Name: Whole-dierlijke Imaging en Flowcytometrische technieken voor analyse van antigeen-specifieke CD8 + T cel reacties na Nanoparticle Vaccinatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Leer de synthese en karakterisering van lipide-gebaseerde vaccinnanodeeltjes om antigeen-specifieke CD8+ T-celuitbreiding in muizen te beoordelen met behulp van beeldvorming en flowcytometrie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door het National Institute of Health verlenen 1K22AI097291-01 en door het National Center for Advancing Translationeel Wetenschappen van de National Institutes of Health onder Award Number UL1TR000433. We hebben ook erkennen Prof. Darrell Irvine aan het MIT en Prof. Matthias Stephan bij Fred Hutchinson Cancer Center voor hun bijdrage aan de eerste werkzaamheden op het vaccin nanodeeltjes en OT-I / Luc transgene muizen.

Alle experimenten beschreven in dit protocol werden goedgekeurd door de Universiteit Comité voor gebruik en onderhoud van Dieren (UCUCA) aan de Universiteit van Michigan en uitgevoerd volgens het vastgestelde beleid en richtlijnen. 1. Synthese en karakterisering van ICMVs Co-geladen met eiwitantigeen en Adjuvant Moleculen <ol><li> Meng 1: 1 molaire verhouding van 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC) en 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N - [4- (p -maleimidophenyl) boterzuuramide] (MPB) in chloroform, waarbij het ​​totale lipide bedrag 1,26 umol per batch (dwz 500 ug DOPC en 630 ug MPB) in een 20 ml glazen flesje (diameter = 28 mm en hoogte = 61 mm). </li><li> Voeg lipofiele geneesmiddelen, zoals monofosforyllipide A (MPLA) of lipofiele kleurstoffen (bijvoorbeeld deed), aan de lipide oplossing gewenste concentratie. Grondig verwijder het organische oplosmiddel door spoelen met extra droge nitrogen gas en het plaatsen van de monsters onder vacuüm O / N. </li><li> Hydrateren lipide film door toevoeging van 200 ui 10 mM bis-tris-propaan (BTP, pH 7,0) bevattende wateroplosbare geneesmiddelen (bijv eiwitantigenen). Vortex gedurende 10 sec elke 10 min gedurende 1 uur bij KT. </li><li> Breng de inhoud van de glazen flacon in een 1,5 ml microcentrifugebuis, plaats monsters in een ijs-waterbad en ultrasone trillingen continu gedurende 5 minuten met behulp van de intensiteit van 40% instelling op een 125 W / 20 kHz probe-tip sonicator. </li><li> Voeg 4 pi van 150 mM dithiothreitol (DTT) aan elke batch (werkconcentratie 2,4 mM), vortex en kort met een tafelblad centrifuge microcentrifuge. </li><li> Voeg 40 ul van 200 mM CaCl 2 en meng met de pipet (werkconcentratie 33 mM). Incubeer de monsters bij 37 ° C gedurende 1 uur tot verknoping van MPB-bevattende lipide lagen met DTT toe. </li><li> Centrifugeer de monsters bij 20.000 xg gedurende 15 minuten, verwijder het supernatant en resuspendeer in 200 ul van ddiH 2 O. </li><li> Herhaal stap 1.7 en centrifuge opnieuw na de tweede ddiH 2 O wassen om CaCl2, gereageerde DTT en ingekapseld lading materialen te verwijderen uit het bovenstaande. </li><li> Bereid 10 mg / ml 2 kDa polyethyleenglycol-thiol (PEG-SH) in ddiH 2 O. Resuspendeer elk ICMV monster in 100 pl PEG-SH-oplossing en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min. </li><li> Voer twee ddiH 2 O wassen (stap 1.7) en resuspendeer de laatste ICMV pellet in PBS en bewaar bij 4 ° C. Voor gebruik meng de ICMV suspensie, als deeltjes naar de bodem na langdurige opslag. </li><li> Voor de karakterisering van deeltjes verwijdert een kleine hoeveelheid (~ 10%) van ICMVs uit elke partij en verdun afzonderlijk in een totaal volume van 1 ml ddiH 2 O. Plaats een enkel monster in een Zetasizer en meet deeltjesgrootte polydispersiteit index en zeta potentiaal van de monsters met een DLS en zeta potentiaal meetsysteem (volgens het protocol van de fabrikant). </li></ol> 2. Onderzoek van lymfkliertest Aftappen van fluorescentie-gelabeld ICMVs met confocale microscopie <ol><li> Bereiding van ICMVs geladen met fluorofoor-gelabelde antigen en lipofiele fluorescente kleurstof <ol><li> Bereid fluorofoor-gelabeld eiwit, zoals ovalbumine omgezet met Alexa Fluor 555-succinimidyl ester, volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Om ICMVs gelabeld met fluorofoor in de lipide schaal bereiden, voeg lipofiele fluorescente kleurstof (bijvoorbeeld, 1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3 &#39;, 3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine, (DID)) tijdens de bereiding van de lipide film (Step 1,2) en 0,05% mol lipide bedrag. Voor lipide film hydratatie (stap 1,3), gebruik buffer bevattende fluorofoor-gelabelde antigen, en volledig ICMV synthese zoals beschreven in stappen 1,4-1,11. </li></ol></li><li> Subcutane toediening van nanodeeltjes op de staart basis <ol><li> Verdoven muis met behulp van een gecontroleerde stroom verdamper voorzien van een inductie kamer utilizing 3% isofluraan en 1,5 l / min zuurstof stroom volgens een erkende IACUC dier protocol. Zodra de muis onbewust, de volgende stappen snel voorafgaande aan de narcose dragen buiten naar optimale toegang tot de plaats van de injectie mogelijk te maken en ongemak voor het dier. Alternatief, gebruik dan een goede montage neuskegel anesthesie te onderhouden. Indien muizen worden verdoofd langer dan 5 minuten, de ogen smeermiddel noodzakelijk irritatie te voorkomen na de procedure. </li><li> Spuit de basis van de staart met 70% ethanol te zuiveren en bevochtig het pelsdeel het natte haar een klein stukje zichtbare huid, die kan worden gebruikt om de naald onder de huid zichtbaar bloot. </li><li> Bereid injecteren van partikels suspensie die gewenste hoeveelheid antigeen en adjuvans per 100 gl vaccinatiedosis in PBS (bijvoorbeeld 10 ug OVA en 0,3 pg MPLA per 100 gl injectiedosis werd in het verleden 6,9). </li><li> Teken het deeltje schorsing into een spuit met een 27-29 G naald en breng de naald in de basis van de staart (~ 5 mm van de haarlijn) met de schuine naar boven en injecteer 50 pl van de deeltjessuspensie 22. </li><li> Wacht