Whole-dierlijke Imaging en Flowcytometrische technieken voor analyse van antigeen-specifieke CD8 + T cel reacties na Nanoparticle Vaccinatie

Het algemene doel van het volgende experiment is het synthetiseren en karakteriseren van op lipiden gebaseerde vaccinnanodeeltjes en het beoordelen van hun vermogen om in vivo de expansie van antigeenspecifieke cytotoxische T-lymfocyten op te wekken. Dit wordt bereikt door het ontwerpen van pathogeen-nabootsende, cross-linked multilamellaire vesikels met tussenliggende billaag (I CMVs), die gezamenlijk zijn geladen met antigeen en adjuvans voor de vaccinatie van naïeve muizen. Deze muizen worden adoptief getransfereerd met luciferase-expresserende antigeenspecifieke CD8-positieve T-cellen.

In de tweede stap wordt de expansie van de antigeenspecifieke CD8-positieve T-cellen geëvalueerd middels in vivo imaging van het hele dier. Perifere mononucleaire bloedcellen, geoogst van de met ICMV geïmmuniseerde dieren, worden vervolgens gekleurd met fluorescentie-gelabelde tetrameren en geanalyseerd via flowcytometrie om de frequentie van de endogene antigeenspecifieke CD8-positieve T-cellen binnen het systemische compartiment te kwantificeren. Uiteindelijk kan bioluminescentie-imaging worden gebruikt om de expansie van de antigeenspecifieke cytotoxische T-lymfocyten als reactie op de nanodeeltjesvaccinatie te volgen.

Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke voorlopige vragen bij het ontwerp van vaccins, zoals wat de omvang is van de expansie van cytotoxische T-lymfocyten en hoe deze cellen naar verschillende weefsels migreren als reactie op vaccinatie met nanodeeltjes? Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals in-situ T-celanalyse na weefselnecropsie, is dat in vivo imaging van de T-celrespons niet-invasief is. Dit maakt longitudinale monitoring van hetzelfde dier mogelijk. Begin met het mengen van een molaire verhouding van één-op-één DOPC en MPB in chloroform, waarbij een totale lipidhoeveelheid van 1,26 µmol per batch in een glazen flacon van 20 ml wordt aangehouden.

Voeg vervolgens lipofiele cargo toe aan de lipidoplossing in de gewenste concentratie en spoel de oplossing met extra droog stikstofgas om het organische oplosmiddel grondig te verwijderen. Plaats het monster overnacht onder vacuüm. De volgende ochtend wordt de lipidfilm gehydrateerd met 200 µL van 10 mM BTP dat de wateroplosbare cargo van belang bevat; vortex de resulterende oplossing gedurende één uur bij kamertemperatuur 10 seconden elke 10 minuten. Breng vervolgens de inhoud over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml.

Plaats de buis vervolgens in een ijswaterbad met continue sonicatie, waarbij de instelling van 40% intensiteit op een 125 watt 20 kilohertz probe tip sonicator wordt gebruikt. Voeg na vijf minuten vier µL 150 millimolar DTT toe aan de buis, vortex om te mengen en centrifugeer het monster kort in een microcentrifuge. Meng daarna 40 µL 200 millimolar calciumchloride door het monster, gevolgd door cross-linking van de MPB-bevattende lipidelagen met DTT bij 37 °C gedurende één uur.

Centrifuge de oplossing aan het einde van de incubatie drie keer; voeg tijdens de tweede en derde centrifugatie 200 µL dubbel gedestilleerd water toe om het resterende calciumchloride, niet-gereageerd DTT en niet-ingekapselde vrachtmaterialen uit het supernatant te verwijderen. Na de laatste centrifugatie suspenderen we de I CMVs gedurende 30 minuten bij 37 °C in 100 µL vers bereide pegol. Was de vesicles vervolgens nog twee keer met dubbel gedestilleerd water.

Resuspendeer de uiteindelijke pellet in PBS en bewaar de ICM VS bij vier graden Celsius. Om de deeltjes te karakteriseren, wordt de koude ICMV-suspensie gemengd voordat een klein aliquot van het monster wordt verdund in een totaal volume van één milliliter dubbel gedestilleerd water. Plaats vervolgens de ICMV's in een zeta sizer-cel en gebruik een systeem voor dynamische lichtverstrooiing en zeta-potentiaalmeting om de deeltjesgrootte, de polydispersiteitsindex en de zeta-potentiaal van de monsters te meten volgens de instructies van de fabrikant.

Om ova-specifieke luciferase-expresserende CD8-positieve T-cellen te isoleren, worden eerst de milten geoogst van OT-1 luciferase-transgene muizen. Plaats de weefsels in 5 mL ijskoude PBS met 2% FBS en breng deze vervolgens over naar een weefselkweekkast.

Gebruik de zuiger van een spuit van 3 mL om tot drie milten tegelijk door een zeef van 70 micron in een conische buis van 15 mL te malen. Was de zuiger en de zeef met PBS en 2%FBS. Breng vervolgens het totale volume van de celsuspensie aan tot 10 mL per milt.

