de oplossing gedurende ten minste drie uur op kamertemperatuur of een nacht van vier graden Celsius.
In dit voorbeeld zullen confocale beelden worden verkregen in een minder confocale microscoop met spectrale detectoren. Maximale excitatie wordt bereikt met een 633 nanometer laser en de detector is ingesteld op een breed bereik. In het rode gebied van het zichtbare spectrum.
Methylgroen rood emissie maakt het mogelijk om goede kwaliteit nucleaire beeldvorming te krijgen, zelfs van diepe specimens zoals hele embryo's met een minimale signaalverlies. Deze eerste serie toont een zebravisretina waarvan de kernen zijn gekleurd met een goed gevestigde DNA-kleurstof om pro drie te zijn. Na een minuut zoomen we uit.
Een ABL-scanregio wordt duidelijk wanneer we hetzelfde experiment met methylgroen uitvoeren, geen duidelijk bleken wordt gezien. In de volgende serie tonen we representatieve resultaten van wat kan worden verkregen met behulp van het hier beschreven protocol, mitotische cellen van zebravis-epidermis waarin mitotische figuren kunnen worden waargenomen. IIC-kern van hetzelfde specimen waar de nucleaire architectuur kan worden gezien.
3D-reconstructie van een deel van een zebravis-larven-epidermale cel gelabeld met methylgroen amalin, een meer panoramische weergave van verschillende nucleaire vormen binnen een 48 uur na bevruchting, zilvervis, br-retina. We hebben hier een eenvoudige manier getoond om een extreem goedkope fluorescente DNA-kleurstof te bereiden die kan worden gebruikt in nucleaire label, hoewel we net als voorbeeld, de van houden verschillende. Deze techniek kan worden toegepast op uw embryo's of weefsels, hetzij volledige montage of sectioneel.
Het kan ook worden gebruikt voor DNA-kleuring in gels en voor DNA-bepaling in oplossing met behulp van fotometrie.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor fluorescente kleuring van gefixeerd biologisch materiaal met behulp van methylgroen, een DNA-specifieke marker. De far-red emissie van methylgroen maakt diepe beeldvorming van specimens mogelijk, waardoor het geschikt is voor gehele embryo's.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Fluorescentiemicroscopie
- Histologische kleuring
- Biologische beeldvorming
Achtergrond
- Methylgroen is een veelgebruikte histologische kleurstof.
- Het reageert sterk met DNA, waarbij het bij voorkeur bindt aan AT-rijke regio's.
- Het werd ontdekt in de context van DNA-onderzoek aan het eind van de 19e eeuw.
- De kleurstof is bestand tegen fotobleking, wat het nut ervan in de microscopie vergroot.
Doel van de studie
- Om het gebruik van methylgroen als kernlabel in fluorescentiemicroscopie te demonstreren.
- Om een methode te bieden voor het bereiden van stam- en werkoplossingen voor kleuring.
- Om confocale beeldvorming van dikke biologische monsters te presenteren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van stok- en werkoplossingen van methylgroen.
- Fluorescente kleuring van gefixeerd biologisch materiaal.
- Toepassing van laserconfocale microscopie.
- Beeldvorming van hele embryo's en analyse van confocale beelden.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kernkleuring van visembryo's met behulp van methylgroen.
- Demonstratie van uitstekende beeldvormingsmogelijkheden dankzij de eigenschappen van methylgroen.
- De verkregen confocale beelden tonen een duidelijke kernlabeling.
- De resistentie van methylgroen tegen fotobleken is bevestigd.
Conclusies
- Methylgroen is een effectieve kernmarker voor fluorescentiemicroscopie.
- De eigenschappen ervan maken het geschikt voor het beelden van dikke biologische monsters.
- De methode kan worden toegepast in diverse biologische onderzoekcontexten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Fluorescente nucleaire labeling met methylgroen maakt hoge-resolutie imaging van kernen in dikke biologische monsters mogelijk, wat vroege ontdekkings- en targetvalidatieworkflows ondersteunt. De stabiliteit, specificiteit voor DNA en compatibiliteit met confocale microscopie bieden voorspellend vertrouwen voor analyses op cellulair en weefselniveau. Deze mogelijkheid verbetert de besluitvorming over de portfolio door robuuste, reproduceerbare imaging in complexe modelsystemen mogelijk te maken.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Faciliteert nauwkeurige nucleaire visualisatie voor hypothese-gestuurde studies in gefixeerde cellen en weefsels.
- Ondersteunt functionele target-validatie door een duidelijke identificatie van de nucleaire architectuur mogelijk te maken.
- Vermindert mechanistische ambiguïteit in cellulaire modellen door middel van DNA-specifieke labeling.
- Maakt een betrouwbare triage van kandidaat-targets mogelijk op basis van high-fidelity imaging-gegevens.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Bereidt gevalideerde biologische systemen voor voor downstream high-content imaging workflows.
- Levert reproduceerbare, kwantitatieve kernlabeling die essentieel is voor assay-standaardisatie.
- Ondersteunt schaalbaarheid en hergebruik van het platform dankzij de stabiliteit en lage kosten van methylgroen.
- Maakt betrouwbare evaluatie van verbindingen mogelijk door fotobleken en signaalverlies te minimaliseren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelevante modelsystemen door beeldvorming in volledige embryo's en dikke weefsels mogelijk te maken.
- Behoudt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie met robuuste kernlabeling.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde voortgang door consistente beeldvormingsresultaten over verschillende modellen te leveren.
- Verbetert voorspellende risicoreductie door compatibiliteit met multiplex-kleuringsprotocollen.
Integratie van pipeline en workflow
Methylgroene fluorescente labeling is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege hypothesetesten tot preklinische beeldvorming, ter ondersteuning van workflows die robuuste kernvisualisatie in complexe monsters vereisen.
- Discovery Biology: Maakt hypothesetesting en pathway-verduidelijking mogelijk via DNA-specifieke nucleaire beeldvorming.
- Screening: Biedt assay-klare, reproduceerbare nucleaire labeling voor high-content screeningplatforms.
- Analytics: Levert kwantitatieve, fotostabiele read-outs voor vergelijkende analyse van cellulaire condities.
- Translationeel Onderzoek: Ondersteunt biomarker-afstemming en continuïteit in ziekterelateerde modellen.
- Enterprise Hergebruik: Biedt een stabiele, kosteneffectieve labelingsoplossing die aanpasbaar is voor diverse R&D-programma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert ambiguïteit bij nucleaire beeldvorming.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid in beeldvormingsworkflows.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door het mogelijk maken van robuuste datageneratie.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde prioritering en de voortgang van ontdekkingsprogramma's.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in confocale microscopie en fluorescentie-imagingtechnieken.
- Toegang tot spectrale detectoren en compatibele laser-excitatiebronnen (bijv. 633 nm) is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie van kleurings- en imagingprotocollen tussen teams voor reproduceerbaarheid.
- Aanpasbaar aan diverse gefixeerde modelsystemen, waaronder hele embryo's en weefselcoupes.
- Beperkt tot gefixeerde monsters; niet geschikt voor nuclear imaging van levende cellen.