een paar seconden voor de druk gelijk aan overmatige back-flow te voorkomen en trek de naald uit. Herhaal de injectie aan de andere zijde van de staartbasis zowel aftappen inguïnale LNS richten. </li></ol></li><li> Voorbereiding van de lymfeklieren cryosecties en onderzoek met confocale microscopie. <ol><li> Euthanaseren de muis met CO 2 stikken, gevolgd door geïnduceerde pneumothorax volgens een IACUC goedgekeurd dier protocol. Extract inguïnale LNS volgens proefopzet aangetoond Bedoya 23 en was het bloed door het plaatsen van de weefsels in 1 ml 4 ° C PBS. </li><li> Absorberen de PBS uit de weefsels met weefsels en plaats weefsel in weefsel cryomolds (10 x 10 x 5 mm 3) voorgevulde naar de top met oktober bevriezing medium 24. Snap bevriezen de tissue blok in vloeibare stikstof voor 30 sec. Als alternatief, plaats weefsel blok op droog ijs gedurende 30 min. Bewaar ingevroren weefsel in -80 ° C vriezer. </li><li> Knip weefselcoupes 5-10 pm dik in een cryostaat ingesteld op -20 ° C 24. </li><li> Indien nodig, voeren immunofluorescentie etikettering, en onderzoekt de weefsel met confocale microscopie als eerder aangetoond 24. </li></ol></li></ol> 3. Controle Uitbreiding van antigeen-specifieke, Luciferase-expressie CD8 + T-cellen na vaccinatie met gehele nanodeeltjes Animal Imaging <ol><li> Isolatie van OVA-specifieke 257-264, luciferase-expressie CD8 + T-cellen van OT-I / Luc transgene muizen <ol><li> Euthanaseren een OT-I / Luc transgene muis met CO 2 stikken en leiden tot een pneumothorax volgens een IACUC goedgekeurd dier protocol. Oogst de milt op een steriele wijze door naar de peritoneale holte en zorgvuldig losmaken van het weefsel van de alvleesklier 23 enplace in 5 ml 4 ° C PBS + 2% FBS voor overdracht naar weefselkweek kap. </li><li> Plaats de milt op een 70 micrometer nylon zeef over een 50 ml conische centrifugebuis (tot 3 milt tegelijk). Met behulp van een zuiger van een injectiespuit 3 ml, slijpen de cellen door de zeef. </li><li> Was de zuiger en de zeef met PBS + 2% FBS en gooi. Breng het totale volume op 10 ml / milt in de 50 ml buis, neem een ​​monster van de celsuspensie te tellen met een hemocytometer en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g. </li><li> Met behulp van een commercieel verkrijgbare kit magnetische negatieve selectie, isoleer het CD8 + T-celpopulatie volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Na wassen cellen met PBS, tel het aantal geïsoleerde CD8 + T-cellen. Om de zuiverheid van de geïsoleerde CD8 + T-cellen bepalen, incubeer ~ 20.000-30.000 cellen in 20 ul van muis CD16 / 32 antilichaam (0,025 mg / ml) gedurende 10 min en voeg 20 ul van αCD8-APC antilichamen (0,005 mg / ml) en incubeer 30 min. Perform alle incubaties bij 4 ° C in PBS + 1% w / v BSA. Voer flowcytometrische analyse 25. </li></ol></li><li> Adoptieve overdracht van geïsoleerde CD8 + T-cellen en visualisatie van hun expansie na vaccinatie <ol><li> Voer adoptieve overdracht van geïsoleerde OT-I / Luc CD8 + T cellen in naïeve C57BL / 6 muizen door toedienen van 1-10 x 10 5 cellen in 200 ul volume PBS via intraveneuze injectie in de staartader 22 (dag -1). Gezien het feit dat bont en zwarte vlekken op de huid in C57BL / 6 muizen kunnen interfereren met de lichtgevende signaal, geschoren albino C57BL / 6 muizen zijn ideaal voor deze studies. </li><li> Na een dag (dag 0), het beheer van het vaccin zoals eerder beschreven (paragraaf 2.2). </li><li> Dien 150 mg per kg muis luciferine lichaamsgewicht intraperitoneaal in een 300 ui volume van PBS. Na 10 min, verdoven de muizen met isofluraan (zoals in stap 2.2.1) en visualiseren OT-I / Luc CD8 + T-cellen door het verwerven van de bioluminescentie signaal voor 5-10 min wet een hele dier imaging-systeem (IVIS, zie Wilson 26 voor gedetailleerde instructies). Herhaal als nodig is voor longitudinale studies. </li></ol></li></ol> 4. Peptide-MHC tetrameer kleuring van PBMC voor analyse van antigeen-specifieke CD8 + T-cellen Opmerking: Het volgende protocol procedure kan worden uitgevoerd op basis van C57BL / 6-muizen adoptief overgedragen met OT-I / Luc CD8 + T cellen of C57BL / 6 muizen zonder de adoptieve overdracht. <ol><li> Op een gewenst tijdstip na vaccinatie verzamel ongeveer 100 pl bloed (4-6 druppels) van muizen via submandibular bloeden techniek 27 in een buis bekleed met K 2 EDTA en keer herhaaldelijk om stolling te voorkomen. </li><li> Breng 100 pi van bloed naar een microcentrifuge buis, voeg 1 ml lysisbuffer, en incubeer gedurende 2-3 minuten om rode bloedcellen (RBCs) te verwijderen. Centrifuge monsters gedurende 5 minuten bij 1500 xg en verwijder het supernatant. Indien de pellet nogppears rood (met vermelding van onvolledige verwijdering van RBC), herhaal de lysis stap met een korte incubatie (&lt;1 min) van lysisbuffer. </li><li> Was de resterende PBMCs met 1 ml FACS-buffer (PBS + 1% w / v BSA) en centrifugeer bij 1500 xg gedurende 5 min. </li><li> Zuig het supernatant en resuspendeer de sample in 20 gl muis CD16 / 32 antilichaam (0,025 mg / ml) om niet-specifieke en FcR bemiddelde antilichaam blokkeert binding. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Transfer cellen van microcentrifugebuisjes in 4 ml ronde bodem FACS buizen. Voeg 20 ul van H-2Kb OVA tetrameer-PE SIINFEKL-oplossing volgens de specificaties van de fabrikant aan elk monster en incubeer gedurende 30 minuten op ijs. </li><li> Bereid de antilichaam cocktail (bv αCD8-APC, αCD44-FITC en αCD62L-PECy7 antilichamen (0,005, 0,005 en 0,002 mg / ml concentratie, respectievelijk)). Voeg 20 ul aan elk experimenteel monster en incubeer gedurende 20 minuten op ijs. Bereid enkele fluorofoor controles door laBeling cellen met elk fluorofoor gelabeld tetrameer of antilichaam op het hierboven aangegeven concentratie. </li><li> Was 2 maal met FACS-buffer en resuspendeer de uiteindelijke pellet in FACS buffer die 2 ug / ml DAPI. De cellen zijn nu gereed voor flowcytometrie-analyse (gegevens en voorbeelden zijn te vinden in Scheffold 25). </li></ol>