Bepaal het totale aantal cellen en centrifugeer de cellen vervolgens. Gebruik daarna een commercieel verkrijgbare kit voor magnetische negatieve selectie om de CD8-positieve miltcellen te isoleren volgens de instructies van de fabrikant. Was de T-cellen vervolgens in PBS.

Tel de cellen en incubeer twee tot drie keer 10⁵ van de cellen in 20 µL muis CD 1632 blokkerend antilichaam. Voeg na 10 minuten 20 µL anti-CD8 APC-antilichaam toe aan de cellen voor 30 minuten en beoordeel de zuiverheid van de met magnetische beads geïsoleerde CD8-positieve T-celpopulatie via flowcytometrie. Voer vervolgens een adoptieve transfer uit van één tot 10 keer 10⁵ OT-I luciferase CD8-positieve T-cellen in 200 µL PBS in naïeve, geschoren albino C57BL/6 muizen via een intraveneuze injectie in de staartvene. Dien 24 uur later het vaccin toe op het juiste aantal dagen na vaccinatie.

Injecteer de dieren na 10 minuten met 150 mg/kg Lucifer; registreer gedurende vijf tot 10 minuten het bioluminescentiesignaal met een whole-animal imaging-systeem om de OT-1 Lucifer CD8-positieve T-cellen te visualiseren en het aantal antigeenspecifieke CD8-positieve T-cellen op het juiste tijdstip te bepalen. Neem na vaccinatie ongeveer 100 µL bloed af van de gevaccineerde muizen via de submandibulaire bloedafname-techniek in een buis gecoat met kalium-EDTA; keer de buis enkele keren om om stolling te voorkomen. Draag vervolgens 100 µL bloed over naar een microcentrifugebuis en voeg 1 mL CK-lysisbuffer toe.

Centrifugeer de cellen na twee tot drie minuten en verwijder het supernatant. Was de resterende pbmc in één milliliter fax-buffer en blokkeer de aspecifieke binding met CD 1632 zoals zojuist gedemonstreerd. Verdeel de celsuspensie na 10 minuten over vier milliliter ronde-bodem fax-buisjes en voeg aan elk monster 20 microliters H two KB over tetramer syn fecal PE-oplossing toe volgens de specificaties van de fabrikant.

Voeg na 30 minuten op ijs 20 µL van het passende antilichaamcocktail toe aan elk experimenteel monster en de enkelvoudige fluoro four controle-antilichamen voor elk fluoro four tag tetrameer of antilichaam aan elk controlemonster. Was vervolgens, na een verdere incubatie van 20 minuten, alle monsters in fax-buffer, resuspendeer de pellets in fax-buffer aangevuld met DPI en analyseer de monsters via flowcytometrie. CMV's die geladen zijn met fluoro four tact-proteïneantigenen en fluorescerende lipofiele kleurstoffen maken de visualisatie van antigeen- en nanodeeltjeslevering in vivo mogelijk. Confocale microscopie-imaging laat bijvoorbeeld zien dat oplosbaar antigeen dat subcutaan aan de basis van de staart wordt toegediend, binnen vier uur na toediening de drainerende lymfeklieren bereikt en binnen 24 uur is geklaard.

In tegenstelling hiermee worden overbeladen I CMV's voor het eerst gedetecteerd aan de periferie van de drainerende lymfeklieren 24 uur na toediening, met een voortdurende accumulatie die resulteert in een grote depositie van ova I CMV's binnen het drainerende lymfeweefsel. Tegen dag vier laat bioluminescentie-imaging van C 57 BL zes muizen, waarop op de dag van vaccinatie OT one Luciferase CD eight positieve T-cellen adoptief zijn overgebracht, inderdaad een minimaal achtergrondniveau van OT one luciferase tcell zien op dag vier na vaccinatie. Echter, muizen die zijn geïmmuniseerd met de ova MPI CMV's vertonen een robuust bioluminescentiesignaal binnen de drainerende inguinale lymfeklieren.

De muizen die gevaccineerd zijn met oplosbaar ova vertonen daarentegen een sterk verminderde expansie van de OT-I Lucifer CD8-positieve T-cellen binnen de drainerende lymfeklieren. Bovendien vertonen muizen die zijn geïmmuniseerd met oplosbaar ova en MPLA, zonder adoptieve transfer van antigeenspecifieke T-cellen, geen noemenswaardige expansie van ova-specifieke CD8-positieve T-cellen, zoals aangegeven door wekelijkse monitoring van de pbmc. ICMV-vaccinatie wekt echter een significant sterkere en endogene CD8-positieve T-celrespons op, waarbij op dag 41 een piek van 28% syn-fecal tetrameer-positieve T-cellen binnen het CD8-positieve T-celcompartiment onder de pbmc wordt bereikt. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u lipide-gebaseerde nanodeeltjes synthetiseert, immunisaties uitvoert en de CTL-expansie in vivo visualiseert en kwantificeert.

Deze methoden kunnen verder worden aangepast om aanvullende informatie over de CTL-respons te onthullen. Bijvoorbeeld kan de teer-kleuringassay worden aangevuld met extra markers zoals CD 1 27, BCL twee en K lrg one om het geheugenfenotype van de cellen te beoordelen.