Perkin Elmer mits de productie gemaakte kosten tijdens de publicatie van dit artikel.

Het protocol in dit artikel beschrijft de synthese en karakterisering van een nieuwe lipide-gebaseerde nanodeeltjes systeem, genaamd ICMVs en geeft het proces valideren doeltreffendheid van nanodeeltjes gebaseerde vaccinpreparaten antigeen-specifieke CD8 + T-cel responsen te induceren. ICMV synthese in elke waterige toestand, hetgeen een belangrijk voordeel ten opzichte van andere gebruikelijke polymere nanodeeltjes systemen (bijvoorbeeld poly (lactide-co-glycolide) zuurdeeltjes), die typisch vereist organische...

Traditionele ontwikkeling vaccin is vooral in dienst van de empirische benadering van trial-and-error. Echter, met de recente ontwikkeling van een breed scala van biomaterialen en de ontdekking van moleculaire determinanten van immuunactivatie is het nu mogelijk om rationeel ontwerpen vaccinformuleringen met biofysische en biochemische signalen afkomstig van pathogenen 1,2. In het bijzonder hebben verschillende deeltjes drug delivery platforms onderzocht als vaccin dragers als ze kunnen samen worden geladen met subunit antigenen en immuunstimulerende middelen, vaccin componenten te beschermen tegen afbraak, en het vergroten van hun co-levering aan antigen presenterende cellen (APC&#39;s) die in lymfe nodes (LNS), waardoor het maximaliseren immuunstimulatie en activering 3-5. In dit rapport beschrijven we de synthese van een &quot;pathogeen-nabootsen&quot; nanodeeltjes systeem, genaamd interbilayer-verknoopt multilamellaire blaasjes (ICMVs), die al eerder hebben aangetoond als een krachtige vaccin platform voor uitlokken van krachtige cytotoxische T lymfocyt (CTL) en humorale immuunresponsen bij zowel systemische als mucosale weefselcompartimenten 6-9. In het bijzonder, de gerealiseerde vaccinatie met ICMVs aanzienlijk serum IgG niveaus versterkt tegen een malaria-antigeen, in vergelijking met vaccinatie met conventionele adjuvantia (bijvoorbeeld, aluin en Montanide) 7 en ook opgewekt potente CTL-responsen tegen tumorcellen en virale uitdaging modellen in muizen 9. Hier, met behulp van ICMVs als model vaccin nanodeeltje systeem beschrijven we methoden voor de karakterisering van het vaccin nano-formuleringen, met inbegrip van de deeltjesgrootte en zetapotentiaal metingen en het bijhouden van de deeltjes mensenhandel aftappen LNS (DLNS) gebruik te maken van confocale beeldvorming van cryosectioned weefsels 7. Bovendien presenteren we een hele dier imaging-gebaseerde werkwijze voor het analyseren expansie van CTL-responsen bij muizen na adoptieve overdracht van luciferase-expressie antigeenspecifieke CD8 + T-cellen 9,10. Ten slotte hebben we deschrijver tetrameer kleuring van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) voor longitudinaal kwantificatie van endogene T cel responsen in muizen gevaccineerd met nanodeeltjes 6,9. ICMVs zijn een lipide-gebaseerde nanopartikelformulering gesynthetiseerd door gecontroleerde fusie van eenvoudige liposomen in multilamellaire structuren, die vervolgens chemisch worden gestabiliseerd door verknoping-maleïmide gefunctionaliseerde fosfolipide kopgroepen binnen lipide lagen met dithiol crosslinkers 6. Zodra ICMVs worden gesynthetiseerd, kan een klein deel van nanodeeltjes worden gebruikt om deeltjesgrootte en zeta potentiaal (bijv oppervlaktelading van de deeltjes) met dynamische lichtverstrooiing (DLS) systeem en een zeta potentiaal analyzer bepaald. DLS maatregelen veranderingen in de lichtverstrooiing in deeltjessuspensies, waardoor de bepaling van de diffusiecoëfficiënt en de hydrodynamische grootte van de deeltjes 11. Het bereiken van consistente deeltjesgrootte van partij tot partij synthese is van cruciaal belangaangezien deeltjesgrootte een van de belangrijkste factoren die van invloed lymfatische drainage vaccin deeltjes DLN en daaropvolgende cellulaire opname door APCs 12,13. Bovendien kan zeta potentiaal worden verkregen door meting van de deeltjessnelheid bij een elektrische stroom wordt aangelegd, met behulp waarvan de elektroforetische mobiliteit van deeltjes en deeltjes oppervlaktelading 11 toelaat. Consistente zeta potentieel waarden van de deeltjes is belangrijk omdat oppervlakte lading van de deeltjes bepaalt colloïdale stabiliteit, die een directe impact op deeltjesdispersie tijdens opslag en na de in vivo toediening 14,15 heeft. Om het deeltje lokalisatie DLN&#39;s volgen, kan ICMVs met de gewenste fluoroforen zoals lipofiele kleurstoffen en covalent gelabeld antigenen worden geëtiketteerd. Na immunisatie kunnen muizen worden gedood op verschillende tijdstippen DLN gereseceerd, cryosectioned en geanalyseerd met confocale microscopie. Deze techniek maakt visualisatie van lymfatische draining van zowel de nanodeeltjes vaccin vervoerders en antigeen DLN. De weefselcoupes kunnen bovendien worden gekleurd met fluorescent gemerkte antilichamen en gebruikt om meer informatie te verkrijgen, zoals soorten cellen verbonden met het antigeen en de vorming van germinale centra zoals we eerder hebben 7 getoond. Zodra het deeltje synthese wordt geoptimaliseerd en handel met de DLN wordt bevestigd, is het belangrijk uitlokken van in vivo CTL expansie valideren. Om uitlokken van antigeen-specifieke CD8 + T-cellen te analyseren in respons op nanodeeltjes vaccinatie hebben we een model antigeen, ovalbumine (OVA) gebruikt, met OVA peptide 257-264 (SIINFEKL) immunodominante CD8 + T-celepitoop, dat gedetailleerde immunologische analyses toelaat antigeen-specifieke T cel responsen voor de eerste vaccinontwikkeling 16,17. In het bijzonder om de dynamiek van expansie en migratie van antigeen-specifieke CD8 + T-cellen ondervragen, hebben we gegenereerd eendubbel transgeen muismodel door kruising firefly luciferase-expressie transgene muizen (Luc) met OT-I transgene muizen die CD8 + T-cellen met T-celreceptor (TCR) specifiek voor SIINFEKL (in samenwerking met H-2Kb) bezitten. Uit deze OT-I / Luc muizen-luciferase expressie, OT-I CD8 + T-cellen kunnen worden geïsoleerd en voorbereid voor adoptieve overdracht naïeve C57BL / 6-muizen. Eenmaal gezaaide zal succesvolle immunisatie met OVA bevattende nanodeeltjes resulteren in uitzetting van de overgedragen T-cellen, die kunnen worden gevolgd door het volgen van de bioluminescentie signaal met een geheel dier beeldvormingssysteem 9,10. Deze niet-invasieve whole-body imaging techniek is gebruikt met andere virale en tumor antigenen in het verleden 18-20, openbaren processen van T-cel expansie in lymfoïde weefsels en verspreiding perifere weefsels in een longitudinale wijze. Aanvullende analyses van adoptief overgedragen antigeenspecifieke CD8 + T-cellen, endogenoons T cel responsen na vaccinatie kunnen worden onderzocht met peptide-major histocompatibility complex (MHC) tetrameer assay 21, waarbij een peptide-MHC tetrameer complex, bestaande uit vier-fluorofoor gelabeld MHC-klasse I moleculen geladen met peptide-epitopen wordt toegepast TCR label en CD8 + T-cellen binden in een antigeen-specifieke wijze. Het peptide-MHC tetrameer assay kan worden uitgevoerd in terminal necropsie onderzoeken antigeen-specifieke CD8 + T-cellen in lymfoïde en perifere weefsels te identificeren of longitudinale studies met perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) verkregen uit seriële bloedafnames. Na kleuren lymfocyten met peptide-MHC tetrameer, flowcytometrie analyse uitgevoerd voor gedetailleerde analyses op het fenotype van CTLs of kwantificatie van de frequentie tussen CD8 + T-cellen.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Synthese en karakterisering van ICMV's geco-loaded met proteïne-antigeen en adjuvant moleculen</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[4-(p-maleïmidophenyl)butyramide] (natriumzout) (MPB)</td><td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td>870012</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>Monofosforyl Lipid A (Synthetisch) (PHAD&trade;) (MPLA)</td><td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td>699800</td><td></td></tr><tr><td>20 ml glazen injectieflacon</td><td>Wheaton</td><td>0334125D</td><td></td></tr><tr><td>Symphny Vacuum Oven</td><td>VWR</td><td>414004-580</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumine (OVA)</td><td>Worthington</td><td>3054</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Tris Propaan (BTP)</td><td>Fisher</td><td>BP2943</td><td></td></tr><tr><td>Q125 Sonicator (125&nbsp;W/20&nbsp;kHz)</td><td>Qsonica</td><td>Q125-110</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>2 kDa Thiolated Polyethyleen Glycol (PEG-SH)</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SH-2000-1g</td><td></td></tr><tr><td>Malvern ZetaSizer Nano ZSP&nbsp;</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZetaSizer Cuvettes</td><td>Malvern</td><td>DTS1070</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">2. Onderzoek van lymfeklierdrainage van fluorescentie-gelabelde ICMV's met confocale microscopie</td></tr><tr><td>1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodikarbocyanine, 4-Chloorbenzenesulfonaat Zout (DID)</td><td>Life Technologies</td><td>D-7757</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-succinimide ester (AF555-NHS)</td><td>Life Technologies</td><td>A37571</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT vriesmedium&nbsp;</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Cryomolds</td><td>VWR</td><td>25608-922</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">3. Monitoring van de uitbreiding van antigeen-specifieke, luciferase-expresserende CD8+ T-cellen na nanopartikelvaccinatie met hele dierbeelden</td></tr><tr><td>C57BL/6 muizen</td><td>Jackson</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Albino C57BL/6 muizen</td><td>Jackson</td><td>000058</td><td></td></tr><tr><td>OT-1 C57BL/6 muizen</td><td>Jackson</td><td>003831</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;m nylon zeef</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&trade; Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td><td>StemCell</td><td>19853</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&reg; hele dierbeelden systeem</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">4. Peptid-MHC tetrameerkleuring van perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) voor flowcytometrische analyse van antigeen-specifieke CD8+ T-cellen</td></tr><tr><td>K2EDTA buizen</td><td>BD</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>ACK lysis buffer</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16/32 Fc Blok</td><td>Ebioscience</td><td>14-0161-86</td><td></td></tr><tr><td>H-2Kb OVA Tetrameer</td><td>MBL</td><td>TS-5001-1C</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD8-APC</td><td>BD</td><td>553031</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD44-FITC</td><td>BD</td><td>553133</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD62L-PECy7</td><td>Ebioscience</td><td>25-0621-82</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-fenylindole dihydrochloride (DAPI)</td><td>SIGMA</td><td>D8417-10MG</td><td></td></tr><tr><td>CyAn Flow Cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>FlowJo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

whole-dierlijke imaging en flowcytometrische technieken voor analyse van antigeen-specifieke cd8 + t cel reacties na nanoparticle vaccinatie

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditionele vaccinadjuvanten, zoals alumina, roepen suboptimale CD8+ T-celreacties op. Om deze grote uitdaging in vaccinontwikkeling aan te pakken, zijn verschillende nanodeeltjessystemen ontworpen om kenmerken van pathogenen na te bootsen om de antigeenafgifte naar lymfeklieren te verbeteren en de antigeenopname door antigeenpresenterende cellen te verhogen, wat leidt tot nieuwe vaccinformuleringen geoptimaliseerd voor het induceren van antigeenspecifieke CD8+ T-celreacties. In dit artikel beschrijven we de synthese van een “pathogeen-nabootsend” nanodeeltjessysteem, aangeduid als interbilayer-crosslinked multilamellaire vesikels (ICMV's) die kunnen dienen als een effectieve vaccindrager voor gezamenlijke afgifte van subdeenheidantigenen en immunostimulerende agentia en het oproepen van krachtige cytotoxische CD8+ T-lymfocyt (CTL) reacties. We beschrijven methoden voor het karakteriseren van de hydrodynamische grootte en oppervlaktelading van vaccinnanodeeltjes met dynamisch lichtverstrooiing en zetapotentiaalanalyse en presenteren een op confocale microscopie gebaseerde procedure om nanodeeltje-gemedieerde antigeenafgifte naar lymfeklieren te analyseren. Verder laten we een nieuwe bioluminescentie hele-dierbeeldvormingstechniek zien die gebruik maakt van adoptieve overdracht van luciferase-expresserende, antigeenspecifieke CD8+ T-cellen in ontvangende muizen, gevolgd door vaccinatie met nanodeeltjes, wat non-invasieve ondervraging van de expansie en verkeerspatronen van CTL's in real time mogelijk maakt. We beschrijven ook tetrameerkleuring en flowcytometrische analyse van perifere bloedmononucleaire cellen voor longitudinale kwantificering van endogene T-celreacties bij muizen gevaccineerd met nanodeeltjes.

De stappen betrokken bij de synthese van ICMVs zijn aangegeven in figuur 1 6. Kort wordt een lipide film die één lipofiele geneesmiddelen of fluorescente kleurstoffen gehydrateerd in aanwezigheid van hydrofiele geneesmiddelen. Divalente kationen, zoals Ca2 +, worden toegevoegd om fusie van anionische liposomen multilamellaire vesicles rijdt. Dithiol crosslinker, zoals DTT, is op &quot;nieten&quot;-maleïmide gefunctionaliseerde lipiden toegevoegd op apposing lipide lagen, en ten slo...

We beschrijven beeldvorming van het hele dier en op flowcytometrie gebaseerde technieken voor het bewaken van de uitbreiding van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen als reactie op immunisatie met nanodeeltjes in een muizenmodel voor vaccinatie.

Whole-dierlijke Imaging en Flowcytometrische technieken voor analyse van antigeen-specifieke CD8 + T cel reacties na Nanoparticle Vaccinatie

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het synthetiseren en karakteriseren van op lipiden gebaseerde vaccinnanodeeltjes en het beoordelen van hun vermogen om in vivo de expansie van antigeenspecifieke cytotoxische T-lymfocyten op te wekken. Dit wordt bereikt door het ontwerpen van pathogeen-nabootsende, cross-linked multilamellaire vesikels met tussenliggende billaag (I CMVs), die gezamenlijk zijn geladen met antigeen en adjuvans voor de vaccinatie van naïeve muizen. Deze muizen worden adoptief getransfereerd met luciferase-expresserende antigeenspecifieke CD8-positieve T-cellen.In de tweede stap wordt de expansie van de antigeenspecifieke CD8-positieve T-cellen geëvalueerd middels in vivo imaging van het hele dier. Perifere mononucleaire bloedcellen, geoogst van de met ICMV geïmmuniseerde dieren, worden vervolgens gekleurd met fluorescentie-gelabelde tetrameren en geanalyseerd via flowcytometrie om de frequentie van de endogene antigeenspecifieke CD8-positieve T-cellen binnen het systemische compartiment te kwantificeren. Uiteindelijk kan bioluminescentie-imaging worden gebruikt om de expansie van de antigeenspecifieke cytotoxische T-lymfocyten als reactie op de nanodeeltjesvaccinatie te volgen.Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke voorlopige vragen bij het ontwerp van vaccins, zoals wat de omvang is van de expansie van cytotoxische T-lymfocyten en hoe deze cellen naar verschillende weefsels migreren als reactie op vaccinatie met nanodeeltjes? Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals in-situ T-celanalyse na weefselnecropsie, is dat in vivo imaging van de T-celrespons niet-invasief is. Dit maakt longitudinale monitoring van hetzelfde dier mogelijk. Begin met het mengen van een molaire verhouding van één-op-één DOPC en MPB in chloroform, waarbij een totale lipidhoeveelheid van 1,26 µmol per batch in een glazen flacon van 20 ml wordt aangehouden.Voeg vervolgens lipofiele cargo toe aan de lipidoplossing in de gewenste concentratie en spoel de oplossing met extra droog stikstofgas om het organische oplosmiddel grondig te verwijderen. Plaats het monster overnacht onder vacuüm. De volgende ochtend wordt de lipidfilm gehydrateerd met 200 µL van 10 mM BTP dat de wateroplosbare cargo van belang bevat; vortex de resulterende oplossing gedurende één uur bij kamertemperatuur 10 seconden elke 10 minuten. Breng vervolgens de inhoud over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml.Plaats de buis vervolgens in een ijswaterbad met continue sonicatie, waarbij de instelling van 40% intensiteit op een 125 watt 20 kilohertz probe tip sonicator wordt gebruikt. Voeg na vijf minuten vier µL 150 millimolar DTT toe aan de buis, vortex om te mengen en centrifugeer het monster kort in een microcentrifuge. Meng daarna 40 µL 200 millimolar calciumchloride door het monster, gevolgd door cross-linking van de MPB-bevattende lipidelagen met DTT bij 37 °C gedurende één uur.Centrifuge de oplossing aan het einde van de incubatie drie keer; voeg tijdens de tweede en derde centrifugatie 200 µL dubbel gedestilleerd water toe om het resterende calciumchloride, niet-gereageerd DTT en niet-ingekapselde vrachtmaterialen uit het supernatant te verwijderen. Na de laatste centrifugatie suspenderen we de I CMVs gedurende 30 minuten bij 37 °C in 100 µL vers bereide pegol. Was de vesicles vervolgens nog twee keer met dubbel gedestilleerd water.Resuspendeer de uiteindelijke pellet in PBS en bewaar de ICM VS bij vier graden Celsius. Om de deeltjes te karakteriseren, wordt de koude ICMV-suspensie gemengd voordat een klein aliquot van het monster wordt verdund in een totaal volume van één milliliter dubbel gedestilleerd water. Plaats vervolgens de ICMV's in een zeta sizer-cel en gebruik een systeem voor dynamische lichtverstrooiing en zeta-potentiaalmeting om de deeltjesgrootte, de polydispersiteitsindex en de zeta-potentiaal van de monsters te meten volgens de instructies van de fabrikant.Om ova-specifieke luciferase-expresserende CD8-positieve T-cellen te isoleren, worden eerst de milten geoogst van OT-1 luciferase-transgene muizen. Plaats de weefsels in 5 mL ijskoude PBS met 2% FBS en breng deze vervolgens over naar een weefselkweekkast.Gebruik de zuiger van een spuit van 3 mL om tot drie milten tegelijk door een zeef van 70 micron in een conische buis van 15 mL te malen. Was de zuiger en de zeef met PBS en 2%FBS. Breng vervolgens het totale volume van de celsuspensie aan tot 10 mL per milt.Bepaal het totale aantal cellen en centrifugeer de cellen vervolgens. Gebruik daarna een commercieel verkrijgbare kit voor magnetische negatieve selectie om de CD8-positieve miltcellen te isoleren volgens de instructies van de fabrikant. Was de T-cellen vervolgens in PBS.Tel de cellen en incubeer twee tot drie keer 10⁵ van de cellen in 20 µL muis CD 1632 blokkerend antilichaam. Voeg na 10 minuten 20 µL anti-CD8 APC-antilichaam toe aan de cellen voor 30 minuten en beoordeel de zuiverheid van de met magnetische beads geïsoleerde CD8-positieve T-celpopulatie via flowcytometrie. Voer vervolgens een adoptieve transfer uit van één tot 10 keer 10⁵ OT-I luciferase CD8-positieve T-cellen in 200 µL PBS in naïeve, geschoren albino C57BL/6 muizen via een intraveneuze injectie in de staartvene. Dien 24 uur later het vaccin toe op het juiste aantal dagen na vaccinatie.Injecteer de dieren na 10 minuten met 150 mg/kg Lucifer; registreer gedurende vijf tot 10 minuten het bioluminescentiesignaal met een whole-animal imaging-systeem om de OT-1 Lucifer CD8-positieve T-cellen te visualiseren en het aantal antigeenspecifieke CD8-positieve T-cellen op het juiste tijdstip te bepalen. Neem na vaccinatie ongeveer 100 µL bloed af van de gevaccineerde muizen via de submandibulaire bloedafname-techniek in een buis gecoat met kalium-EDTA; keer de buis enkele keren om om stolling te voorkomen. Draag vervolgens 100 µL bloed over naar een microcentrifugebuis en voeg 1 mL CK-lysisbuffer toe.Centrifugeer de cellen na twee tot drie minuten en verwijder het supernatant. Was de resterende pbmc in één milliliter fax-buffer en blokkeer de aspecifieke binding met CD 1632 zoals zojuist gedemonstreerd. Verdeel de celsuspensie na 10 minuten over vier milliliter ronde-bodem fax-buisjes en voeg aan elk monster 20 microliters H two KB over tetramer syn fecal PE-oplossing toe volgens de specificaties van de fabrikant.Voeg na 30 minuten op ijs 20 µL van het passende antilichaamcocktail toe aan elk experimenteel monster en de enkelvoudige fluoro four controle-antilichamen voor elk fluoro four tag tetrameer of antilichaam aan elk controlemonster. Was vervolgens, na een verdere incubatie van 20 minuten, alle monsters in fax-buffer, resuspendeer de pellets in fax-buffer aangevuld met DPI en analyseer de monsters via flowcytometrie. CMV's die geladen zijn met fluoro four tact-proteïneantigenen en fluorescerende lipofiele kleurstoffen maken de visualisatie van antigeen- en nanodeeltjeslevering in vivo mogelijk. Confocale microscopie-imaging laat bijvoorbeeld zien dat oplosbaar antigeen dat subcutaan aan de basis van de staart wordt toegediend, binnen vier uur na toediening de drainerende lymfeklieren bereikt en binnen 24 uur is geklaard.In tegenstelling hiermee worden overbeladen I CMV's voor het eerst gedetecteerd aan de periferie van de drainerende lymfeklieren 24 uur na toediening, met een voortdurende accumulatie die resulteert in een grote depositie van ova I CMV's binnen het drainerende lymfeweefsel. Tegen dag vier laat bioluminescentie-imaging van C 57 BL zes muizen, waarop op de dag van vaccinatie OT one Luciferase CD eight positieve T-cellen adoptief zijn overgebracht, inderdaad een minimaal achtergrondniveau van OT one luciferase tcell zien op dag vier na vaccinatie. Echter, muizen die zijn geïmmuniseerd met de ova MPI CMV's vertonen een robuust bioluminescentiesignaal binnen de drainerende inguinale lymfeklieren.De muizen die gevaccineerd zijn met oplosbaar ova vertonen daarentegen een sterk verminderde expansie van de OT-I Lucifer CD8-positieve T-cellen binnen de drainerende lymfeklieren. Bovendien vertonen muizen die zijn geïmmuniseerd met oplosbaar ova en MPLA, zonder adoptieve transfer van antigeenspecifieke T-cellen, geen noemenswaardige expansie van ova-specifieke CD8-positieve T-cellen, zoals aangegeven door wekelijkse monitoring van de pbmc. ICMV-vaccinatie wekt echter een significant sterkere en endogene CD8-positieve T-celrespons op, waarbij op dag 41 een piek van 28% syn-fecal tetrameer-positieve T-cellen binnen het CD8-positieve T-celcompartiment onder de pbmc wordt bereikt. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u lipide-gebaseerde nanodeeltjes synthetiseert, immunisaties uitvoert en de CTL-expansie in vivo visualiseert en kwantificeert.Deze methoden kunnen verder worden aangepast om aanvullende informatie over de CTL-respons te onthullen. Bijvoorbeeld kan de teer-kleuringassay worden aangevuld met extra markers zoals CD 1 27, BCL twee en K lrg one om het geheugenfenotype van de cellen te beoordelen.

whole-animal-imaging-flow-cytometric-techniques-for-analysis-antigen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In dit artikel beschrijven we een methode gebruik te maken van multi-spectraal imaging flowcytometrie om de internalisering van polyanhydride nanodeeltjes of bacteriën door RAW 264.7 cellen te kwantificeren.

Het analyseren van cellulaire internalisatie van nanodeeltjes en bacteriën door Multi-spectrale Imaging flowcytometrie

This video describes a protocol for isolating rare-antigen-specific CD8+ T cells using magnetic nanoparticle-based artificial antigen-presenting cells (aAPCs) functionalized with antigenic peptide-loaded MHC-Igs and anti-CD28 antibodies. Interaction of the aAPCs with CD8+ T cells specifically expressing the antigenic peptide-targeting T cell receptors, followed by their expansion in vitro, results in the enrichment and expansion of this CD8+ T cell population.

Nanoparticle-Based Enrichment and Expansion of Antigen-Specific CD8+ T Cells

This video demonstrates an assay to analyze antigen-specific CD8+ T cells in different cell cycle stages. Fluorescently-labeled viable cells are selected using flow cytometry, and the cells in the different cell cycle stages are identified by their DNA content using antibodies against cell proliferation-associated nuclear protein and a nucleic acid stain.

An Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8+ T Cells

The video demonstrates an immunological method to monitor in vivo adjuvant-induced cytotoxic T lymphocyte or CTL production. A mouse is pre-injected with genetically engineered, proliferative dye-stained donor CD8+ T lymphocytes. Subcutaneous injection of ovalbumin with adjuvants generates cytotoxic CD8+ T lymphocytes that are identified post-harvesting through immunostaining and flow cytometry.

An Immunological Technique to Monitor Adjuvant-Mediated Cytotoxic T Lymphocyte Generation

Analyse van nanodeeltjes interactie met gedefinieerde subpopulaties van immune cellen door flowcytometrie.

Detectie van TL Nanoparticle Interacties met Primary Immune celtypes door flowcytometrie

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn om ex vivo validatie uit te voeren van in vivo nabije-infrarood fluorescentie xenograft beeldvormingsexperimenten bij muizen met behulp van met fluorofoor gelabelde nanolichamen en conventionele antilichamen.

Validatie van Nanobody en antilichamen gebaseerde<em&gt; In Vivo</em&gt; Tumor Xenograft NIRF-imaging Experimenten op muizen, waarbij<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Flowcytometrie en Microscopie

Hier beschrijven we een complete workflow voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van immuun synapsen tussen primaire menselijke T-cellen en cellen antigeen-presenteren. De methode is gebaseerd op imaging stroom cytometry, waarmee de verwerving en evaluatie van verscheidene duizend cel beelden binnen een relatief korte periode van tijd.

Kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de immuun SYNAPS in het menselijke systeem met behulp van Imaging Stroom Cytometry

Antigeen-specifieke T-cellen zijn moeilijk te karakteriseren of frametechnieken gebruiken in therapieën vanwege hun extreem lage frequentie. Hierin bieden we een protocol voor de ontwikkeling van een magnetische deeltjes die aan antigeen-specifieke T-cellen binden kan te verrijken van deze cellen en vervolgens uit te breiden ze verschillende keer voor zowel de karakterisering en de therapie.

Verrijken en uit te breiden van zeldzame Antigen-specifieke T-cellen met magnetische nanodeeltjes

Hier presenteren we een protocol voor de ex vivo kwalitatieve detectie van antigeen-specifieke CD8+ T cellen. Analyse is mogelijk met eencellige schorsingen van organen of van kleine hoeveelheden bloed. Een breed scala van studies vereisen de analyse van de reacties van de cytotoxische T-cel (vaccinatie en kanker immunotherapie studies).

Gelijktijdige kwantificering van anti-vector en Anti-transgenic-specifieke CD8+ T cellen Via MHC ik tetrameer kleuring na vaccinatie met een virale Vector

Klonale expansie is een belangrijk kenmerk van antigeenspecifieke T-celrespons. De celcyclus van antigeen-reagerende T-cellen is echter slecht onderzocht, deels vanwege technische beperkingen. We beschrijven een flowcytometrische methode om klonaal uitdijende antigeenspecifieke CD8 T-cellen in milt- en lymfeklieren van gevaccineerde muizen te analyseren.

Een DNA/Ki67-gebaseerde flowcytometrietest voor celcyclusanalyse van antigeenspecifieke CD8 T-cellen bij gevaccineerde muizen

Het protocol presenteert gedetailleerde methoden om te evalueren of de nano-emulsie ophiopogonine D adjuvans effectieve cellulaire immuunresponsen bevordert.

In vitro Cellulaire activiteit Evaluatie van het nano-emulsievaccin Adjuvans Ophiopogonine D

Leer de synthese en karakterisering van lipide-gebaseerde vaccinnanodeeltjes om antigeen-specifieke CD8+ T-celuitbreiding in muizen te beoordelen met behulp van beeldvorming en flowcytometrie.

Whole-dierlijke Imaging en Flowcytometrische technieken voor analyse van antigeen-specifieke CD8 + T cel reacties na Nanoparticle Vaccinatie (Video) | JoVE Journal

Whole-dierlijke Imaging en Flowcytometrische technieken voor analyse van antigeen-specifieke CD8 + T cel reacties na Nanoparticle Vaccinatie

Meer video's verkennen